促进神经元发育和/或健康的方法

申请号 CN201480040464.3 申请日 2014-06-21 公开(公告)号 CN105431056A 公开(公告)日 2016-03-23
申请人 MJN美国控股有限责任公司; 发明人 邝晨钟; 萧彦; E.K.佩尔斯; Z.约尼; D.洪曼;
摘要 本公开内容涉及在受试者中促进神经元健康和/或发育的方法,即通过提供包含神经学组分的营养组合物,其中所述神经学组分可以促进脑和神经系统发育和进一步提供神经学保护作用和修复。所述神经学组分可包括乳 铁 蛋白、 硫酸 锌、一种或多种有机硫化合物、及其混合物。
权利要求

1.一种促进神经元健康和/或发育的方法,其包括提供营养组合物,所述营养组合物包含化合物源、脂肪源、蛋白源和神经学组分,其中所述神经学组分包含乳蛋白、硫酸锌、至少一种有机硫化合物及其组合。
2. 权利要求1的方法,其中所述有机硫化合物包含α-硫辛酸,其存在量为约0.1 mg/100 kcal-约35 mg/100 kcal。
3. 权利要求1的方法,其中硫酸锌存在量为约0.1 mg/100 kcals-约2 mg/100 kcals营养组合物。
4.权利要求1的方法,其中所述至少一种有机硫化合物包含至少一种选自以下的化合物:烯丙基硫化物、烯丙基二硫化物和萝卜硫素。
5.权利要求1的方法,其中所述营养组合物进一步包含唾液酸。
6.权利要求1的方法,其中所述营养组合物进一步包含益生元
7.权利要求1的方法,其中所述营养组合物进一步包含二十二碳六烯酸。
8.权利要求1的方法,其中所述营养组合物是婴儿配方。
9.权利要求1的方法,其中所述营养组合物进一步包含益生菌
10. 促进神经元健康和/或发育的方法,包括提供营养组合物,其每100 kcal包含:
(i) 约6 g-约22 g碳水化合物源;
(ii) 约1 g-约7 g蛋白源;
(iii) 约1.3 g-约7.2 g脂肪源;和
(iv) 神经学组分,其包括乳铁蛋白、硫酸锌、至少一种有机硫化合物及其组合。
11. 权利要求10的方法,其中所述至少一种有机硫化合物的存在量为约0.1 mg-约
200 mg/100 kcal营养组合物。
12. 权利要求10的方法,其中所述至少一种有机硫化合物以约0.1 mg-约37 mg/100 kcal营养组合物的量包含α-硫辛酸。
13. 权利要求10的方法,其中所述营养组合物进一步包含每100kcal约0.3 g-约1.2 g益生元。
14. 权利要求10的方法,其中所述营养组合物进一步包含每100 kcal约0.5 mg-约
45 mg唾液酸。
15. 权利要求10的方法,其中所述营养组合物进一步包含约5 mg/100 kcal-75 mg/100 kcal二十二碳六烯酸。
16.营养组合物,其包含:
(i) 碳水化合物源;
(ii) 蛋白源;
(iii) 脂肪源;和
(iv) 神经学组分,其包括乳铁蛋白、硫酸锌和至少一种有机硫化合物。
17. 权利要求16的营养组合物,其中所述有机硫化合物是α-硫辛酸和存在量为约
0.1 mg/100 kcal-约37 mg/100 kcal。
18.权利要求16的营养组合物,其进一步包含唾液酸。
19.权利要求16的营养组合物,其进一步包含二十二碳六烯酸。
20.权利要求16的营养组合物,其中所述营养组合物是婴儿配方。

说明书全文

促进神经元发育和/或健康的方法

技术背景

[0001] 本公开内容涉及在受试者中促进神经元健康和发育、以及神经发生的方法,包括提供适合给予成人和小儿受试者的营养组合物,其包含神经学组分(neurologic component)。所述神经学组分可包括乳蛋白、以及硫酸锌、至少一种有机硫化合物及其组合。合适的非限制性有机硫化合物包括α-硫辛酸(“ALA”)、烯丙基硫化物、烯丙基二硫化物、萝卜硫素(“SFN”)和/或L-萝卜硫素(“L-SFN”)。

背景技术

[0002] 脑部仅占总体重的2%,但它是消耗高的器官,其使用高达30%的每日热量和营养物。(Harris, J.J.等人, 中枢神经学白质的能量学(The Energetics of CNS White Matter). Jour. of. Neuroscience, Jan. 2012: 32(1): 356-371)。人类脑和神经系统在产前生命早期开始形成并且两者持续发育,直到约3岁。这种早期发育对整个脑部和神经系统的健康可具有终生的作用。因此,脑营养物在婴儿、儿童和孕妇以及哺乳期妇女的饮食中可以是重要的添加剂,因为它们促进早期脑发育和预防和保护免遭脑和神经系统伤害或疾病的能。另外,脑营养物对于成人是重要的,因为许多营养物促进神经系统修复和提供神经保护性健康益处。
[0003] 许多营养物被认为涉及支持健康的脑发育。然而,最近已经发现某些有机硫化合物,例如ALA,当与乳铁蛋白组合时,在人类脂肪衍生的干细胞(“hADSCs”)和人类神经元干细胞(“hNSCs”)上促进神经发生和/或神经元分化。
[0004] 乳铁蛋白,一种铁-结合的糖蛋白,是人乳中存在的主要的多功能剂中的一种。它具有以可逆方式结合两个铁分子的能力并且可以促进肠道中铁的摄取。
[0005] 硫酸锌具有分子式ZnSO4。通常锌是需要由饮食提供的必需的微量矿物质。锌对于超过300种酶的生物功能是必须的并且稳定一些蛋白质的四级结构。在中枢神经系统中,锌可以集中在特定的谷酰胺能神经元的突触囊泡上,其主要存在于前脑中并与其它脑结构连接。
[0006] 烯丙基硫化物,通常也称为二烯丙基硫化物,是化学式为C6H10S的有机硫化合物。烯丙基硫化物,例如二烯丙基硫化物、二烯丙基二硫化物、和二烯丙基三硫化物,是蒜油的主要成分。在体内烯丙基硫化物可以被细胞色素P450 2E1 (CYP2E1)转化为二烯丙基亚砜和二烯丙基砜。
[0007] 萝卜硫素(“SFN”)是具有分子式C6H11NOS2的有机硫化合物的异硫氰酸酯组内的分子。SFN及其异构体,例如L-萝卜硫素(“L-SFN”),已知在实验模型中表现出抗癌和抗微生物性质。SFN可以得自十字花科蔬菜,例如椰菜、芽甘蓝或卷心菜。SFN如下产生:当酶芥子酶与萝卜苷(glucoraphanin)(一种芥子油苷(glucosinolate))反应时,将萝卜苷转化为SFN。
[0008] 需要的是促进神经元健康和发育的方法,即通过给予包含神经学组分的组合物,以支持脑和神经系统健康。所述神经学组分包括乳铁蛋白,至少一种有机硫化合物及其组合。本文公开的这些营养组合物可以具有累加的和/或协同的神经系统健康益处。因此,本公开内容涉及促进和支持脑和神经系统健康的方法,即通过提供包含神经学组分的营养组合物。发明内容
[0009] 简而言之,在一个实施方案中,本公开内容涉及促进神经元发育的方法,即通过提供包含神经学组分的营养组合物,所述神经学组分包括乳铁蛋白、硫酸锌、至少一种有机硫化合物和/或其组合。有机硫化合物的合适的非限制性实例包括ALA、烯丙基硫化物、烯丙基二硫化物、萝卜硫素(“SFN”)、和/或L-萝卜硫素(“L-SFN”)。
[0010] 在某些实施方案中,所述营养组合物可以进一步包含长链多不饱和脂肪酸(“LCPUFA”)如二十二六烯酸(“DHA”)、唾液酸、益生元益生菌、β-葡聚糖、铁源、非瑟、山奈酚、熊果酸、或其一种或多种的混合物。
[0011] 由于在生命的第一年期间的关键性脑发育,在一个实施方案中,所述方法包括提供包括婴儿配方或小儿营养组合物的营养组合物,其包含本文所述的神经学组分。本文所述的营养组合物也可用于作为药物或营养补充剂,用于在患有神经变性疾病和/或脑损伤的受试者中促进神经学健康。此外,本公开内容的营养组合物可提供神经保护性健康益处和促进整个脑和神经系统健康。
[0012] 应理解的是,以上一般性描述和以下详细描述给出了本公开内容的实施方案和意图提供用于理解要求保护的本公开内容的性质和特点的概述或框架。所述描述用来解释要求保护的主题的原理和操作。在阅读以下公开内容时,对于本领域技术人员而言本公开内容的其它的和额外的特征和优势会是容易地显而易见的。
[0013] 附图简述图1A是在神经元分化条件下没有用神经学组分处理的hADSCs的相差显微术图像。
hADSCs的形态学表现未分化状态,具有大而平的形态学,以及无明显神经突突起。
[0014] 图1B是形成类似双极、三极和多极神经细胞的形态学的hADSCs的相差显微术图像。
[0015] 图2A是含有没有用神经学组分或DHA处理的hADSCs的对照孔的相差显微术图像。
[0016] 图2B是含有用DHA处理的hADSCs的对照孔的相差显微术图像。
[0017] 图2C是含有用ALA处理的hADSCs的对照孔的相差显微术图像。
[0018] 实施本发明的最佳模式现在将详细提及本公开内容的实施方案,其一个或多个实施例在下文阐述。每个实施例均通过解释本公开内容的营养组合物和或方法的方式提供,且不作为限制。事实上,对本领域技术人员而言将显而易见的是,在不违背本公开内容的范围和精神的情况下可对本公开内容的教导作出多种修饰和变更。例如,作为一个实施方案的一部分说明或描述的特征可与另一个实施方案一起使用以产生更进一步的实施方案。
[0019] 因此,本公开内容意欲涵盖在随附的权利要求书及其等同物的范围内的这些修饰和变更。本公开内容的其它目的、特征和方面在以下详述的说明书中公开或根据以下详述的说明书而显而易见。本领域普通技术人员应理解的是,本论述仅为示例性实施方案的说明,并非意在限制本公开内容更广泛的方面。
[0020] 本公开内容一般涉及促进神经元健康和发育的方法,即通过提供包含神经学组分的营养组合物,其中所述神经学组分包括乳铁蛋白和有机硫化合物例如ALA。另外,本公开内容涉及支持和促进脑和神经系统健康、神经发生和神经保护作用,以及认知发展的方法,即通过向目标受试者提供含有本文所述的神经学组分的营养组合物。
[0021] “营养组合物”是指满足受试者的营养需求的至少一部分的物质或配方。术语“营养的”、“营养配方”、“肠内营养的”、和“营养补充剂”在本公开内容全文中用作营养组合物的非限制性实例。此外,“营养组合物”可以指液体、粉末、凝胶、糊剂、固体、浓缩物、混悬液或即用形式的型肠内配方、口服配方、婴儿配方、小儿受试者的配方、儿童配方、成长乳和/或成人配方。
[0022] 术语“肠内的”意指通过胃肠道或消化道,或者在胃肠道或消化道内可递送的。“肠内给予”包括经口喂饲、胃内喂饲、经幽给予以及进入消化道的任何其它给予。“给予”比“肠内给予”更广泛并且包括胃肠外给予或物质进入受试者身体的任何其它给予途径。
[0023] “神经学组分”是指这样的化合物或组合物:其通过促进或抑制神经发生而影响神经发生。因此,与在不提供神经学组分时的神经发生程度相比,在某些情况下,神经学组分促进神经发生,而在其它情况下,神经学组分抑制或减少神经发生。
[0024] “α-硫辛酸”,在本文中缩写为“ALA”,是指分子式为C8H14S2O2的源自辛酸的有机硫化合物。通常,ALA含有经由二硫键相连的两个硫原子。α-硫辛酸与硫辛酸(缩写为“LA”)同义,并且这两个术语和缩写在本文中可以可互换地使用。
[0025] 本文使用的“萝卜硫素”包括萝卜硫素的任何已知异构体,其包括但不限于L-萝卜硫素。在一些实施方案中,萝卜硫素可包括仅L-萝卜硫素,在其它实施方案中,萝卜硫素的提及可包括L-萝卜硫素、D-萝卜硫素、任何其它合适的萝卜硫素异构体及它们的任何组合。因此,本文使用的术语萝卜硫素包括萝卜硫素的任何异构体,包括但不限于立体异构体、旋光异构体、结构异构体、对映体、几何异构体以及它们的组合。
[0026] 术语“解度”是指通过水解方法破坏肽键的程度。例如本公开内容的蛋白等同源,在一些实施方案中,可包含水解度不大于40%的水解蛋白。对于该实例,这是指全部肽键的至少40%已通过水解法裂解开。
[0027] 术语“部分水解的”是指水解度大于0%、但小于50%。
[0028] 术语“广泛水解的”是指水解度大于或等于50%。
[0029] “小儿受试者”是指小于13岁的人。在某些实施方案中,小儿受试者是指介于出生到8岁之间的人类受试者。在其它实施方案中,小儿受试者是指介于1-6岁之间的人类受试者。在再进一步的实施方案中,小儿受试者是指介于6-12岁之间的人类受试者。术语“小儿受试者”可以指婴儿(早产儿或足月儿)和/或儿童,如下所述。
[0030] “婴儿”意指年龄在从出生至不超过1岁的范围内的人类受试者,包括0-12个月的矫正年龄的婴儿。短语“矫正年龄”意指婴儿的实足年龄减去婴儿早产的时间的量。因此,如果婴儿被怀孕至足月,矫正年龄就是该婴儿的年龄。术语婴儿包括低出生体重婴儿、极低出生体重婴儿和早产婴儿。“早产的”是指在妊娠的第37周末期之前出生的婴儿。“足月的”是指在妊娠的第37周末期之后出生的婴儿。
[0031] “儿童”意指年龄在12个月-约13岁的范围内的受试者。在一些实施方案中,儿童是年龄在1-12岁之间的受试者。在其它实施方案中,术语“儿童”指介于1-约6岁、或介于约7-约12岁之间的受试者。在其它实施方案中,术语“儿童”指介于12个月-约13岁之间的任何年龄范围。
[0032] “儿童营养产品”是指满足儿童的营养需求的至少一部分的组合物。成长乳是儿童营养产品的实例。
[0033] “婴儿配方”意指满足婴儿至少一部分营养需求的组合物。在美国,婴儿配方的内容由在21 C.F.R.第100、106、107部分中列出的联邦法规规定。这些法规限定大量营养物、维生素、矿物质和其它成分的水平,以努力模仿人母乳的营养和其它性质。
[0034] 术语“成长乳”是指意在用作不同饮食的一部分以便支持年龄约1岁-约6岁的儿童的正常生长和发育的广泛种类的营养组合物。
[0035] “营养完全的”意指可用作唯一营养源的组合物,其会供应基本上所有日常所需量的维生素、矿物质和/或微量元素与蛋白质、碳水化合物和脂质的组合。实际上,“营养上完全的”描述了提供支持受试者的正常生长和发育所需的足够量的碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量的营养组合物。
[0036] 因此,对于早产婴儿,“营养完全的”营养组合物,按照定义,会提供早产婴儿生长所需的质量上和数量上足够量的碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
[0037] 对于足月婴儿,“营养完全的”营养组合物,按照定义,会提供足月婴儿生长所需的质量上和数量上足够量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
[0038] 对于儿童,“营养完全的”营养组合物,按照定义,会提供儿童生长所需的质量上和数量上足够量的所有碳水化合物、脂质、必需脂肪酸、蛋白、必需氨基酸、条件必需氨基酸、维生素、矿物质和能量。
[0039] 当用于营养物时,术语“必需”是指不能通过身体以足以用于正常生长和维持健康的量合成的,并因此必须通过饮食供应的任何营养物。术语“条件必需”当用于营养物时,是指在身体不能得到足够量的前体化合物用于内源合成发生的条件下必须通过饮食供给的营养物。
[0040] “益生菌”是指对宿主健康发挥至少一种有益效果的、具有低致病性和无致病性的微生物。
[0041] 术语“灭活的益生菌”是指这样的益生菌:其中所提及的益生菌生物体的代谢活性或繁殖能力已经被降低或破坏。然而,“灭活的益生菌”在细胞水平上仍然保留至少一部分其生物学的乙二醇-蛋白(glycol-protein)和DNA/RNA结构。本文使用的术语“灭活的”与“无活力”同义。更具体地讲,灭活的益生菌的非限制性实例是灭活的鼠李糖乳杆菌GG (Lactobacillus rhamnosus GG,“LGG”)或“灭活的LGG”。
[0042] 术语“细胞等同物”是指相等数量的活细胞的无活力、不复制的益生菌等同物的水平。术语“不复制”可理解为得自相同量的复制的细菌(cfu/g)的不复制的微生物的量,包括灭活的益生菌、DNA片段、细胞壁或细胞质化合物。换言之,无论无生命的、不复制生物体是否是死的、不复制的、灭活的、破碎的等,它们的量以cfu为单位表示,如同所有的微生物是活的一样。
[0043] “益生元”意指这样的不易消化的食物成分,其通过选择性刺激消化道中可改善宿主健康的一种或有限种细菌的生长和/或活性而对宿主产生有益影响。
[0044] “β-葡聚糖”是指所有β-葡聚糖,包括特定类型的β-葡聚糖,例如β-1,3-葡聚糖或β-1,3;1,6-葡聚糖。此外,β-1,3;1,6-葡聚糖为β-1,3-葡聚糖的一种。因此,术语“β-1,3-葡聚糖”包括β-1,3;1,6-葡聚糖。
[0045] 本文使用的“非人乳铁蛋白”是指由不同于人母乳的源产生的或得自不同于人母乳的源的乳铁蛋白。在某些实施方案中,非人乳铁蛋白是氨基酸序列不同于人乳铁蛋白的氨基酸序列的乳铁蛋白。在其它实施方案中,用于本公开内容的非人乳铁蛋白包括由遗传修饰生物体产生的人乳铁蛋白。本文使用的术语“生物体”是指任何连续生命系统,例如动物、植物真菌或微生物。
[0046] 本文使用的所有百分比、份和比例均以总配方的重量计,除非另有说明。
[0047] 本公开内容的营养组合物可基本上不含任何本文描述的任选或选择成分,只要剩余的营养组合物仍包含本文所述的所有所需成分或特征。在本发明上下文中,除非另有说明,术语“基本不含”意指所选组合物可包含小于有功能量的任选成分,通常小于0.1%重量,也包括0%重量的该任选或选择成分。
[0048] 对本公开内容的单数特性或限制的所有提及应包括相应的复数特性或限制,反之亦然,除非另有说明或在作出该提及的上下文中明确暗示与此相反。
[0049] 本文使用的方法或过程步骤的所有组合可按任何顺序实施,除非另有说明或在提及该组合的上下文中明确暗示与此相反。
[0050] 本公开内容的方法和组合物,包括其组分,可包含以下,或由以下组成或基本上由以下组成:本文描述的实施方案的基本要素和限制,以及本文描述的或营养组合物中在其它方面有用的任何额外或任选成分、组分或限制。
[0051] 本文使用的术语“约”应解释为指作为任何范围的端点而指定的两个数字。对范围的任何提及应被考虑为提供对该范围的任何子集的支持。
[0052] 脑和神经系统的发育在个体的整体健康和安乐中起到关键性作用。因此,本公开内容的方法促进脑和神经系统健康。在某些实施方案中,所述方法包括提供神经学组分和二十二碳六烯酸(“DHA”)的组合,其可具有支持脑和神经系统发育和健康的累加的和/或协同的益处效果。
[0053] 如上注释,所述神经学组分包含乳铁蛋白、硫酸锌、至少一种有机硫化合物及其组合。合适的非限制性有机硫化合物包括α-硫辛酸(“ALA”)、烯丙基硫化物、烯丙基二硫化物、萝卜硫素(“SFN”)、和/或L-萝卜硫素(“L-SFN”)及其混合物。
[0054] 注意,所述神经学组分包含乳铁蛋白。乳铁蛋白是约80kD的单链多肽,其根据物种含有1-4个聚糖。不同物种的乳铁蛋白的3-D结构是类似的,但不同。每个乳铁蛋白包含两个同源小叶,称为N-和C-小叶,分别是指分子的N-末端和C-末端部分。每个小叶进一步由两个亚-小叶或结构域组成,其形成裂缝,其中铁离子(Fe3+)与碳酸(氢)根阴离子以协同合作方式紧紧结合。这些结构域分别称为N1、N2、C1和C2。乳铁蛋白的N-端具有强阳离子肽区,其负责许多重要的结合特性。乳铁蛋白具有非常高的等电点(~pI 9)并且其阳离子性质在其防御细菌、病毒和真菌病原体的能力中起主要作用。乳铁蛋白的N-末端区内有若干阳离子氨基酸残基簇,其介导乳铁蛋白抗广泛范围的微生物的生物活性。
[0055] 用于本公开内容的乳铁蛋白可以例如分离自非人动物的乳汁或由遗传修饰的生物体产生。更具体地讲,用于本文的乳铁蛋白,在一些实施方案中,可包含非人乳铁蛋白、由遗传修饰的生物体产生的非人乳铁蛋白和/或由遗传修饰的生物体产生的人乳铁蛋白。
[0056] 用于本公开内容的合适的非人乳铁蛋白包括但不限于与人乳铁蛋白的氨基酸序列具有至少48%同源性的那些。例如,乳铁蛋白(“bLF”)具有与人乳铁蛋白具有约70%序列同源性的氨基酸组成。在一些实施方案中,非人乳铁蛋白与人乳铁蛋白具有至少65%同源性,和在一些实施方案中,具有至少75%同源性。可被接受用于本公开内容的非人乳铁蛋白包括但不限于,bLF、猪乳铁蛋白、乳铁蛋白、水牛乳铁蛋白、山羊乳铁蛋白、鼠乳铁蛋白和骆驼乳铁蛋白。
[0057] 可以通过本领域已知的任何方法产生适于本公开内容的bLF。例如,在美国专利号4,791,193(其通过引用全部结合到本文中)中,Okonogi等人公开了产生高纯度牛乳铁蛋白的方法。通常,所公开的方法包括3个步骤。原料乳材料首先与弱酸性阳离子交换剂接触吸附乳铁蛋白,接着是第二步,其中进行洗涤以去除未吸附的物质。接着是解吸步骤,其中将乳铁蛋白取出以产生纯化的牛乳铁蛋白。其它方法可包括以下文献中描述的步骤:
美国专利号7,368,141、5,849,885、5,919,913和5,861,491,其公开内容通过引用全部结合到本文中。
[0058] 在某些实施方案中,可通过用于自乳源分离蛋白的膨胀床吸附(“EBA”)过程提供用于本公开内容的乳铁蛋白。EBA,有时也称为稳定流化床吸附,是用于自乳源分离乳蛋白例如乳铁蛋白的方法,包括建立包含颗粒基质的膨胀床吸附柱,将乳源应用于所述基质,和用包含约0.3-约2.0M氯化钠的洗脱缓冲液自基质洗脱乳铁蛋白。任何哺乳动物乳源都可用于本过程,尽管在具体的实施方案中,所述乳源是牛乳源。在一些实施方案中,所述乳源包含全乳、减脂乳、脱脂乳、乳清酪蛋白或其混合物。
[0059] 在具体的实施方案中,目标蛋白是乳铁蛋白,虽然也可分离其它乳蛋白,例如乳过化物酶或乳白蛋白。在一些实施方案中,所述方法包括以下步骤:建立包含颗粒基质的膨胀床吸附柱,将乳源应用于所述基质,和用包含约0.3-约2.0 M氯化钠自基质上洗脱乳铁蛋白。在其它实施方案中,用约0.5-约1.0 M氯化钠洗脱乳铁蛋白,而在进一步的实施方案中,用约0.7-约0.9 M氯化钠洗脱乳铁蛋白。
[0060] 膨胀床吸附柱可以是本领域已知的任何一种,例如美国专利号7,812,138、6,620,326、和6,977,046中描述的那些,其公开内容藉此通过引用结合到本文中。在一些实施方案中,以膨胀模式将乳源应用于柱中,以膨胀或填充模式进行洗脱。例如,膨胀模式中的膨胀比率可以是约1-约3、或约1.3-约1.7。EBA技术进一步描述于国际公布申请号WO 92/00799、WO 02/18237、WO 97/17132,其通过引用全部结合到本文中。
[0061] 乳铁蛋白的等电点为约8.9。分离乳铁蛋白的现有技术EBA方法使用200 mM氢氧化钠作为洗脱缓冲液。因此,系统的pH升至超过12,和乳铁蛋白的结构和生物活性可因不可逆的结构变化而受累(comprised)。现在已经发现氯化钠溶液在自EBA基质分离乳铁蛋白中可以用作洗脱缓冲液。在某些实施方案中,氯化钠浓度为约0.3 M-约2.0 M。在其它实施方案中,乳铁蛋白洗脱缓冲液的氯化钠浓度为约0.3 M-约1.5 M、或约0.5 m-约1.0 M。
[0062] 本文使用的乳铁蛋白,在一些实施方案中,可以是分离自全乳和/或具有低的体细胞计数的乳的乳铁蛋白,其中“低的体细胞计数”是指体细胞计数小于200,000细胞/mL。举例来说,合适的乳铁蛋白可得自新西兰Morrinsville的Tatua Co-operative Dairy Co. Ltd.,得自荷兰Amersfoort的FrieslandCampina Domo或得自新西兰Auckland的Fonterra Co-Operative Group Limited。
[0063] 令人吃惊的是,本文包括的乳铁蛋白维持某种杀菌活性,即使暴露于低pH(即低于约7,和甚至低至约4.6或更低)和/或高温(即高于约65℃,和高达约120℃),这是预计会破坏或严重限制人乳铁蛋白的稳定性或活性的条件。在用于本文所述类型的营养组合物的某些加工方案(例如巴氏消毒)期间,可预期这些低pH和/或高温条件。因此,甚至在加工方案后,乳铁蛋白具有抗人类肠道内存在的不期需的细菌性病原体的杀菌活性。
[0064] 当为了实施本公开内容的方法将乳铁蛋白作为神经学组分的要素包含在内并且掺入营养组合物中时,在一些实施方案中,乳铁蛋白的存在量为约10 mg/100 kcal-约250 mg/100 kcal。在一些实施方案中,乳铁蛋白的存在量为约50 mg/100 kcal-约175 mg/100 kcal。在又一些实施方案中,乳铁蛋白的存在量为约100 mg/100 kcal-约150 mg/100 kcals。
[0065] 硫酸锌,在一些实施方案中,可以包含于营养组合物的神经学组分中。在一些实施方案中,硫酸锌在营养组合物中的存在量可为约0.01 mg/100 kcals-约2 mg/100 kcals。在仍其它实施方案中,硫酸锌在营养组合物中的存在量可为约0.1 mg/100 kcals-约1.5 mg/100 kcals。而且,在其它实施方案中,硫酸锌在营养组合物中的存在量可为约0.5 mg/100 kcals-约1.0 mg/100 kcals。
[0066] 在一些实施方案中,并入所述神经学组分中的至少一种有机硫化合物可包含ALA。适于用作神经学组分的ALA的实例包括但不限于ALA的对映体和外消旋混合物,其包括,R-硫辛酸“RLA”、S-硫辛酸“SLA”、和R/S-LA。用钠(“Na-RALA”)或(如钾-R-硫辛酸盐)稳定化的R-硫辛酸也是合适的。
[0067] 当并入营养组合物中以用于实施本公开内容的方法时,ALA,在一些实施方案中,存在量可为约0.1 mg/100 kcals-约35 mg/100 kcals。在一些实施方案中,ALA的存在量可为约2.0 mg/100 kcals-约25 mg/100 kcals。在仍其它实施方案中,ALA的存在量可为约5.0 mg/100 kcals-约15 mg/100 kcals。
[0068] 在一些实施方案中,神经学组分的有机硫化合物可包含烯丙基二硫化物。在一些实施方案中,烯丙基二硫化物在营养组合物中的存在量可为约1 mg/100 kcals-约170 mg/100 kcals。在再一些实施方案中,烯丙基二硫化物的存在量可为约50 mg/100 kcals-约120 mg/100 kcals。在仍其它实施方案中,烯丙基二硫化物的存在量可为约75 mg/100 kcals-约100 mg/100 kcals。
[0069] 萝卜硫素(包括L-萝卜硫素)可以以约1.5 mg/100 kcals-约7.5 mg/100kcals的量并入营养组合物中。在再一些实施方案中,萝卜硫素的存在量可为约2 mg/100 kcals-约6 mg/100 kcals。在一些实施方案中,萝卜硫素的存在量可为约3 mg/100 kcals-约5 mg/100 kcals。
[0070] 可将营养组合物的神经学组分中包含的营养物与营养组合物中的其它成分配制在一起,以提供合适的营养物水平,用于目标受试者。在一些实施方案中,包含神经学组分的营养组合物是营养完全的配方,其适于支持正常生长并也有益于脑发育。在某些其它实施方案中,神经学组分中的营养物的组成和浓度经设计模拟对于早期人发育健康的水平。
[0071] 营养组合物中包括的神经学组分的营养物可包括功能等同物、源、代谢物、先决条件和/或其组合。这样的神经学组分的营养物可以是天然存在的、合成的、或通过生物体和/或植物的遗传操作而开发的,无论这样的源是目前已知的还是以后开发的。
[0072] 本文所述的神经学组分的营养物的源可以是乳、其它乳制品、大豆、肉、蛋、鳕鱼、酿酒酵母、器官肉(organ meats)、小麦芽、甘蔗提取物、番茄、椰菜、芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、小白菜、羽衣甘蓝、散叶甘兰、芥蓝、芜菁、苤蓝、芥菜、萝卜、小萝卜、芝麻菜、豆瓣菜、其它植物和从中可得到神经学组分的营养物并用于营养组合物中的经强化的或未经强化的任何其它源。优选地,神经学组分的营养物的源应当是食品级,是由食品衍生的或微生物产生的。另外,神经学组分的营养物的源可以是通过本领域已知的分离和纯化技术而获得的复杂混合物的一部分,所述技术旨在富集这类混合物的神经学组分营养物的衍生物或前体。
[0073] 此外,一定量的神经学组分中的营养物可以是在已知成分中固然存在的,例如通常用于制备营养组合物的天然油、碳水化合物源或蛋白源。在一些实施方案中,根据神经学组分的添加的和固有的源二者,计算神经学组分的本文所述的浓度和比例。
[0074] 注意,在本文所述的方法中,可将神经学组分与其它成分一起配制以提供营养组合物,以便提供对于目标受试者合适的营养水平。在一些实施方案中,营养组合物是营养完全的配方,其适于支持正常生长并也有益于脑发育。
[0075] 另外,可通过本领域众所周知的任何方法将神经学组分添加或掺入营养组合物中。在一些实施方案中,可将它们添加到营养组合物中,以补充营养组合物。例如,在一个实施方案中,可将神经学组分添加到市售可得的婴儿配方中。例如,Enfalac、Enfamil®、Enfamil® Premature Formula、Enfamil® with Iron、Enfamil® LIPIL®、Lactofree®、Nutramigen®、Pregestimil®、和ProSobee® (其各自可得自Mead Johnson Nutrition Company, Glenview, Illinois, U.S.)可以用合适水平的神经学组分补充,并用于本公开内容的实施。
[0076] 在其它实施方案中,所述神经学组分可以替代不含神经学组分的另一营养源。例如,一定量的脂肪源可被含有神经学组分的另一脂肪源代替。在仍其它实施方案中,通常添加到营养组合物中的成分源可以被改变,使得所选源提供通常被添加入营养组合物中的成分和神经学组成二者。
[0077] 在一些实施方案中,可通过本领域已知的任何方法将神经学组分包括在产前饮食补充剂中。产前给予神经学组分可以直接影响胎儿和胚胎发育。因为脑发育始于产前生命早期,所以将神经学组分包括在产前饮食补充剂中,可当小儿受试者仍在子宫内时促进其脑发育和神经发生。
[0078] 合宜地,可以使用市售可用的产前饮食补充剂和/或产前营养产品。例如,Expecta®补充剂(可得自Mead Johnson Nutrition Company, Glenview, Illinois, U.S.)可以用合适水平的神经学组分补充,并用于本公开内容的实施。
[0079] 所述产前饮食补充剂可每日按一个或多个剂量给予。在一些实施方案中,所述产前饮食补充剂每日按两个剂量给予。在单独的实施方案中,所述产前饮食补充剂按三个每日剂量给予。可将所述产前饮食补充剂给予孕妇或哺乳的妇女。
[0080] 本公开内容考虑任何口服可接受的剂型。这类剂型的实例包括但不限于丸剂、片剂、胶囊剂、软凝胶剂、液体、液体浓缩物、粉剂、酏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、锭剂、珠、扁囊剂及其组合。或者,可将本公开内容的产前饮食补充剂添加入更完全的营养组合物中。在该实施方案中,所述营养组合物可含有蛋白、脂肪和碳水化合物组分并且可用于补充饮食或可用作唯一营养源。
[0081] 在一些实施方案中,所述营养组合物包含至少一种碳水化合物源。碳水化合物源可以是本领域使用的任何一种,例如,乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖浆固体、麦芽糊精、蔗糖淀粉、大米糖浆固体等。碳水化合物组分在营养组合物中的量通常可以在介于约5 g/100 kcal-约25 g/100 kcal之间变化。在一些实施方案中,碳水化合物的量为约6 g/100 kcal-约22 g/100 kcal。在其它实施方案中,碳水化合物的量为约12 g/100 kcal-约14 g/100 kcal。在一些实施方案中,优选玉米糖浆固体。此外,将水解的、部分水解的和/或广泛水解的碳水化合物包括在营养组合物中可以是合意的,因为它们易于消化。具体地讲,水解的碳水化合物不大可能含变应原性的表位。
[0082] 适合用于本文的碳水化合物材料的非限制性实例包括水解的或完整的,天然的或化学改性的淀粉,其来自玉米、木薯粉、大米或马铃薯,呈蜡状或非蜡状。合适的碳水化合物的非限制性实例包括多种水解的淀粉,表征为水解的玉米淀粉、麦芽糊精、麦芽糖、玉米糖浆、右旋糖、玉米糖浆固体、葡萄糖、和多种其它葡萄糖聚合物及其组合。其它合适的碳水化合物的非限制性实例包括常被称为蔗糖、乳糖、果糖、高果糖玉米糖浆、难消化的寡糖例如低聚果糖及其组合的那些。
[0083] 此外,本公开内容的营养组合物可包含至少一种蛋白源。蛋白源可以是本领域使用的任何蛋白源,例如脱脂乳、乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、水解蛋白、氨基酸等。可用于实施本公开内容的牛乳蛋白源包括但不限于乳蛋白粉、乳蛋白浓缩物、乳蛋白分离物、脱脂乳固体、脱脂乳、脱脂乳粉、乳清蛋白、乳清蛋白分离物、乳清蛋白浓缩物、甜乳清、酸乳清、酪蛋白、酸性酪蛋白、酪蛋白酸盐(例如,酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙)、大豆蛋白及其任意组合。
[0084] 在营养组合物的具体的实施方案中,蛋白源的乳清:酪蛋白比例与在人母乳中发现的类似。在一个实施方案中,蛋白源包含约40%-约85%乳清蛋白和约15%-约60%酪蛋白。
[0085] 在一些实施方案中,所述营养组合物包含约1g-约7g蛋白源/100 kcal。在其它实施方案中,所述营养组合物包含约3.5 g-约4.5 g蛋白/100 kcal。
[0086] 在一些实施方案中,所述营养组合物的蛋白作为完整蛋白提供。在其它实施方案中,蛋白作为完整蛋白和水解蛋白两者的组合提供。在其中蛋白源包含水解蛋白的某些实施方案中,水解蛋白的水解程度在约4%-10%之间。在某些其它实施方案中,蛋白被更多地水解。
[0087] 在一些实施方案中,所述营养组合物的蛋白源可包含部分水解蛋白、广泛水解蛋白和/或其组合。在一些实施方案中,经历合适水解过程以提供本文公开的蛋白源的蛋白质包括来自牛乳的蛋白。可用酶处理所述蛋白以分解一些或大部分引起不良症状的蛋白,目的是减少变态反应、不耐受和致敏。在再一个实施方案中,所述营养组合物的蛋白组分基本上由广泛水解蛋白组成,以减少食物变应性的发生。此外,蛋白可通过本领域已知的任何方法来水解。
[0088] 在仍其它实施方案中,所述蛋白源包含氨基酸。在再一个实施方案中,所述蛋白源可以用含谷氨酰胺-的肽补充。
[0089] 在一些实施方案中,本公开内容的营养组合物基本不含完整蛋白。在此背景下,术语“基本不含”是指本文优选的实施方案包含足够低浓度的完整蛋白,因此使配方低变应原性。本公开内容的营养组合物基本不含完整蛋白并因此是低变应原型的程度,通过2000年8月美国儿科学会的政策声明(Policy Statement of the American Academy of Pediatrics)来确定,在该声明中,低变应原性配方被定义为在合适的临床研究中,当在前瞻性的随机、双盲、安慰剂对照试验中给予时,以95%可信度证明在90%经证实对牛乳过敏的婴儿或儿童中不引起反应的配方。
[0090] 在一些实施方案中所述营养组合物可以是不含蛋白的并且包含游离氨基酸作为蛋白等同源。在一些实施方案中,所述氨基酸可包括但不限于,组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、肉毒、牛磺酸及其混合物。在一些实施方案中,所述氨基酸可以是支链氨基酸。在某些其它实施方案中,可以包括小氨基酸肽作为营养组合物的蛋白组分。这样的小氨基酸肽可以是天然存在的或合成的。营养组合物中的游离氨基酸的量可以在约1g/100 kcal-约5 g/100 kcal变化。
[0091] 所述营养组合物也可包含脂肪源。用于本公开内容的营养组合物的合适的脂肪或脂质源可以是本领域已知或使用的任一种,其包括但不限于动物源,例如乳脂(milk fat)、黄油、黄油脂(butter fat)、蛋黄脂质;海产源,例如鱼油、海产油、单细胞油;蔬菜和植物油,例如玉米油、低芥酸菜子油、葵花油、大豆油棕榈油精油、椰子油、高油酸葵花油、月见草油菜籽油橄榄油、亚麻子(亚麻籽)油、籽油、高油酸红花油、棕榈硬脂、棕榈仁油、小麦胚芽油;中链甘油三酯油和乳液和脂肪酸的酯;及其任何组合。
[0092] 本公开内容的营养组合物也可含有长链多不饱和脂肪酸(“LCPUFAs”)源。合适的LCPUFAs包括但不限于DHA、二十碳五烯酸(“EPA”)、花生四烯酸(“ARA”)、n-6途径中的亚油酸(18:2 n-6)、γ-亚麻油酸(18:3 n-6)、二同型-γ-亚麻油酸(dihomo-γ-linolenic acid)(20:3 n-6),α-亚麻油酸(18:3 n-3)、十八碳四烯酸(18:4 n-3)、二十碳四烯酸(20:4 n-3)、二十碳五烯酸(20:5 n-3)、和二十二碳五烯酸(22:6 n-3)及其组合。的确,认为在神经学组分和DHA组合中可以有阳性协同效应。
[0093] LCPUFA在营养组合物中的量,在一些实施方案中,为约5 mg/100 kcal-约100 mg/100 kcal。在仍其它实施方案中,LCPUFA在营养组合物中的量为约10 mg/100 kcal-约50 mg/100 kcal。
[0094] LCPUFAs源包括乳制品例如蛋和乳脂;海产油,例如鳕鱼、鲱鱼、沙丁鱼、金枪鱼和许多其它鱼;某些动物油脂,猪油、牛油和微生物油例如真菌和藻类的油,或来自从中可得到LCPUFAs并用于营养组合物的经强化或未经强化的任何其它源。LCPUFA可以是通过本领域已知的分离技术而获得的复杂混合物的一部分,所述分离技术旨在在这类混合物中富集LCPUFAs和LCPUFAs衍生物或前体。
[0095] 在营养组合物中可以以以下形式提供LCPUFAs:游离脂肪酸的酯;甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯;磷酸甘油酯,包括卵磷脂;和/或其混合物。另外,在营养组合物中可以以下形式提供LCPUFA:磷脂,尤其是磷脂酰胆碱。
[0096] 在一个实施方案中,尤其是当营养组合物是婴儿配方时,所述营养组合物中补充有DHA和ARA二者。在该实施方案中,ARA:DHA的重量比可以是约1:3-约9:1。在具体的实施方案中,ARA:DHA的重量比是约1:2-约4:1。
[0097] DHA存在于营养组合物中,在某些实施方案中,量为约5 mg/100 kcal-约75 mg/100 kcal。在某些实施方案中,DHA的存在量为约10 mg/100 kcal-约50 mg/100 kcal。在再一些实施方案中,DHA的存在量为约15 mg/100 kcal-约30 mg/100 kcal。
[0098] 所述营养组合物可以使用本领域已知的标准技术用含有DHA和/或ARA的油来补充。例如,DHA和ARA可以添加到所述组合物中,即通过替代组合物中正常存在的相等量的油,例如高油酸葵花油。作为另一实例,含有DHA和ARA的油可添加到所述组合物中,即通过替代相等量的无DHA和ARA的组合物中正常存在的总体脂肪混合物的其余部分。
[0099] 如果使用,DHA和/或ARA源可以是本领域已知的任何源,例如海洋油、鱼油、单细胞油、蛋黄脂质和脑脂质。在一些实施方案中,DHA和ARA源自单细胞Martek油、DHASCO®和ARASCO®,或其变体。DHA和ARA可以呈天然形式,只要LCPUFA源的剩余物不导致对婴儿的任何实质性的有害作用。或者,DHA和ARA可以以精制形式使用。
[0100] 在一个实施方案中,DHA和ARA源是单细胞油,如以下文献所教导的:美国专利号5,374,567;5,550,156;和5,397,591,其公开内容通过引用全部结合到本文中。然而,本公开内容不限于这样的油。
[0101] 此外,营养组合物的一些实施方案可以模拟人母乳的某些特性。然而,为了满足一些受试者的特定营养需求,营养组合物可包含高于人乳的量的一些营养组分。例如,所述营养组合物可包含高于人母乳的量的DHA。营养组合物的增高水平的DHA可补偿现有的营养DHA的缺乏。
[0102] 在一些实施方案中所述营养组合物包含唾液酸。唾液酸是9碳糖的超过50个成员的家族,所有所述9碳糖都是神经氨酸的衍生物。存在于人体中的主要的唾液酸家族来自N-乙酰基神经氨酸亚家族。唾液酸在乳中存在,例如牛乳和山羊乳。在哺乳动物中,与其它体细胞膜相比,神经细胞膜具有最高浓度的唾液酸。唾液酸残基也是神经节苷脂的组分。
[0103] 如果包括在营养组合物中,唾液酸的存在量可为约0.5 mg/100 kcals-约45 mg/100 kcal。在一些实施方案中唾液酸的存在量可为约5 mg/100 kcals-约30 mg/100 kcals。在仍其它实施方案中,唾液酸的存在量可为约10 mg/100 kcals-约25 mg/100 kcals。
[0104] 在某些实施方案中,所述营养组合物也可含有一种或多种益生元(也称为益生元源)。益生元可以刺激摄食的益生菌微生物的生长和/或活性,选择性地减少肠道中存在的病原体,并有利地影响肠道短链脂肪酸概况。这样的益生元可以是天然存在的、合成的、或通过生物体和/或植物的遗传操作而开发的,无论这样的新源是目前已知的还是以后开发的。可用于本公开内容的益生元可包括低聚糖、多糖和含有果糖、木糖、大豆、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的其它益生元。
[0105] 更具体地讲,可用于本公开内容的益生元可包括聚葡萄糖、聚葡萄糖粉、乳果糖、乳果寡糖(lactosucrose)、棉子糖、寡聚葡萄糖、菊糖、寡聚果糖、寡聚异麦芽糖、大豆寡糖、乳果寡糖、寡聚木糖、寡聚壳糖、寡聚甘露糖、寡聚阿拉伯糖(aribino-oligosaccharide)、唾液酸寡糖、寡聚岩藻糖(fuco-oligosaccharide)、寡聚半乳糖和龙胆 寡糖(gentio-oligosaccharide)。在一些实施方案中,益生元在营养组合物中存在的总量可以为约0.1 g/100 kcal-约1 g/100 kcal。在某些实施方案中,益生元在营养组合物中存在的总量可以为约0.3 g/100 kcal-约0.7 g/100 kcal。此外,营养组合物可包含含有聚葡萄糖(“PDX”)和/或寡聚半乳糖(“GOS”)的益生元组分。在某些实施方案中,所述益生元组分包含至少20% GOS、PDX或其混合物。
[0106] 如果PDX用于益生元组合物,PDX在营养组合物中的量,在一个实施方案中,范围可为约0.1 g/100 kcal-约1 g/100 kcal。在另一个实施方案中,聚葡萄糖的量范围为约0.2 g/100 kcal-约0.6 g/100 kcal。和在仍其它实施方案中,PDX在营养组合物中的量可以为约0.1 mg/100 kcal-约0.5 mg/100 kcal或约0.3 mg/100 kcal。不受任何特定理论束缚,认为PDX与本公开内容的神经学组分组合,尤其是当其含有ALA时,可以协同增强脑发育和/或神经发生。
[0107] 如果GOS用于益生元组合物,GOS在营养组合物中的量,在一个实施方案中,可以是约0.1 g/100 kcal-约1 g/100 kcal。在另一个实施方案中,GOS在营养组合物中的量可以是约0.2 g/100 kcal至约0.5 g/100 kcal。在其它实施方案中,GOS在营养组合物中的量可以是约0.1 mg/100 kcal-约1.0 mg/100 kcal或约0.1 mg/100 kcal-约0.5 mg/100 kcal。
[0108] 在营养组合物的具体的实施方案中,PDX与GOS组合给予。在此实施方案中,PDX和GOS可以以PDX:GOS的比例为约9:1-1:9给予。在另一个实施方案中,PDX:GOS的比例可以是约5:1-1:5。在再一个实施方案中,PDX:GOS的比例可以是约1:3-3:1。在具体的实施方案中,PDX与GOS的比例可以是约5:5。在另一个具体的实施方案中,PDX与GOS的比例可以是约8:2。
[0109] 在具体的实施方案中,将GOS和PDX补充到营养组合物中,其总量为至少约0.2 mg/100 kcal或约0.2 mg/100 kcal-约1.5 mg/100 kcal。在某些实施方案中,所述营养组合物可包含GOS和PDX,其总量为约0.6-约0.8 mg/100 kcal。
[0110] 在一个实施方案中,所述营养组合物可含有一种或多种益生菌。本领域已知的任何益生菌都可以是在本实施方案中可接受的。在具体的实施方案中,所述益生菌可以选自以下任一种:乳杆菌种类,鼠李糖乳杆菌GG (ATCC号53103);双歧杆菌种类,长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) BB536 (BL999, ATCC: BAA-999)、长双歧杆菌AH1206 (NCIMB: 41382)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve) AH1205 (NCIMB: 41387)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis) 35624 (NCIMB: 41003)、和动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) BB-12 (DSM No. 10140)或其任何组合。
[0111] 如果包括在组合物中,益生菌的量可以从约1 x 104-约1.5 x 1010 cfu益生菌6 9
/100 kcal变化。在一些实施方案中益生菌的量可以是从约1 x 10-约1 x 10 cfu益生
7
菌/100 kcal。在某些其它实施方案中,益生菌的量可以从约1 x 10 cfu/100 kcal-约1
8
x 10 cfu益生菌/100 kcal变化。
[0112] 在一个实施方案中,所述益生菌可以是有活力的或无活力的。本文使用的术语“有活力的”意指有生命的微生物。术语“无活力的”或“无活力的益生菌”意指无生命的益生菌微生物、它们的细胞组分和/或其代谢产物。所述无活力的益生菌可为已经加热灭活或其它方式灭活,但其保留有利地影响宿主健康的能力。在本公开内容中有用的益生菌可以是天然存在的、合成的或通过生物体的基因操作而开发的,无论这样的源是目前已知的还是日后开发的。
[0113] 在某些实施方案中,所述营养组合物可包括含有益生菌细胞等同物的源。当包括4 10
在营养组合物中时,益生菌细胞等同物的量可以从约1 x 10-约1.5 x 10 益生菌细胞等
6
同物/100 kcal变化。在一些实施方案中益生菌细胞等同物的量可以是从约1 x 10-约1
9
x 10益生菌细胞等同物/100 kcal营养组合物。在某些其它实施方案中,益生菌细胞等同
7 8
物的量可以从约1 x 10-约1 x 10益生菌细胞等同物/100 kcal营养组合物变化。
[0114] 在某些实施方案中,并入营养组合物的益生菌源可包含有活力的菌落形成单位,和无活力的细胞等同物。
[0115] 在某些实施方案中,所述营养组合物包括来自益生菌分批培养过程的指数生长期晚期的培养上清液。不受理论束缚,认为培养上清液的活性可以归因于组分的混合物(包括蛋白样物质,和可能包括(外泌)多糖物质),其如发现在益生菌分批培养的指数期(或“对数期”)晚期释放到培养基中。本文使用的术语“培养上清液”包括培养基中存在的组分的混合物。细菌分批培养的识别阶段是技术人员已知的。这些是“延迟期”、“对数期”(“对数期”或“指数期”)、“稳定期”和“死亡期”(或“对数下降期”)。活细菌在期间存在的所有时期中,细菌代谢来自培养基的营养物,并向培养基中分泌(施加、释放)物质。在生长期的指定时间点的分泌物的组成通常是不可预期的。
[0116] 在一个实施方案中,通过包括以下步骤的工艺可得到培养上清液:(a) 使用分批过程,在合适培养基中培养益生菌例如LGG;(b) 在培养步骤的指数生长期晚期收获培养上清液,该时期是参考分批培养过程的延迟期和稳定期之间的时间的后半段而定义;(c) 任选地自上清液中去除低分子量成分,从而保留超过5-6千道尔顿(kDa)的分子量成分;(d) 自培养上清液中去除液体含量,从而得到组合物。
[0117] 培养上清液可包含自指数期晚期收获的分泌物。指数期晚期发生在指数期中期之后的时间内(其是指数期持续时间的一半时间,因此当提到指数期晚期时是指延迟期和稳定期之间的后半段时间)。具体地讲,本文使用的术语“指数期晚期”是指LGG分批培养过程的延迟期和稳定期之间的后四分之一的时间。在某些实施方案中,在指数期持续时间的5
75%-85%的时间点收获培养上清液,并且可以在指数期经过的时间的约 /6时进行收获。
[0118] 注意,所公开的营养组合物可包含ß-葡聚糖源。葡聚糖是多糖,尤其是葡萄糖的聚合物,其可为天然存在的且可存在于细菌、真菌、酵母和植物的细胞壁中。β葡聚糖(β-葡聚糖)本身为葡萄糖聚合物的不同亚类,所述葡萄糖聚合物由葡萄糖单体链组成,其通过β型糖苷键连接在一起以形成复合碳水化合物(complex carbohydrates)。
[0119] β-1,3-葡聚糖是从例如酵母、蕈类、细菌、藻类或谷类中纯化得到的碳水化合物聚合物。β-1,3-葡聚糖的化学结构取决于β-1,3-葡聚糖的源。此外,各种生理化学参数,例如溶解度、一级结构、分子量和分支,在β-1,3-葡聚糖的生物活性中发挥作用。(Yadomae T., 真菌β-1,3-葡聚糖的结构和生物活性 (Structure and biological activities of fungal beta-1,3-Glucans). Yakugaku Zasshi. 2000;120:413-431.)β-1,3-葡聚糖为天然存在的具有或不具有各种植物、酵母、真菌和细菌细胞壁中存在的β-1,6-葡萄糖侧链的多糖。β-1,3;1,6-葡聚糖为包含具有在(1,6)位连接的侧链的以(1,3)连接的葡萄糖单元的那些。β-1,3;1,6葡聚糖为共享结构共性的葡萄糖聚合物的异质组,包括由β-1,3键连接的直链葡萄糖单元主链,和自该主链延伸出的β-1,6连接的葡萄糖分支。虽然这是现在描述的β-葡聚糖类型的基本结构,但可存在一些变更。例如,某些酵母β-葡聚糖具有延伸自β(1,6)分支的β(1,3)分支额外区域,其进一步增加其相应的结构的复杂性。
[0120] 衍生自面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的β-葡聚糖由连接在1和3位的D-葡萄糖分子链组成,其具有连接在1和6位的葡萄糖侧链。酵母-衍生的β-葡聚糖为不溶的、纤维样复合糖,其具有以下通用结构:具有β-1,3主链的直链葡萄糖单元,其散布有长度通常为6-8个葡萄糖单元的β-1,6侧链。更特别地,衍生自面包酵母的β-葡聚糖为聚-(1,6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1,3)-β-D-吡喃葡萄糖。
[0121] 此外,β-葡聚糖在小儿受试者中耐受良好且不产生或导致过量气体、腹胀、胃气胀或腹泻。将β-葡聚糖加入用于小儿受试者的营养组合物,例如婴儿配方、成长乳或另一儿童营养产品,会通过增加抗入侵病原体的抵抗力改善受试者的免疫应答并因此维持或改善总体健康。
[0122] 在某些实施方案中,β-葡聚糖在营养组合物中的量为约3 mg/100 kcal-约17 mg/100 kcal。在另一实施方案中,β-葡聚糖的量为约6 mg/100 kcal-约17 mg/100 kcal。
[0123] 在一些实施方案中所述营养组合物可包含β-1,3;1,6-葡聚糖。β-1,3;1,6-葡聚糖可衍生自面包酵母。营养组合物可包含完整葡聚糖颗粒β-葡聚糖、颗粒状β-葡聚糖、PGG-葡聚糖(聚-(1,6)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1,3)-β-D-吡喃葡萄糖)或其任何混合物。
[0124] 本文所述的公开的营养组合物,在一些实施方案中也可包含有效量的铁。铁可包括包封的铁形式,例如包封的富马酸亚铁或包封的硫酸亚铁或较低反应性的铁形式,例如焦磷酸铁或正磷酸铁。
[0125] 所公开的营养组合物可以以本领域已知的任何形式来提供,例如粉剂、凝胶剂、混悬剂、糊剂、固体、液体、液体浓缩物、可重构的粉状乳替代物或即用型产品。营养组合物,在某些实施方案中,可包含营养补充剂、儿童营养产品、婴儿配方、人乳强化剂、成长乳或针对婴儿或小儿受试者设计的任何其它营养组合物。本公开内容的营养组合物包括例如,口服可摄取的、健康促进物质,其包括例如食品、饮料、片剂、胶囊剂和粉剂。此外,本公开内容的营养组合物可针对具体卡路里含量进行标准化,其可作为即用型产品提供,或其可以浓缩的形式提供。在一些实施方案中,营养组合物呈粉末形式,其粒径范围为5 μm-1500 μm、更优选范围为10 μm-300 μm。
[0126] 如果营养组合物呈即用型产品形式,营养组合物的渗透度可以是约100-约1100 mOsm/kg水,更典型地约200-约700 mOsm/kg水。
[0127] 在某些实施方案中,所述营养组合物是低变应原的。在其它实施方案中,所述营养组合物是犹太教允许的和/或伊斯兰律法合法的。在再进一步的实施方案中,所述营养组合物含有非遗传修饰的成分。在一个实施方案中,所述营养配方是无蔗糖的。所述营养组合物也可以是无乳糖的。在其它实施方案中,所述营养组合物不含任何中链甘油三酯油。在一些实施方案中,组合物中不存在叉菜胶。在其它实施方案中,所述营养组合物不含所有树胶。
[0128] 本公开内容的营养组合物不限于包含本文具体列出的营养物的组合物。任何营养物都可以作为组合物的一部分而递送,用于满足受试者的营养需要和/或为了优化受试者的营养状况的目的。
[0129] 此外,在某些实施方案中,所述营养组合物是营养完全的,其含有作为受试者的唯一营养源的合适种类和含量的脂质、碳水化合物、蛋白、维生素和矿物质。的确,所述营养组合物可以任选地包括任何数量的蛋白、肽、氨基酸、脂肪酸、益生菌和/或它们的代谢副产物、益生元、碳水化合物和可为受试者提供许多营养益处和生理益处的任何其它营养物或其它化合物。此外,本公开内容的营养组合物可包含调味剂、增味剂、甜味剂、色素、维生素、矿物质、治疗用成分、功能食品成分、食品成分、加工成分或其组合。
[0130] 本公开内容的营养组合物可针对具体卡路里含量进行标准化,其可作为即用型产品提供,或其可以浓缩的形式提供。
[0131] 在某些实施方案中,本公开内容的营养组合物是成长乳。成长乳是基于强化乳的饮料,其意图用于超过1岁的儿童(一般为1-3岁、4-6岁或1-6岁)。它们不是医用食物并且不意图作为膳食替代或用以解决具体营养缺乏的补充剂。相反,意图用作不同饮食的补充剂,将成长乳设计为提供额外的保障,其使得儿童实现对所有必需维生素和矿物质、大量营养物加上额外功能性饮食组分(例如具有声称的健康-促进性质的非必需营养物)的连续的每日摄入。
[0132] 本公开内容的营养组合物的准确组成可以因不同市场而变,取决于地方法规和目标人群的饮食摄入信息。在某些实施方案中,本公开内容的营养组合物由以下组成:乳蛋白源,例如全乳或脱脂乳,加上用以达到所期需的感官性质而添加的糖和甜味剂,和添加的维生素和矿物质。脂肪组成通常源自乳原料。可将总蛋白的指标定为匹配人乳、牛乳或较低值。通常将总碳水化合物的指标定为提供尽可能少的添加的糖,例如蔗糖或果糖,以达到可接受的口味。典型地,以匹配地区牛乳的营养贡献的水平添加维生素A、钙和维生素D。另外,在某些实施方案中,可以提供约20%的饮食参考摄取(DRI)或20%的每日值(DV)/份的水平添加维生素和矿物质。此外,营养价值可以因市场不同而变化,取决于预期人群的经鉴定的营养需求、原料的贡献和地区法规。
[0133] 一种或多种维生素和/或矿物质也可以足以供应受试者的每日营养需求的量加入营养组合物中。本领域普通技术人员应理解,维生素和矿物质需求会例如根据儿童年龄而变化。例如,婴儿可以具有与1-13岁儿童不同的维生素和矿物质需求。因此,实施方案无意将营养组合物限制于特定的年龄组,而是提供了可接受的维生素和矿物质组分的范围。
[0134] 在为儿童提供营养组合物的实施方案中,所述组合物可以任选地包括但不限于,下列维生素或其衍生物的一种或多种:维生素B1 (硫胺素、焦磷酸硫胺素、TPP、三磷酸硫胺素、TTP、盐酸硫胺素、一硝酸硫胺素)、维生素B2 (核黄素、黄素单核苷酸、FMN、黄素腺嘌呤二核苷酸、FAD、乳黄素、卵黄素)、维生素B3 (尼克酸、烟酸、烟酰胺、尼克酰胺、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、NAD、烟酸单核苷酸、NicMN、吡啶-3-甲酸)、维生素B3-前体色氨酸、维生素B6 (吡哆醇、吡哆、吡哆胺、盐酸吡哆醇)、泛酸(泛酸盐、泛醇)、叶酸盐(叶酸、叶酸(folacin)、蝶酰谷氨酸)、维生素B12 (钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素、氰钴胺、羟钴胺素、腺苷钴胺素)、生物素、维生素C (抗坏血酸)、维生素A (视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、具有与其它长链脂肪酸形成的视黄酯、视黄醛、视黄酸、视黄醇酯)、维生素D (钙化醇、胆钙化醇、维生素D3、1,25,-二羟维生素D)、维生素E (α-生育酚、α-生育酚乙酸酯、α-生育酚琥珀酸酯、α-生育酚烟酸酯、γ-生育酚)、维生素K (维生素K1、叶绿醌、醌、维生素K2、甲基萘醌-7、维生素K3、甲基萘醌-4、甲萘醌、甲基萘醌-8、甲基萘醌-8H、甲基萘醌-9、甲基萘醌-9H、甲基萘醌-10、甲基萘醌-11、甲基萘醌-12、甲基萘醌-13)、胆碱、肌醇、β-胡萝卜素及其任何组合。
[0135] 在提供儿童营养产品例如成长乳的实施方案中,所述组合物可以任选地包括但不限于,下列矿物质或其衍生物的一种或几种:、钙、醋酸钙、葡萄糖酸钙、氯化钙、乳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、氯化物、铬、氯化铬、吡啶甲酸铬(chromium picolonate)、、硫酸铜(copper sulfate)、葡萄糖酸铜、硫酸铜(cupric sulfate)、氟化物、铁、羰基铁、三价铁、富马酸亚铁、正磷酸铁、铁研制剂(iron trituration)、多糖铁、碘化物、碘、镁、碳酸镁、氢氧化镁、氧化镁、硬脂酸镁、硫酸镁、锰、钼、磷、钾、磷酸钾、碘化钾、氯化钾、醋酸钾、硒、硫、钠、多库酯钠、氯化钠、硒酸钠、钼酸钠、锌、氧化锌、硫酸锌及其混合物。矿物质化合物的非限制性示例性衍生物包括任何矿物质化合物的盐、碱性盐、酯和螯合物
[0136] 矿物质可以以盐例如磷酸钙、甘油磷酸钙、柠檬酸钠、氯化钾、磷酸钾、磷酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁和亚硒酸钠的形式添加至成长乳或其它儿童营养组合物中。可添加本领域已知的额外的维生素和矿物质。
[0137] 在一个实施方案中,儿童营养组合物每份可包含任何给定的国家的最大饮食推荐量的约10-约50%或一组国家的平均饮食推荐量的约10-约50%的维生素A、C和E、锌、铁、碘、硒和胆碱。在另一个实施方案中,儿童营养组合物每份可供给任何给定的国家的最大饮食推荐量的约10-30%或一组国家的平均饮食推荐量的约10-30%的维生素B。在再一个实施方案中,儿童营养产品中的维生素D、钙、镁、磷和钾的水平可与乳中存在的平均水平一致。在其它实施方案中,儿童营养组合物中的其它营养物可以以任何给定国家的最大饮食推荐量的约20%或一组国家的平均饮食推荐量的约20%每份存在。
[0138] 营养组合物可以任选地包括下列调味剂中的一种或多种,其包括但不限于:调味提取物、挥发油类、可可或巧克力调味剂、花生酱调味剂、饼干屑、香草或任何可市售获得的调味剂。有用的调味剂的实例包括,但不限于,纯茴香提取物、仿香蕉提取物、仿樱桃提取物、巧克力提取物、纯柠檬提取物、纯橙子提取物、纯薄荷提取物、蜂蜜、仿菠萝提取物、仿朗姆酒(imitation rum)提取物、仿草莓提取物、葡萄或葡萄籽提取物、苹果提取物、覆盆子提取物或香草提取物;或挥发油类,例如蜂蜜花油、月桂油、香柠檬油、柏木油、樱桃油、肉桂油、丁香油或薄荷油;花生酱、巧克力调味剂、香草饼干屑、奶油硬糖、太妃糖,及其混合物。调味剂的量可变化很大,这取决于使用的调味剂。可依照本领域已知选择调味剂的类型和量。
[0139] 营养组合物可以任选地包括一种或多种可添加用于稳定最终产品的乳化剂。合适的乳化剂的实例包括但不限于,卵磷脂(例如来自鸡蛋或大豆或任何其它植物和动物源)、α乳清蛋白和/或甘油单酯和甘油二酯,及其混合物。其它乳化剂对于技术人员是容易地显而易见的,合适乳化剂的选择将部分取决于配方和终产品。
[0140] 所述营养组合物可以任选地包含一种或多种也可添加以延长产品货架期防腐剂。合适的防腐剂包括但不限于,山梨酸钾、山梨酸钠、苯甲酸钾、苯甲酸钠、EDTA钙二钠,及其混合物。
[0141] 营养组合物可以任选地包含一种或多种稳定剂。用于实施本公开内容的营养组合物的合适的稳定剂包括但不限于,阿拉伯树胶、茄替胶、刺梧桐胶、西黄蓍胶、琼脂、帚叉藻聚糖、瓜尔豆胶、结冷胶、槐豆胶、果胶、低甲氧基果胶、明胶、微晶纤维素、CMC (羧甲基纤维素钠)、甲基纤维素羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、DATEM (甘油单酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯)、葡聚糖、角叉菜胶、CITREM (脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯的柠檬酸酯)及其混合物。
[0142] 本公开内容进一步提供通过向目标受试者提供包含本文所述的神经学组分的营养组合物促进脑和神经系统健康的方法。不受任何具体理论束缚,认为提供包含神经学组分的营养组合物会支持神经发生和/或神经元健康和发育。
[0143] 在一些实施方案中,所述目标受试者可以是小儿受试者。此外,在一个实施方案中,向小儿受试者提供的营养组合物可以是婴儿配方。加入婴儿配方的神经学组分可以选自特定源并且其浓度可经调节以使得健康益处最大化。在该方法的另一实施方案中,向小儿受试者提供的包含神经学组分的营养组合物是成长乳。
[0144] 在另一实施方案中可向目标受试者提供营养组合物,所述受试者已患有、目前患有、或可能在未来患有脑和/或神经系统损伤。在再一个实施方案中,可向任何目标受试者提供包含神经学组分的营养组合物以促进神经保护作用。在仍其它实施方案中,所述方法涉及通过向孕妇或哺乳期母亲提供包含神经学组分的营养组合物促进神经发生。另外,包含本文所述的神经学组分的营养组合物可向目标受试者提供神经学营养的补充源。
[0145] 本公开内容进一步提供促进神经元健康和/或发育,以及本文列举的其它益处的方法,其包括给予受试者有效量的本公开内容的营养组合物。在某些实施方案中,所述营养组合物可以被直接排入(expelled)受试者的肠道(intestinal tract)和/或直接排入肠内(gut)。在某些实施方案中,所述组合物可以被配制为在肠内消耗或肠内给予。
[0146] 本公开内容的方法涉及提供本文所述的营养组合物,向其目标受试者递送增强的神经学营养和健康益处。对于具体神经学疾病或对于具体目标受试者提供本文所述的营养组合物的方法的公开内容并不是限制性的,相反,它们进一步用作其中给予本文所述的营养组合物可以是合适的的实施例。实施例
[0147] 提供实施例以说明本文所述的营养组合物的神经学组分中包含的营养物的神经发生。简而言之,通过本文所述程序在人脂肪衍生的干细胞(“hADSCs”)中测试了ALA的神经发生能力。这些实施例不应解释为对本文所公开的营养组合物的任何限制,而是用来说明神经学组分的神经发生。预期说明书连同实施例,被认为是仅仅示例性的,具有实施例之后的权利要求书指出的本公开内容的范围和精神。Kuang等人提交的美国专利申请顺序号13/408,485和Kuang等人提交的美国专利申请顺序号13/408,490(其各自在2012年2月29日提交)的程序,可以适于本公开内容的实施,并且通过引用结合到本文中。
[0148] 实施例1本实施例描述了,与DHA和阴性对照相比,由ALA所致的hADSCs的神经发生。
[0149] ALA购自Sigma-Aldrich ®, St. Louis, Missouri (Cat. #TI395-1G)。ALA在100%乙醇中稀释至250 mg/mL和贮存于-80° C。
[0150] hADSCs购 自Invitrogen(也 称 为 Life Technologies, of Carlsbad, CA, U.S.A.),并且在100mm培养板中,维持培养基内培养为几乎汇集单层,所述培养基由得自Invitrogen®的具有生长补充剂和L-谷氨酰胺的Complete MesenPro RS培养基组成。培养、传代和接种hADSCs的过程如下所述。
[0151] 当细胞培养达到汇集时,进行hADSCs的亚培养。为了传代hADSCs,使用以下程序:i) 自细胞中吸出Complete MesenPRO RS培养基;ii) 用Dulbecco氏磷酸缓冲盐水(DBPS)缓冲液清洗细胞层表面区域,即通过将DPBS加入贴壁细胞层相对的容器一侧并前后摇动容器若干次;iii) 通过抽吸去除DPBS并弃去;iv) 通过加入足以覆盖细胞层的体积的预热的无酚红的胰蛋白酶-EDTA溶液,而使细胞分离;v) 在37℃孵育约7分钟;vi) 在显微镜下观察细胞,以确定是否需要额外孵育;vii) 加入3mL维持培养基到平板中,混合细胞悬液,将悬液加入15mL离心管中并在210g 离心5分钟;viii) 用血球计数器测定细胞总数和%活力;ix) 向各容器加入Complete MesenPRO RS培养基,使得最终培养体2
积为0.2mL-0.5mL/cm;x) 通过向各容器加入合适体积的细胞而接种细胞并在37℃.,5% CO2和90%湿度中孵育;和xi) 接种后3或4天,完全去除培养基并用等体积的Complete MesenPRO RS培养基替换。
[0152] 在新鲜培养板上接种传代的hADSCs之前,培养器皿的表面用无菌DPBS溶液洗涤3次,接着用无菌水多次清洗。第一层包被是多聚-L-氨酸。通过加入约15至约20 μg/mL多聚-L-鸟氨酸并在37℃孵育1小时制备包被。培养板用DPBS洗涤3次,每次洗涤15分钟。第二层包被是牛血浆纤连蛋白。纤连蛋白原液在DPBS中1:1000稀释并将500 µL加入各孔。培养板在室温下放置1小时。用500 µL/孔的DPBS进行最后一次洗涤并立即使用培养板。
[0153] 然后将移出细胞和以2x104细胞/ml (1x104细胞/孔)的密度再次接种到24孔培养板上,所述培养板中含有多聚-L-鸟氨酸和牛血浆纤连蛋白包被。
[0154] 接种和引发后3天;将培养基替换为神经元分化培养基。从温箱中移出培养板并且所有程序都在层流净化罩(laminar flow hood)中进行。从各孔完全去除培养基。hADSCs然后用无菌DPBS溶液以1 ml/孔的量洗涤,以去除过量的培养基。去除DPBS溶液并替换为神经元分化培养基。配制神经元分化培养基,使得神经发生将归因于营养物而非培养基。TM
使用的神经元分化培养基是Neurobasal 培养基,得自Invitrogen®,其包含下表1中列举的成分。
[0155] 表1: NeurobasalTM培养基组分 分子量 浓度(mg/L) mM
氨基酸
甘氨酸 75 30 0.4
L-丙氨酸 89 2 0.0225
L-精氨酸盐酸盐 211 84 0.398
L-天冬酰胺-H2O 150 0.83 0.00553
L-半胱氨酸 121 31.5 0.26
L-组氨酸盐酸盐-H2O 210 42 0.2
L-异亮氨酸 131 105 0.802
L-亮氨酸 131 105 0.802
L-赖氨酸盐酸盐 183 146 0.798
L-甲硫氨酸 149 30 0.201
L-苯丙氨酸 165 66 0.4
L-脯氨酸 115 7.76 0.0675
L-丝氨酸 105 42 0.4
L-苏氨酸 119 95 0.798
L-色氨酸 204 16 0.0784
L-酪氨酸 181 72 0.398
L-缬氨酸 117 94 0.803
维生素
氯化胆碱 140 4 0.0286
D-泛酸钙 477 4 0.00839
叶酸 441 4 0.00907
烟酰胺 122 4 0.0328
吡哆醇盐酸盐 204 4 0.0196
核黄素 376 0.4 0.00106
硫胺素盐酸盐 337 4 0.0119
维生素B12 1355 0.0068 0.000005
i-肌醇 180 7.2 0.04
无机盐
氯化钙(CaCl2) (无水的) 111 200 1.8
硝酸铁(Fe(NO3)3"9H2O) 404 0.1 0.000248
氯化镁(无水) 95 77.3 0.814
氯化钾(KCl) 75 400 5.33
碳酸氢钠(NaHCO3) 84 2200 26.19
氯化钠(NaCl) 58 3000 51.72
磷酸二氢钠(NaH2PO4-H2O) 138 125 0.906
硫酸锌(ZnSO4-7H2O) 288 0.194 0.000674
其它组分
D-葡萄糖(右旋糖) 180 4500 25
HEPES 238 2600 10.92
酮酸钠 110 25 0.227
以不同浓度将ALA加入各孔的无血清培养基中。预热的无血清培养基含有具有L-谷氨酰胺、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF和N2 补充剂的神经基础培养基。见下表2。
[0156] 表2. N2补充剂。组分 分子量 浓度(mg/L) mM
蛋白
人转铁蛋白(Holo) 10000 10000 1
胰岛素重组全链 5807.7 500 0.0861
其它组分
黄体酮 314.47 0.63 0.002
腐胺 161 1611 10.01
亚硒酸盐 173 0.52 0.00301
[0157] 在5 µg/ml浓度测试ALA的处理。在3小时和24小时时在相差显微镜下单独测试ALA并与阳性对照(20 µM DHA)和阴性对照(无处理)相比较。一式三份重复实验。
[0158] 在采集图像后,进行数据分析和比较,以测定ALA在促进神经发生中的有效性。通过神经元形态学测定神经元分化。这些变化中的一些包括细胞质收缩,以及轴突和树突样细胞质突出的形成(神经突)。这些变化开始于hADSCs细胞质向核收缩,形成收缩的细胞体和细胞质延生。细胞最终发展出与双极、三极和多极神经元细胞类似的形态学。见图1A和1B。
[0159] 通常,如果hADSCs显示出神经元形态学,此结果归因于所添加的神经学组分(在本实施例中是ALA)的神经发生能力。例如,在无处理的对照孔中的hADSCs维持其推定的形态学,在培养表面上大的、平的和铺开的细胞,这表明无明显的神经发生。见图2A。
[0160] 明显地,在加入5 µg/ml ALA中显示出增强神经发生的强效应,如通过图2C中hADSCs所显示的神经元形态学示出。根据这些结果,确定了ALA可以用作天然存在的营养物,其具有神经发生作用。加入ALA,当与阴性对照相比时,也促进神经发生。如图2C所说明,浓度为5 µg/ml的ALA展示出神经发生,显示hADSCs的大量神经突突起,细胞质收缩和神经元分化。
[0161] 加入20µM DHA到hADSCs中作为阳性对照,当与阴性对照相比时,增强了hADSCs的神经元形态学。此外,在20µM DHA存在时,少量hADSCs从其推定形态学戏剧性地变为神经元细胞形态学,因为细胞质收缩和神经突开始从hADSCs中伸出。见图2B。
[0162] 此外,如从比较图2B(用DHA处理的细胞)与图2C(用ALA处理的细胞)可见,用ALA处理的hADSCs显示出明显的神经元的形态学方面的变化,表明ALA可以具有不同于DHA的神经发生模式。在神经突突起方面,当与DHA相比时,ALA显示出促进神经发生的强劲能力。此外,由ALA处理产生的神经突突起显示了神经突延伸,其与其它神经突延伸连接以形成神经元网络样结构。因此ALA强劲地促进神经发生。
[0163] 此外,与DHA相比,用ALA处理的孔显示出总体较少的细胞死亡,表明ALA强劲地促进神经发生,同时具有较低的细胞毒性。比较图2B与图2C。
[0164] 配制实施例表1提供了神经学组分的示例性实施方案,所述神经学组分可以掺入或加入到本文所述的营养组合物中。本实施例提供了每100kcal份的营养组合物中要包括的各成分的量。
[0165] 表1.示例性神经学组分的营养分布型表2提供了本公开内容的营养组合物的示例性实施方案和描述了每100kcal份中要包括的各成分的量。
[0166] 表2.示例性营养组合物的营养分布型本说明书中引用的所有参考文献,包括但不限于,所有文章、出版物、专利、专利申请、发言稿、课本、报告、手稿、小册子、书、因特网帖子、杂志、文章、期刊等,都通过引用全部结合到本说明书中。本文参考的讨论仅仅是意欲概述其作者作出的主张,而并非承认任何参考构成了现有技术。申请人保留挑战所引用的参考文献的准确度和有关性的权利。
[0167] 尽管本公开内容的实施方案已使用特定的术语、装置和方法来描述,但这样的描述仅用于说明性目的。使用的文字仅为描述性而非限制性文字。应理解的是本领域普通技术人员在不违背本公开内容的精神或范围的情况系可作出改变和变更,所述本公开内容的精神或范围在随后的权利要求书中进行阐述。此外,应理解的是,多个实施方案的方面可整体或部分互换。因此,所附权利要求书的精神和范围不应受限于其中所含形式的描述。
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