干酪的生产方法

                    技术领域

本发明涉及一种从酶处理的干酪用乳中生产干酪的方法，以及所制得 的干酪作为食物制品配料的用途。本发明还涉及稳定乳组合物中的脂肪的 方法。

                    发明背景

在干酪制品中，脂肪相的状态对干酪的性能是重要的。脂肪相对干酪 生产和成熟期间的稳定化是特别重要的，而且对最终的干酪也是重要的， 这些最终的干酪将被使用，就此食用或用于制备即食食品如比萨饼、吐司 或汉堡。

而且，干酪制品的渗油性(oiling-off properties)是重要的品质参数。渗 油在储藏和熔融时容易形成游离的油。过量的渗油是一种最常与其中使用 干酪的加热制品有关的缺陷，例如比萨饼及相关的食品(参见例如Kindstedt J.S；Rippe J.K.1990，J Dairy Sci.73：867873)。随着消费者关心膳食脂肪含 量的程度增加，控制/消除这个缺陷越来越重要。制品中游离的油/脂肪被认 为是高脂肪含量，并且通常是不期望的。

在其它食物制品中，脂肪相经常通过机械乳化来加以稳定化，例如通 过均质。该技术通常不适合于干酪生产，因为干酪用乳的均质会对干酪用 乳的凝结性以及所生产的干酪的产量和味道产生负面影响。

已知GB 1,525,929中公开了使用一酰基甘油磷脂制备稳定的水包油型 乳液，其中所说的一酰基甘油磷脂是通过对二酰基甘油磷脂进行磷脂酶A 处理而获得的。GB 1,525,929还描述了使用经磷脂酶A处理的含磷酸脂蛋 白的物料来制备水包油型乳液，即使用经磷脂酶处理的物料作为水包油型 乳液的乳化稳定剂，其中提及了调味汁、填料和蛋黄酱。但GB 1,525,929 中没有公开干酪。

所谓的卵磷脂酶活性，被公开作磷脂酶活性，在关于乳中的细菌污染物 以及这种乳在干酪生产中的用途有所报道：“J.J Owens，对来自乳污染物的 卵磷脂酶的观察(Observations on lecithinases from milk contaminants)，Process Biochemistry,第13卷第1号，1978，第10-18页”和“J.J Owens，乳中的卵 磷脂酶阳性菌(lecithinase Positive Bacteria in Milk)，Process Biochemistry，第 13卷，第13-15页，1978”。

US 4,861,610公开了一种制备干酪组合物即融化干酪的方法，用于掺 加到食料中，其中将一酰基甘油磷脂、脂肪、水和熔化的盐添加到干酪中。 该方法包括在添加脂肪之前进行加热处理以便使干酪溶解(将干酪与一酰 基甘油磷脂混合)。随后通过混合机将干酪-组合物乳化。US 4,861,610中没 有公开用磷脂酶处理乳和用经酶处理的乳制造干酪。

需要一种制造干酪的改进的方法，特别是改进干酪中的脂肪稳定性的 方法。

                    发明内容

本发明提供一种干酪的生产方法，该方法包括以下步骤：

a)用磷脂酶处理干酪用乳或干酪用乳的分提部分(a fraction of cheese milk)；和

b)由干酪用乳生产干酪。

其中步骤a)在步骤b)之前进行和/或同时进行。

本发明提供一种改进干酪性能的方法，具体说本发明改进了干酪和干 酪用乳的脂肪稳定性。本发明的发明者发现酶处理干酪用乳可以显著增强 了由所说磷脂酶处理的干酪用乳生产的干酪在热处理期间的稳定性。本发 明还提供了通过本发明的方法增加干酪产量的方法。

本发明还涉及磷脂酶在制造干酪制品中的用途，其中在干酪生产之前 和/或生产期间对干酪用乳或其分提部分进行磷脂酶处理。本发明还涉及可 通过本发明所述任何方法可获得的干酪，特别是通过本发明所述任何方法 获得的干酪。

                    具体实施方式

本发明提供一种生产干酪的方法，该方法包括以下步骤：

a)用磷脂酶处理干酪用乳或干酪用乳的分提部分；和

b)由干酪用乳生产干酪。

其中步骤a)在步骤b)之前进行和/或与步骤b)同时进行。

因此，本发明方法的步骤a)和b)可以同时进行，即在乳凝结剂形成凝 块的或多或少的相同时间让磷脂酶在干酪用乳中反应。

干酪用乳和干酪的生产：

本文中，术语“干酪”可以是任何类型的干酪并且包括例如天然干酪、 干酪类似物和融化干酪。干酪可以通过本领域已知的任何适宜的方法来获 得，例如通过用凝乳酶对干酪用乳进行酶凝结或者通过用食用级酸或乳酸 细菌生长时产生的酸对干酪用乳进行酸凝结。在一个实施方案中，本发明 方法制造的干酪是凝乳酶-凝乳干酪。因此，在一个实施方案中，用凝乳酶 来制造干酪。在本发明方法的步骤b)中，可以对干酪用乳进行常规的干酪 加工工艺处理。凝乳酶是可商购获得的，例如Naturen(动物凝乳酶)、 Chy-max(发酵生产的凝乳酶)、Microlant(发酵生产的微生物凝结剂)，所 有均来自丹麦的Chr-Hansen A/S。

融化干酪可以从天然干酪或干酪类似物通过将干酪蒸煮和乳化来制 造，包括用乳化盐(例如磷酸盐和柠檬酸盐)，并且还可以包括香辛料/调味 料。在一个实施方案中，本发明方法的干酪制品不是融化干酪。

干酪类似物可以理解为干酪类产物，其中组合物的一部分是非乳成分， 例如是植物油。干酪类似物的另一个实例是干酪基料。本发明的方法可应 用于生产干酪类似物，只要产品中含有脂肪(例如乳脂肪，如乳脂)作为组合 物的一部分。

本发明方法生产的干酪包括所有种类的干酪，例如Campesino、英国 切斯特干酪、丹麦丹波牛奶硬干酪、Drabant瑞典牛奶半硬干酪、赫尔加德 干酪、Manchego西班牙山羊奶硬干酪、意大利波罗伏洛干酪、法国圣保林 半硬干酪、软干酪、Svecia瑞典乳脂硬干酪、Taleggio意大利乳脂软干酪、 白色干酪，包括制干酪凝块凝乳酶-凝结生产的凝乳酶-凝乳干酪；成熟干酪 如英国切达干酪、美国科尔比牛奶硬干酪、荷兰艾丹姆干酪、法国明斯特 干酪、瑞士格鲁耶尔干酪、瑞士埃曼塔尔牛奶硬干酪、法国卡门培尔干酪、 意大利珀尔梅散干酪和意大利罗马诺干酪；新鲜干酪如Mozzarella白色干 酪和伊色列混合羊奶干酪；酸凝结的干酪如乳脂干酪、法国纽沙特尔干酪、 Quarg不成熟即食的粗制脱脂酸奶干酪、酪农干酪和Queso Blanco牛奶软 干酪以及pasta filata干酪。一种实施方案涉及通过本发明方法生产比萨饼 用牛奶软干酪。

在干酪制造中，乳中酪蛋白的凝结可以分两种方式进行：所谓的凝乳 酶-凝乳和酸-凝乳干酪。在干酪的生产中，这两种类型的凝乳构成两大类干 酪类型。新鲜酸凝乳干酪指通过乳、乳脂或乳清经酸化或酸化和加热的联 合作用而凝结产生的那些干酪种类，该种类的干酪制成后无需成熟便可以 即食。新鲜酸-凝乳干酪通常与凝乳酶-凝乳干酪种类(例如Camberbert、英 国切达干酪、瑞士埃曼塔尔牛奶硬干酪)不同，其中凝乳酶-凝乳干酪的凝结 正常情况下是通过凝乳酶在pH值6.4-6.6下作用引起的，不同之处在于新 鲜酸-凝乳干酪的凝结正常情况下发生在接近于酪蛋白的等电点即例如在pH 4.6下，或者当使用高温时在更高的pH，例如在Ricottta pH6.0和80℃。 在本发明的一个优选实施方案中，干酪属于凝乳酶凝乳干酪类的干酪。在 另一些实施方案中，术语干酪还包括酸凝乳干酪，包括新鲜酸凝乳干酪。

Mozzarella白色干酪属于所谓pasta filata或延展(stretched)凝乳中的一 种，正常情况下这种干酪的区别特点是将新鲜凝乳在热水中进行独特的塑 化和捏合处理，这种处理赋予了成品干酪其特征性的纤维蛋白结构以及熔 融和延展性能，例如参见Paul S.Kindstedt的“Mozzarella和Pizza干酪” 《干酪：化学、物理学和微生物学》第2卷：Major Cheese groups，第2版， 第337-34l页，Chapman & Hall。这里使用的比萨饼用牛奶软干酪包括适合 比萨饼用的干酪并且它们通常是pasta filata/延展凝乳干酪。在一个实施方 案中，本发明的方法还包括对pasta filata干酪的热/延展处理，例如用于制 作Mozzarella白色干酪。

本发明方法所要处理的干酪用乳中可以含有一种或多种以下乳分提部 分：脱脂乳、乳脂、全乳、甜奶油或酸化奶油生产中的酪乳、乳清蛋白浓 缩物以及奶油或乳脂肪。根据本发明方法将被磷脂酶处理的干酪用乳中还 可以含有原料乳。

在本发明的另一些实施方案中，将被磷脂酶处理的干酪用乳是完全从 干燥乳分提部分中制备的或者部分地从干燥乳分提部分中制备的，所说的 干燥乳分提部分例如全乳粉、脱脂乳粉、酪蛋白、酪蛋白酸盐、总乳蛋白 或酪乳粉或者其任何的组合形式。

术语“干酪用乳”，特别是在本发明方法的步骤b)中，是指制备干酪 用的以乳为基料的组合物。因此，在本发明的方法中，干酪可以由以乳为 基料的组合物(“干酪用乳”)来制备，其中所有或仅一部分受磷脂酶处理。 这里所说的术语“干酪用乳”可以包括术语“干酪用乳的分提部分”，除 非从上下文中明显看出此两术语指不同的含义。

本文中，术语“干酪用乳的分提部分”，特别是在本发明方法的步骤 a)，是指受本发明酶处理的干酪用乳的分提部分。“干酪用乳的分提部分” 可以包括本发明中定义的一种或多种乳分提部分，即例如脱脂乳、乳脂、 全乳、甜奶油或酸化奶油生产中的酪乳、乳清蛋白浓缩物、奶油和乳脂肪。 奶油可以是例如熔融的形式。待处理的干酪用乳的分提部分还可以包括原 料乳，并且也可以如前述从干燥的乳分提部分中制备。本文中，术语“干 酪用乳的分提部分”是指待处理的干酪用乳中的一种或多种组分。当在步 骤a)中磷脂酶处理干酪用乳的分提部分时，则步骤a)在步骤b)之前进行而 不在步骤b)的过程中进行。在酶处理干酪用乳的分提部分之后，将该分提 部分与一种或多种用于制作干酪用乳的乳分提部分合并，从中在步骤b)中 制备干酪。

步骤a)中的酶处理可以对干酪用乳的分提部分进行，或者可以对干酪 用乳本身进行。因此，本发明的范围是干酪的生产方法，该方法包括以下 步骤：步骤i)用磷脂酶处理干酪用乳的分提部分；步骤ii)从步骤i)的经处 理的分提部分中制备干酪用乳和步骤iii)从步骤ii)的干酪用乳中生产干酪。 步骤ii)还包括：可以将步骤i)的经酶处理的干酪用乳分提部分与(a)未经磷 脂酶和/或(a)经磷脂酶处理的干酪用乳分提部分合并，以提供干酪用乳，从 中在步骤iii)中生产干酪。在本文中，步骤i)相当于步骤a)并且步骤iii)相当 于步骤b)。

在优选实施方案中，待酶处理的干酪用乳或干酪用乳分提部分，含有 或由乳脂组成。在另一些实施方案中，待酶处理的干酪用乳或干酪用乳分 提部分，含有或由奶油组成。在另一些实施方案中，待酶处理的干酪用乳 或干酪用乳分提部分，含有或由酪乳组成。在一个实施方案中，步骤a)的经 酶处理的乳在步骤b)之前不干燥。在另一些实施方案中，本发明的方法不 包括降低干酪总脂肪含量的特定步骤，例如EP 531 104 A2中公开的方法， 其涉及降低食品中脂类含量的方法。

可以使用来自不同种类动物的乳来生产干酪。因此，“乳”可以是通过 给例如母牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶获得的乳分泌液。

可以将用于生产干酪的乳标准化成所需的组成，通过除去一部分或全 部的任何原料乳组分和/或通过向其中加入附加量的组分。这可以通过在到 达乳品厂将原料乳分离成乳脂和脱脂乳来实现。因此，干酪用乳可以常规 通过将原料乳分提并且将分提部分重新组合来制备，以便获得具有所需最 终组成的干酪用乳。分离可以是连续离心，导致产生非常低脂肪含量(例 如＜0.5％)的脱脂乳和例如＞35％脂肪含量的乳脂。“干酪用乳”可以通过 将乳脂和脱脂乳混合来形成。在优选的实施方案中，待磷脂酶处理的干酪 用乳或干酪用乳分提部分不得自于干酪。

待用磷脂酶处理的干酪用乳，包括干酪用乳分提部分包含磷脂，例如 是卵磷脂。干酪用乳可以具有适合于通过本发明方法生产的干酪的任何总 脂肪含量，例如，约25％脂肪(干物质计)，如10-50％脂肪，其中例如约0.06％ 是磷脂类，例如总脂肪含量的0.02-5％(w/w)是磷脂类。

为确保干酪用乳中的低细菌数，可以采用常规的步骤。通常来说不优 选将脱脂乳巴氏杀菌，因为干酪用乳中的热变性蛋白质对乳的凝结产生负 面影响，并且阻碍干酪的成熟。因此，可以通过其它技术来降低脱脂乳分 提部分中的细菌数，例如微孔过滤或离心法除菌。乳脂可以经过巴氏杀菌 来获得产品中的低细菌数。

本发明的方法还包括步骤c)在步骤a)之后和在步骤b)之前，对经处理 的干酪用乳或干酪用乳分提部分进行加热处理。在一个实施方案中，本发明 的方法包括以下步骤：i)用磷脂酶处理干酪用乳的分提部分(例如，乳脂)； 步骤ii)对步骤i)的经酶处理的分提部分进行加热处理；步骤iii)将步骤ii) 的乳分提部分与(a)未经酶处理的和/或(a)经磷脂酶处理的乳分提部分合 并，获得从中生产干酪用的干酪用乳和步骤iv)从步骤iii)的干酪用乳中生产 干酪，其中步骤i)相当于步骤a)并且步骤iv)相当于步骤b)。因此，在其 中干酪用乳的分提部分是乳脂的一个实施方案中，本发明方法还可以包括 在步骤a)之后和在步骤b)之前将乳脂巴氏杀菌的步骤。

在本发明的方法中，在生产干酪之前，例如在丹麦青纹干酪的生产中， 可以将干酪用乳或干酪用乳的分提部分进行均质处理。均质可以在用磷脂 酶处理之前和/或之后实施。然而，在其它实施方案中，在干酪生产之前， 不对步骤b)的干酪用乳进行均质处理。

酶处理：

本发明方法中的酶处理可以通过将磷脂酶分散到干酪用乳或干酪用乳 分提部分中并且在适宜的温度下在合适的保温时间内使酶发生反应。可以 根据本领域公知的原理，选择适合所选酶的条件进行磷脂酶处理。酶处理 是一种用磷脂酶处理干酪用乳的乳脂肪分提部分的处理过程。

酶处理可以在任何适宜的pH下进行，例如pH2-10，如pH4-9或5-7。 可以优选使用pH5.5-7.0。

可以在3-7℃冷藏过程中对干酪用乳或干酪用乳分提部分的磷脂酶处 理，例如处理至少2小时，如2-48小时或者至少5小时，如5-24小时来 实施本发明的方法。还可以这样实施本发明的方法以致于例如在步骤b)的 干酪制作过程期间，让磷脂酶在30-45℃凝结条件下反应(例如反应至少5分 钟如至少10分钟或者至少30分钟如5-60分钟)。另外，可以这样实施本 发明的方法以致于在干酪用乳凝结之前，在磷脂酶的最佳温度例如45-80℃ 如47-80℃或50-80℃下让磷脂酶对乳分提部分反应，例如反应至少10分钟， 如至少30分钟，例如10-180分钟。

任选地，在酶处理之后，将磷脂酶的酶蛋白质除去/减少和/或将酶灭活。

适宜的酶用量通常为脂肪含量的0.01-1％(w/w)，例如，0.1-1.0％，特 别是0.2％(w/w)，相当于2000 IU/100g脂肪。1 IU(国际单位)定义为在标 准条件下每分钟产生1微摩尔游离脂肪酸的酶量，所说的标准条件为：蛋 黄底物(大约0.4％磷脂类)、pH8、40℃、6mM Ca++。分析方法AF 280可 根据需要从Novo Nordisk A/S获得并且描述于实施例中。酶用量以经处理 的干酪用乳(如实施例中例举的乳脂)的w/w脂肪含量计。或者，可以通过 本文描述的其它分析方法来确定酶用量。

酶处理可以分批进行，例如在带有搅拌的罐中，或者可以连续进行， 例如系列搅拌罐式反应器。

在一个实施方案中，将磷脂酶添加到乳脂分提部分中，以便在45-80℃ 下进行该分提部分的独立磷脂酶处理。在另一些实施方案中，刚刚在干酪 凝乳酶之前或者与干酪凝乳酶同时加入磷脂酶，例如在32-36℃下。

本发明方法中所用的酶：

本发明方法所用的酶包括磷脂酶如磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶B。 在本发明的方法中，磷脂酶处理可以由一种或多种磷脂酶来提供，如两种 或更多种磷脂酶，例如两种磷脂酶，包括(但不限制于此)用A型和B型同 时处理，用A1型和A2型同时处理；用A1型和B型同时处理；用A2型和B 型同时处理或者用相同类型的两种不同磷脂酶处理。还包括用一种类型的 磷脂酶的处理，如A1、A2和B。

磷脂类，如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由外位(sn-1)和中间位(sn-2)被两个 脂肪酸酯化并且第三位被磷酸酯化的甘油组成；进而，磷酸可以酯化氨基 醇。磷脂酶是参与磷脂类水解的酶。可以区别出很多类型的磷脂酶活性， 包括磷脂酶A1和A2，其可水解一个脂肪酰基(分别在sn-1和sn-2位)形成 溶血磷脂，以及溶血磷脂酶(或磷脂酶B)，其可水解溶血磷脂中剩余的脂 肪酰基。因此，本发明涉及能够水解磷脂中的一个和/或两个脂肪酰基的酶 的用途。

磷脂酶A1根据标准酶EC-分类定义为EC 3.1.1.32。

正式名称：磷脂酶A1

催化的反应：磷脂酰胆碱+H(2)O<>2-酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸 阴离子

备注：具有比EC 3.1.1.4更宽的特异性。

磷脂酶A2根据标准酶EC-分类定义为EC 3.1.1.4。

正式名称：磷脂酶A2

别名：磷脂酰胆碱2-酰基水解酶、卵磷脂酶a、磷脂酶或磷脂脂酶 (phosphatidolipase)

催化的反应：磷脂酰胆碱+H(2)O<>1-酰基甘油磷酸胆碱+脂肪酸 阴离子

备注：还可作用于磷脂酰乙醇胺，胆碱缩醛磷脂和磷脂，除去连接在2- 位上的脂肪酸

联系本发明的酶，这里所说的术语“磷脂酶A”旨在覆盖具有磷脂酶 A1和/或磷脂酶A2活性的酶。

“磷脂酶B”：根据标准酶EC-分类定义为EC 3.1.1.5。

正式名称：溶血磷脂酶

别名：卵磷脂酶b、溶血卵磷脂酶、磷脂酶b或plb。

催化的反应：2-溶血磷脂酰胆碱+H(2)O<>甘油磷酸胆碱+脂肪酸 阴离子

联系本发明的酶，这里所说的术语“磷脂酶”旨在覆盖如本文定义的 对磷脂类具酶活性的酶。这里所说的术语磷脂酶包括具有磷脂酶活性的酶， 例如磷脂酶A(A1或A2)或磷脂酶B活性。磷脂酶活性可以由还具有其它活 性的酶来提供，例如，具有磷脂酶活性的脂酶。磷脂酶活性可以例如来自 具有磷脂酶副活性的脂酶。在本发明的其它实施方案中，磷脂酶活性由本 质上仅具有磷脂酶活性的酶和其中磷脂酶活性不是副活性的酶提供。在本 发明的一个实施方案中，磷脂酶不是如WO 98/26057中定义的具有磷脂酶 副活性的脂酶。

磷脂酶可以来源于任何来源，例如动物来源(如哺乳动物)，例如来源 于胰腺(例如牛或猪的胰腺)或者来源于蛇毒或蜂毒。或者，磷脂酶可以是 微生物来源的，例如来源于丝状真菌、酵母或细菌，例如曲霉属的属和种， 如黑曲霉；Dictyostelium，如D.discoideum；毛霉属，如爪哇毛霉、大毛霉、 细胞毛霉；链孢霉属，如粗糙链孢霉；Rhizomucor，如R.pusillus；根霉属 (Rhizopus)，如无根根霉、日本根霉、葡枝根霉；核盘菌属(Sclerotinia)，如 大豆核盘菌；发癣菌属，如深红色发癣菌属；Whetzelinia，如W. sclerotiorum；芽胞杆菌属，如巨大芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌；柠檬酸杆菌属， 如弗氏柠檬酸杆菌；肠杆菌属，如产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、tarda肠杆菌； 欧文氏菌属，如草生欧文氏菌；埃希氏菌属，如大肠杆菌；克雷伯氏菌属，如 肺炎克雷伯氏菌；变形杆菌属，如普通变形菌；普罗威登斯菌属，如斯氏普 罗威登斯菌；沙门氏菌属，如鼠伤寒沙门氏菌；沙雷氏菌属，如液化沙雷氏 菌、粘质沙雷氏菌；志贺氏菌属，如弗氏志贺氏菌；链霉菌属，如 violeceomber链霉菌；耶尔森氏菌属，如小肠结肠耶尔森氏菌。因此，磷脂 酶可以是真菌性的，例如来源于核菌真菌(Pyrenomycetes)类，如镰孢属，如 大刀镰孢菌株、异孢镰孢菌株、茄病镰孢菌株或尖孢镰孢菌株。磷脂酶也 可以是来自曲霉属丝状真菌菌株，如泡盛曲酶、臭曲酶、日本曲酶、黑曲 酶或米曲酶菌株。优选的磷脂酶源于镰孢属的菌株，特别是尖孢镰孢，例 如源于WO 98/26057中所述的菌株DSM 2627，特别是WO 98/26057的权 利要求36和序列号2描述的菌株。在另一些实施方案中，磷脂酶是 PCT/DK/00664(Novo NordiskA/S，丹麦)中公开的磷脂酶。

本发明方法中所用的磷脂酶可以得自或可得自本文提及的任何来源。 本文中术语“得自”指可以从生物体中分离的天然存在的酶，即酶的氨基 酸序列同一性与天然酶一致。术语“得自”还指可以在宿主生物中重组生 产酶，重组体生产的酶具有与天然酶一致的同一性或者具有经过修饰的氨 基酸序列，例如，具有一种或多种缺失、插入和/或置换的氨基酸，即重组 生产的酶，其是天然氨基酸序列的突变体和/或片段。天然酶的含义包括天 然变体。此外，术语“得自”包括通过例如肽合成法合成生产的酶。术语 “得自”还包括经过修饰的酶，例如被糖基化、磷酸化等，无论是体内或 体外。本文中，术语“可得自”指酶具有与天然酶一致的氨基酸序列。该 术语包括了从生物体中分离的天然存在的酶，或在相同类型或不同类型生 物体中的酶被重组表达，或通过如肽合成法合成生产的酶。对于重组生产 的酶来说，“可得自”和“得自”是指酶的同一性而不是在其中重组生产的 宿主生物的同一性。

因此，磷脂酶可以通过使用任何适宜的技术由微生物得到。例如，可 以通过适宜微生物的发酵、随后通过本领域已知的方法从所得发酵肉汤或 微生物中分离磷脂酶制剂来获得磷脂酶制剂。磷脂酶还可以通过使用重组 DNA技术来获得。这种方法正常包括培养用重组DNA载体转化的宿主细 胞，其中所说的重组DNA载体含有编码所需磷脂酶的DNA序列和与适宜 表达信号操作连接的DNA序列，以便其能够在允许酶表达的条件下表达培 养基中的磷脂酶并且从培养物中回收酶。还可以将DNA序列掺入宿主细胞 的基因组中。DNA序列可以来源于基因组、cDNA或合成来源或这些的任 何组合，并且可以根据本领域已知的方法分离或合成。

适宜的磷脂酶可商购获得。作为实际使用的酶的典型实例，优选使用 得自胰腺的磷脂酶A2，如Lecitase(Novo Nordisk A/S制造)。

在另一些实施方案中，本发明方法中的磷脂酶源是始于通过干酪生产 中所用的引子生物表达酶，例如在乳酸菌包括如乳酸杆菌中过表达磷脂酶。 或者，通过添加磷脂酶，选择性地与由这里所述的引子培养物中提供的磷 脂酶组合，对干酪用乳或干酪用乳分提部分进行处理。

在一个优选的实施方案中，磷脂酶不从微生物乳污染物中获得。因此， 在本发明的方法中，磷脂酶处理不通过乳或乳分提部分中存在的微生物乳 污染物所表达的磷脂酶的酶作用来提供，至少不是主要部分。微生物乳污 染物可以是蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、假单胞菌种、液化肠 杆菌(阴沟克雷伯氏菌)、Alcalignes viscolactis，corynefrom rod中的一种或 多种。在一个实施方案中，磷脂酶不从这些污染物中获得。在另一些实施 方案中，磷脂酶不同于“J.J Owens，对来自乳污染物的卵磷脂酶的观察， Process Biochemistry，第13卷第1号，1978，第10-18页”和“J.J Owens，乳 中的卵磷脂酶阳性菌，Process Biochemistry，第13卷，第13-15页，1978”中 公开的酶。

在本发明的方法中，磷脂酶处理可以通过将干酪用乳和/或干酪用乳分 提部分与纯化的磷脂酶接触来进行。这里所说的术语“纯化”概括了不含 生物组分的磷脂酶蛋白质，其中所说的生物是用于获得酶的生物。术语“纯 化”还概括了不含天然生物组分的磷脂酶蛋白质，其中所说的天然生物是 用于获得酶的天然生物，也称为“本质上纯的”磷脂酶并且可以与磷脂酶 特别相关，所述磷脂酶是天然存在的磷脂酶且没有被基因修饰如通过缺失、 置换或插入一个或多个氨基酸残基而修饰的磷脂酶。

因此，可以将磷脂酶纯化，就是说仅存在少量的其它蛋白质。术语“其 它蛋白质”具体涉及其它酶。这里所说的术语“纯化”还指除去其它组分， 特别是磷脂酶源细胞中存在的其它蛋白质，最特别是其它酶。磷脂酶可以 是“基本上纯的”，即不含生产其所用的生物的其它组分，例如用于重组 生产磷脂酶的宿主生物。优选，酶的纯度是至少75％(w/w)，更优选至少 80％、85％、90％、甚至至少95％。在另一个更优选的实施方案中，磷脂酶 是至少98％纯的酶蛋白制剂。在其它实施方案中，磷脂酶不是乳中天然存 在的磷脂酶。

术语磷脂酶中包括对酶的催化活性可能是必要的任何辅助性化合物， 例如适宜的受体或辅因子，它们可以是或不是反应体系中天然存在的。

磷脂酶可以呈适合所需用途的任何形式，例如呈干粉或颗粒、非粉尘 状颗粒、液体、稳定化液体或被护酶的形式。颗粒剂可以例如按照US 4,106,991和US 4,661,452中公开的来生产，并且可以选择性地通过本领域 已知的方法包衣。液体酶制剂可以例如通过添加稳定剂如糖、糖醇或其它 多元醇、乳酸或其它有机酸根据既定的方法稳定化。被护酶可以按照EP 238,216公开的方法来制备。

通过本发明的方法，与相类似但不经过步骤a)酶处理的干酪制作方法 相比，可以将干酪中卵磷脂的含量减少至少5％，如至少10％、至少20％、 至少30％、至少50％，例如5-95％。

在牛乳中，卵磷脂正常情况下占乳中的磷脂类的95％以上，而溶血卵 磷脂占磷脂类的大约1％。尽管磷脂类正常情况下占牛乳中总脂类的小于 1％，但它们起特别重要的作用，主要存在于乳的脂肪球膜中。通过本发明 的方法，步骤b)的干酪中的卵磷脂含量为干酪总磷脂含量的小于90％，例 如小于80％，例如小于60％或小于50％。在本发明的其它实施方案中，干 酪中溶血卵磷脂含量占干酪总磷脂类含量的至少5％，例如至少10％、至少 20％、至少30％、至少50％、例如5-99％，如5-90％、10-90％或30-90％或 40-80％。通过本领域技术人员已知的任何方法测定，如通过HPLC，测定 卵磷脂或溶血卵磷脂的含量。

在一个优选的实施方案中，应理解的是，干酪中的卵磷脂与溶血卵磷 脂的相对量是通过卵磷脂转变成溶血卵磷脂的转化率来提供，其中卵磷脂 转变成溶血卵磷脂是通过用磷脂酶处理干酪用乳或干酪用乳分提部分来进 行的。干酪中的脂肪含量通常为65％(w/w)，例如10-60％。

本发明还涉及磷脂酶在本发明方法中的用途。因此，一个实施方案涉 及磷脂酶在制造干酪制品中的用途，包括向干酪用乳或干酪用乳的分提部 分添加磷脂酶并且加工干酪用乳以制作干酪。由此，磷脂酶在制造干酪制 品中的用途属于本发明的范围，其中对干酪用乳或其分提部分的磷脂酶处 理在干酪生产之前和/或生产期间进行。

本发明还涉及通过本发明方法生产的干酪在比萨饼、即食食品、融化 干酪中或作为其它食物制品配料的用途。因此，本发明方法生产的干酪可 以用来进一步加工食物制品中，如融化干酪、比萨饼、汉堡、吐司、调味 汁、填料、干酪粉或干酪风味剂。

在另一些实施方案中，本发明的方法还包括对步骤b)的干酪进行热处 理的步骤，如在150-350℃下。

本发明还涉及可通过本发明方法获得的干酪，特别是通过本发明的方 法获得的干酪。

在一个优选实施方案中，本发明涉及改进干酪中的脂肪稳定性的方法， 该方法如本文所述。在一个实施方案中，通过本发明方法制造的干酪具有 降低的脂肪/油渗出，例如，“油状物”直径降低至少5％，如至少10％、至 少20％、至少40％、例如“油状物”直径降低20-800％，例如20-600％；  “油 状物直径”的测定在实施例1或2中给出。

在一个实施方案中，本发明涉及增加干酪产量的方法，例如在干酪生 产中增加干酪脂肪产量和/或干酪蛋白产量。因此，本发明提供了一种干酪 制造方法，导致较高产量的干酪和通过本发明方法生产的干酪的脂肪相的 更好稳定性。由此，一个实施方案涉及改进干酪的脂肪稳定性和/或增加干 酪产量的方法。通过本发明的方法，脂肪产量可增加至少0.5％，如增加 0.5-10％，例如0.5％-5％，其测定方法按照例如实施例3描述的“脂肪差法” (“fat by difference”)。

本发明的其它方面：

本发明还提供稳定乳组合物中的脂肪的方法，该方法包括用选自磷脂 酶的酶处理乳或乳的分提部分。本发明的发明者发现通过用磷脂酶处理可 以改进乳组合物的乳液稳定性。由此，本发明还涉及稳定乳组合物的脂肪 乳液的方法，该方法包括用磷脂酶处理乳或乳的分提部分。该方法可以在 本发明所述方法的步骤a)中进行。

本发明还提供了改进的UHT乳脂的生产方法，特别是具有改进的脂肪 稳定性，这种UHT乳脂的生产方法包括以下步骤：步骤a)用磷脂酶处理 乳脂和步骤b)对步骤a)的经磷脂酶处理的乳脂进行UHT处理，其中步骤 a)在步骤b)之前进行。本发明还涉及可通过本发明的这种方法获得的或通 过这种方法获得的UHT-乳脂。最后，本发明涉及磷脂酶在制造UHT-乳脂 中的用途。

本发明还提供乳脂液的生产方法，该方法包括以下步骤：步骤a)用磷 脂酶处理乳组合物(例如，乳脂)和步骤b)由经酶处理的乳组合物生产乳脂 液。本发明还涉及可通过本发明的这种方法获得的或通过这种方法获得的 乳脂液。最后，本发明涉及磷脂酶在制造乳脂液中的用途。

在以下的实施例中将对本发明进一步的说明，这些实施例不以任何方 式限制本发明的范围。

实施例

磷脂酶活性的测定：

可以按照以下描述的原理测定磷脂酶活性。该方法中使用蛋黄作为富 含卵磷脂的底物。

原理：pH静态滴定。通过磷脂酶在脱氧胆酸钙和钠的存在下于pH 8.0 和40℃下pH-静态(pH-stat)水解经匀化的含有磷脂类的蛋黄。用0.1 N氢氧 化钠滴定释放出的脂肪酸，并且监测作为时间的函数的碱体积。一磷脂酶 单位定义为在标准条件下产生一微当量游离脂肪酸的酶量。

试剂：0.016 M脱氧胆酸钠(C24H39NaO4)、0.32 M氯化钙、0.01 N盐 酸、0.1 N氢氧化钠。

底物：将1个蛋黄添加到100 ml水中并且在分散器中匀化，通过双层 纱网过滤均匀的底物。加入5ml 0.32 M氯化钙使滤液稳定。

滴定混合物：将100ml底物与50ml 0.016脱氧胆酸钠混合。

或者，可以使用DK 99/00664(Novo Nordisk A/S，丹麦)：“磷脂酶活性 (PHLU)”、“磷脂酶活性(LEU)”、“磷脂酶单层分析”、“平板分析 1”和“平板分析2”所述的或WO 98/26057(Novo Nordisk A/S)：“NEFA-C 试验”所述的分析方法定性或定量测定磷脂酶活性。

实施例1

对生产干酪用的乳脂的磷脂酶处理

在本实施例中，用磷脂酶处理乳脂，然后与脱脂乳合并，制备干酪用 乳。

原料

干酪用乳的组成：

脱脂乳  0.1％脂肪     1820ml

乳脂    38.0％脂肪    180ml

酪乳(含引子培养物)    50ml

CaCl2                0.4g

酶：

1)凝乳酶(酸性天冬氨酸Rhizomucor miehei蛋白酶-EC 3.4.23.6)用 量：0.107g

2)Lecitase(得自胰腺的磷脂酶A2，可从Novo Nordisk A/S获得)，用 量(以脂肪计)：0.2％(w/w)。

干酪的生产

方法：用磷脂酶(Lecitase，Novo Nordisk A/S丹麦制造；用量0.2％(以 w/w脂肪含量计))独立地处理乳脂，通过将混合物在50℃水浴中保温30分 钟而进行。将经处理的乳脂与脱脂乳混合，使混合物达到总脂肪含量为3.5％ (w/w)，并且放入33-35℃水浴中。将CaCl2加入2升干酪用乳中，并且加 入引子培养物(即酪乳)并且将混合物搅拌5-10分钟。将乳在不加任何搅拌 下放置30分钟。然后，加入凝乳酶(酸性天冬氨酸Rhizomucor miehei蛋 白酶)并且将乳搅拌1分钟。随后，确定凝结点(大约12分钟)，并且将乳 放置约25-26分钟，然后切割。

凝结点(凝结时间)是从加入凝乳酶到出现第一个絮凝征兆所经过的时 间，并且通过在乳中移动黑棒来确定，即凝结点是当在棒上第一次观察到 衍酪蛋白可见沉淀时的时间点。

通过进行如下试验来确定准确的切割时间：用凝结棍在干酪的表面作 一小的切割，将棍放在切割部分的下面并且向前移动，当干酪被分离，形 成两个锐边，并且在两锐边之间聚集有乳清时，准备切割干酪。

用搅打器将干酪轻度搅拌使其破裂，并且放置两分钟。两分钟之后， 在10-15分钟期间间断搅拌干酪以从凝乳中分离乳清。将不断出现的乳清 和凝乳转移至含有布的筛网上。通过布将乳清沥出1-2小时。在干酪的顶 部放置0.6kg重物以除去更多的乳清，之后将干酪在室温下储放过夜。

结果：干酪生产的数据(凝结时间、切割时间、乳清量、乳清中蛋白 质的量和干酪的量)示于表1中。

干酪的熔融

方法：在熔融之前，将干酪切成高约2.5cm且直径约8cm的块。将 干酪样品在250℃烘箱中加热8分钟。加热后测定干酪的直径，取两个直 径的平均值。

结果：参见下表1。

脂肪/油的渗出

方法：在进行渗出试验之前，将干酪切割成高2.5cm且直径约8cm 的块。将干酪样品在200℃烘箱中加热3分钟之后测定脂肪/油的渗出。测 定渗出到滤纸-Whatman40上的液体的直径，取四个直径的平均值。

结果：参见下表1。

实施例1获得的样品的测定值示于表1

使用不同批次的乳/乳脂原料进行两组试验。一组列于第1和2栏。并 且第2组列于第3、4和5栏。

表1干酪生产中用于处理乳脂的磷脂酶试验 试验号 1* 对照  2  含  Lecitase 3* 对照  4  含  Lecitase  5  含  Lecitase 干酪生产中的数据 凝固时间，分钟 1330  1415 1620  1700  1600 切割时间，分钟 3130  3130 3550  3550  3430 乳清重量 1635.5  1660.1 1625.8  1645.8  1668.7 干酪重量 314.75  296.74 327.44  322.75  318.77 乳清中的％蛋白质 0.96  0.92 0.84  0.83  0.83 乳清中蛋白质的g数 15.7  15.3 13.7  13.7  13.9 干酪熔融结果 加热后的平均直径， cm 8.0  7.5 8.0  7.3  7.3 脂肪/油渗出结果 加热后滤纸上的“油 状物”直径，cm 6.6  5.8 6.8  5.4  5.4

*试验1和3，没有添加Lecitase。试验1*是试验2的对照，试验3* 是试验4-5的对照。

从表所示的结果中(参见表1下部所示的“干酪的熔融”和“脂肪/油的 渗出”)，明显看出最初用磷脂酶处理的乳脂所制造的干酪改进了干酪在 加热处理期间的稳定性。由加热后样品平均直径的测定值看出，当用磷脂 酶处理用于干酪用乳的乳脂时，直径较小。此外，当用磷脂酶处理乳脂时， 在滤纸上的油状物直径减小。

结果证明通过本发明的方法可以获得加热处理期间稳定性得到改进的 干酪。

实施例2

乳脂的磷脂酶处理以测试对乳脂的稳定作用

方法：使用3种不同量的Leeitase10L(Novo Nordisk A/S，丹麦)(以 估测的脂肪计的用量＝36％)，将乳脂(200g)在50℃下保温15分钟：

1.用量0％

2.用量0.2％(＝乳脂的0.0725％)

3.用量1.0％(＝乳脂的0.36％)

保温后将乳脂冷却至5℃。按标准化方式搅打乳脂(Philips 5速混合器， 开始在4速下运行2分钟，其余时间在5速下)。将100g经搅打的乳脂填 充到漏斗中，并且在室温下静置滴汁1小时。

样品和结果：

将样品1搅打7分25秒。约300ml乳脂。在漏斗中1小时后滴汁的 量＝2.5ml。

将样品2搅打20分钟，没有发现泡沫形成。样品变得略微稠厚，并 且获得淡黄色。

将样品3搅打15分钟，没有发现泡沫形成。样品变得略微稠厚，并 且获得淡黄色。

Lecitase处理破坏了起泡能力。乳脂中泡沫的形成是基于脂肪球的崩 溃并且形成了连续的脂肪相，这种连续相形成泡沫。根据本发明的方法， 上述结果说明Lecitase处理改进了乳脂中脂肪的乳化性和稳定性。

实施例3

对生产MOZZARELLA白色干酪用的乳脂的磷脂酶处理

在本实施例中，用磷脂酶处理乳脂，然后与脱脂乳合并，以制备干酪 用乳。

原料

干酪用乳的组成：

脱脂乳，经巴氏杀菌  0.83％脂肪  13.63L

乳脂                30％脂肪    1.37L

CaCl2                          0.4g/2kg乳脂

来自from Rhodia Foods(Rhodia Inc，Madison，WI，USA)的引子培养物 LH100和TA061(乳酸菌)，各0.6g

酶：

1)凝乳酶(酸性天冬氨酸Rhizomucor miehei蛋白酶-EC 3.4.23.6)用 量：w 50 KRU/g(可从Novo Nordisk A/S获得的KRU方法：0.60g

2)Lecitase(得自胰腺的磷脂酶A2，可从Novo Nordisk A/S获得)，用 量(以脂肪计)：0.2％(w/w)

干酪的生产

方法：用磷脂酶(Lecitase，Novo Nordisk A/S丹麦制造；用量0.2％(以 w/w脂肪含量计))独立地处理乳脂，通过将混合物在50℃水浴中与CaCl2 保温30分钟来进行。将经处理的乳脂与脱脂乳混合，使混合物达到总脂肪 含量为3.5％(w/w)，并且放入15L干酪槽中(使用可得自丹麦GEA Liquid processing，Haderslevvej 36,6000 Kolding的带有2×15L槽的干酪装置)。将乳 平衡至34.4℃，并且加入引子培养物，并且在加入凝乳酶之前将混合物轻 微搅拌4-5分钟，然后加入凝乳酶(酸性天冬氨酸Rhizomucor miehei蛋白 酶)并且将乳搅拌3分钟。随后，将乳放置约35分钟然后切割。

通过进行如下试验来确定实际的切割时间：用凝结棍在干酪的表面作 一小的切割，将棍放在切割部分的下面并且向前移动，从而干酪分离，形 成两个锐边，并且在两锐边之间聚集有乳清。用1/2英寸的刀进行切割。

然后将切割后的凝乳加热至41.1℃(约30分钟)。然后将干酪轻微搅拌 直至凝乳的pH达到pH5.90，之后沥出乳清并堆成5cm的干凝块。当pH 达到5.25时将凝乳切割成1.5英寸的立方体并且覆盖在冷自来水中15分钟。 待自来水沥干后将凝乳称重。将NaCl(0.2％干酪用乳重量)分3份干加到立 方体状的凝乳中。然后，在63℃下通过双螺杆延展机(可获得自Stainless Fabricating Inc.，Columbus.WI，USA的超微混合机(Supreme Micro Mixing Machine))于9rpm下将凝乳延展。之后，将经延展的凝乳放入7℃水中30 分钟，并且放入7℃盐水(23％NaCl)中90分钟。

干酪生产的数据(干酪中的蛋白质，通过Dumas燃烧法(LECO)测定； 含水量，通过CEM Corp.，Matthews，NC，28108的CEM自动变更计算机 (Automatic Volatility Computer)AVC-80型测定以及脂肪差)收集在表2中。

结果：参见下表2。

脂肪/油的渗出

方法：将干酪样品在90℃烘箱中加热5分钟，测定脂肪/油的渗出。在 进行渗出试验之前，将干酪在osterizer共混机中磨碎，达到样品均匀。随 后将2.0g样品成型加工成金属环状(2cm)并且放在Whatman#4滤纸的中 央。

根据油环和干酪圈之间的面积之差，测定油的析出(测定三次)。

结果：参见下表2。

可熔性

方法：挤压-流动流变测定法，参考Ak，M.M.和Gunasekaran.1995.J. Texture Stud.26：695-71l。

参数：稳定微系统(Stable Micro Systems)TA-XT2质地分析仅上的十字 头速度(crosshead speed)0.1mm/sec。将直径25mm、高15mm的圆柱形样 品放入50℃水浴中5分钟以平衡温度。

经P-脂酶处理的样品的可熔性仅略微低于它们各自的对照。

实施例3获得的样品的测定值示于表2

使用不同批次的乳/乳脂原料进行两组试验。

表2干酪生产中用于处理乳脂的磷脂酶试验 试验号 1  1-对照 2 2-对照 干酪生产中的数 据 干酪中的蛋白质 18.8％ 18.1％ 20.4％ 20.5％ 含水量 43.1％ 45.1％ 46.3％ 46.9％ 脂肪差 38.1％ 36.8％ 33.3％ 33.6％ 油析出的结果 加热后滤纸上 “油状物”的面 积，％干酪面积 57％ 176％ ＜10％ 61％

*试验1和2是添加了Lecitase的，试验1-对照和2-对照是相应的试 验，平行进行但不添加Lecitase。在试验1中，冷藏5天后测定油的析出， 并且在试验2中，冷藏8天后测定油的析出。

从表2结果明显看出最初用磷脂酶处理的乳脂所制造的Mozzarella白 色干酪显著减少了油的析出，油的析出是Mozzarella白色干酪的关键品质 参数。结果证明通过本发明的方法可以获得加热处理期间稳定性得到改进 的干酪。还看出磷脂酶增加了干酪中的脂肪含量，可能是由于加工期间脂 肪损失的降低引起的。因此，最初用磷脂酶处理导致干酪产量的增加。