在人体中胞间通讯是重要并普遍存在的。在此过程中的关键角色是胞外糖 类部分(extracellular carbohydrate moiety)，其与特定底物结合如各种不同的膜 分子，细胞因子或病原体。唾液酸是这些糖类部分的重要成分之一，它是存在 于大多数人体和动物组织中的九碳单糖。在运转和交互作用程度高的组织中， 如在大脑中，唾液酸浓度很高。它存在于所有的人体体液中，且其中在乳汁中 含量尤其高。唾液酸可由人体合成。
在过去二十年中，唾液酸受到诸多科学关注，参见Wang，B.和Brand-Miller J.，唾液酸在人类营养中的作用和潜力(The role and potential of sialic acid in human nutrition)，Eur J Clin Nutr 2003；57：1351-1369以及Schnauer R.，唾液酸 研究的成就和挑战(Achievements and challenges of sialic acid research)，配糖 体(Glycoconjugate)J 2000；17：485-499。它在细胞通讯中的作用涵盖分子相互 作用的调节，如在细胞和感染原之间的通讯中的作用。它是细胞膜分子的结构 部分，如神经节苷脂和糖蛋白。
关于人体内唾液酸功能的饮食方面新兴知识也得到了研究。唾液酸是人乳 低聚糖的主要部分，表现出营养作用。而且，发现人乳喂养的婴儿的脑和唾液 中含有的唾液酸远多于用仅含微量唾液酸的商业配方婴儿食品喂养的婴儿的 大脑和唾液中所含有的唾液酸，这表明这种糖类部分的有效吸收。(参见Tram， T.H.，等人，婴儿唾液的唾液酸含量：人乳喂养婴儿和配方婴儿食品喂养婴儿 的比较(Sialic acid content of infant saliva：comparison of breast fed with formula fed infants)、Arch Dis Childh 1997；77：315-8，Wang，B.，等人，早产儿中唾液的 唾液酸含量的纵向调查：人乳喂养婴儿和配方婴儿食品喂养婴儿的比较(A longitudinal study of salivary sialic acid in preterm infants：Comparison of human milk-fed versus formula-fed infants)，J Pediatr 2001；138：914-6以及Wang B.， 等人，人乳喂养婴儿脑神经节苷脂和糖蛋白唾液酸与配方婴儿食品喂养婴儿 的比较(Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants)，Am J Clin Nutr 2003；78：1024-9)。
自然界中唾液酸以几种化学形式存在。在体内组织中，发现它作为与蛋白 或脂类结合的低聚糖链的部分，仅有微量可供的游离唾液酸。在乳汁中它主要 与糖蛋白结合或游离低聚糖。但是，发现少量游离或脂结合唾液酸。
在人乳中，大部分唾液酸与低聚糖结合。包含唾液酸的低聚糖浓度随哺乳 期阶段和个体差异而变化很大。几位作者测量了人足月乳中的含量，发现含量 范围为从第一周的大于1g/L到成熟乳中的90-450mg/L左右(参见 Martin-Sosa，S.，等人，哺乳期过程中足月婴儿的西班牙母亲的乳汁中的唾液酸 分布(Distribution of Sialic Acids in the Milk of Spanish Mothers of Full Term Infants During Lactation)，J Pediatr Gastroenterol Nutr 2004；39：499-503，Carlson， S.E.，在哺乳期过程中人乳低聚糖和糖蛋白中N-乙酰神经氨酸浓度 (N-Acetylneuraminic acid concentrations in human milk oligosaccharides and glycoproteins during lactation)，Am J Clin Nutr 1985；41：720-6，Martin-Sosa，S.， 等人，人乳和牛乳中以及婴儿配方食品中的唾液酸寡糖：随哺乳期进程变化 (Sialyloligosacchardies in Human and Bovine Milk and in Infant Formulas： Variations with the Progression of Lactation)，J Dairy Sci 2003；86：52-59，以及 Wang，B.，等人，人乳及婴儿配方食品中的唾液酸的浓度和分布(Concentration and distribution of sialic acid in human milk and infant formulas)，Am J Clin Nutr 2001；74：510-5)。
相反地，牛乳中的大多数唾液酸是与蛋白结合。牛成熟乳中只含有少量结 合唾液酸的低聚糖。在初乳中其含量为230mg/L左右，而牛成熟乳中是25-54 mg/L(参见Martin，M.J.，等人，在哺乳期过程中牛乳唾液酸糖结合物的分布 (Distribution of Bovine Milk Sialoglycoconjugates During Lactation)，J Dairy Sci 2001；84：995-1000，以及Martin-Sosa，S.，等人，人乳和牛乳中以及婴儿配方食 品中的唾液酸寡糖：随哺乳期进程变化(Sialyloligosacchardies in Human and Bovine Milk and in Infant Formulas：Variations with the Progression of Lactation)， J Dairy Sci 2003；86：52-59)。
基于牛乳的婴儿配方食品和第二阶段配方婴儿食品由牛成熟乳生产，在这 些产品中结合唾液酸的低聚糖含量已被发现为15-35mg/L，而早产儿配方食品 中含量稍高为80mg/L。大豆配方食品中不含有结合唾液酸的低聚糖。参见 Wang，B.，等人人乳及婴儿配方食品中的唾液酸的浓度和分布(Concentration and distribution of sialic acid in human milk and infant formulas)，Am J Clin Nutr 2001；74：510-5以及Martin-Sosa，S.，等人，人乳和牛乳中以及婴儿配方食品中 的唾液酸寡糖：随哺乳期进程变化(Sialyloligosacchardies in Human and Bovine Milk and in Infant Formulas：Variations with the Progression of Lactation)，J Dairy Sci 2003；86：52-59。
利用本发明的唾液酰乳糖浓缩物，可将婴儿配方食品中结合唾液酸的低聚 糖强化到与人乳匹配的浓度，即结合唾液酸的低聚糖的总浓度能增加到 100-1500mg/L，匹配不同哺乳期阶段的人乳中的浓度。但是，由于人乳组合物 的大量变化，和其他食品用途可能需要其他浓度的结合唾液酸的低聚糖的事 实，本发明的范围不限于上述强化范围。
含有食品所用组分的唾液酸在商业上是可获得的。该组分的一种是结 合到蛋白κ-酪蛋白上的牛唾液酸，其中商业上可购自阿拉食品(Arla Foods) (丹麦)。也有合成生产的唾液酸源，如来自摩比技术(MoBiTech)，德国 的合成唾液酰乳糖，还有重组的含有唾液酸的人κ-酪蛋白(参见美国专利 No.6,270,827)。
因此，现有的商业上可购的含唾液酸产品也不是得自天然来源，即它们是 合成或利用重组技术产生的，或者其含有主要结合蛋白的唾液酸而不是像人乳 中一样结合低聚糖的唾液酸。本发明中的产品是目前所知的第一种含有高浓度 包含唾液酸的低聚糖浓缩物的产品，其来自于天然的反刍动物乳源。

本发明涉及一种源于乳制品的浓缩物，其富含天然存在于乳制品中的唾液 酰乳糖，以至于以干物质为基准，唾液酰乳糖的含量为0.32-25重量％。浓缩 物可被干燥。这种从天然的反刍动物乳源获取的唾液酰乳糖浓缩物粉末确定可 被掺入多种食品中，包括但不限于：婴儿配方食品和其他婴儿营养食品，儿童 营养物，功能性食品和用于医药目的或食疗目的的食品。
所述浓缩物可按照本发明的下述方法制备，超滤含有天然存在的唾液酰乳 糖的乳制品，然后用相同超滤膜对超滤滞留物进行渗滤，之后任选地进行反渗 透和/或干燥，其中，所述膜是薄膜聚酰胺基膜(thin film polyamide based membrane)。

以干物质为基准，本发明的浓缩物具有唾液酰乳糖的含量为0.32-25重量 ％，优选0.4-25％，1-25％，5-25％，10-15％。
所述乳制品可以是源于反刍动物或其他产乳动物的乳或任何乳制品。例如 乳制品可以是牛乳清制品，如乳清滞留物或乳清渗透物。它也可以是用乳清制 备乳糖中的母液。它还可以采用乳渗透物、乳滞留物、分馏乳滞留物或任何其 他含有唾液酰乳糖的乳制品。
本发明的浓缩物可以这样使用，或它可经进一步处理例如通过反渗透，结 晶，亲和层析或它们的组合以去除水分，或者它可单独或者与一种或多种载体 一起干燥。可使用任何载体，如油、脂肪、乳清、脱除矿物质的乳清、乳清蛋 白浓缩物、乳清蛋白分离物、其他乳清分馏物、乳清或乳的渗透物或浓缩物、 脱脂乳、全脂乳、半脱脂乳、乳分馏物、麦芽糊精(maltodextrins)、蔗糖、乳 糖、天然淀粉和预凝胶化淀粉、葡萄糖浆、酪蛋白和酪蛋白分馏物。
本发明的浓缩物，包括干燥浓缩物可用于任何营养组合物，如婴儿营养品、 蛋白棒、运动营养产品、饮料、保健补充物、用于医药目的的食品和临床营养 品。婴儿营养品可以是，但不限于，婴儿配方食品、第二阶段配方婴儿食品、 婴儿谷物产品或成长乳，即适于1-3岁儿童的改良乳或乳粉。
方法中采用由相同或不同生产商制造的两种不同的薄膜聚酰胺基膜当然 也会起作用，其中一种膜用于超滤(UF)而另一种膜用于渗滤(DIA)过滤。 可选地，相同或不同生产商制造的两种或多种不同的薄膜聚酰胺基膜的组合， 可以同时用于超滤和渗滤过滤。各种膜必须具有适当的本专利所述的MWCO 截留值。
本发明方法的一个优选实施例采用了一种膜，其具有适宜的分子量截留 (MWCO)0.5-4千道尔顿(kDalton)，最佳为2.5千道尔顿。1千道尔顿、1.5 千道尔顿、2千道尔顿、3千道尔顿、3.5千道尔顿也是有作用的。
所述膜为薄膜聚酰胺基膜，如GE奥斯摩克斯(Osmonics)GH系列膜 或相应常规用于超滤的膜。温度并不关键，但一般将采用4-50℃，如5℃、6 ℃、7℃、8℃、9℃或10℃，而更高的温度如11℃、12℃、13℃、14℃、15 ℃或者甚至20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或50℃也可以使用。
压力并不关键，但一般将采用1-40bar。也可采用膜生产商的推荐。最好 的结果通常为1-10bar的压力，如2bar、3bar、4bar、5bar、6bar、7bar、8 bar、9bar或10bar，而更高的压力如11bar、12bar、13bar、14bar、15bar 或者甚至20bar、25bar、30bar、35bar或40bar也可以使用。料液压力可低 至1bar和高至50bar。一般料液压力为5-6bar或10bar。最佳结果通常得自使 用1-10bar，但更高的料液压力也会正常工作，即使它们不那么高效。
本发明采用错流螺旋卷式膜(crossflow spiral wound membranes)，然而其 他的膜和构造(configuration)也可选择使用。可选的膜和构造可以是，但不 限于：错流过滤、死端过滤、板式和框式系统、筒式系统(cartridge system)、 振荡系统、平板膜、螺旋卷式膜、纤维膜和管状膜。所述膜被安置在适当的工 艺装置(process unit)中允许料液和膜接触，控制工艺的参数例如，但不限于， 温度、压力、流速、pH等。所述膜将料液分离成渗透物和滞留物过程流。过 程流可在所述工艺装置中被完全去除，或以相同方式完全或部分在所述工艺装 置和相连的供应系统(罐和过程流)中循环。在使用前，根据膜生产商的说明， 采用生产商许可的清洗剂和工艺参数清洗膜和工艺装置。
定义和特定设备
本发明中已经采用配有UV检测系统和Shodex色谱柱的高效液相色谱 (HPLC)来测定唾液酰乳糖浓度，然而也可采用具有可接受精确性的任何程 度的现有技术。
通常程度的现有技术包括，但不限于：分光光度技术、色谱技术、酶分析 法、酶联免疫吸附测定(ELISA)，其他湿化学分析法等。
本发明采用爱拓(东京，日本)((Tokyo，Japan))的模型 N1-E和N1-α折射计以及罗氏(Roche)宝灵曼公司(Boehringer Mannheim) 的酶法乳糖分析试剂盒来测定过程流的乳糖浓度，但也可采用具有可接受精确 性的任何程度的现有技术。由酶法乳糖分析测得的过程流折射率和相应的过程 流乳糖浓度存在线性相关(校正曲线)。所述校正曲线允许通过折射率测定“实 时”估测过程流中的乳糖水平。
超滤(UF)在本发明中定义为利用0.5-500千道尔顿MWCO膜的膜分离 方法，更准确来说应被称为利用0.5千道尔顿膜过滤的纳滤(nanofiltration) 方法。
渗滤(DIA)在本发明中定义为批量方式或持续地加水至滞留物中并不断 用水移除膜渗透物的膜分离方法。
反渗透(RO)定义为实质上的脱水技术，通过RO膜移除水分和小的水相 溶质。
适宜的超滤和渗滤的膜的实例是GE Osmonics(明内通卡，明尼苏达州， 美国)的GH系列膜。
GH膜的典型工业用途包括：纺织品染料的脱盐和浓缩，废水流的脱色， 和化学纯化。GH膜一般不用于乳品工业，而本专利描述了它们用于从得自乳 品的料液中纯化唾液酰乳糖的首次获知的应用。
虽然唾液酰乳糖在反刍动物乳汁中的含量相对于总的碳水化合物含量很 低，但令人惊奇的是，浓缩唾液酰乳糖的尝试被发现是成功的。通过下述的几 种膜过滤技术即可生产一种营养化合物，其唾液酰乳糖的含量为1 w/w％-40wt/wt％，优选为5wt/wt％-20wt/wt％，乳糖含量为1wt/wt％-95wt/wt％， 以及蛋白含量为0wt/wt％-95wt/wt％。
只要不超过生产商所推荐GH系列膜的最高温度50℃，在任何温度下都 可实施该方法。
料液的pH不应超过膜生产商所推荐的最大限度，通常为1-13。本发明使 用来自于乳制品的原料作为原料流(feed stream)，其pH一般为但不限于6-7。 所述在不加通常用于使pH标准化的酸、碱、缓冲液或其他材料的情况下，可 将所述源于乳的进料原料直接进行加工。
膜压力差异不应超过膜生产商所推荐的最大限度，通常为每膜元件 0.5-1.5bar。可调整料液压力以获得最佳的膜渗透性，具有更高的压力通常压缩 膜孔并影响渗透性。本发明所采用的料液压力为1-40bar，但不限于此。优选 1-20bar的料液压力，对于Osmonics GH系列膜，最优选5-10bar。在所推荐 的2-11bar范围内，pH是不重要的。
本发明中含有高程度提高水平的唾液酰乳糖的浓缩物可经膜过滤源于乳 的料液来制备，所述源于乳的料液如乳清、乳、酪乳，或它们的分馏物。源于 乳的料液经超滤以产生富含唾液酰乳糖的滞留物，其具有显著降低的乳糖和灰 分含量。然后将富含唾液酰乳糖的滞留物进行渗滤以进一步降低乳糖和灰分含 量。
任选地，可以通过反渗透或其他移除液体而不影响基于干物质的重量的唾 液酰乳糖含量的步骤以进一步浓缩经超滤和渗滤获得的浓缩物。从而，超滤/ 渗滤浓缩物可经由反渗透被进一步浓缩为含有约1-40％唾液酰乳糖(干物质的 wt/wt)的反渗透浓缩物。加工料液可以是唾液酰乳糖超滤或渗滤浓缩物，唾 液酰乳糖超滤或渗滤浓缩物的混合物，新鲜料液和唾液酰乳糖超滤或渗滤浓缩 物的混合物，或任一前述料液的稀释液。可一直持续此方法直到浓缩物中唾液 酰乳糖浓度达到所要的水平。
还可将结晶或亲和层析或其组合与上述过滤技术结合起来。
在本发明的另一个实施方式中，将浓缩物单独干燥或与适宜载体材料一起 干燥以获得适于掺入要求富含唾液酰乳糖材料的组分，载体材料如乳清、脱除 矿物质的乳清、乳清/WPI、其他乳清分馏物、乳清或乳的渗透物或浓缩物、 脱脂乳、全脂乳、半脱脂乳、麦芽糊精、蔗糖、乳糖、或天然淀粉或预凝胶化 淀粉。产品既可喷雾干燥也可冷冻干燥。
唾液酰乳糖浓缩物适于应用到食品例如，但不限于，婴儿营养品、蛋白棒、 运动营养产品、饮料、保健补充物、用于医药目的的食品或临床营养品，以提 供日常生理所需剂量的唾液酰乳糖。然而将其掺入其他种类食品的应用在技术 上和营养学上也是可行的。
将通过下列非限制性实施例进一步阐述本发明。
实施例1
采用12GH8040C1566超滤膜(GE Osmonics，material nr.1207118)超滤 3500kg分馏后的牛乳滞留物，料液温度10℃，压力5-7bar。
通过超滤将料液量减少至500kg后，在料液温度10℃，压力5-7bar条件 下进行批量渗滤(12×GH8040C1566超滤膜，GE Osmonics，material nr. 1207118)。渗滤用水(3次添加，共1430kg)被以分批方式加入过滤器中。持 续进行渗滤直至渗滤渗透物的折射率≤0.1白利糖度(brix)。
渗滤产生106kg渗滤滞留物，其可在料液温度5-10℃，压力25bar下进行 反渗透(1×SF3840反渗透膜，GE Osmonics)来浓缩。
反渗透过滤将106kg渗滤滞留物减成14.5kg的浓缩物，其被干燥成最终 的粉末含(干物质的wt/wt)：
唾液酰乳糖        14％
乳糖              44％
蛋白              8％
脂肪              0.1％
矿物质            8％
在后续实施例中该产品将作为唾液酰乳糖浓缩物。
实施例2
采用18GH3840-30D超滤膜(GE Osmonics)超滤1600kg分馏后的乳清 渗透物，料液温度10℃并且压力5-7bar。
通过超滤将料液量减少至170kg后，在料液温度10℃，压力5-7bar条件 下进行渗滤(18×GH3840-30D超滤膜，GE Osmonics)。渗滤用水(共904kg) 持续地加入以维持过滤器(filtration plant)中恒定滞留物量。持续进行渗滤直 至渗滤渗透物的折射率≤0.2brix。
渗滤产生170kg渗滤滞留物：干重为0.4％，唾液酰乳糖0.030％和乳糖 0.22％。其符合含有7.5％唾液酰乳糖(干物质的wt./wt.)的唾液酰乳糖浓缩物。
实施例3
采用18GH3840-30D超滤膜(GE Osmonics)超滤3000kg分馏后的乳清 滞留物，料液温度10℃，压力5-7bar。
通过超滤将料液量减少至170kg后，在料液温度10℃，压力5-7bar条件 下进行渗滤(18×GH3840-30D超滤膜，GE Osmonics)。渗滤用水(共1241kg) 持续地加入以维持过滤器中恒定滞留物量。持续进行渗滤直至渗滤渗透物的折 射率≤0.5brix。
渗滤产生170kg渗滤滞留物，可在料液温度5-10℃，压力25bar下进行反 渗透(1×SF3840反渗透膜，GE Osmonics)将其浓缩至21.29kg。
在料液温度10℃，压力5-7bar条件下，将8.63L反渗透浓缩物进行批量 渗滤(1×GH3840-30D渗滤膜，GE Osmonics)。并将渗滤用水(3次添加，共 69.5kg)以分批方式加入过滤器中。渗滤滞留物被干燥成含有7.17％唾液酰乳 糖(干物质的wt/wt)的唾液酰乳糖浓缩物。
实施例4
将实施例1中制备的唾液酰乳糖浓缩物与含80wt/wt％蛋白的乳清蛋白浓 缩物(Lacprodan 80，Arla Foods，丹麦)在混合桶中混合直至完全溶解。通过 粉末填料斗(powder addition funnel)将乳清蛋白浓缩物添加连接到唾液酰乳 糖浓缩物再循环流中。唾液酰乳糖浓缩物和乳清蛋白浓缩物是以唾液酰乳糖浓 缩物33％和乳清蛋白浓缩物66％的配比进行混合的。
在其返回搅动的混合桶之前，混合浓缩物被导入内嵌(in line)的混合器 中，其中得到搅拌。经混合后，所述浓缩物被泵至新桶中，再从这经平板预热 器(预热温度75℃)被泵至喷雾塔。通过高压泵所述混合物被泵入尼鲁(Niro) 喷雾塔中，在以下条件进行喷雾：
喷射压力               195bar
喷嘴                   Delawan 4×28/54
进风温度(Hot air temp) 200℃
排风温度               92℃
该方法获得了最终的唾液酰乳糖浓缩物蛋白粉末，其组成如下(干物质的 wt/wt)：
唾液酰乳糖             5％
乳糖                   21％
蛋白                   60％
脂肪                   6％
矿物质                 8％
实施例5
在本发明的这个实施例中，用唾液酰乳糖浓缩物强化基于牛乳的新生儿配 方奶粉，而其他配方奶粉如：第二阶段配方奶粉，成长配方奶粉，早产儿配方 奶粉或基于大豆的配方奶粉也可用类似的方法强化，因此也被考虑包含在此实 施例中。制备该实施例以符合欧盟有关脂肪、蛋白、碳水化合物和灰分浓度的 相关法规(授权指示91/321/EEC关于婴儿配方食品和第二阶段配方食品)。
根据本发明实施例的计算，据估计在基于牛乳的婴儿配方奶粉中天然的结 合唾液酸的低聚糖浓度为30mg/L。而强化后的目标浓度为260mg/L，在人成 熟乳的含量范围内。
在表1中显示了用于新生儿(starter infant)配方奶粉中的常规成分和最终 配方奶粉的营养分布。在表2的例子中，在相同婴儿配方奶粉每100g粉末中 强化了2.369g的唾液酰乳糖浓缩物，相当于每100g粉末含354mg唾液酰乳糖 或173mg结合唾液酸的低聚糖。每升添加133g粉末时，每升配方奶粉强化了 230mg结合唾液酸的低聚糖。此外，配方奶粉还有天然的结合唾液酸的低聚糖 含量为30mg/L左右，使得结合唾液酸的低聚糖总含量约为260mg/L。
表3所示例子中的婴儿配方奶粉，每100g配方奶粉中强化了7.080g唾液 酰乳糖浓缩物蛋白粉末，相当于每100g粉末含354mg唾液酰乳糖或173mg 结合唾液酸的低聚糖。如上，每升添加133g粉末时，由于在天然结合唾液酸 的低聚糖含量约为30mg/L的基础上另每升强化230mg结合唾液酸的低聚糖， 则最终配方奶粉中结合唾液酸的低聚糖总含量约为260mg/L。
表1.典型新生儿配方奶粉和含酪蛋白比乳清蛋白为40/60的最终配方奶 粉的成分营养分布

表2.新生儿配方奶粉和强化了本发明实施例1的唾液酰乳糖浓缩物且含 酪蛋白比乳清蛋白为40/60的最终配方奶粉的成分营养分布

表3.新生儿配方奶粉和强化了本发明实施例2的唾液酰乳糖浓缩物蛋白 粉末且含酪蛋白比乳清蛋白为40/60的最终配方奶粉的成分营养分布

为了简明，不同的矿物质和维生素没有详细说明，但显而易见矿物质和维 生素的添加应根据唾液酰乳糖浓缩物和唾液酰乳糖浓缩物蛋白粉末的含量贡 献来调整。另外，为保证酪蛋白/乳清蛋白为40/60，唾液酰乳糖浓缩物和唾液 酰乳糖浓缩物蛋白粉末中的蛋白被视为乳清蛋白。而这两种成分中的唾液酰乳 糖被视为碳水化合物。唾液酰乳糖浓缩物和唾液酰乳糖浓缩物蛋白粉末中的部 分氮素并不是真蛋白，因而需据此调整蛋白水平，但为简明起见，没有包括在 本实施例中。