우유 및 이를 포함하는 식품 조성물

우유 및 이를 포함하는 식품 조성물 {MILK AND FOOD COMPOOSITION INCLUDING THE SAME}

본 발명은 우유 및 식품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알러지 피부염 유발성이 저감된 우유 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

우유는 여러 동물의 젖들 중에서 인간에게 영양적으로 가장 완전에 가까운 식품이며, 양적인 면과 경제적인 면에서 인간이 가장 편리하게 이용할 수 있도록 오랜 기간을 통해 개발된 식품이다. 우유의 단백질은 각종 아미노산 이외에도 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산을 다량 함유하고 있어 더욱 영양적 가치가 높다. 그 외에도 비타민, 무기질 등 필수 영양소가 매우 풍부하게 포함되어 인류의 완전한 식품이라고 알려져 있다.

시중에 판매되는 우유는 원유를 가공 처리하여 얻어지는 것으로서, 원유는 가공 처리 중에 바람직하지 않은 효소를 불활성화시키고, 병원성 및 변질 미생물을 파괴하기 위해 열처리된다.

그러나, 열 처리는 pH 감소, 칼슘의 석출, 단백질 변성, 갈변화, 그리고 카제인의 변형 등의 문제를 야기할 수 있고, 이러한 변화는 중요하고 관능 특성, 영양 가치, 열교환기를 뒤엉키게 하는 민감성 그리고 침전물 형성에 영향을 미친다.

뿐만 아니라, 이러한 단백질 변성은 우유 알러지에 의한 피부염, 아토피 피부염 등을 유발할 수도 있다는 문제가 제기되어 오고 있다.

한국등록특허 제 0785516호에는 우유를 60~65℃에서 30분간 살균하는 단계를 포함하는 우유의 제조 방법이 개시되어 있다.

본 발명은 알러지 피부염 유발성이 저감된 우유 및 이를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 원유를 비가열 가압 살균하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되어 알러지 피부염 유발성이 저감된 우유.

2. 위 1에 있어서, 상기 살균은 500MPa 내지 600MPa의 압력으로 3분 내지 10분간 수행되는 것인, 우유.

3. 위 1에 있어서, 상기 원유를 용기에 충진하고 밀봉하는 단계를 더 포함하며, 상기 살균은 상기 밀봉 이후에 수행되는 것인, 우유.

4. 위 1에 있어서, 상기 방법은 조사료가 65중량% 이상 포함된 사료를 급여한 젖소로부터 원유를 얻는 단계를 더 포함하는, 우유.

5. 위 4에 있어서, 상기 사료는 상기 조사료 65 내지 80중량% 및 농후사료 20 내지 35중량%를 포함하는, 우유.

6. 위 4에 있어서, 상기 조사료는 캄보디아 내피어그라스 40 내지 65중량%, 연맥 10 내지 20중량%, 티모시 10 내지 20중량% 및 알팔파 10 내지 20중량%를 포함하는, 우유.

7. 위 2에 있어서, 상기 우유는 오메가 3 지방산 함량이 오메가 6 지방산 함량의 1/10 이상인, 우유.

8. 위 1 내지 7 중 어느 한 항의 우유를 포함하는 식품 조성물.

9. 위 8에 있어서, 상기 식품 조성물은 우유, 요거트, 치즈, 생크림, 아이스크림, 버터, 연유, 유당, 유청, 분유, 육류, 소시지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 스프, 음료 및 알코올 음료로 이루어진 군에서 선택된 것인, 식품 조성물.

10. 위 8에 있어서, 알러지 피부염의 개선능이 있는 식품 조성물.

본 발명의 우유는 단백질 변성이 최소화 되어, 변성 유단백질로부터 기인하는 알러지 피부염의 유발을 억제할 수 있다.

본 발명의 우유는 유해균은 종래와 동일한 수준으로 억제되면서 영양소 파괴는 최소화된 우유를 포함하여, 건강 기능성 및 관능이 우수하다.

도 1은 우유의 제조 공정 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 사료를 젖소에 급여하여 시간 경과에 따라 얻어지는 원유의 오메가 3 지방산과 오메가 6 지방산의 비율을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 및 비교예의 우유의 대장균 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 및 비교예의 우유의 일반 세균 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 및 비교예의 우유의 일반 세균 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 및 비교예의 우유의 유산균 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 및 비교예의 우유의 비피더스균 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 및 비교예의 우유의 효모 및 곰팡이 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 비교예 1의 우유에서 분석된 단백질을 분석한 것이다.
도 10은 실시예 2의 우유에서 분리된 단백질을 분석한 것이다.
도 11은 실시예 3의 우유에서 분리된 단백질을 분석한 것이다.
도 12는 실시예 6의 우유에서 분리된 단백질을 분석한 것이다.
도 13은 비교예 2의 우유에서 분리된 단백질을 분석한 것이다.
도 14는 관능 평가 대상 패널의 나이대 및 성별을 나타낸 것이다.
도 15는 관능 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실시예 및 비교예의 우유의 리파아제, 프로테아제 활성을 나타낸 것이다.
도 17은 실시예 및 비교예의 우유의 알칼린 포스파타아제, 락토퍼옥시다아제 활성을 나타낸 것이다.
도 18은 알러지 피부염 유발 정도를 실험하기 위해, 마우스에 알러지 피부염을 유발하는 공정 순서이다.
도 19는 실시예 및 비교예의 우유를 경구 투여한 군과 대조군의 마우스 등 피부 상태를 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 및 비교예의 우유를 경구 투여한 군과 대조군의 마우스 등 피부의 상처 수준을 점수화한 것이다.
도 21은 실시예 및 비교예의 우유를 경구 투여한 군과 대조군의 마우스 혈청의 IgE level을 나타낸 것이다.
도 22는 실시예 및 비교예의 우유를 경구 투여한 군과 대조군의 마우스의 림프절 크기를 나타낸 것이다.
도 23은 실시예 및 비교예의 우유를 경구 투여한 군과 대조군의 마우스 피부 조직의 병리학적 특징을 관찰할 수 있는 사진이다.

본 발명은 원유를 비가열 가압 살균하는 단계를 포함하는 방법으로 제조됨으로써, 단백질 변성이 최소화되어, 변성 유단백으로부터 기인하는 알러지 피부염의 유발을 최소화할 수 있는 우유 및 이를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 알러지 피부염 유발성이 저감된 우유는 원유를 비가열 가압 살균하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것이다.

본 발명의 우유는 예컨대, 젖소로부터 원유를 얻는 단계; 얻어진 원유를 여과 및 청정하는 단계; 청정된 원유를 균질화하는 단계; 균질화된 원유를 용기에 충진하고 밀봉하는 단계; 및 밀봉된 원유를 살균하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.

각 단계를 예시하면 다음과 같다.

먼저, 젖소로부터 원유를 얻는다.

조사료(roughage)는 섬유질 함량이 높은 거친 사료를 의미하는 것으로서, 젖소에게 급여하는 경우 되새김과 침 분비를 촉진하고, 반추위의 발달을 좋게 하며, 번식장애와 각종 대사성 질병의 예방에 중요한 역할을 한다.

사료가 조사료를 65중량% 이상 포함하는 경우, 이를 급여한 젖소의 건강 및 축산 생산성을 현저히 개선할 수 있고, 오메가 3 지방산과 오메가 6 지방산 함량비를 상기와 같이 조절 가능하며, 비타민, 미네랄 등 영양 비율이 우수하다. 조사료는 바람직하게는 65중량% 내지 80중량%로 포함될 수 있다. 이에 따라, 영양소 함량도 높은 식품 조성물을 제조할 수 있다.

사용할 수 있는 조사료의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 알팔파, 티모시, 연맥, 버뮤다, 라이그라스, 클라인, 캄보디아 내피어그라스 등을 사용할 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 오메가 3 지방산 함량 개선을 극대화하면서, 젖소의 생장에 요구되는 영양 균형도 동시에 충족시킨다는 측면에서 바람직하게는 캄보디아 내피어그라스, 연맥, 티모시, 알팔파 등을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 캄보디아 내피어그라스, 연맥, 티모시 및 알팔파를 사용할 수 있다.

조사료가 캄보디아 내피어그라스, 연맥, 티모시 및 알팔파를 포함하는 경우, 캄보디아 내피어그라스 40 내지 65중량%, 연맥 10 내지 20중량%, 티모시 10 내지 20중량% 및 알팔파 10 내지 20중량%를 포함할 수 있다. 캄보디아 내피어 그라스는 오메가 3 지방산 함량이 높고, 가격이 저렴하여 상기와 같이 다량 포함됨으로써, 조사료의 오메가 3 지방산 함량을 높이고 원가를 절감시킬 수 있다. 그리고, 연맥, 티모시 및 알팔파 모두 오메가 3 지방산 함량이 높아, 상기 사료들을 상기 함량으로 포함시 오메가 3 지방산 함량을 전술한 범위로 조절하면서도 젖소의 생장에 요구되는 영양 성분 요구량을 충족시킬 수 있다.

본 발명에 따른 사료는 농후사료를 더 포함한다.

농후사료(concentrated feed stuff)는 부피가 작고 섬유소가 적으며 가소화 양분이 많은 사료로서, 상기 조사료와 함께 농후사료를 더 포함하여 오메가 3 지방산, 미네랄 등의 영양소 외에도 지방, 단백질 등의 영양소 밸런스가 우수하다.

사용할 수 있는 농후사료의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 미나리, 총체벼, 아마, 잭푸르트, 카사바, 타피오카, 사탕수수, 소맥분, 파파야, 채종박, 파인애플, 코코넛, 바나나, 카사바건칩, 들깻묵 등을 들 수 있고, 바람직하게는 미나리, 총체벼, 아마, 잭푸르트, 카사바, 타피오카, 사탕수수, 소맥분, 파파야, 채종박 등을 들 수 있다. 이들은 단독 또는 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다. 이들 농후사료는 오메가 6 지방산 함량이 낮으면서, 이와 동시에 단백질, 지방 등 영양소 함량은 높아 바람직하다.

필요에 따라, 농후사료는 석회석, 식염, 비타민, 무기질, 효모 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다.

농후사료는 사료에 잔량으로 포함되는 것으로서, 35중량% 이하, 바람직하게는 20 내지 35중량%로 포함될 수 있다. 농후사료 함량이 상기 범위 내인 경우 본 발명에 따른 사료가 상기 조사료를 충분히 포함하여 오메가 3 지방산, 비타민, 미네랄 등의 성분을 다량 포함하면서, 단백질, 지방 등의 영양소도 고루 포함할 수 있다.

원유의 여과 및 청정은 원유 내에 있는 먼지, 공기, 우유 응고물 등을 제거하는 공정으로, 이러한 원유 내 불순물을 제거함으로써 원유 본래의 풍미가 증진된다.

원유를 필터를 통해 여과하고, 여과된 원유를 원심분리하여 청정시킬 수 있다.

원유의 여과 전에 원유를 검사하는 단계를 더 포함할 수 있다.

검사 단계는 집유된 원유의 신선도와 유제품 원료로서의 적합성을 판정하는 단계로서, 관능검사, 비중검사, 알코올 검사, 산도 검사 등 다양한 검사를 거쳐서 합격된 원유만을 가공처리한다.

균질화 단계는 상기 청정된 원유의 유지방 함량을 일정하게 균질화하여, 맛과 품질을 유지할 수 있도록 한다.

구체적으로, 원유가 생산되는 목장 또는 계절에 따라 원유 내의 지방 함량에 차이가 발생하고, 그에 따라 우유의 맛과 품질에 변화가 발생할 수 있으므로, 우유 상층부의 크림 형성을 방지하고 소화가 용이하도록 원유 내의 지방 함량을 일정하게 균질화하는 과정이 필요하다.

균질화 공정은 원유 내의 지방구를 미세하게 분쇄시킴으로써 수행될 수 있다.

이후에 균질화된 원유를 용기에 충진하고 밀봉한다.

그러고 나서, 밀봉된 원유를 살균한다.

원유의 살균법으로는 대표적으로 저온살균법(low temperature long time method, LTLT), 고온 단시간 살균법(high temperature short time method, HTST) 및 초고온 가열법(ultra high temperature heating method, UHT)이 있다.

저온살균법은 원유를 62 내지 65℃에서 약 30분간 가열처리하는 방법으로, 일반 세균은 90% 이상 사멸하고 병원균은 전부 사멸하게 된다. 하지만 유산균, 비피더스균 등 유익균도 함께 사멸하게 되고, 그외 단백질, 미네랄 등 영양소들도 열변성 또는 파괴된다.

고온 단시간 살균법은 원유를 72℃에서 15초간 가열 살균하는 방법으로, 대량의 우유를 연속적으로 살균 처리가 가능하기 때문에 가장 보편적으로 사용되는 방법으로, 저온살균법보다 생균수가 더욱 감소된다.

초고온 가열법은 원유를 130 내지 150℃에서 2초간 살균하여 멸균 상태로 만드는 방법이다.

그러나, 이러한 대표적인 살균법들은 유단백을 열변성 또는 파괴시켜, 알러지 피부염을 유발할 수 있다. 그리고, 모두 원유에 존재하는 유익균 수를 상당히 감소시키고, 이에 따라 관능도 저하되는 문제점이 있다.

또한, 원유를 가열하므로 통상적으로 용기에 밀봉된 제품 상태로는 가열 살균이 불가하고, 살균 이후에 냉각 등의 추가 공정을 거친 후에야 용기로의 충전 및 밀봉이 가능하다. 즉, 원유가 살균되고 나서 밀봉되기까지 추가 공정을 더 거쳐야 하므로, 추가 공정 중에 오염원에 노출될 수 있다.

그러나, 본 발명은 원유를 비가열 가압 살균한다. 이에 따라, 유단백의 변성을 최소화하여, 변성 유단백으로부터 기인하는 알러지 피부염의 유발을 억제할 수 있다. 또한, 영양소 함량이 높은 우수한 원유의 영양소 파괴 및 유익균 감소를 최소화하고, 우수한 기능성 및 원유에 가까운 관능을 유지할 수 있다.

그리고, 가열 없이 수행되는 바, 원유를 용기에 충진하여 밀봉한 후에 수행될 수 있어, 살균 이후에 오염원에 노출될 가능성을 근본적으로 없앨 수 있다.

본 발명에 따른 살균은 가열 없이 수행되는 것으로서, 가열 없이도 살균 효과를 나타내기 위해 초고압으로 수행될 수 있다. 예를 들면 500 내지 600MPa의 압력으로 수행될 수 있다. 압력이 500MPa 미만이면 원유에 존재하는 다양한 균에 대한 충분한 불활성화 및 살균 효과를 나타내기 어려울 수 있고, 압력이 600MPa 초과이면 압력 증가에 따른 살균력 개선 효과가 미미하고, 공정 비용이 현저히 증가되는 문제가 있다.

살균은 가열 없이 상온(예를 들면 10 내지 25℃)에서 수행될 수 있다.

살균 시간은 특별히 한정되지 않고 병원성 균은 멸균시키면서, 유익균 및 영양소 파괴는 억제할 수 있도록 적절히 선택되어 수행될 수 있으며, 예를 들면 3분 내지 10분간 수행될 수 있다. 살균 시간이 3분 미만이면 살균 효과가 충분치 않을 수 있고, 10분 초과이면 공정 비용이 현저히 증가하며, 단백질의 변성을 유발할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 우유를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 우유를 포함(함유)하거나, 우유로 제조되는 제품을 모두 포함한다. 예를 들면, 우유 자체; 요거트, 치즈, 생크림, 아이스크림, 버터, 연유, 유당, 유청, 분유 등의 유제품; 육류, 소시지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 스프, 음료, 알코올 음료 등의 각종 식품을 들 수 있다.

전술한 방법으로 제조된 우유는 알러지 피부염의 유발이 억제된 것인 바, 상기 우유를 포함(함유)하거나, 우유로 제조되는 제품을 포함하는 본 발명의 식품 조성물은 알러지 피부염 유발성이 저감되어, 우유로부터 기인하는 알러지 피부염을 억제할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 발명자들은 상기 식품 조성물이 알러지 피부염의 개선능도 갖는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

제조예 1. 사료의 제조

하기 표 1에 기재된 성분 및 함량을 갖는 사료를 제조하였다.

내추럴 믹스의 경우 미나리, 총체벼, 아마, 잭푸르트, 카사바, 타피오카, 사탕수수, 소맥분, 파파야 및 채종박을 혼합하여 사용하였다.

제조된 사료의 오메가 6 지방산 함량/ 오메가 3 지방산 함량은 1.82였다.

제조예 2. 사료의 제조

하기 표 2에 기재된 성분 및 함량을 갖는 사료를 제조하였다. 제조된 사료의 오메가 6 지방산 함량/ 오메가 3 지방산 함량은 11.54였다.

실시예 . 우유의 제조

제조예 2의 사료를 급여해온 농장의 젖소에 제조예 1의 사료를 급여하여, 해당 젖소로부터 원유를 얻었다.

다만, 젖소의 사료 배합을 단시간 내에 변경하면 젖소에 급격한 스트레스를 유발할 수 있으므로, 제조예 1의 사료량을 점차 늘려가며 급여하였다. 사료의 배합비는 하기 표 3과 같다.

사료 급여 1주차부터 19주차까지 주 1회 착유하여, 원유의 오메가 3 지방산 함량과 오메가 6 지방산 함량을 측정하여, 그 비를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 6주차에 오메가 6 지방산 함량/ 오메가 3 지방산 함량이 다소 증가하기는 하나, 이후에 오메가 6 지방산 함량/ 오메가 3 지방산 함량이 점차 감소한 것을 확인할 수 있다.

제조예 1의 사료를 100% 급여하고 2주가 경과한 후부터는 오메가 6 지방산 함량/ 오메가 3 지방산 함량이 4 이하로 낮아, 오메가 6 지방산 함량이 낮고, 오메가 3 지방산 함량이 높은 원유가 얻어졌다.

19주차에 얻어진 원유를 50메쉬의 필터로 여과하고, 4℃로 냉각한 다음, 4800rpm으로 회전하는 청정기에 투입하여 청정하였다.

이후에, 65℃에서 150kg/cm ³ 의 압력으로 청정된 원유를 균질화하고 PET 재질의 용기에 충전하고 밀봉하였다.

이후에, Hiperbaric사의 초고압처리기를 이용하여, 하기 표 4에 기재된 조건으로 원유를 살균하였다.

비교예 . 우유의 제조

상기 실시예와 동일하게 여과, 냉각, 청정 및 균질화된 원유에 대하여 하기 표 5에 기재된 살균법을 적용하고, 4℃로 냉각한 다음, PET 재질의 용기에 충전하고 밀봉하여 우유를 제조하였다.

실험예

1. 우유 살균방법에 따른 제어 미생물의 정량 분석 방법

(1) 제어 미생물 분석 재료 및 방법

일반 세균: 시료를 Plate Count Agar (PCA, Difco)에 도말(spreading)하고 30℃, 48시간 배양하여 생성된 콜로니의 수(CFU/ml)를 계수하여 시료에 잔존하는 일반 세균의 수를 측정하였다.

대장균 군： Desoxycholate Lactose Agar (DLA, Oxoid)를 사용하여 시료원액은 주입평판(Pouring), 희석액은 도말평판으로 30℃, 24시간 배양하여 Coliform Count Plate (Petrifilm, 3M)를 사용하여 잔존하는 대장균 군의 수를 측정하였다.

총 유산균： BCP Plate Count Agar (BCP, Eiken)를 사용하여 30℃, 72시간 배양한 뒤, 발생된 황색의 집락을 총 유산균수의 집락으로 계수하였다.

비피더스균: BL Agar (BL, Eiken)를 이용하여 30℃, 72시간 배양한 뒤, 시료에 발생된 유갈색~황갈색의 비피더스균 수를 측정하였다.

병원성 대장균: 축산공전에 따라 MacConkey Agar로 분리배양 한 뒤, Triple Sugar Iron (TSI)의 경사면에 획선평판(streaking)하여 37℃, 24시간 동안 가스교환이 가능하도록 뚜껑을 느슨하게 닫아 배양하고, 배지의 경사면이 발효에 의해 노란색이 띄는지 확인하여 병원성 대장균의 양성 유무를 판정하였다.

살모넬라균: Triple Sugar Iron (TSI)의 경사면에 획선평판하여 37℃, 24시간 배양하였다. 경사면이 유당과 서당의 비분해로 인해 배지가 붉게 변하는지 확인하여 양성 유무를 판정하였다.

리스테리아 모노사이토제네스: Listeria Oxford Agar (LOA)를 사용해 배지 표면에 시료를 획선평판하여 37℃, 24시간 배양하였다. 전형적인 Listeria colonies는 갈색~회갈색을 띄는데 이를 기준으로 양성유무를 판단하였다.

캠필로박터 제주니: Triple Sugar Iron (TSI)의 경사면에 획선평판 하여 37℃, 24시간 배양하였다. 경사면이 당 발효에 의해 배지는 노란색으로 변하며, 경사면과 butt부분은 적색으로 변하는데 색 변화로 양성유무를 판단하였다.

클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens): Clostridium perfringens 수의 측정은 식품공전의 방법을 따랐으며, Nutrient Agar Plate를 사용하여 획선평판하였다. 37℃, 20시간 혐기배양한 뒤, 그람염색을 실시하였다. 또 동시에 보통한천배지에서 37℃, 24시간 호기 배양하여 균의 비발육을 확인하여 균의 양성유무를 판단하였다.

클로스트리디움 보툴니눔(Clostridium botulinum): 0.1%의 glucose를 첨가한 Gifu Anaerobic Medium Semi-Solid (GAM)에 접종하여 37℃, 72시간 배양하였다. 운동성이 있는 것(균이 퍼져서 자람)을 양성으로 판정하였다.

주입평판법(Pour plate): 대장균군 실험 시 시험용액 1 ml과 시험용액을 순차적 희석법으로 희석한 각 단계 희석액 1 ml을 멸균 petri dish에 무균적으로 취했다. 약 45℃로 유지한 DLA 배지를 15 ml 분주하고 회전하여 좌우로 기울이면서 시료와 배지를 잘 섞고 응고시켰다. 응고시킨 petri dish는 거꾸로 뒤집어 30℃에서 24시간 배양하였다.

획선평판법(Streak plate): 병원성 대장균과 살모넬라, 클로스트리디움 보툴니눔 실험 시 멸균 1 ㎕ loop를 이용하여 각각의 배지에 시험용액을 묻혀 표면 전체로 획선을 그었고, 시험용액이 접종된 petri dish는 거꾸로 뒤집어 30℃에서 24시간 배양하였다.

도말평판법(Spread plate): 그 외 모든 검출은 도말평판법을 이용하였음. 도말평판법은 멸균된 spreader를 이용하여 배지 표면에 전체적으로 펴서 도말하였음. 시험용액이 접종된 petri dish는 거꾸로 뒤집어 48시간 배양하였다.

(2) 집락수 산정

배양 후 즉시 집락 계산기를 사용하여 생성된 집락수를 계산하였다. 집락수의 계산은 1개의 평판 당 20∼200개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 하였다. 전체 평판에 250개 이상 집락이 발생한 경우 250에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 계산하였다.

(3) 기록

① 20~200 CFU/ plate 인 경우

CFU/ml는 하기 수학식 1과 같이 계산하였다.

[수학식 1]

CFU/ml = [C / {(1 x n1) + (0.1 x n2)}] xd

(식 중, N은 식육(ml) 당 세균 집락수이고, C는 모든 평판에서의 집락수의 합이고, n1은 첫 번째 희석배수에서 계산된 평판수이고, n2는 두번째 희석배수에서 계산된 평판수이고, d는 첫 번째 희석배수에서 계산된 평판의 희석배수임).

[수학식 2]

N = (232 + 244 + 33 + 28) / <(1 x 2) + (0.1 x 2)> x 10 ^-2 = 537/0.022

≒ 24,409

≒ 24,000

② 20 CFU / plate 이하인 경우

③ 200 CFU / plate 이상인 경우

TNTC: too numerous to count

EAPC: estimated aerobic plate count

2. 미생물 분석 결과

(1) 대장균 수

실시예 및 비교예의 우유를 4℃에서 2주간 냉장보관하였다. 냉장 보관 중에 1일, 4일, 7일, 11일 및 14일째에 시료를 각각 채취하여, 대장균 수를 측정하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하면, 비가열 살균을 한 실시예의 경우 LTLT 살균한 우유와 동일하게 대장균이 검출되지 않은 것을 확인할 수 있다.

(2) 총 세균수

실시예 및 비교예의 우유를 각각 4℃와 10℃에서 2주간 냉장보관하였다. 냉장 보관 중에 1일, 4일, 7일, 11일 및 14일째에 시료를 각각 채취하여, 세균 수를 측정하였고, 그 결과는 도 4(4℃) 및 도 5(10℃)에 나타내었다.

도 4 및 도 5를 참조하면, 비가열 살균을 한 실시예의 우유가 LTLT 살균한 우유와 유사한 수준으로 세균이 검출된 것을 확인할 수 있다.

(3) 총 유산균수

실시예 및 비교예의 우유를 4℃ 에서 2주간 냉장보관하였다. 냉장 보관 중에 1일, 4일, 7일, 11일 및 14일째에 시료를 각각 채취하여, 유산균 수를 측정하였고, 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 실시예들의 우유에서 LTLT 살균한 우유보다 많은 유산균이 검출된 것을 확인할 수 있다.

(4) 비피더스균수

실시예 및 비교예의 우유를 4℃ 에서 2주간 냉장보관하였다. 냉장 보관 중에 1일, 4일, 7일, 11일 및 14일째에 시료를 각각 채취하여, 비피더스균 수를 측정하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7을 참조하면, 실시예들의 우유에서 LTLT 살균한 우유보다 많은 비피더스균이 검출된 것을 확인할 수 있다.

(5) 효모 및 곰팡이수

실시예 및 비교예의 우유를 4℃ 에서 2주간 냉장보관하였다. 냉장 보관 중에 1일, 4일, 7일, 11일 및 14일째에 시료를 각각 채취하여, 효모 및 곰팡이 수를 측정하였고, 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하면, 비가열 살균을 한 실시예의 경우 LTLT 살균한 우유와 동일하게 효모 및 곰팡이가 검출되지 않은 것을 확인할 수 있다.

3. 단백질 변성도 측정

실시예 및 비교예의 우유를 1시간 원심분리한 후에 on-chip 전기영동법으로 단백질을 분리하여 패턴을 분석하였다.

그 결과는 도 9 내지 도 13에 나타내었다(도9(비교예 1), 도 10(실시예 2), 도 11(실시예 3), 도 12(실시예 6), 도 13(비교예 2)).

도면을 참조하면, 단백질 크기는 대체로 유사하게 나타났으나, 비교예 2의 우유는 실시예들에 비해 단백질 종류가 다양하게 나타난 것을 확인할 수 있다 이는, 비교예들의 우유는 단백질이 보다 많이 변성되었음을 의미한다.

4. 관능평가

실시예 6의 우유와 비교예 2 및 4의 우유의 관능 평가를 실시하였다.

최근 1개월 내 우유를 음용한 경험이 있는 미취학 아동 및 50대 이하 남녀 37명을 대상으로 전체적인 맛, 고소한 맛, 부드러움(목넘김), 향 및 비린맛에 대해 평가하고, 음용한 우유 중 가장 선호하는 제품에 대해 설문하였다.

평가 기준은 하기와 같으며, 결과는 점수의 평균값으로 나타내었다.

전체적인 맛, 고소한 맛, 부드러움(목 넘김), 우유 향

매우 좋지 않다: 1점 ~ 매우 좋다: 5점

비린 맛

매우 비리지 않다: 5점 ~ 매우 비리다: 1점

패널의 나이대 및 성별은 도 14에 나타내었고, 평가 결과는 도 15에 나타내었다.

도 15를 참조하면, 실시예의 우유가 모든 항목에서 우수한 것으로 나타났고, 특히 전체적인 맛에서 큰 차이를 보인 것을 확인할 수 있다.

그리고, 패널 37명 중 31명이 실시예의 우유를 가장 선호한다고 응답하였고, 비교예 2는 2명, 비교예 4는 4명이었다.

5. 우유 효소의 활성 정량 분석

(1) 실험 방법

실시예 및 비교예의 우유를 4℃ 에서 2주간 냉장보관한 후, 시료로 사용하였다.

리파아제 활성은 10 nM p-nitrophenyl butyrate 100 ㎕, 50 mM potassium phosphate (pH 7.5)의 기질용액 800 ㎕에 균질화시킨 샘플 100 ㎕를 취하여, 37℃ incubator에서 15분간 반응시킨 후 유리된 p-nitro phenyl의 양을 405 nm에서 spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 분석하였다.

프로테아제 활성은 Anshu(2005)와 Wolfgang(2001)의 방법을 변형하여 측정하였다. 구체적으로, 37℃에서 10분간 방치한 0.6% 카제인 용액 0.1ml에 시료 0.1ml을 넣어 37℃에서 10분간 반응시켰다.

여기에 0.4M 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 0.2ml을 가해 37℃에서 25분간 방치시킨 뒤 침전물을 0.45㎛ syringe filter로 여과하여, 여과액 0.1ml에 0.4M Na ₂ CO ₃ 0.5ml과 Folin phenol 0.1ml을 가해 37℃에서 20분간 발색시킨 뒤 냉각하여 660 nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다. 생성된 타이로신(tyrosine)의 양은 ㎍/ml로 나타내었으며, 타이로신의 양으로 작성한 표준곡선에 따라 활성을 비교하였다.

알칼린 포스파타아제 활성은 Abcam사의 Alkaline Phosphatase Assay kit(Colorimetric)(abcam)를 이용하여 측정하였다.

구체적으로, SunRed Dye Substrate에 2차 증류수 100㎕를 넣어 SunRed dye substrate stock solution을 제조하고, 상기 stock solution 20㎕를 Assay buffer 5ml에 첨가하여 Assay reaction mixture를 제조하였다.

이후, 알칼린 포스파타아제 스탠다드에 0.1% BSA(N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide) 증류수 희석액 100ml를 첨가하여 알칼린 포스파타아제 스탠다드 용액을 제조하여 well에 넣었다.

그리고, 나머지 well에 상기 BSA 증류수 희석액 및 실시예 및 비교예의 우유 50㎕를 각각 넣은 다음, 모든 well에 상기 assay reaction mixture 50㎕를 첨가하여 암실에서 60분간 방치한 후에, 405 nm에서 spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

락토퍼옥시다아제 활성은 Cloud-Clone Corp 사의 ELISA kit for 락토퍼옥시다아제 (LPO) Alkaline Phosphatase Assay kit를 제조사의 방법에 따라 분석하였다.

구체적으로, 각 microplate에 시료를 넣고 37℃에서 2시간 반응시킨 후 시료를 제거한 후 Detection Reagent A를 넣고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이를 PBST(Phosphate Buffered Saline Tween-20)로 세척한 뒤 Detection Reagent B를 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척한 다음 substrate solution을 첨가하여 37℃에서 25분간 암반응시킨 후, 반응을 종료시키기 위해 각 microplate에 stop solution을 넣은 후 microplate reader기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 분석하였다.

(2) 실험 결과

1) 리파아제 활성

원유에 존재하는 리파아제는 유리 지방산을 생성시켜 지방 분해취를 발생킨다.

상기 표 9 및 도 16을 참조하면, 실시예의 우유의 리파아제 활성이 비교예들에 비해 현저히 낮은 것을 확인할 수 있다.

2) 프로테아제 활성

프로테아제는 NPN(Non protein Nitrogen) 함량을 증가시키고, 단백질의 응고, 겔화시키며, 쓴맛을 발생시킨다. 또한, 가열 중에 생성한 casein을 분해함으로써, 우유의 중요한 조성성분인 유단백질과 유지방을 분해시킨다.

상기 표 9 및 도 16을 참조하면, 실시예의 우유의 프로테아제 활성이 비교예 4의 UHT법으로 살균한 우유와 유사한 수준으로 낮은 것을 확인할 수 있다.

3) 알칼린 포스파타아제 활성

알칼린 포스파타아제 활성은 우유의 살균 적정 여부의 지표로 이용되는 것으로서, 표 19및 도 17을 참조하면, 실시예의 우유의 알칼린 포스파타아제 활성이 LTLT, HTST 법으로 살균한 우유보다 낮은 것을 확인할 수 있다.

4) 락토퍼옥시다아제 활성

표 9 및 도 17을 참조하면, 실시예의 우유들의 락토퍼옥시다아제 활성이 비교예들보다 다소 높기는 하나, 저하된 것을 확인할 수 있고, 비교예 6의 경우는 LTLT 법으로 살균한 우유와 유사한 결과를 나타내었다.

6. 알러지 피부염 유발 정도 측정

(1) 실험 방법

실험동물은 6주령 수컷 Balb/c mice를 Damul Science(Daejeon, Korea)로부터 구입하여 온도 20±2℃와 습도 50±15%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실험실에서 1주일간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다.

Lee 등(2010)의 방법을 약간 변형하여 도 18의 순서도에 따라 알러지 피부염을 유발하였다. 생후 6주령의 수컷 Balb/c 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후, 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 24시간 후 1% 2,4-dinitrochlorobenzene (DNCB) 용액(acetone:olive oil = 3:1)을 0, 3일 째에 마우스의 등 부위에 도포하고 6일에 다시 제모하였다. 일주일 후부터 0.2% DNCB 용액을 7, 10일째에 동일한 부위에 고르게 도포하여 알러지 피부염을 유발하였다.

실험 동물은 정상군(Naive), 증류수를 경구 투여한 대조군(NC), 항히스타민(kerotifen, 1 mg/kg/200 ㎕)을 경구 투여한 양성 대조군(PC), 실시예 1의 우유를 경구 투여한 HPP군, 비교예 2의 우유를 경구 투여한 LTLT군, 비교예 3의 우유를 경구 투여한 HTST군, 비교예 4의 우유를 경구 투여한 UHT군으로 나누어 총 7개의 군으로 나누어, 각 시료를 알러지 피부염 유발 11일부터 7일 동안 매일 경구투여 하였다.

실험이 종료된 후 카메라로 촬영한 후 피부 조직의 외형적인 변화를 관찰한 후 피부 병변은 erythema/hemorrhage（홍반/출혈), edema (부종), excoriation/erosion (찰상/짓무름), scarring/dryness (흉터/건조)의 각각의 정도에 따라 없음(0점), 증상 약함(1점), 보통(2점), 심함(3점)으로 총 12점으로 판정하였다.

실험 종료일에 복부 대동맥에서 채혈한 후, 이를 4℃, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 실험에 사용되기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

마우스 혈청 내 total IgE의 함량은 ELISA kit(BD Pharmingen, San Diego, CA)을 이용하여 측정하였다. 먼저, ELISA microplate에 anti-mouse IgE를 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 coating시켰다. 이를 PBST (PBS + 0,05% Tween 20)로 세척하고 10% FBS (Fetal bovine serum) 용액으로 blocking 하였다. 이를 PBST로 세척한 뒤 각 microplate 에 1/25로 희석한 혈청을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 다시 PBST로 세척하고 희석한 biotinylated anti-mouse IgE streptavidin-horseradish peroxidase conjugate를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 PBST로 세척한 다음, tetramethylbenzidine (TMB) 및 hydrogen peroxide를 첨가한 substrate solution을 첨가하여 실온에서 30분 동안 암반응시켰다. 반응을 종료시키기 위해 각 microplate에 1 N H3PO4를 넣은 후, microplate reader기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그리고, 피부조직을 적출하여 10% paraformaldehyde (pH7.4)로 고정하여 일련의 과정을 통하여 파라핀 블록을 제작한 후, 5μm 간격으로 피부조직을 종단면으로 절편하였다. 이를 조직학적 검사를 위해 hematoxylin & eosin로 염색하고 x100 현미경 시야에서 사진을 찍어 제시하였다(Olympus, Japan).

모든 실험 결과는 SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 기술적인 통계치를 산출하였다. 결과는 평균±표준편차로 표시하였고, 실험군의 평균 간의 유의성을 Duncan's multiple range test로 p < 0.05 수준에서 검증하였다.

(2) 실험결과

1) 피부 관찰

도 19를 참조하면, 비교예 2 및 4의 우유를 투여한 군에서는 부종, 표피 박리 등 아토피 증상이 관찰되었으나, 실시예 1의 우유를 투여한 군에서는 항히스타민 투여군(PC)과 유사한 수준으로 아토피 증상이 억제된 것을 확인할 수 있다.

2) 상처 수준 비교

도 20을 참조하면, 실시예 1의 우유를 투여한 군에서는 홍반, 부종 등 병변이 항히스타민 투여군(PC)보다도 낮은 것을 확인할 수 있다.

3) IgE 레벨 비교

도 21을 참조하면, 비교예 2 및 4의 우유를 투여한 군은 증류수 투여군(NC)과 유사한 수준의 IgE 함량을 나타냈으나, 실시예 1의 우유를 투여한 군은 항히스타민 투여군과 유사한 수준으로 IgE 함량이 감소한 것을 확인할 수 있다.

4) 림프절 크기 비교

염증 반응 주변의 림프 조직은 항원 제거를 위해 세포분화가 활발하게 일어나, 림프절이 커진다.

도 22를 참조하면, 실시예 1의 우유를 투여한 군은 항히스타민 투여군보다도 림프절의 크기가 작은 것을 확인할 수 있다.

6) 조직병리학적 특징

도 23을 참조하면, 증류수 투여군(NC)에서는 마우스의 피부 긁음으로 발생한 층판소체를 확인할 수 있고, 비교예 4의 우유 투여군에서는 진피 조직의 상처로 인해 표면이 울퉁불퉁해지고 재생이 가장 느리게 진행되는 것을 확인할 수 있다.

그러나, 실시예 1의 우유를 투여한 군에서는 피부의 복구 및 재생시 관찰되는 ES cell이 관찰되었다.