분비 면역글로블린이 풍부한 우유 분획 제조방법

분비 면역글로블린이 풍부한 우유 분획 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING MILK FRACTIONS RICH IN SECRETORY IMMUNOGLOBULINS}

본 발명은 S-IgA를 함유하는 우유를 분획화하여 분비 IgA(S-IgA)이 풍부한 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 조성물은 예를 들어, 상기 조성물을 약제, 식품 또는 화장품에 편입시킴으로써, 치료가 요구되는 인간 또는 동물에서 특히, 예를 들어, 위장관, 비뇨생식관, 기도, 비강 또는 구강과 같은 점막 표면의 감염 및/또는 염증의 치료 및/또는 예방, 비만 및 관련 질병의 치료 및/또는 예방, 또는 식품 알러지의 치료 및/또는 예방중 하나 이상에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 탈지와 여과 및 농축 단계를 포함하는 상기 밀크 분획을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 획득가능한 우유 분획, 이를 함유하는 산물 뿐만 아니라 상기 산물의 용도에 관한 것이다.

항체들은 과학 및 의학 분야에서 많이 응용된다. 어떤 표적에 대해 새로운 항체를 생성하는 것은 꽤 복잡하지 않다. 대부분의 적용에 있어서, 항체들은 B-세포 생성 항체와 불멸화 세포주의 융합으로부터 생성되는 소위 하이브리도마 세포주에 의해 생성된다. 이러한 하이브리도마 세포는 쉽게 배양될 수 있으며, 항체는 배양 상층액으로부터 수거될 수 있다. 항체를 생성하는 다른 방법은 면역화된 동물의 혈청으로부터 수거하는 것이다. 가축의 사육 기술은 보편화되어 있으며, 가축 사육 시설은 상대적으로 저렴하다.

가축의 포유류 분비 산물에서 면역 특이적 항체의 생성은 이미 지난 수십년간 실현가능한 것으로 입증되었다. 초기에, 가장 우수한 결과는 초유, 즉, 새끼가 탄생한 후 여성에 의해 생성되는 첫번째 유즙액에서 획득되었다. 초유 단계후 여성에 의해 생성되는 젖은 본 명세서에서 성숙유라 칭하여진다. 초유는 포유류 분비선의 독특한 생리학적 및 기능성 상태에서 생성되는 상당히 독특한 산물이다. 반추동물에서 초유와 성숙유의 기본적 조성 차이는 이의 80-90%가 IgG 부류인, 매우 높은 초유 면역글로블린의 함량이다. 성숙유에서 항체 수준은 초유에서 달성될 수 있는 것보다 (대략적으로 등급으로) 기본적으로 낮다(Hodgkinson et al., WO 98/54226; Hastings, 미국 특허 제 5,017,372호). 따라서, 대부분의 임상 및 전임상 시험에서 사용되는 우유-유래 항원 특이적 항체는 실제로 초유-유래이며 주로 IgG 부류에 속하는 것이었다(Tollemar et al., Bone Marrow Transpl. 23: 283-290(1999); Bostwick et al., 미국 특허 제 5,773,000호; Cordle et al., 미국 특허 제 5,260,057호).

면역글로블린 A(IgA)는 점막 면역성에 중요한 역할을 하는 항체이다. IgA는 특정 형태의 분비물에서 발견되며, 이는 소위 J-사슬에 의해 연결된 IgA 모노머의 다이머를 포함하며, 약 435kDa의 분자량을 갖는 소위 분비 성분을 더 포함하는 S-IgA로 칭하여진다. 이의 분비 형태로, 눈물, 타액, 인간 초유/성숙유, 위장관액, 질액 및 전립선 및 호흡상피의 분비물을 포함하는 점성 분비물에서 주요 면역글로블린이다. 따라서, 이들은 위장관, 호흡기관, 생식기관 및 구강/비강의 점막 영역에서 발견될 수 있으며, 그리고 병원체에 의한 군체형성을 억제하는 작용을 한다. 분비 IgA는 소화 및 호흡관과 같은 혹독한 환경에서 생존하여 체내 분비물에서 증가하는 미생물에 대한 보호를 제공할 수 있다. 이러한 특성은 위장관 점막 및 호흡관의 점막 뿐만 아니라 피부의 점막과 같은 건강을 개선 및/또는 향상시키기 위한, 특히 점막 표면의 감염 및/또는 염증을 치료 및/또는 예방하기 위한 제품으로 적용하는데 있어서, S-IgA를 바람직한 면역글로블린으로 만든다. 이러한 제품의 예는 예를 들어, 유아 제제와 같은 장 제제, 임상적 영양, 기능성 식품 및 기능식품; 약학 제제, 피부 제제 및 에어로졸 제제를 포함한다. 따라서, 반추동물 우유에서 (분비) IgA의 증가된 수준을 생성하는데 많은 노력이 투자되었다는 것은 놀라운 것이 아니다.

미국 특허 제 6,974,573호에는 점막 통과 또는 기도를 통해 항원을 투여하고, 그 다음 포유류 분비선 또는 유방위 림프절(supramammary lymph node)을 통해 상기 항원을 투여하여 가축을 과면역화하는 방법이 기재되어 있다. 상기 문헌에는 이에 따라 직접적으로 얻어지는 우유를 사용하거나, 항원-특이적(IgA) 항체를 정제하는 추가 공정이 기재되어 있다.

면역글로블린이 풍부한 분획을 얻기위해 우유와 같은 복합 조성물을 여과 분획화하는 것이 당 기술분야에 알려져 있으나, 이러한 종래 기술의 대부분은 IgG 분리와 관련된 것이며, 이는 소과 포유류 분비산물에서 주요 면역글로블린인 사실을 감안하면 놀라운 것이 아니다. US 2004/0167320에는 접선 흐름 여과의 개선된 방법을 사용하여 복합 혼합물로부터 관심대상의 분자를 분리하는 방법 및 장치가 개시되어 있다. US 2004/0167320에 따른 적절한 관심대상의 분자는 면역글로블린을 포함한다. 상기 미국특허출원은 원유로부터 정용여과(diafiltration)를 이용하여 IgG1을 정제하는 예가 기재되어 있으며, 여기서 공정 조건 및 파라미터가 자세히 기재되어 있다. 하지만, 상기 문헌에는 우유로부터 상당히 보다 많은 S-IgA를 분리하는 것에 대해서는 기재되어 있지 않다.

US 2003/0059512에는 하나 이상의 횡류 여과 단계를 포함하는 우유와 우유 산물의 분리 방법 및 장치가 개시되어 있다. 특히, US 2003/0059512에는 탈지 우유를 카세인 풍부 투석유물 분획 및 카세인 감소 투과 분획으로 분리한 다음, 상기 투과물을 알부민 및 면역글로블린과 같은 마크로분자가 풍부한 투과 분획을 형성하기에 적절한 후속적인 횡류 여과 모듈에 플로잉하고, 이는 예를 들어, 크로마토그래피 또는 횡류 여과를 사용하여 더욱 분리 및 정제되어 알부민 및 면역글로블린으로 형성될 수 있는 것이 제시되어 있다. US 2003/0059512에는 S-IgA는 고사하고 IgA 풍부 우유 분획의 제조와 관련된 어느 특이적 정보나 예시가 기재되어 있지 않다.

US 4,644,056에는 초유 또는 우유를 가공하여 락트산 또는 초유 면역글로블린의 용액을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 상기 문헌에 따르면, 초유는 pH 4.0-5.5로 산성화되고, 0.1-1.2㎛의 평균 공극 크기를 갖는 여과 유니트에서 횡류 여과되며, 이후 저분자량 성분들은 5-80kDa의 분리 한계로 다른 여과 유니트에서 더욱 횡류 여과되어 제거된다. 이 실시예는 용액내에 IgA, S-IgA 및 IgM가 존재한다는 것이 면역전기영동을 통해 보고되었으나, 이러한 여과 유니트를 이용한 산성화 초유의 정용여과를 통해 주로 IgG를 함유하는 용액을 생성하는 것에 대해 기술하고 있다. 그럼에도 불구하고, US 4,644,056에 개시된 방법은 우유(초유가 아닌 또는 성숙유)로부터 S-IgA 풍부 분획을 우수한 수율로 효과적으로 제조하기에 전혀 충분하지 않다.

분자량 뿐만 아니라 형상에 있어서, 한편으로 IgA 및 IgG와 다른 한편으로 S-IgA 사이에 큰 차이가 있다는 사실을 고려하면, S-IgA를 분리하는 종래기술의 IgG-분리 방법의 적용은, 효과적인 작업 및 충분한 수율이 요구되는 경우, 즉, 산업적 규모 생산으로 적용하기에 적절한 방법을 제공하는 것은 고사하고, 전혀 간단하지 않은 것이다. 상기로부터 분명한 바와 같이, S-IgA 풍부(초유가 아닌) 우유 분획을 효과적으로 생성하는데 사용될 수 있는 방법에 대한 요구는 종래 기술에 의해 만족되지 않고 있다. 이에 본 발명의 목적은 이러한 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 이러한 요구를 만족하는 방법을 개발하는데 성공하였다. 간략히 언급하자면, 본 발명은 하나 이상의 마이크로포러스 멤브레인 여과 단계를 사용하여 분비 면역글로블린 A가 풍부한 우유 분획을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 본 발명에 따라 얻어지는 농축 우유 분획은 약제, 식품 또는 화장품에 편입시키기에 적절하나, 추가의 다운 스트림 프로세싱이 또한 예측된다. 본 발명 방법의 바람직한 프로토콜은 탈지, 마이크로 여과 및 다수의 정용여과 사이클을 통한 한외여과 농축을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 예를 들어, 상기 조성물을 약제, 식품 또는 화장품에 편입시킴으로써, 치료가 요구되는 인간 또는 동물에서 특히, 예를 들어, 위장관, 비뇨생식관, 기도, 비강 또는 구강과 같은 점막 표면의 감염 및/또는 염증의 치료 및/또는 예방, 비만 및 관련 질병의 치료 및/또는 예방, 또는 식품 알러지의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

도 1: 우유 스키밍 장치(1), 제 1 홀딩 탱크(4), 마이크로여과 모듈(6), 제 2 홀딩 탱크(10), 한외여과 모듈(11), 스프레이-건조 장치(12) 및 물 공급원(8)을 포함하는 본 발명의 구현에 따른 분비 IgA(S-IgA) 우유 분획 생성의 통합 공정의 흐름도. 흐름도에서 (2)는 UF 투과 스트림을 나타내며, (3)은 MF 투석유물 스트림을 나타내며, (7)은 MF 투과 스트림을 나타내며, 그리고 (9)는 UF 투석유물 스트림을 나타낸다.
도 2A: 총 투과물 부피에 대한 마이크로 여과 투과물에서 총 S-IgA의 누적 퍼센트. ●으로 이루어진 선은 투과물을 나타내며, ■으로 이루어진 선은 투석유물을 나타내며, 그리고 ▲로 이루어진 선은 투과물과 투석유물을 합한 값인 총 S-IgA를 나타낸다. 퍼센트는 ▲ 선의 평균으로 표기된다.
도 2B: 총 투과물 부피에 대한 마이크로 여과 투과물에서 C. 디피실리 독소 A 특이 S-IgA의 누적 퍼센트. ●으로 이루어진 선은 투과물을 나타내며, ■으로 이루어진 선은 투석유물을 나타내며, 그리고 ▲로 이루어진 선은 투과물과 투석유물을 합한 값인 총 S-IgA를 나타낸다. 퍼센트는 ▲ 선의 평균으로 표기된다.
도 2C: 총 투과물 부피에 대한 마이크로 여과 투과물에서 C. 디피실리 독소 A 특이 IgG의 누적 퍼센트. ●으로 이루어진 선은 투과물을 나타내며, ■으로 이루어진 선은 투석유물을 나타내며, 그리고 ▲로 이루어진 선은 투과물과 투석유물을 합한 값인 총 C. 디피실리 독소 A 특이 IgG를 나타낸다. 퍼센트는 ▲ 선의 평균으로 표기된다.

본 발명자들은 이러한 요구를 만족하는 방법을 개발하는데 성공하였다. 간략히 언급하자면, 본 발명은 하나 이상의 마이크로포러스 멤브레인 여과 단계를 사용하여 분비 면역글로블린 A가 풍부한 우유 분획을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 본 발명에 따라 얻어지는 농축 우유 분획은 약제, 식품 또는 화장품에 편입시키기에 적절하나, 추가의 다운 스트림 프로세싱이 또한 예측된다. 본 발명 방법의 바람직한 프로토콜은 탈지, 마이크로 여과 및 다수의 정용여과 사이클을 통한 한외여과 농축을 포함한다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 이러한 작업전 우유의 산성화를 필요로 하지 않음을 발견하였다. 상기 방법은 면역글로블린에 해로운 고온과 관련된 어느 타입의 작업을 요구하지 않는다.

이하 실시예에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 우유에 본래 존재하는 S-IgA의 75%이상, 특히, 85% 정도로 높은 수율을 쉽게 이룬다. 당 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명은 바람직한 견지로 상기 가축 점막 과면역화 방법과 같은 고 항원 특이적 S-IgA 함량을 갖는 우유 가공을 포함한다.

본 발명의 방법은 예기치 않게 고수율을 달성하는 것 외에도, 확장성, 현존하는 다이어리 팩토리 적용성 및 S-IgA 품질 및 안정성에 영향을 미치는 공정 파라미터의 제어성의 견지에서 특히 이로운 잇점을 제공한다.

일 견지로, 본 발명은

를 포함하는 분비 IgA(S-IgA) 풍부 우유 분획의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "분비 IgA" 또는 "S-IgA"는 눈물, 타액, 초유 및 성숙유, 장액 및 호흡상피의 분비물을 포함하는 점성 분비물에서 발견되는 두 IgA 모노머로 구성된 다이머릭 면역글로블린을 칭한다. 상기한 바와 같이, 이러한 IgA 다이머는 또한 J-사슬 뿐만 아니라 소위 분비 성분을 포함하여 약 435 kDa의 분자량을 갖는다.

용어 "S-IgA 풍부 우유 분획"은 본 발명의 방법에 의해 획득되는 산물을 칭하며, 미처리된 원유보다 건조 중량 기준으로 현저히 보다 많은 양으로 S-IgA를 함유한다. 특히, 상기 방법은 리피드 및 카세인과 같은 벌크 우유 성분으로부터 S-IgA를 분리하는 것을 목적으로 한다. 상기 방법은 또한 작은 유장 단백질, 모노- 및 디-사카라이드 및 염과 같은 작은 유기 및 무기 우유 물질을 제거할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 S-IgA 풍부 우유 분획은 전형적으로 면역글로블린(S-IgA, IgA, IgM 및 IgG) 및 다른 유장 단백질의 조합, 미량의 모노- 및 디-사카라이드 및 유장에서 일반적으로 발견되는 다른 성분들을 포함한다. 본 발명에 따라 생성되는 산물은 이하 설명되는 바와 같이, (농축)액일 수 있으며, 또한 건조 고형 형태일 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하다(to comprise)"는 특별히 언급되지 않은 아이템들을 배제하지 않고 후속하는 아이템들이 포함되는 것으로 비제한적 견지로 사용된다. 또한, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 정황상 분명히 하나이며, 요소들중 단지 하나만 존재하는 것으로 요구되는 경우를 제외하고, 하나 이상의 요소가 존재할 수 있는 가능성을 배제하지 않는 것을 칭한다. 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 따라서 보통 "적어도 하나"를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "원유"는 포유류로부터 직접 획득되는 우유를 칭한다. 본 발명에 따라 처리되기 전에 원유는 예를 들어, 저장 등을 위해 냉각 또는 냉장에 의한 것과 같이 통상적인 우유 가공으로 처리될 수 있다. 그러나, 이러한 처리는 면역글로블린의 악화를 일으킬 수 있는 과도한 온도 혹은 화학물질 및/또는 효소의 첨가를 포함하지 않아야한다. 당 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 가열에 의해 야기되는 면역글로블린의 어느 손상 정도는 우유나 우유 분획이 상기 온도에 노출되는 도중 적용되는 온도 뿐만 아니라 시간에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현으로, 5분, 2분, 1분, 0.5분 또는 0.1분이상 온도가 60℃를 초과하는 어느 단계 또는 작업을 포함하지 않으며, 바람직하게, 온도가 55℃, 보다 바람직하게, 50℃를 초과하는 어느 단계를 포함하지 않는 방법이 제공된다. 조절 요건으로 적어도 하나의 파스테르화 단계가 공정에 포함되는 것이 필요하다는 것을 예측할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 구현으로, 상기 방법은 전형적으로 70℃이상의 온도로 최대 40초간, 바람직하게 최대 30초간 우유 또는 우유 분획을 가열하는 것을 포함하는 단계를 포함한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 pH 5.5를 초과하는, 바람직하게 pH 5.6을 초과하는, 보다 바람직하게 pH 5.7을 초과하는, 가장 바람직하게 pH 5.8을 초과하는 원유의 지방 부피 함량을 낮추는 단계를 포함한다. 상기 방법의 특히 바람직한 구현에 따르면, 원유의 pH는 6-7.5 범위내이며, 가장 바람직하게 pH 6.3-7 범위내이다. 당 기술분야에 알려진 바와 같이, 원유의 pH는 일반적으로 6.5-6.8 범위내에 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구현에 따르면, 상기 방법은 카세인 응집이 일어나는 양으로 산의 첨가를 포함하지 않는다. 이론으로 한정하려는 것은 아니나, 본 발명자들은 마이크로여과 전의 카세인 응집은 MF 멤브레인 플럭스에 현저한 영향을 주어, 이에 따라 전체 공정 효율이 감소되는 것으로 생각된다. 또한, 카세인 응집공정중에 낮은 pH는 면역글로블린에 유해하다. 가장 바람직하게, 원유는 본 발명의 방법에 적용되기 전에 산성화되지 않는다.

포유류에 의해 생산되는 우유에 함유된 지방은 0.1-20㎛ 범위내 직경을 갖는 구형 소구체로서 95%이상으로 존재한다. 원유의 지방 함량을 낮추기 위해, 당 기술분야에 알려진 어느 방법이 사용될 수 있다. 우유로부터 지방 소구체의 분리, 즉, 소위 스키밍은 일반적으로 소구체와 액체 사이에 존재하는 부피량 차이(밀도)에 기초한다. 두 스키밍 타입이 통상적으로 구분된다: 응집된 지방 소구체 풍부층을 제공하며, 작업은 5-10℃에서 10-16시간동안 수행되는 소위 자발적 스키밍 및 우유 전체를 원뿔모양 디스크 파일에서 약 4000-5000rpm의 원심분리를 행하여 연속적으로 크림과 스키밍된 우유를 분리하는 원심분리 스키밍으로 구분된다. 본 발명의 특히 바람직한 구현에 따르면, 원유의 지방 함량은 0.1중량%미만, 바람직하게 0.075중량%미만의 수준으로 낮아진다. 우유에 일반적으로 존재하는 지방 소구체는 예를 들어, 필터 플러깅, 플럭스 감소와 같이 여과 공정에 해로운 영향을 줄 수 있기 때문에, 마이크로여과 전에 우유의 지방 함량 감소는 공정 효율을 크게 증진시킬 수 있다.

스키밍 후, pH 5.5를 초과하는 우유는 마이크로여과(MF)에 적용된다. 본 명세서에서 용어 "마이크로여과"는 함유된 분자의 크기를 제외하고 한외여과나 나노여과와 기본적으로 다르지 않은 마이크로다공성 멤브레인을 통해 통과하는 것을 포함하는 여과 공정의 일반적 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 마이크로여과는 주어진 공극 크기의 멤브레인을 사용하여 이들의 크기 차이에 기초하여 용액 또는 서스펜션에서 성분을 분리하는 압력 구동 분리 공정이다. 보다 큰 입자가 논-멤브레인 또는 뎁스 필터의 사용으로 제거될 수 있지만, 정확히 규정된 공극 크기를 갖는 멤브레인 필터만이 확실한 정량적 유지가 가능하다.

본 발명에 따르면, 0.01-1.0㎛ 범위내 평균 공극 크기를 갖는 마이크로다공성 멤브레인이 사용된다. 공극 크기 (또는 공극 직경)는 공극의 직경 측정값이다. 0.1-0.45㎛의 평균 공극 크기를 갖는 마이크로다공성 멤브레인을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 공극 크기의 범위는 일반적으로 분포될 수 있으며, 스프레드는 상당히 좁을 수 있다(예, 최대 공극 크기 대 최소 공극 크기의 비율은 2미만일 수 있음). 라지 스프레드 및 불균질의 경우, 공극 크기는 좁은 공극 크기 분포를 갖는 멤브레인에 비해 상당히 낮은 예측 흐름 속도를 가질 것이다. 바람직하게, 공극 크기 분포는 공극 크기의 표준 편차가 평균 공극 크기의 20%미만이 되도록 한다. 다른 바람직한 구현으로, 공극 크기의 표준 편차는 평균 공극 크기의 15, 10, 5 또는 2%미만이다. MF 마이크로다공성 멤브레인의 공극 크기 특성을 측정하는 방법은 당 기술분야의 숙련자에게 알려져 있다.

마이크로시브를 포함하는 다른 타입의 MF 멤브레인이 (상업적으로) 이용가능하며, 예를 들어, 알루미늄-옥시드, 지르코늄 옥시드, 티타늄 옥시드 또는 이의 혼합물, 실리슘니트리드 또는 다른 실리슘계 화합물 또는 이의 혼합물, 폴리설폰, 플루오로폴리머, 셀룰로즈, 폴리올레핀 수지 및 폴리에테르설폰을 포함하는 세라믹, 반도체 또는 중합 물질로 구성된다. 본 발명의 다공성 멤브레인은 세라믹 멤브레인인 것이 바람직하다. 어느 이론으로 한정하려는 것은 아니나, 본 발명자들은 세라믹 멤브레인이 강인성, 수명, 경제성, CIP 및 소 공극 크기 분포와 관련하여 중합 멤브레인에 비해 잇점을 제공하는 것으로 생각된다. 본 발명의 방법에 적절히 사용될 수 있는 세라믹 마이크로여과 멤브레인의 바람직한 예는 멤브라록스 세라믹 멤브레인을 포함하며, 이는 다공성 알루미나 지지체 및 알루미나, 지르코니아 또는 타이타니아의 여과층으로 구성된다.

MF 여과 방식 및/또는 여과 모듈의 구성에 대해, 본 발명은 특별히 제한되지 않는다. 기본적으로 두 가지 다른 여과 방식으로 구분될 수 있다. 즉, 멤브레인을 통해 유체의 100%를 통과시키고자 공급 스트림이 멤브레인면에 수직으로 적용되는 "데드-엔드" 여과로도 알려진 직접 흐름 여과(DFF), 및 일부는 멤브레인을 통해 통과되고(투과물), 나머지(투석유물)는 공급 저장소로 다시 재순환됨에 따라 공급 스트림이 멤브레인면에 평행하게 통과되는 횡류 여과로도 알려진 접선 흐름 여과(TFF)로 구분될 수 있다. 이러한 여과 방식에 사용될 수 있는 당 기술분야에 알려진 다른 여과 모듈의 예는 홀로우 화이버 모듈, 스파이럴 운드 모듈, 터뷸러 모듈 및 플래이트 모듈을 포함한다.

마이크로여과중에 적용되는 조건은 총 S-IgA 수율을 증가시키기 위해 그리고/또는 공정 시간 및/또는 효율을 최적화시키기 위해 필요에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 전형적인 방법으로, 스키밍된 우유는 10-100 l/㎡ h, 바람직하게 10-60 l/㎡ h, 가장 바람직하게 20-50 l/㎡ h, 그리고 특히 30-35 l/㎡ h의 플럭스로 여과된다. MF 공정은 전형적으로 여과하기 전에, 1-6 bar, 바람직하게 2-4.5 bar, 그리고 특히 3-4 bar의 범위내 주입 압력을 포함한다. 배출 압력은 전형적으로 0.5-5 bar, 바람직하게 1-3.5 bar의 범위내이다. 바람직하게, 적용되는 압력은 1.5-5 bar, 보다 바람직하게 2-4.5 bar, 가장 바람직하게 3-4 bar 범위내의 트랜스멤브레인 압력을 형성한다. MF 공정에 있어서, 온도는 전형적으로 10-55℃ 범위내로, 바람직하게 15-40℃ 범위내로, 가장 바람직하게 20-35℃ 범위내로, 그리고 특히 25-30℃ 범위내로 유지된다. 본 발명자들은 이러한 온도가 플럭스, S-IgA 투과 및 분자 면역글로블린 안정성에 최적한 것으로 생각된다.

본 발명에 따라, 마이크로여과는 S-IgA 함유 투과물 및 카세인 풍부 투석유물을 생성한다. 이는 당 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 투석유물은 주요부의 우유 카세인을 함유하며, 투과물은 우유 면역글로블린을 포함하는 주요부의 우유 유장 단백질을 함유하는 것을 의미한다. 따라서, 건조 고형 중량 기준으로, 투과물 S-IgA 함량은 원유 S-IgA 함량보다 높다.

본 발명에 따르면, 마이크로여과 투과물은 후속적으로 농축된다. 이러한 정황에 사용된 용어 "농축"은 투과물 분획으로부터 모노- 및 디사카라이드 및 이외 소수의 우유 성분을 포함하는 실질적인 양의 물을 제거하는 어느 공정을 칭한다. 당 기술분야의 숙련자에 의해 알려진 어느 방법이 적용될 수 있으나, 일부 구현에 따르면, 이는 55℃를 초과하는 온도를 포함하지 않아야 하며, 바람직하게는 10-15℃에서 행하여진다.

본 발명의 특히 바람직한 구현으로, 본 명세서에서 상기 정의된 방법에 있어서 마이크로여과 투과물은 한외여과에 의해 농축되는 방법이 제공된다. 한외여과(UF)는 수압으로 반투과성 멤브레인에 대해 액체를 밀어넣는 멤브레인 여과이다. 부유된 고분자량의 고형물 및 용질은 남기고, 물 및 저분자량 용질은 멤브레인을 통해 통과시킨다. 한외여과는 함유된 분자의 크기를 제외하고 마이크로여과 혹은 나노여과와 기본적으로 다르지 않다.

본 발명에 따르면, 1-100 kDa 범위내의 필터 컷오프 값을 갖는 다공성 멤브레인이 사용될 수 있다. "분자량 컷오프 값"("MWCO")은 이의 일반적인 의미로 사용되는 것으로, 용액내에 어떤 MW을 갖는 분자의 특정 퍼센트를 보유하는 마이크로다공성 멤브레인의 능력을 나타낸다(전형적으로 90% 보유도). 10-100 kDa의 범위내, 가장 바람직하게 50-100 kDa의 범위내의 분자량 컷오프 값을 갖는 멤브레인을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

다른 타입의 UF 멤브레인이 (상업적으로) 이용가능하며, 예를 들어, 알루미늄-옥시드, 지르코늄 옥시드, 티타늄 옥시드 또는 이의 혼합물, 실리슘니트리드 또는 다른 실리슘계 화합물 또는 이의 혼합물, 폴리설폰, 플루오로폴리머, 셀룰로즈, 폴리올레핀 수지 및 폴리에테르설폰을 포함하는 세라믹, 반도체 또는 중합 물질로 구성된다. 본 발명의 다공성 UF 멤브레인은 중합 다공성 멤브레인인 것이 바람직하나, 세라믹 멤브레인의 사용이 또한 본 발명에 의해 예측된다. UF 여과 방식 및/또는 필터 모듈의 원심분리와 관련하여, 본 발명은 특별히 제한되지 않는다. 직접 흐름 여과(DFF) 방식 및 접선 흐름 여과(TFF) 방식 모두 본 발명의 목적에 적절할 수 있다. 이러한 여과 방식에 사용될 수 있는 당 기술분야에 알려진 다른 필터 모듈의 예는 홀로우 화이버 모듈, 스파이럴 운드 모듈, 터뷸러 모듈 및 플래이트 모듈을 포함한다.

한외여과중에 적용되는 조건은 당 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 다수의 변수에 따라 달라질 것이다. 특정 환경하에서 상기 공정을 수행하고 최적화하는 것은 당 기술분야의 숙련자의 기술범위내에 포함된다. 본 발명에 따른 전형적인 방법으로, 마이크로여과 투과물은 1-50 l/㎡ h, 바람직하게 2.5-40 l/㎡ h, 그리고 특히 5-30 l/㎡ h의 플럭스로 여과된다. 상기 UF 공정은 전형적으로 여과전에 1-6 bar 범위내의 주입 압력을 포함한다. 배출 압력은 전형적으로 0.5-5 bar의 범위로 한다. 바람직하게, 적용되는 압력은 1.5-6 bar의 범위내 트랜스멤브레인 압력을 형성한다. UF 공정에 있어서, 온도는 전형적으로 10-40℃ 범위내로, 바람직하게는 10-25℃ 범위내로 유지된다.

한외여과 작업은 투석유물로서 S-IgA 풍부 우유 분획 및 주로 염과 작은 유기 분자를 포함하는 S-IgA 저조 투과물을 생성한다.

전형적으로, 획득된 UF-투석유물은 건조 고형분 중량을 기준으로 30-90중량%, 바람직하게 40-85중량% 범위의 양으로 단백질을 함유한다. 상기 단백질은 관심 대상의 면역글로블린과 함께 다른 우유 단백질, 주로 유장 단백질, 미량의 모노-디사카라이드 및 기타 소 우유 성분들을 포함한다. 사용되는 멤브레인에 따라, UF 단계는 S-IgA 함유 UF 투석유물로부터, 10 kDa 이하, 바람직하게 50 kDa 이하, 가장 바람직하게 100 kDa 이하의 분자량을 갖는 유장 단백질 (뿐만 아니라 다른 단백질)의 분획을 제거하도록 최적화될 수 있다. 이러한 목적으로, 각각, 5-15 kDa 범위내 또는 40-60 kDa 범위내 또는 80-120 kDa 범위내의 MWCO를 갖는 UF 멤브레인을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 작은 유기 분자 뿐만 아니라 무기 분자가 또한 UF 멤브레인을 투과할 수 있을 것이다. 또한, UF 농축 단계는 우유에 함유된 염 및 모노- 및 디사카라이드와 같은 물질들의 현저한 분획을 제거할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 상기 방법에 있어서, 마이크로여과 투석유물이 정용여과액과 혼합되고, 그 마이크로여과 투석유물과 정용여과액의 혼합물이 후속적인 마이크로여과 및 농축 단계에 적용되는 하나 이상의 정용여과 사이클을 포함하는 방법이 제공된다. 정용여과를 수행하기 위해 여러 방법이 있다. 연속 정용여과시, 정용여과액은 MF 시료 공급 저장소에 첨가되며, 바람직하게 투과물이 생성되는 것과 동일한 속도로 첨가된다. 비연속 정용여과시, 용액은 우선 희석된 다음, 출발 부피로 다시 농축된다. 그 다음, 이 공정은 MF 공급으로부터 S-IgA의 요구 수율이 획득될 때까지 반복된다. 본 발명의 방법에서, 연속 정용여과 작업 방식을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에서, 각 정용여과 부피 또는 정용여과 사이클과 함께, MF 시료 공급 저장소에 본래 함유된 S-IgA의 분획이 추출될 것이다. "정용여과 부피" (또는 "디아볼륨(diavolume)")는 본 명세서에서 MF-투석유물의 양과 비교하여 회수된 여과물의 부피로 정의된다. 제거된 여과물의 부피가 정용여과 작업 시작시 투석유물의 부피와 동일한 경우, 1 디아볼륨이 처리된다. 따라서, 용어 "정용여과 사이클"은 MF 시료 공급 저장소로부터 1 디아볼륨의 제거 및 수집을 처리하는 것을 칭한다. 전형적으로, 모든 정용여과 사이클에서 얻어지는 그리고/또는 전체 정용여과 부피로 얻어지는 S-IgA MF-투과물 분획은 업스트림 농축 단계(들)에 집합적으로 적용된다.

본 발명에 따른 정용여과액으로 사용되기에 적절한 액체는 물 및 수용액을 포함한다. 바람직하게, 정용여과액은 물이거나 우유의 수성 분획이다. 본 발명의 특히 바람직한 구현에 따르면, 정용여과액은 한외여과 투과물이다.

본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 상기 방법에 있어서, MF 투과물 부피가 수집되는 것을 의도하는 적어도 6 정용여과 사이클을 포함하며, 정용여과 시작시 MF 투석유물 부피의 6배의 초기 MF 투과물 부피를 배제하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 보다 바람직하게, 상기 방법에 있어서, 적어도 6, 8, 10 또는 12 정용여과 사이클을 포함하며, 보다 바람직하게 적어도 13 또는 14 정용여과 사이클을 포함하며, 가장 바람직하게 적어도 15 정용여과 사이클을 포함하는 방법이 제공된다. 현실적인 이유로, 본 발명의 방법에서 정용여과 사이클의 수는 30을 초과하지 않을 것이며, 바람직하게 20을 초과하지 않는다.

용어 "부피 농축 팩터"(VCF)는 초기 공급 부피 대 투석유물 부피의 비율을 나타낸다. 예를 들어, 만일 20L의 공급 스톡중 18L가 여과물로 통과되고 2L가 투석유물에 남게되는 것으로 처리되는 경우, 10배 농축이 수행되는 것이며, 따라서 부피 농축 팩터는 10이다. 바람직하게, 마이크로여과 단계에서 VCF는 1.5-8 범위내이며, 보다 바람직하게 2-6 범위내이며, 가장 바람직하게 2.5-4 범위내이다. 한외여과 단계에서 VCF는 전형적으로 10-30 범위내이며, 가장 바람직하게 15-25 범위내이다.

보다 바람직한 구현으로, 상기 방법에 있어서, MF 투과물은 UF 단계 수행중에 모노- 및 디-사카라이드 및 다른 작은 우유 성분들을 제거하기 위해 물이나 수용액으로, 바람직하게 멸균수로 희석된다. 이는 특히 본 발명의 방법이 상기한 바와 같이 정용여과액으로서 한외여과 투과물을 사용할 경우에 유익하다. 전형적으로 VCF를 이용하여 10-30 범위내로 초기 UF 농축한 후, 투석유물의 부피의 40-60% 범위내 부피로 UF 시료 공급 저장소에 물을 첨가한다.

본 발명에 따른 정용여과 공정이 완료되면, UF 시료 공급 저장소내에 함유된 S-IgA 풍부 분획은, 예를 들어 물을 제거하기 위해 그리고/또는 S-Iga를 더욱 정제하기 위한 것과 같이 더욱 다운-스트림으로 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 견지로, 상기 방법에 있어서, 최종 정용여과 작업 후 획득되는 S-IgA 풍부 분획이 수집되고, 그 후, 상기 분획으로부터 예를 들어, 진공 증발기를 이용하여 물이 제거되고, 그리고/또는 상기 분획은 이의 미생물 함량을 줄이기 위한 후속 여과 단계에 적용되고 그리고/또는 상기 분획은 분무-건조, 동결-건조되거나 S-IgA 정제를 위한 크로마토그래피 프로세스에 공급물로 사용된다.

상기 언급된 후속적인 여과 단계는 전형적으로 S-IgA 풍부 분획의 세균적재를 감소시키기 위해 적용되며, 그리고/또는 예를 들어, 시스템의 '오염' 부분에서와 같이 새로운 미생물 오염이 후속적인 작업중에 도입될 수 있기 때문에, 이는 일차 마이크로여과 단계가 충분한 정도로 세균적재를 감소시키지 못한 경우에 바람직하다. 바람직하게, 이 단계는 0.05-0.5㎛, 보다 바람직하게 0.1-0.3㎛의 평균 공극 크기를 갖는 마이크로다공성 멤브레인을 사용하는 데드-엔드 타입 여과를 포함한다.

분무-건조는 액체 혼합물을 작은 물방울로 부수고(아토마이징), 장치내에 물방울로부터 용매를 증발시키는 강한 구동력이 존재하는 분무-건조 장치에서 혼합물로부터 용매를 신속히 제거하는 것을 포함하는 어느 공정을 칭한다. 본 발명에 따른 분무-건조는 S-IgA 풍부 UF 투석유물을 100-200℃, 바람직하게 125-175℃ 온도의 대기로 분무함으로써 적절히 수행될 수 있다.

"동결-건조" 또는 "얼림 건조"는 UF 투석유물액을 동결한 다음 승화에 의해 물을 제거하거나 증발시키는 것을 포함하는 어느 냉-건조 방법이다.

S-IgA의 추가 정제는 전형적으로 이온교환, 소수성 상호작용, 혼합 방식, 친화 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피 또는 어느 다른 알려진 크로마토그래피법을 포함하며, 이러한 모든 공정이 면역글로블린 정제 분야에 일반적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구현으로, 상기 방법에 있어서, S-IgA 풍부 분획을 친화 크로마토그래피 정제에 적용하는 추가 단계를 포함한다. 친화 크로마토그래피에서 단백질은 리간드와의 가역적 상호작용에 기초하여 분리된다. 본 발명의 친화 크로마토그래피 공정은 전형적으로 면역글로블린 또는, 보다 특이적으로는 (S-)IgA와 리간드 사이의 특이적 상호작용에 기초한다. 상기 리간드는 크로마토그래피 매트릭스에 커플링된다. 리간드는 경쇄, 즉, κ 또는 λ 사슬, 중쇄, 즉, α 사슬, 분비 성분 또는 J-사슬의 리전 또는 예를 들어, 중쇄와 분비 성분, 중쇄와 J-사슬, 중쇄, 분비 성분 및 J-사슬과 같이 둘 이상의 리전 또는 특이 리전 부분의 조합에 대해 높은 친화도를 갖는 것이 사용될 수 있다. 이러한 리간드의 적절한 예는 공급원으로서 예를 들어, 모노클로날 Fab-분획, 단일 사슬 가변-도메인 분획 또는 당 기술분야에 알려진 어느 다른 리간드와 같이 포유류, 조류 또는 기타 종의 항체 또는 항체 프레그먼트 기원에 기초한 천연 또는 조직 배양 리간드를 포함한다. 상기 단계후 만일, 예를 들어 우유가 특정 항원에 대해 면역화된 동물로부터 얻어지고, 그 목적이 이러한 항체를 고 순도로 특별히 얻고자 하는 경우와 같이 S-IgA 풍부 분획이 특정 항원에 대한 항체를 함유하는 것으로 알려진 경우 추가적인 정제가 수행될 수 있으며, 그 다음, 특정 항원이 (S-)IgA의 친화 정제를 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, UF 투석유물 분획은, 임의로 농축과 같은 적절한 전처리 작업후, (S-)IgA와 리간드의 특이적 바인딩에 호의적인 조건하에서 크로마토그래피 컬럼에 적용된다. (S-)IgA 리간드 바인딩은 특이적이고 가역적이며, 미결합 물질은 컬럼을 통해 세정된다. 표적 (S-)IgA는 이의 용출에 호의적인 조건으로 변화되거나, 특히 경쟁적 리간드를 이용하여 특이적으로 또는 pH, 이온 강도 또는 극성을 변화시킴으로써 비특이적으로 회수된다. 그 다음, (S-)IgA는 이로부터 정제되고 농축된다.

본 발명의 다른 견지는 본 발명의 방법에 원유로서 사용되는 우유에 관한 것이다. 바람직한 구현에 따르면, 상기 우유는 상기한 바와 같이 가축 동물로 부터 획득된다. 본 발명의 특히 바람직한 견지로, 상기 방법에 있어서, 상기 우유는 가축 동물로부터, 바람직하게 소 및 염소로 구성되는 그룹으로부터 선택된 가축 동물로부터 초유 단계후 수거된 성숙유이다. 용어 "성숙유" 및 "비-초유 우유"는 본 명세서에서 분만후 처음 4일 내지 7일을 포함하는 초유 단계후 분비되는 우유를 칭하는 것으로 상호 호환적으로 사용된다. 일반 성숙유는 단백질, 특히 항체가 보다 낮은 양으로 함유되어 있는 점에서 초유와 다르며, 일반적으로 최대 300일까지 이의 성분을 일정하게 함유한다.

본 발명의 특히 바람직한 구현으로, 상기 우유는 우유내로 항원에 대해 특이적인 S-IgA의 분비를 유도하는 것과 같이 하나 이상의 항원으로 면역화된 동물로부터 획득된다. 전형적으로, 이러한 방식으로 생산된 성숙유는 적어도 0.5㎍/ml, 보다 바람직하게 적어도 15㎍/ml, 가장 바람직하게 적어도 50㎍/ml의 양으로 항원 특이적 S-IgA를 함유한다. 고 항원 특이적 타이터의 S-IgA를 함유하는 비-초유 우유를 획득하기 위한 가축 동물의 면역화는 미국 특허 제 6,974,573호 및 관련 미국 특허 제 7,074,454호에 기재되어 있다. 본 발명의 특히 바람직한 견지로, 상기 방법에 있어서, 동물의 면역화는 하나 이상의 항원을 포함하는 제 1 조성물을 동물이 과면역화되도록 점막 또는 기도를 통해 상기 동물에 투여하고, 후속적으로 상기 하나 이상의 항원을 포함하는 제 2 조성물을 상기 동물의 젖샘이나 유방상 림프절에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 면역화 방법은 미국 특허 제 6,974,573호에 기재되어 있으며, 이 문헌의 상세한 설명에는 이러한 방법의 상세한 설명 및 바람직한 구현에 구체적으로 언급되어 있다.

본 발명은 어느 특이적 항원 및/또는 항원 특이적 항체에 제한되는 것은 아니나, 특히 관심 대상의 항원은 클로스트리디움 spp.(Clostridium spp.), 스타필로코커스 spp.(Staphylococcus spp.), 스트렙토코커스 spp.(Streptococcus spp.), 헬리코박터 spp.(Hellicobacter spp.), 에스케리챠 spp.(Escherichia spp.), 캄필로박터 spp.(Campylobacter spp.), 살로넬라 spp.(Salmonella spp.), 모락셀라 spp.(Moraxella spp.), 헤모필러스 spp.(Heamophilus spp.), 바이러스(예, 로타바이러스, 노로바이러스), 기생충(예, 가디아 람브리아), 이스트(예, 칸디다 spp.) 및 곰팡이로부터 기원한 것들을 포함한다. 본 발명에 따른 관심 대상의 항원들은 예를 들어, 관심 대상의 미생물로부터 유래된 세포 성분, 독소, 독성인자, 부착 인자, 콜로니화 인자, 효소, 펩타이드, 캡슐라/멤브레인 바운드 폴리사카라이드를 포함하며, 바람직하게 상기 언급된 미생물들중 하나 이상으로부터 유래된 것들을 포함하며, 또한 바이러스로부터 유래된, 바람직하게는 상기 언급된 것들로부터 유래된 외막 단백질 및 독성 인자를 포함한다.

본 발명의 다른 구현으로, 상기 방법에 있어서 우유는 활성 (과)면역화를 겪지 않은 가축 동물로부터 얻어진다.

본 발명의 다른 견지는 상기 방법에 의해 획득가능한 산물에 관한 것이다. 당 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 이러한 산물은 전형적으로 건조 분말 및/또는 농축액의 형태로 존재할 것이며, 그리고 전형적으로 총 건조 중량 기준으로 적어도 0.02중량%, 바람직하게 적어도 0.10중량% 그리고 가장 바람직하게 적어도 0.25중량%의 양으로 S-IgA를 함유할 것이다. 면역글로블린 및 기타 우유-유래 고형분 이외에, 본 발명의 산물은 상당한 양의 물 또는 다른 담체 물질을 함유할 수 있다. 어느 추가 (또는 사전) 정제 단계 없이, 여과 및 농축후 얻어지는 산물은 건조 중량 기준으로 최대 5중량%의 S-IgA를 함유한다. 당 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 마이크로여과 및 농축 단계후 수행되는 추가 정제 단계, 특히 상기 언급된 친화 크로마토그래피 프로세스는 최대 100중량%의 S-IgA를 함유하는 산물을 형성할 수 있다.

상기 산물은 점막 및/또는 피부의 감염 및/또는 염증을 예방하거나 그리고/또는 치료하는데 있어서 이를 필요로 하는 대상자에 사용하기 위해, 모든 종류의 건강 유지 및/또는 개선 제품, 특히, 약제, 화장품 및/또는 식품에 편입되기에 매우 적절하다. 대상자는 사람일 수 있으나, 또한 동물일 수 있다. 바람직한 구현으로, 대상자는 사람이다. 본 발명에 따른 이러한 제품의 바람직한 예는 정제, 캡슐, 분말 및 필(pill)과 같은 고형 약학 구강 투여 제형 뿐만 아니라 전형적으로 용액, 서스펜션, 크림, 연고 및 에어로졸 제형과 같은 구강 및 경피 투여용 반고체 또는 반액체 제형을 포함한다. 일 구현으로, 상기 제품은 장 제형, 특히 유아 제형; 임상 영양제; 기능성 식품 및/또는 건강증진식품(nutraceutical)이다. 본 명세서에 사용된 용어 '건강증진식품' 및 '기능성 식품'은 일반적인 다이어트의 일부로서 소비되지만 생리학적 효과를 가지며 그리고/또는 기본적인 영양학적 기능 이상으로 만성 질병의 위험을 감소시키는 것으로 입증된 식품 및 음료를 칭한다. 다른 구현으로, 상기 제품은 크림, 로션 또는 연고와 같이 피부에 적용되는 치료 또는 미용 조성물이다. 다른 구현으로, 예를 들어, 에어로졸 제형과 같이 하기도나 예를 들어, 음료액과 같이 상기도에 투여되는 제품이 제공된다. 다른 구현으로, 예를 들어, 용액, 서스펜션 또는 연고와 같이 경구 및/또는 비강의 점막 투여용 조성물이 제공된다. 다른 구현으로, 본 발명에 따르면, 예를 들어, 크림, 로션 또는 다른 액체 제형과 같이 비뇨생식기에 투여되는 조성물이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 견지는 전술한 바와 같은 상기 방법에 의해 획득가능한 산물을 포함하는 정제, 캡슐, 분말, 필(pill), 용액, 서스펜션, 액체 또는 고형 식품, 음료, 로션, 크림, 연고 및 에어로졸 제형으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 제품 및 전술한 바와 같은 상기 방법에 의해 획득가능한 산물을 상기 어느 제품의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다. 상기 제품은 일반적인 웰빙에 사용될 수 있으며, 전형적으로, 예를 들어, 위장관, 비뇨생식기, 기도, 비강 또는 구강과 같은 점막 표면의 감염 및/또는 염증의 치료 및/또는 예방, 비만 및 관련 질병의 치료 및/또는 예방, 또는 식품 알러지의 치료 및/또는 예방중 하나 이상에 사용된다.

실시예

실시예 1:

클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficle) 및 이의 독소(독소 A 및 독소 B)에 대해 표적된 특이 면역글로블린을 함유하는 원유를 3 홀스테인-프리시안(Holstein-Friesian) 소로부터 수집하였다. 착유후 우유를 냉각시키지 않고 직접 40℃로 가열하였다. 40℃의 우유를 우유로부터 크림을 분리하기 위해 125L/h의 용량을 갖는 클레어 밀키 원심분리기로 처리하였다. 얻어진 탈지유(40L)를 마이크로여과 파일롯 설비의 시스템 탱크에 넣었다. 총 2.52㎡의 여과 영역을 갖는 7 구배 다공성 EP3730 Membralox 0.1㎛ 필터가 장착된 TetraPak MSK-7 파일롯 설비를 사용하여 카세인으로부터 유장 단백질을 분리하였다. 처리시 우유의 온도는 25-30℃로 유지되었다.

한외여과는 50 KDa의 필터 분자량 컷오프 및 2.0㎡의 필터 영역으로 행하였다. 이 공정의 투과물은 마이크로여과를 위한 정용여과액으로 사용된다. 한외여과는 대기온도에서 수행되었으며, 플럭스는 마이크로여과시 정용여과를 수행하기 위해 충분한 정용여과액이 생성되도록 조절되었다. 이에 따라, 한외여과에 대한 플럭스는 대략 40 L/㎡h이었다.

파일롯 설비는 실험 시작시 물로 가동되었다. 구배 다공성 필터 모듈의 사용으로 전체 멤브레인 영역에 대한 트랜스멤브레인 압력을 보장하였다. 실험은 여과전 3.75bar의 주입 압력 및 여과후 2.55bar의 배출 압력으로 수행되었다. 이는 3.15bar의 트랜스멤브레인 압력 및 1.2bar의 압력 드롭을 형성하였다. 이 압력은 실험 코스도중 크게 변하지 않았다. 투과물 및 투석유물 흐름은 시스템 탱크로 향하였다. 탈지유가 파일롯 설비의 데드 볼륨(dead volume)(15L)에 존재하는 물과 혼합되는 10분의 안정화후, 투과물 흐름은 수집 용기로 이송되고, 10리터 부피의 투과물이 수집되었다. 매 10리터후, 투과물 및 투석유물로부터 분석을 위해 시료를 취하였다. 40리터의 투과물 이후에, 파일롯 설비의 시스템 탱크를 비우고, 탈지유 농축물이 파일롯 설비의 데드 볼륨을 차지하였다. 이때, 10리터의 한외여과 투석물이 시스템 탱크에 첨가되었다. 이는 실험이 300L의 투과물에서 정지될 때까지 반복되었다.

300L의 투과물에서 효과적으로 17.3 정용여과가 우유에서 수행되었으며, 투과물의 초기 40L가 우유의 농축물이었다. 탈지 우유의 농축 팩터는 농축 단계에서 0.73-2.67 범위이며, 정용여과도중에서는 1.60-2.67 범위이다. 300L 투과물에서, 총 S-IgA, C. 디피실리 독소 A 특이 S-IgA 및 C. 디피실리 독소 A 특이 IgG가 각각, 96.6%, 97.1% 및 105.4%의 퍼센트로 투과물에 존재하였다. 예측대로, 총 S-IgA 및 C. 디피실리 독소 A 특이 S-IgA는 유사한 투과 곡선을 나타내었다. 그러나, 이러한 곡선은 C. 디피실리 독소 A 특이 IgG보다 느리다. IgG 수준은 140L의 투과물에서, 그리고 이에 따라 6.7 정용여과에서 이미 97%이었다. S-IgA는 동일한 수준에 도달하기 위해서 약 10 정용여과를 더 필요로 한다. (2 경쇄와 2 중쇄로 구성되는) IgG의 분자량, S-IgA(추가 J-사슬 및 분비 성분을 함유한 다이머) 및 IgM kDa(J-사슬과 결합된 펜타머릭 구조)의 분자량은 각각, 180, 435 kDa 및 900 kDa이다. S-IgA 및 IgG의 구조는, IgG가 구형 단백질로서 간주될 수 있으며, S-IgA는 Fc 부에서 이의 말단간의 형상이 보다 고삐와 같은 모양을 갖는 점에서 상이하다. 이러한 형상 및 크기 차이는 우유로부터 고수율로 S-IgA를 여과하는데 필요한 정용여과시 차이를 나타내는데 아마 주된 역할을 할 것이다. 상기 언급된 파라미터(25-30℃, P _i 3.75 bar, P _O 2.55 bar)로 마이크로여과 멤브레인을 통과한 플럭스는 30-35L/㎡h이었다.

도 2A, 2B 및 2C에, 총 S-IgA, C. 디피실리 독소 A 특이 S-IgA 및 IgG의 투과율을 나타내었다. 표 1에서, IgG 및 S-IgA의 회수를 위해 수행된 정용여과 사이클수의 차이를 나타내었다.

본 명세서에 나타낸 실시예 및 구현들은 단지 예시적인 것이며, 이를 고려한 다양한 변형 또는 변화는 당 기술분야의 숙련자에게 본 출원의 정신 및 범위내에 그리고 첨부된 청구범위의 범위내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 공개물, 특허 및 특허출원들은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.