클로렐라 효소 가수분해물을 첨가한 염지액을 이용한 가우다 치즈 제조방법

클로렐라 불가리스 배양액을 이용한 기능성 숙성 치즈용 염지액 제조 및 이를 이용한 가우다 치즈 제조방법{The Gaussian with the manufacture and functional solution for curing this cheese ripened cheese manufacturing method using Chlorella vulgaris culture}

본 발명은 클로렐라 불가리스 배양액을 이용한 기능성 숙성 치즈용 염지액 제조 및 이를 이용한 가우다 치즈 제조방법에 관한 것으로, 클로렐라 효소 가수분해물을 이용하여 숙성치즈용 염지액을 제조하고 이를 이용한 기능성 숙성 가우다 치즈의 제조방법에 관한 것이다.

최근 해양 자원에서 발견된 신물질 중 37%이상이 해양 미세조류가 생성하는 것으로 밝혀져 해양 미세조류에 관한 관심이 증가하고 있는 추세이다. 해양 미세조류의 상업적 이용은 항생제, 비타민, 항암제 등의 의약품 및 건강 기능식품뿐만 아니라 오염 토양의 정화 및 생물학적 비료로서 사용이 증가하고 있다. 해양 미세조류는 배양 방법에 따라 생리활성 물질의 생산성을 높일 수 있으며, 이용 가능성도 증대될 수 있다.

해양 미세조류 중 클로레라 및 스피루나 등은 건강식품으로 널리 사용되고 있으며, 체내 중금속의 축적 억제 및 배설, 환경 독성 물질의 생물학적 분해, 동맥경화 및 간장 장애의 억제, 항암 활성, 면역기능 강화, 세포의 부활작용, 식품의 보습효과와 활성 산소종이나 자유 라디칼과 같은 유해물질을 고거함으로써 노화를 억제할 수 있는 성분들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 특히 클로렐라는 학문적이나 연구적으로 여러 방면에서 사용되고 있으며 식품 첨가물로의 활용도가 높은 미세조류중 하나이다.

한편, 종래에는 클로렐라가 포함된 미역을 이용한 만주의 제조 방법이 개시되어 있었으나, 생리적 기능성이 높은 클로렐라를 이용한 숙성치즈용 염지액을 제조하고 이를 이용한 치즈의 제조방법은 개시된 바가 없었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 생리적 기능성이 높은 클로렐라를 이용한 숙성치즈용 염지액을 제조하고 이를 이용한 웰빙형 숙성 가우다 치즈의 제조방법을 제공하는 것에 그 목적이 있다.

본 발명에 따른 클로렐라 불가리스 배양액을 이용한 기능성 숙성 치즈용 염지액 제조 및 이를 이용한 가우다 치즈 제조방법은 원유를 살균하는 단계; 상기 살균된 원유를 냉각하는 단계; 상기 냉각된 원유에 유산균 스타터와 염화칼슘을 첨가한 후 배양하는 단계; 상기 배양된 원유에 렌넷을 첨가한 후 응고시켜 커드를 제조하는 단계; 상기 커드를 커팅 및 교반하는 단계; 상기 커드로부터 유청을 배제하고 가수한 후 교반하는 단계; 상기 커드를 압착하여 치즈로 제조하는 단계; 상기 치즈를 클로렐라 효소 가수분해물의 염지액에 투입하여 염지하는 단계; 및 상기 염지된 치즈를 숙성실에서 숙성시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 상기 클로렐라 효소 가수분해물은 Cellulase, Trypsin 및 Pepsin 효소를 이용하여 가수분해하여 기질 비로 1:100으로 12시간 동안 추출한 다음 10분 동안 효소를 불활성화 시킨 후 -70℃에서 보관하여 제조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 상기 염지하는 단계에서는 클로렐라 효소 가수분해 배양액의 Brix 농도를 1~5%으로 pH는 5.2로 조정하고 소금을 20~25%로 첨가하여 염지액을 제조하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 상기 염지하는 단계에서는 치즈 100중량부에 대하여 0.5~1중량부의 클로렐라 효소 가수분해물을 첨가한 염지액에 투입하여 5~6시간 염지하는 것을 특징으로 한다.

상기와 같이 이루어지는 본 발명은 생리적 기능성이 높은 클로렐라를 이용한 숙성치즈용 염지액을 제조하고 이를 이용하여 기능성 숙성 가우다 치즈를 제조할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 가우다 치즈의 외관.
도 2는 Chlorella vulgaris의 1,0000배 확대한 현미경 사진.
도 3은 담수산 C. vulgaris 기본 배양 사진.
도 4는 클로렐라 효소적가수분해 배양액이 세포생존율에 미치는 영향.
도 5는 클로레라 효소적가수분해 배양액이 LPS유도된 NO의 생성에 미치는 효과.
도 6은 Gallic acid 농도에 따른 표준곡선과 Quercetin 농도에 따른 표준 곡선.
도 7은 가우다치즈의 숙성기간에 따른 생균수 변화.
도 8은 가우다 치즈의 숙성기간에 따른 pH 변화.

본 발명은 클로렐라 불가리스 배양액을 이용한 기능성 숙성 치즈용 염지액 제조 및 이를 이용한 가우다 치즈 제조방법에 관한 것으로 생리적 기능성이 높은 클로렐라를 이용한 숙성치즈용 염지액을 제조하고 이를 이용한 웰빙형 숙성치즈를 제조하고자 하였다.

가. 재료 및 방법

1. 클로렐라 확보 및 대량 배양

1) 종 소개 및 특징

녹조류에 속하는 단세포로 구형의 모습을 하고 있으며, 세포벽은 셀롤로오즈로 이루어져 있어 다소 두꺼운 것이 특징이다. 크기는 직경 2~5 ㎛로 매우 소형이며 편모는 가지고 있지 않다. 대규모 대량배양이 가능하기에 전 세계적으로 가장 상업적으로 많이 이용되어지고 있는 종이기도 하다. 처음에는 건강식품을 위주로 이용되어져 왔으나 최근에는 다양한 약리작용 및 기능성에 대한 연구가 밝혀지면서 더욱 광범위하게 이용되어지고 있다.

본 종은 백혈구 감소증, 상처, 고혈압, 당뇨병, 유아 발육, 빈혈 등에도 유효성이 인정되고 있으며, 영양조성은 단백질, 지방질, 클로로필, 카로티노이드, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 미네랄, 리놀렌산, 리놀산, 비타민 C 등 16종에 달하는 비타민류도 함유되어 있다. 이러한 다양한 영양소에 기인하여 약리제품은 물론 최근에는 드링크제, 식초, 차, 두부, 주류, 면류, 사탕 및 과자에 이르기까지 다양한 식품에도 이용되고 있다.

2) 종 분양 및 보존

본 종인 Chlorella vulgalis는 한국미세조류은행(Korea Microalgae Culture Center, KMCC)으로부터 분양받아 종을 실험실에서 세포밀도가 안정화 될 때까지 보존한 뒤 실험에 이용하였다.

3) 미세조류 배양

종 보존을 통해 안정화 된 미세조류를 보다 큰 용량에서 배양하기 위해 멸균된 담수를 5 L(배양수 3 L) 준비하였다. 여기에 종 보존되던 원종을 접종해 주어 batch cuture 원리로 배양해 주었다. 영양염을 공급하기 위해 Conway 배지를 표 1과 같이 조성표에 기준하여 제조한 후 공급하였다. 영양염 배지는 접종하는 시기에 1회만 공급해 주었으며 배양일수가 경과되어도 추가적인 공급은 행하지 않았다. 빛 조건으로는 3파장 형광등을 조명등으로 하여 20L:4D의 명암주기(광주기)를 설정한 후 온도 22±1℃인 실험실에서 배양하였다.

한편, 최고밀도를 보이는 배양일수에 전량을 수확하여 실험 원료원으로써 이용하였다.

A 배지.

2. 클로렐라 배양액의 효소적 가수분해물 제조

클로레라의 기능성물질 증진을 위해서 효소를 이용하여 가수분해하였고, 기질 비로 1:100으로 12시간 동안 추출한 다음 10분 동안 효소를 불활성화 시킨 후 -70℃에서 보관하였다. 이때 사용한 효소는 cellulase, trypsin 및 pepsin을 이용하였다.

3. 클로렐라 효소 가수분해물의 기능성 검증

1) 세포배양

Raw 264.7 cells은 한국세포주연구재단에서 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO ₂ incubator에서 세포를 배양하여 실험에 이용하였다.

2) 세포 생존율 측정

Raw264.7 cells를 96 well plate에 5x10 ⁴ cells/well로 분주하여 16 시간을 배양한 후, 클로렐라 효소 가수분해물은 100, 500 및 1,000 ppm으로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후, LPS를 처리하여 20시간 동안 37℃, 5% CO ₂ incubator에서 배양하였다. 세포에 MTT를 0.5 mg/mL의 농도로 처리하여 4시간 배양한 후 배지를 제거하고 생성된 formazan crystals을 DMSO에 녹여 ELISA microplate reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 구하였다. 세포의 생존율은 control cell에 대한 백분율로 표시하였다.

3) NO 생성량 측정

Raw 264.7 cells를 96 well plate에 1x10 ⁵ cells/well로 분주하여 16 시간을 배양한 후, 클로렐라 효소 가수분해물은 100, 500 및 1,000 ppm 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 그 후, LPS로 처리하여 20시간 동안 37℃, 5% CO ₂ incubator에서 배양하였다. 그 후, 세포배양액을 이용하여 nitric oxide(NO)의 양을 Griess 시약으로 측정하였다. 즉, 세포배양액 100 μL와 Griess시약(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H20) 100 μL를 혼합하여 96well plates에서 5분 동안 반응시킨 후, 540 nm에서 ELISA microplate reader로 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite(NaNO2)로 흡광도를 측정하여 표준곡선을 얻은 후, N0의 농도를 산출하였다.

4. 클로렐라 효소 가수분해물을 이용한 염지액 제조

클로렐라 효소 가수분해물에 소금을 20~25%을 첨가한 다음 가우다 치즈의 염지액으로 설정하였다.

5. 가우다 치즈 제조

클로렐라 효소 가수분해물을 이용하여 가우다치즈 제조 방법은 아래와 같으며, 클로렐라 효소추출물은 예비 압착한 다음 치즈 100g 당 0.5% ~ 1.0% 사이로 첨가하였고 그 후 압착 후 염지 및 숙성시켜 제조하였으며, 그 외관은 도 1과 같았다.

1) 살균 : 63℃에서 30분간 살균처리

2) 냉각 : 31℃ ~ 32℃까지 냉각

3) 스타터, 염화칼슘 - 온도 유지하며 45분간 배양 (중온균 및 염화칼슘 첨가물을 첨가한 후 배양 시작)

- 중온균 : 원유의 10U/100kg (DVS 균주 이용 시)

- 염화칼슘 : 원유의 0.02% (20g/100kg, 따뜻한 물에 10배 희석)

4) 렌넷 첨가 : 100kg 원유에 19ml 렌넷 첨가. 증류수에 10배 희석

5) 응고 : 32℃에서 25~30분간 두어 응고

6) 커팅 : 8~10mm 크기로 가로, 세로로 절단

7) 교반 : 20~30분

8) 1차 유청 배제 : 원유의 35% (35ℓ/100kg)

9) 1차 가수 : 원유의 30%를 온수를 첨가하여 원유 온도 35℃ 까지 되도록 함(30ℓ, 가온수 온도 60~65℃)

10) 교반 : 15분

11) 2차 유청 배제 : 원유의 20% (20ℓ)

12) 2차 가수 : 원유의 10%를 온수를 첨가하여 원유 온도 38℃ 까지 되도록 함(10ℓ, 가온수 온도 70~80℃)

13) 교반 : 15분 후 커드의 상태 확인

14) 유청 내 예비압착 : 30분간 커드의 무게로 압착함

15) 본 압착 : 치즈 무게의 약 5배의 무게로 overnight 함

16) 클로레라 효소 가수분해물을 이용한 염지액에 염지 (kg당 5-6시간 염지)

17) 숙성실에서 숙성

6. 클로렐라 효소 가수분해물 염지액에 따른 가우다 치즈의 생리활성 특성

1) 총폴리페놀 함량 및 총플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 다음과 같이 실시하였다. 시료용액 0.1 mL에 증류수 1.9 mL와 Folin-Ciocalteau's phenol reagent 0.2 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시켰다. 여기에 포화 Na ₂ CO ₃ 용액 0.4 mL와 증류수 1.9 mL를 가하여 혼합하고 실온에서 1시간 반응시킨 후 725 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 tannic acid를 이용하여 농도별 표준 곡선을 작성한 후 총 폴리페놀 함량을 구하였다. 총 플라보노이드 함량은 시료용액 0.2mL에 1 N NaOH 0.6 mL와 diethylene glycol 4 mL를 가하여 37°C에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 naringin을 이용하여 표준곡선을 작성한 후 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

2) DPPH radical 소거능 측정

시료용액의 DPPH radical 소거능은 시료용액 0.2 mL에 0.1 mM DPPH 용액 2 mL를 가하여 혼합하고 실온에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 시료용액 첨가군과 무첨가군 간의 흡광도비(%)로 나타내었다.

7. 가우다치즈의 숙성중 품질특성

1) 침지액에 따른 가우다치즈의 일반성분 분석

침지액에 따른 가우다치즈의 일반성분 분석은 다음과 같은 방법으로 분석하였다. 수분은 상압가열건조법, 조지방은 soxhlet 추출법, 조단백질은 semimicro kjedahl법, 조회분은 회화법을 이용하였다.

2) 숙성기간에 따른 pH 변화

pH는 pH meter을 이용하여 숙성기간에 따른 가우다 치즈의 pH 변화를 측정하였다.

3) 숙성기간에 따른 생균수 변화

생균수의 변화는 1개월 간격으로 시료를 채취하여 멸균식염수에 십진 희석법으로 희석한 뒤, BCP 한천배지를 이용하여 평판배양법으로 37°C에서 48시간 배양하여 나타난 노란색 colony 수를 측정하여 log CFU(colony forming unit/ml로 나타내었다.

나. 결과

1. 클로렐라 확보 및 대량 배양

1) 미세조류 종 : Chlorella vulgaris (담수산)

종 보존을 통해 안정화 된 미세조류를 보다 큰 용량에서 배양하기 위해 멸균된 담수를 5 L(배양수 3 L) 준비하였다. 여기에 종 보존되던 원종을 접종해 주어 batch cuture 원리로 배양해 주었다. 영양염을 공급하기 위해 Conway 배지를 조성표에 기준하여 제조한 후 공급하였다. 영양염 배지는 접종하는 시기에 1회만 공급해 주었으며 배양일수가 경과되어도 추가적인 공급은 행하지 않았다. 빛 조건으로는 3파장 형광등을 조명등으로 하여 20L:4D의 명암주기(광주기)를 설정한 후 온도 22±1℃인 실험실에서 배양하였으며, 도 2와 같이 현미경으로 1,000배 확대하여 Chlorella vulgaris의 외관을 촬영하였다.

한편, 최고밀도를 보이는 배양일수에 전량을 수확하여 실험 원료원으로써 이용하였으며, 도 3과 같이 담수산 C. vulgaris 기본 배양을 소규모 배양부터 중간 배양까지 나타내었다.

2. 클로렐라 배양액의 효소적 가수분해물 제조

클로레라의 기능성물질 증진을 위해서 효소를 이용하여 가수분해하였고, 기질 비로 1:100으로 12시간 동안 추출한 다음 10분 동안 효소를 불활성화 시킨 후 -70℃에서 보관하였다. 이때 사용한 효소는 trypsin 및 pepsin을 이용하였으며, 이때 가수분해물의 폴리페놀 함량은 아래 표 2와 같다.

3. 클로렐라 효소 가수분해물의 기능성 검증

염증은 물리적 혹은 화학적 독성자극 혹은 미생물적 독성 물질에 의해 신체 국소에서 발생하는 손상에 대한 상해를 제거하여 본 상태로 회복하려는 유기체의 반응으로 염증반응에서의 자극은 직접 신체국소에 작용을 하여 상해를 주기도 하지만 대개 간접적으로 내인성 화학 전달물질을 통해 구소의 혈관이나 세포에 전달되어 손상을 주는 것으로 보고되어 있다. 이로 말미암아 관절염, 천식, 자가면역질환 그리고 동맥경화증과 같은 다양한 질병이 발생하게 되며, 이러한 다양한 질병의 원인이 활성산소 종으로 생성된다는 사실이 연구보고 되고 있으며, 이러한 활성산소를 억제할 수 있는 항산화 작용을 해주는 천연물질이 필요하며, 본 연구에서는 클로렐라 배양액의 효소적 가수분해에 따른 항산화 작용을 in vitro로 확인하였다.

1) 클로렐라 효소적 가수분해물이 LPS로 유도된 NO의 생성에 미치는 효과 및 세포생존률

클로렐라 효소적가수분해 배양액이 세포생존율에 미치는 영향은 도 4와 같으며, 클로레라 효소적가수분해 배양액이 LPS유도된 NO의 생성에 미치는 효과는 도 5와 같다. RAW264.7 cells에서 LPS로 유도된 NO의 생성에 미치는 클로렐라 효소적 가수분해물의 억제 효과를 측정하기 위해서 클로렐라 효소적 가수분해물의 농도를 10, 50 및 250ppm으로 조정하여 이용하였다. 대조군과 비교할 때 LPS(10 μL/mL)은 약 95배 증가하였고, 클로렐라 효소적 가수분해물은 LPS에 의해 유도된 높은 NO 생성에 대해 농도 의존적으로 유의성 있게 억제 효과를 나타내었다. 대조군인 클로렐라 배양액은 NO 생성 억제 효과는 효소적 가수분해보다 30% 정도 낮은 결과가 나타났다. 세포독성 효과는 250 ppm의 농도에 이르기까지 세포독성을 유발하지 않는 것으로 나타났다.

4. 클로렐라 효소 가수분해물을 이용한 염지액 제조

클로렐라 효소 가수분해 배양액을 이용한 염지액 제조는 다음과 같다. 클로렐라 효소 가수분해 배양액의 Brix 농도를 1~5%으로 조정한 다음 소금을 20~25%로 첨가하여 제조한다. 이때의 pH는 5.2로 조정하여 사용한다.

5. 클로렐라 효소 가수분해물 염지액에 따른 가우다 치즈의 생리활성 특성

숙성이 완료된 4개월차에 대조구 및 실험구(클로렐라 효소 가수분해물 염지액에 침지하여 제조한 가우다 치즈)의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 DPPH 소거 활성을 측정하였다. 표 3과 같이 총 폴리페놀 함량은 대조구 및 실험구에서 각각 0.4㎍/㎖ 및 1.4 ㎍/㎖이었고, 총 플라보노이드는 0.00088㎍/㎖ 및 0.01㎍/㎖으로 나타났다. DPPH 라디칼 소거능은 시료를 첨가하지 않은 증류수군의 흡광도와 비교하여 나타낸 결과 대조구는 DPPH 라디칼 소거 활성이 없는 것으로 나타났고, 실험구는 10%의 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타났다.

실험구 ^{1 )} : 클로렐라 효소 가수분해물 염지액에 침지하여 제조한 가우다 치즈.

도 6은 총 폴리페놀 함량 Gallic acid 농도에 따른 표준곡선과 총 폴라보노이드 함량 Quercetin 농도에 따른 표준 곡선을 나타내었다.

6. 가우다치즈의 숙성중 품질특성

1) 침지액에 따른 가우다치즈의 일반성분 분석

클로렐라 효소가수분해 배양액을 이용한 염지액에 침지하여 제조한 가우다 치즈의 일반성분 분석결과는 표 4와 같았다. 수분, 단백질, 지방 및 회분 함량은 각각 43.2, 20.3, 31.3 및 3.4%으로 나타나 대조구(일반적인 방법으로 제조된 가우다치즈)와는 이화학적 차이는 나타나지 않았다. 숙성기간에 따른 일반성분 함량 변화를 분석하였고, 숙성기간이 증가할수록 수분함량은 감소하였고, 이에 따라 지방, 단백질 및 회분의 함량은 증가하는 경향이 나타났다.

실험구 ^{1 )} : 클로렐라 효소 가수분해물 염지액에 침지하여 제조한 가우다 치즈.

2) 생균수 및 pH 변화 측정

숙성기간이 증가할수록 대조구 및 실험구(클로렐라 효소가수분해 배양액을 이용하여 제조한 염지액에 침지하여 제조한 가우다 치즈) 모두에서 도 7과 같이 생균수가 감소하는 것으로 나타났다. 숙성기간에 따른 pH의 변화는 도 8과 같이 초기 5.30에서 숙성 4개월 까지 모두 실험구에서는 약간 감소하여 대조구 5.20, 실험구는 5.22 이었으며, 그 후 숙성기간 동안에 치즈 내 단백질분해와 암모니아 생성 영향에 따라 각각 5.50 및 5.49 다소 증가하는 경향을 나타났으며, 유의적인 차이는 없었다.

<실시예>

원유를 63℃에서 30분간 살균하고 32℃로 냉각하였다.

상기 냉각된 원유에 유산균 스타터 DVS(Direct-Vat-Set) 균주 10U와 염화칼슘 20g를 첨가한 후 32℃를 유지하면서 45분간 배양하였다.

상기 배양된 원유 100kg에 대하여 렌넷 19ml 첨가한 후, 32℃에서 25분간 두어 응고시켜 커드를 제조하였다.

상기 커드를 치즈용 나이프를 이용하여 8mm 크기로 가로 및 세로로 커팅하고 20분간 휘저으면서 교반하였다.

이후, 1차 유청 배수(원유의 35중량%)를 하고, 온도 65℃의 가온수로 1차 가수(원유의 30중량%)를 한 후, 35℃에서 15분간 교반하였다.

이후, 2차 유청 배수(원유의 20중량%)를 하고, 온도 80℃의 가온수로 2차 가수(원유의 10중량%)를 한 후 38℃에서 15분 동안 교반하였다.

상기 커드를 30분간 예비 압착한 후, 상기 커드 무게의 5배로 본압착하여 치즈를 제조하였다.

다음으로, 상기 압착하여 제조된 치즈 100중량부에 대하여 1중량부의 클로렐라 효소 가수분해물을 첨가한 염지액에 투입하여 6시간 염지하였다.

여기에서, 상기 클로렐라 효소 가수분해물은 Cellulase, Trypsin 및 Pepsin 효소를 이용하여 가수분해하여 기질 비로 1:100으로 12시간 동안 추출한 다음 10분 동안 효소를 불활성화 시킨 후 -70℃에서 보관함으로써 클로렐라 배양액 효소 가수분해물을 제조하였다.

여기에서, 클로렐라 효소 가수분해 배양액의 Brix 농도를 1%으로 pH는 5.2로 조정하고 소금을 20%로 첨가하여 염지액을 제조하였다.

상기 염지한 치즈를 숙성실에서 3개월간 숙성시켜 가우다 치즈를 제조하였다.