콜레스테롤 저하효과를 갖는 지용성 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 제조방법

콜레스테롤 저하효과를 갖는 지용성 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 제조방법 및 그를 포함하는 식품{Method for Manufacturing Fat-soluble Ester Compound of Phytosterol or Phytostanol Unsaturated Fatty Acid for Lowering Cholesterol Level and Foodstuff Containing the Same}

본 발명은 콜레스테롤 저하효과를 갖는 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 콜레스테롤 과다증의 치료뿐 아니라, 일부 심장계 질환 및 고혈압 등의 예방에도 이용 가능한 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 제조방법 및 그를 포함하는 식품에 관한 것이다.

콜레스테롤은 생체막의 구성성분인 동시에 호르몬 합성의 출발물질로 쓰이는 등 인체에 반드시 필요한 영양소이나, 이러한 콜레스테롤도 과다 섭취하게 되면 혈관 내에 축적하여 심장계 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 아직까지는 저콜레스테롤 식이요법 이외에 예방할 방법이 없으며, 콜레스테롤 저하제 등의 약품 복용이 효과는 있으나, 콜레스테롤 합성효소의 작용억제에 따른 간 기능 장애와 같은 부작용을 유발하는 등의 이유로 인하여 사용이 극히 제한적이다. 따라서, 콜레스테롤 저하작용이 있는 식품의 개발이 요구되고 있다.

인체 내 혈중 콜레스테롤 저하작용을 하는 것으로 알려진 물질로는 키토산(chitosan), 피토스테롤(phytosterol), 이노시톨(inositol), 펙틴(pectin) 등이 있으나 피토스테롤을 제외한 경우 그 효과나 대사기작이 명확히 밝혀져 있지 않다. 식물성 스테롤인 피토스테롤은 콜레스테롤과의 구조적 유사성으로 인하여, 인체에 해로운 저밀도 지질단백질(LDL: low density lipoprotein)-콜레스테롤과의 경쟁을 통하여 인체 내 콜레스테롤 흡수대사를 저해하는 작용기작이 이미 밝혀져 있고, 식품첨가물로서 FDA의 승인이 되어 있다.

한편, 피토스테롤은 고등식물 중의 스테로이드 구조를 갖는 알콜 화합물을 통칭하는 것으로, 스티그마스테롤(stigmasterol), 스피나스테롤(spinasterol), 캄페스테롤(campesterol) 및 시토스테롤 등으로 분류할 수 있으며, 예를 들면, 시토스테롤에도 α-, β-, γ- 타입이 존재한다. 이와 같이 다양한 피토스테롤 화합물 중에서 가장 대표적인 물질인 β-시토스테롤(24-ethyl-5α-cholestene-3β-ol)의 콜레스테롤 저하 효과에 관해서는, 웅성 랫트 및 인체를 대상으로 한 실험에서 확인되었다(Sugano, M. et al., J. Nutr., 107:2011-2019, 1977). 또한, β-시토스테롤을 지방산으로 치환한 β-시토스테롤 에스테르 화합물도 거의 동일한 효과를 나타낸다(Mattson, FH et al., J. Nutr. 107:1139-1146, 1977). 예를 들면, 성인 남성에게 매일 2g의 β-시토스테릴 올레이트를 5일간 투여하였을 때, 혈중 콜레스테롤치가 33% 저하되었다(Mattson, FH et al., Am. J. Clin. Nutr., 35:697-700, 1982).

이와 같은 콜레스테롤 저하 효과 이외에도 β-시토스테롤은 치주증 및 치은염의 치료제인 Zea mays L.의 주요성분으로도 알려져 있다. 그러나, β-시토스테롤 그 자체로는 물, 유지 모두에 용해되지 않는 물리적 한계로 인하여 제형화에 제한을 받고 있으며, 현재 상업화된 것은 영양제 타입의 단순정제 차원에 머물러 있으며 식품소재로서의 개발은 미비한 상태이다.

최근에는, 이와 같은 β-시토스테롤의 단점을 보완하기 위해서, β-시토스테롤의 고형 형태인 β-시토스타놀(24-ethyl-5α-cholestane-3β-ol)을 지방산과 반응시킨 β-시토스타놀 에스테르 화합물이 버터, 마아가린 등과 같은 고형 유제품에 첨가제로 사용될 경우, 혈중 콜레스테롤을 낮출 수 있는 것으로 알려져 있다(참조: WO 92/19640). 그러나, β-시토스타놀 에스테르 화합물은, 국내에서는 비교적 수요가 적은 고형 유제품에만 적용가능하며, 액상 오일제품에는 용해되지 않고, β-시토스테롤을 유기화학적 방법에 의해서 수소화(hydrogenation)시켜, β-시토스타놀을 합성한 후 지방산과 반응시켜야 하는 어려움이 있다.

따라서, 콜레스테롤과다증의 치료뿐 아니라, 일부 심장계 질환 및 고혈압 등의 예방도 가능하다는 예방의학적 견지에서, 식물성 오일 등과 같은 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 경제적인 제조방법 개발의 필요성이 끊임없이 대두되어 왔다.

이에, 본 발명자들은 불포화 지방산 또는 그의 에스테르 화합물이 포화 지방산 또는 그의 에스테르 화합물보다 융점이 현저히 낮고 대부분이 실온에서 액상인 점에 착안하여, 피토스테롤 또는 피토스타놀을 불포화 지방산과 결합시킨 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 제조방법을 개발하였으며, 수득한 물질이 피토스테롤 또는 피토스타놀과 동일한 효과를 나타내며 액상 오일에 용해 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 콜레스테롤 과다증의 치료뿐 아니라 일부 심장계 질환 및 고혈압 등의 예방도 가능한 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 경제적 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 제조방법에 의하여 제조된 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물을 포함하는 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 콜레스테롤 저하효과를 갖는 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 제조방법은 피토스테롤 또는 전기 물질의 수소화(hydrogenation) 형태인 피토스타놀을, 톨루엔, 염화메틸렌, 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran), 벤젠 또는 디에틸에테르(diethylether) 등의 비극성 유기용매에 용해시키고, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP: 4-dimethylaminopyridine), 피리딘 또는 트리에틸아민(TEA: triethylamine)과 같은 염기성 촉매를 첨가한 후, 불포화 지방산과 1,3-디시클로헥실카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3'-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC: 1-ethyl-3-[3'-dimethylaminopropyl] carbodiimide), 옥살릴클로라이드(oxalyl chloride), 카보닐디이미다졸(carbonyl diimidazole), 2-클로로피리디움 (2-chloropyridium), 2,2'-디피리딜디설파이드(2,2'-dipyridyl disulfide) 또는 2-이미다조일디설파이 드(2--imidazoyl disulfide)와 같은 카르복실기 활성화 물질을 첨가하여 에스테르화 반응시키는 공정, 및 전기 공정에서 수득한 반응물을 여과하고 용매를 제거한 후, 메탄올 또는 메탄올/아세톤(8:2, v/v) 혼합용매 내에서 교반하고 침전시키는 공정을 포함한다. 이때, 반응물질로 사용하는 피토스테롤은 고등식물에서 발견되는 스테로이드 구조를 갖는 알코올 화합물을 통칭하는 것으로, 전술한 스티그마스테롤, 스피나스테롤, 캄페스테롤 및 시토스테롤 등을 포함하고, 바람직하게는 α-, β-, γ- 타입의 시토스테롤을 포함하며, 피토스타놀은 전술한 피토스테롤의 수소치환된 형태인 시토스타놀, 캄페스타놀을 포함한다. 한편, 불포화 지방산으로서는 탄소수가 4 내지 22개, 바람직하게는 12 내지 20개, 보다 바람직하게는 16 내지 18개인 것을 이용하며, 불포화도는 1 내지 3의 범위인 것을 이용한다.

또한, 본 발명은 전기 제조방법에 의하여 제조된 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물을 포함하는 식품을 제공한다. 이때, 전기 식품은 이에 한정되는 것은 아니나, 식용유, 샐러드 오일, 쿠킹오일, 마요네즈, 마아가린, 샐러드 드레싱, 버터 또는 쇼트닝을 포함한다.

이하, 본 발명의 콜레스테롤 저하효과가 있는 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 제조방법을 피토스테롤로서 β-시토스테롤을, 불포화 지방산으로서 올레인산을 채용한 예를 중심으로 공정별로 나누어 보다 상세히 설명하고자 한다.

제 1공정: 피토스테롤과 불포화 지방산의 에스테르화 반응

β-시토스테롤과 불포화 지방산을 1:1 내지 1:3, 바람직하게는 1:2의 몰비로 첨가하고, 톨루엔, 염화메틸렌, 테트라히드로퓨란, 벤젠 또는 디에틸에테르 등의 비극성 유기용매에 용해시킨 후, DMAP, 피리딘 또는 TEA와 같은 염기성 촉매를 첨가하여, 0 내지 70℃, 바람직하게는 22 내지 28℃, 가장 바람직하게는 25℃에서 교반하여 모든 입자를 완전히 용해시킨다. 전기의 온도에서 DCC, EDC, 옥살릴클로라이드, 카보닐디이미다졸, 2-클로로피리디움, 2,2'-디피리딜디설파이드 또는 2-이미다조일디설파이드와 같은 카르복실기 활성화 물질을 유기용매에 용해시켜 β-시토스테롤에 대하여 1:1.1 내지 1:3, 바람직하게는 1:1.3 내지 1:1.6, 가장 바람직하게는 1:1.4의 몰비로, 온도를 30 내지 34℃로 올려주며 서서히 적하하고, 1 내지 5시간, 바람직하게는 2 내지 4시간 동안, 가장 바람직하게는 3시간 동안 교반한 후, TLC를 이용하여 반응의 종료점을 결정한다.

제 2공정: 피토스테롤-불포화 지방산 에스테르 화합물의 수득

피토스테롤과 불포화 지방산의 에스테르화 반응이 종료된 다음, 반응물을 여과하고 용매를 감압하여 제거함으로써 오일상의 물질을 수득한다. 수득한 오일상의 물질을, 30 내지 50℃, 바람직하게는 35 내지 45℃, 가장 바람직하게는 40℃에서 메탄올 또는 메탄올/아세톤(8:2, v/v) 혼합용액을 가하여 격렬히 교반하고, 0 내지 4℃에서 1시간 내지 30시간, 바람직하게는 3시간 내지 27시간, 가장 바람직하게는 5시간 내지 24시간동안 냉각하여 침전시킴으로써, 왁스(wax)형태의 피토스테롤-불포화 지방산 에스테르 화합물을 얻는다.

본 발명에서 수득한 β-시토스테롤-불포화 지방산 에스테르 화합물은 웅성 랫트를 대상으로 한 동물실험에서 콜레스테롤을 저하시키는 효과가 확인되었으며, 옥수수유, 참기름 등의 오일에 용해됨이 확인되었고, 품질비교 결과 일반식용유와 물리적인 측면에서 성질의 변화가 나타나지 않았다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 이하의 실시예에서는 피토스테롤로서 β-시토스테롤을 채용한 예를 나타내었으나, 그 범위는 본 발명의 취지에 따라 스티그마스테롤, 스피나스테롤, 캄페스테롤 또는 시토스테롤에도 적용가능하다는 것 및, 불포화 지방산으로 불포화도가 1인 올레인산을 대상으로 하였으나, 불포화도가 2인 리놀레인산(linoleic acid) 및 불포화도가 3인 리놀렌산(linolenic acid)과 같은 불포화 지방산에도 본 발명의 적용이 가능하다는 것은 명백하며, 또한, 액상 오일로서 식용유(옥수수유)를 대상으로 하였으나, 본 발명의 취지에 따라 기타의 오일류 즉, 참기름, 면실유, 대두유, 소맥 배아유, 미강유, 홍화유, 채종유 및 해바라기유에도 본 발명의 적용이 가능하다는 것은 더욱 명백하다 할 것이다.

실시예 1: β-시토스테롤과 올레인산의 에스테르화 반응

둥근 플라스크에 반응물질로서 β-시토스테롤 30g(72mmol), 올레인산 41.45g(147mmol)을 125mL의 염화메틸렌에 용해시킨 후, 염기성 촉매인 DMAP 2.65g(22mmol)를 첨가하고, 25℃의 수조 안에서 격렬히 교반함으로써 모든 입자를 완전히 용해시켰다. 75mL의 염화메틸렌에 카르복실기 활성화 물질인 DCC 22.39g(109mmol)을 용해시킨 후, 초기에는 빠른 속도로 DCC 용액을 적하하며 온도를 32℃로 올린 다음, 적하속도를 줄이고 온도를 유지시켰다. 적하가 끝난 다음, 25mL의 염화메틸렌을 이용하여 기벽을 씻어주고 3시간동안 더 교반한 후, TLC로 반응의 종료시점을 확인하였다.

실시예 2: β-시토스테릴-올레이트 화합물의 수득

실시예 2-1: 메탄올을 이용한 침전

반응 중에 생성된 디시클로헥실우레아(dicyclohexylurea)침전물을 여과하여 제거하고, 용매를 감압하여 휘발시킴으로써 오일상의 물질을 수득하였다. 수득한 오일상의 물질에 400mL의 메탄올을 첨가하고 40℃에서 1시간동안 교반한 후, 4℃의 냉장고에 5시간동안 보관하여 생성물을 왁스 형태로 고형화시킨 다음 용매를 제거하였다. 다시 메탄올 300mL을 부은 후, 전기의 과정을 한번 더 반복하였으며, TLC를 이용하여 생성물 내의 불순물(반응하지 않은 올레인산) 함유정도를 확인하고, 만약 불순물이 많이 남아 있는 경우, 전기의 과정을 한번 더 시행하였다. 상기와 같은 공정을 통하여 β-시토스테릴 올레이트를 90% 수율로 수득하였다.

실시예 2-2: 메탄올/아세톤 혼합용매를 이용한 침전

반응 중에 생성된 디시클로헥실우레아 침전물을 여과하여 제거하고, 감압하에서 용매를 휘발시킴으로써 오일상의 물질을 수득하였다. 수득한 오일상의 물질을 20mL의 염화메틸렌에 용해시킨 후, 격렬히 교반되는 메탄올/아세톤(8:2, v/v) 혼합용매에 서서히 적하하여 침전시켰다. 4℃에서 24시간 이상 방치한 다음, 여과하여 왁스형태의 β-시토스테릴 올레이트를 51% 수율로 수득하였다.

실시예 3:

서울대학교 실험동물사육장에서 사육한 생후 3주령의 Sprague-Dawley 웅성 랫트 30마리를 사용하여, 먼저 정상식이에 콜레스테롤 및 콜릭산(cholic acid)을 각각 1%, 0.5% 농도로 균질하게 혼합하여 1주일간 급여함으로써, 혈중 콜레스테롤치를 상승시켰다. 상기와 동일한 사료를 급여하면서 상기 실시예 1,2에서 합성한 왁스형태의 β-시토스테릴 올레이트를 사료와 혼합하여 급여하였다. 시료의 투입량은 β-시토스테릴 올레이트 기준으로 0.16g/kg/day이며, 1주일 후의 총 혈중콜레스테롤치, HDL(high density lipoprotein)-콜레스테롤 및 LDL(low density lipoprotein)-콜레스테롤 양을 측정하여 통계처리하였으며 등분산검정을 실행하였다.

* : 시료투여 1주일 후의 대조군 대비 총 콜레스테롤치의 저하율

** :대조군과의 유의차( p〈 0.05 )

* : 시료투여 1주일 후의 대조군 대비 LDL-콜레스테롤치의 저하율

** : 대조군과의 유의차( p〈 0.05 )

상기 표 1, 2, 3에서 볼 수 있듯이, β-시토스테릴 올레이트는 β-시토스테롤과 마찬가지로 LDL-콜레스테롤과의 경쟁적 흡수기작을 통해서, 인체에 해로운 LDL-콜레스테롤의 흡수를 감소시켜 혈중 콜레스테롤의 저하시키는 반면, HDL-콜레스테롤의 흡수에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.

실시예 4:

실시예 1에서 수득한 β-시토스테릴 올레이트의 용해도를 조사하였다(참조: 표 4). 용해도는 각 농도(%(w/v))의 시료를 각각의 온도에서 3일간 방치한 후, 침전물의 생성여부를 조사한 결과이며, 표 4에서, ○는 침전물이 생성되지 않은 상태를 나타내며 는 침전물이 생성된 경우를 나타낸다. 표 4에서 보듯이, β-시토스테릴 올레이트는 액상 오일에 용이하게 용해됨이 확인되었으며, β-시토스테릴 올레이트를 1% 함유한 식용유를 식품의약품 안전청(KFDA)의 식용유지 기준 및 규격에 의하여 일반식용유와 비교하였을 때, 표 5에 정리한 것과 같이 품질면에서 커다란 차이가 없었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 콜레스테롤 저하기능을 갖는 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명에서, 전기의 방법에 의해 제조된 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물은 기존의 피토스테롤 또는 피토스타놀과는 달리 옥수수유, 참기름 등의 액상 오일류에 쉽게 용해될 뿐만 아니라, 인체에 해로운 LDL-콜레스테롤의 흡수를 감소시켜 혈중 콜레스테롤치를 저하시키는 반면, HDL-콜레스테롤의 흡수에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 의해 제조된 액상 오일에 용해가능한 피토스테롤 또는 피토스타놀의 불포화 지방산 에스테르 화합물은 콜레스테롤 과다증의 치료뿐 아니라, 일부 심장계 질환 및 고혈압 등의 예방에 사용될 수 있는 식품에 유효성분으로 널리 적용될 수 있을 것이다.