测定多个被分析物的方法

本发明涉及对样品中被分析物进行测定的快速和低成本的方法。 尤其是，本发明涉及微滴定板，所述微滴定板的底部包含(半)透膜过滤 器并且涉及所述滴定板在同时测定样品液体中多个被分析物的方法中 的应用。

使用酶联免疫吸附分析(ELISA)对诸如抗体或抗原的特定被分析 物的测定与定量是一种良好的标准化诊断方法。目前这些方法通常是 通过使用96-孔聚苯乙烯微滴定板来实现的。所述方法包含若干关键步 骤，包括i)将捕获配体固定化在所述微滴定板小孔的壁上(所谓的包被 步骤)，ii)通过洗涤分离所述结合与游离的捕获配体，iii)将目的被分 析物与所述结合的捕获配体结合，iv)通过洗涤将结合与游离的被分析 物分离，v)将共轭连接的酶与所述结合的被分析物结合，vi)通过洗 涤将所述结合与游离的共轭物分离，vii)通过对加入底物的酶转化对所 述结合的共轭物进行测定。由于这些基本的处理步骤，尤其是将所结 合的反应物与未结合的反应物分离的广泛的洗涤过程，所述方法工作 强度较大并且相对较为缓慢。

除了在多个结合反应中所涉及到的扩散过程由此延迟了该过程这 一事实之外，大量洗涤步骤也产生了大量的废液。当使用具有生物危 害的材料或传染性样品时，这是特别难以解决的，并且会产生大量污 染的废液。

此外，为了对一份样品中的多个被分析物进行检测，需要采用能 与待测的单个被分析物特异性结合的不同捕获配体对分别的微滴定板 进行包被。因此，一份样品必需施用到不同的滴定板上。由于所用包 因捕获配体的不同而不同(例如，不同的缓冲液，温育时间，温育温度 等)，因此有时也需要使用不同的滴定板。而且，因为用不同的捕获配 体对一块滴定板上的单个小孔进行包被也会在小孔之间产生交叉污染 的风险，所以也需要不同的滴定板。

在多个诊断领域中，可测定单个样品中存在或不存在多个被分析 物。当通过ELISA技术对样品中的多个不同被分析物进行测定时，上 述的对每种单独ELISA检测所需要的分别的微滴定板也具有一些缺 点。例如，如果只对有限数量的样品进行测定，那么在微滴定板中就 会有许多的小孔未得到使用。而且，如果需要对不同的被分析物进行 测定就需要将所述检测样品等分在不同的测定板上，因此需要较大的 样品体积。再者，本质上也很难对不同滴定板得到的结果进行比较。 如上所述，现有技术方法中的另一个问题在于需要大量的洗涤液体， 并且在需要测定传染因子的情况时会产生大量污染的废液。按顺序进 行所述过程的操作是相当耗时的并且容易出错。

本发明人现已找到了在液体样品中对被分析物进行测定的方法， 该方法能够克服现有技术的一或多个缺点。所述方法涉及a)提供含有 多个容器的特定的微滴定板，其中每个容器的底部都含有能直接或间 接与被分析物结合的(半)透膜过滤器，且其中每个容器都通过容器分隔 壁与相邻的容器分隔，其中所述容器可被分为一或多个簇的分组，每 个簇含有至少两个容器，其中所述簇通过簇分隔壁与相邻的簇分隔， 且其中至少有部分所述容器分隔壁低于所述簇分隔壁，或者其中所述 容器分隔壁包含至少一条通道，所述通道将簇内的至少两个相邻容器 相连，所述通道与所述容器的底部有一段距离，且至少部分地低于所 述容器的顶部。所述方法还包括步骤b)：将所述液体样品施用于至少 一簇容器，通过所述膜过滤器对所述样品进行过滤，从而将所述一或 多被分析物与所述膜过滤器或捕获配体结合，并且进行可选的洗涤步 骤；和步骤c)：通过对所述膜过滤器进行结合分析从而测定在所述容器 中一或多个被分析物的所述结合，所述结合分析优选为化学荧光免疫 分析。

本发明还涉及上述方法中所提供的特定微滴定板本身及其在被分 析物测定中的应用。

事实上，当使用上述方法时，本发明人发现该方法极大地降低了 所需要的洗涤液体的量。此外，还发现可在单个微滴定板上进行不同 的分析测定。

作为结果，本发明人发现可通过单次实施步骤，将单个样品施用 于单个微滴定板上的多个相连容器从而在其上进行不同的分析检测。

在第一方面，本发明提供了测定本说明书如上所述的样品中被分 析物的方法。在本发明所述方法的实施方案中，以微滴定板的形式提 供了多个样品容器。所述微滴定板的整个底部都具有(半)透膜过滤器， 使得所述每个容器的底部也包含(半)透膜过滤器。

在本说明书中，术语“(半)透膜过滤器”，“(半)透膜”和“膜过 滤器”是可以互换使用。

所述多个容器可以是任意数量和形状，并且可以采用任意的装饰 性模式进行设置，优选地，所述多个容器可以是标准的96孔微滴定板 的形式，也可以是包含约384孔，864孔，1536孔，2400孔或约3456 孔的特别适合的形式。

与每串容器相连的容器的数量可以是任意适于在多个容器中测定 多个被分析物的目的的数目。在上述方法的特定优选实施方案中，该 方法涉及到包含至少n2个相邻容器的微滴定板的应用，其中n为整数， 优选从2-10，更优选为2-5。这样的数量对编码的位置，程序的标准化 以及制造的原因而言都是有利的考虑到。

本发明还涉及含有多个容器的微滴定板，其中每个容器的底部都 含有能直接或间接与被分析物结合的(半)透膜过滤器，且其中每个容器 都通过容器分隔壁与相邻的容器分隔，其中所述容器可被分为一或多 个簇的分组，每个簇含有至少两个容器，其中所述簇通过簇分隔壁与 相邻的簇分隔，且其中至少有部分所述容器分隔壁低于所述簇分隔壁， 或者其中所述容器分隔壁包含至少一条通道，所述通道将簇内的至少 两个相邻容器相连，所述通道与所述容器的底部有一段距离，且至少 部分地低于所述容器的顶部。

在该方法中，所述微滴定板的使用情况是当将样品液体施用于簇 中的第一个容器时，所述施用的液体的量是使所述液体水平升高至高 于所述容器分隔壁或高于所述通道的位置的量，至少部分所述施用的 样品液体会从所述第一个容器流到或溢出至相邻的第二个容器中，直 到所述液体水平再次与所述容器分隔壁一致或低于所述通道的位置为 止。此时，根据其体积，所应用的液体的量应能均匀分配在簇内的所 有容器中，然后在单次样品应用步骤中为所述簇内的所有容器提供等 量提及的样品液体。

优选地，所述容器分隔壁具有在相邻或相接容器之间的特定的最 小高度或位置，可将该高度或位置升高到比所述容器的底部更高，从 而可以在其中包含一定的样品液体的量。基本上所述量足以对所述被 分析物进行分析检测。容器的通常容量包含或在溢出之前为1-5000μl， 优选为5-1000μl，更优选为5-250μl液体的容量。因此，本发明的微滴 定板的特征在于其具有簇分隔壁和容器分隔壁，其中所述簇分隔壁使 得样品液体从一个容器溢出至另一个容器。基本上在本发明的方法中， 当注入容器的液体量超过其溢出之前的容量时将发生溢出，在本说明 书中也称为溢出体积。所述容器分隔壁的高度通常为0.1-20毫米，优 选为1-5毫米。所述簇分隔壁通常比所述容器分隔壁高0.1-15毫米，优 选高出1-5毫米。

所述容器分隔壁和簇分隔壁可以是任意的材料，并且例如可以是 清澈的，白色的，黑色的或者是透明的或者是避光的，原则上可以是 任意的颜色。优选地，所述壁是避光的。

基于本发明的方法，原则上可用于在任意液体样品和任意液体中 测定被分析物，诸如在细胞培养上清液，水(包括饮用水，冷却塔水， 废水和处理水)，土壤的提取物或其他液体，例如油，但优选为体液， 例如乳液，尿液，(全)血，血清，血浆，胸膜液，胃液，十二指肠液， 眼内液，腹水，腹膜液，羊膜液，滑液，胆囊液，脑脊髓液，阴道分 泌物(包括月经)，精液，痰液，唾液，粪便或肥料的提取物，汗液或伤 口的分泌液上进行测定。

为了在诸如活检组织样品的非液体样品中测定被分析物，可以采 用浆液，悬液，溶液，浸渍，匀浆等等方式制备适合的样品。因此， 所述样品可含有液体样品，来自样品的液体，液化的样品，或从液体 状的样品的制备物。所述被分析物可以悬浮或溶解形式存在于所述样 品中。

所述样品可得自任意来源或任意受试者，包括但不限于哺乳动物， 包括例如人类，非人类灵长类，小鼠，猪，牛，山羊，猫，兔，大鼠， 豚鼠，仓鼠，马，猴，绵羊或其他非人类哺乳动物；以及非哺乳类动 物，包括非哺乳动物类脊椎动物，例如禽类(例如鸡和鸭)或鱼类，以及 非哺乳动物类无脊椎动物。

所述方法可用于测定一份样品中的多个被分析物。本发明的方法 可用于测定诸如DNA或RNA，蛋白和多糖的核苷酸，多肽或糖或其 聚合物的被分析物。同样还可测定抗体，抗原，酶，辅因子，代谢物， 激素，朊病毒，病毒，细菌和/或真菌。一般而言，可以利用本发明的 方法测定可以被提供特异性结合部分的化学或生物物质，例如在抗体- 抗原结合部分对中的每一结合部分，或诸如酶/底物，电荷转移复合体， 层叠复合体，共价复合体等等的结合对。

在本说明书中，术语“一或多个被分析物”中的“多个”可理解 为不同类型的被分析物。

在本说明书中，术语“抗体”是指单克隆抗体，多特异性抗体， 合成抗体，人类抗体，人源化抗体，嵌合抗体，单链Fvs(scFv)，单链 抗体，Fab片段，F(ab`)片段，二硫键连接的Fvs(sdFv)，抗-独特型(抗 -Id)抗体(包括，例如抗本发明抗体的抗-Id抗体)，以及上述任意的表位 结合片段。尤其是，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子以及免疫球蛋 白分子的免疫活性部分，即含有与待测定被分析物免疫特异性结合的 抗原结合位点的分子。所述免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的 任意类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，族(例如IgG1，IgG2， IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚族。

本发明的方法和微滴定板尤其适用于生物样品中多个被分析物的 测定，例如如下试验板或者试验菜单的不同的传染因子或者其人类或 动物或者更广泛参量的抗体：用于手术室，急诊检测，生育检测，饲 料转化，肿瘤标记，自身免疫疾病，骨和矿物质疾病，代谢疾病，胃 肠紊乱和参数，止血，药物滥用，糖尿病，酮症，白血球性增生，供 血领域的试验板或者试验菜单以及激素，过敏原、GMO’s，和在食品， 饲料或所述环境中的污染物和/或残留物的试验板或者试验菜单。

优选的可通过所述多个被分析物分析进行测定的被分析物有病毒 和细菌或针对其的抗体。在特定优选的实施方案中，可采用本发明的 方法对导致如下疾病的因子(或针对其的抗体)进行测定，诸如诸如牛海 绵性脑病(BSE)，口蹄疫，牛呼吸道合胞病毒(BRSV)诱导的疾病，牛病 毒性腹泻，普鲁氏菌病，细螺旋体病，肺蠕虫传染，猪霍乱，猪细小 病毒(PPV)诱导的疾病，伪狂犬病病毒(PrV)诱导的疾病(或奥耶斯基氏 病)，猪水泡病，炭疽，沙门氏菌病，弯曲杆菌诱导的疾病，大肠杆菌 诱导的疾病，霍乱以及其他细菌诱导的疾病，HIV，HBV，HCV，HTLVI 和/或HTLVII。

也可以制备适于对激素，代谢疾病，饲料转化，生育，骨和矿物 质疾病，酮病，白血球性增生等等进行检测的菜单，其中所述菜单包 括对多个因子的大量检测。特别适合的菜单是那些针对在特定领域实 施检测的菜单，所述领域例如食品/饲料工业，该菜单可含有针对食品 安全的微生物检测，对遗传修饰生物体(GMO)存在的检测，或对在食 品或饲料中污染物，毒素，残留物和激素存在于否的检测。

其他适合的菜单是那些在环境检测领域实施检测的菜单，所述环 境检测例如对阿特拉津(atrazine)，pyretroiden，农业毒素或诸如除草剂， 杀真菌剂，灭螺剂，杀虫剂等的农药进行检测的试验板。本领域所属 技术人员应容易确定其他检测领域的其它的适合菜单。例如，可以发 展出在多个分析物中进行多个被分析物分析检测，或进行与特定的生 物系统(例如监控细胞因子mRNA或蛋白水平的免疫分析或杂交分析板) 相关的活性测定，或对疾病状态(例如对心脏表标记进行分析，对引起 过敏反应的过敏原进行测定，对传染性生物体进行测定的分析板)进行 测定，组织类型，生物体，蛋白族，酶或生物分子等等进行测定的分 析板。在一个实施方案中，分析板可用于为生物系统的鉴定提供指纹(例 如与特定细胞类型，细胞器类型，生物体类型，组织类型，细菌或病 毒相关的被分析物水平的模式)。例如，在生物系统的属内对多个成分 的多个分析可用来鉴定所述属内的种或亚种。在另一实施方案中，涉 及在生物系统内对不同成分进行多个分析的不同分析方法可用来鉴定 所述生物系统的状态(例如，疾病状态与正常状态，活化状态与正常状 态等等)，或鉴定由外部条件或刺激(例如与疾病状态的发展相关的成分 分布的变化，刺激性物质的加入，潜在候选药物的加入，诸如pH，温 度的环境条件的变化，等等)影响的生物系统内的所述成分。分析板还 可用来测定一或多个蛋白的功能。例如，可通过对酶底物和/或蛋白结 合部分的模式库进行筛选从而确定其酶促或结合活性筛选蛋白。反之， 可将蛋白的模式库暴露于已知生物材料从而确定是否所述蛋白中的任 意一种可以与所述生物材料结合，反应或被其转化。

通过本发明所述方法测定的优选被分析物是诸如瘙痒病(Sc)， BSE，慢性消耗性疾病(CWD)和克雅氏病(CJD)，以及那些由PrPSc， PrPBSE，PrPCWD，PrPCJD朊病毒引起的可传染的海绵状脑病(TSE)的病原 体。

在本说明书中，容器可定义为含有开放的顶部末端，壁和封闭底 部末端的(圆形)圆柱状容器。通常的容器是常规微滴定板的小孔。基于 本发明，所述容器的底部具有(半)透膜过滤器。在本说明书中，所述(半) 透膜过滤器代表了所述容器的底部，可在所述膜过滤器之下提供降低 的气压或真空从而将用于所述容器的液体从所述容器中去除，由此使 得所述容器中的液体通过所述过滤器。或者，也可通过提供正气压使 施加给所述容器的液体从所述容器中适当地去除，由此推动所述容器 中的液体通过所述过滤器。只要方法适当，所述容器的确切形状并不 重要，例如，真空吸气机可有效地使其成分穿过所述容器底部所含的 膜过滤器。在本发明微滴定板的优选实施方案中，所述板特别适合于 与真空吸气机组合使用。

所述容器可以是任意适合的刚性材料，例如玻璃，聚苯乙烯，聚 丙烯，聚酰胺，聚乙烯，聚丙烯，丁二烯苯乙烯丙烯酸脂(ABS)，Barnox， PVC，尼龙，EVA，PET等等及其组合。所述材料可以是全部清澈的， 白色的，黑色的或者是透明的或者是避光的，原则上可以是任意的颜 色

所述(半)透膜过滤器可以是任意适合的材料，例如硝酸纤维素，乙 酸纤维素，混合的纤维素酯，聚砜，聚醚砜，聚丙烯，聚偏二氟乙烯 (PVDF)，聚碳酸酯，尼龙，玻璃(例如作为微纤维)，或者聚四氟乙烯 (PFTE或Teflon)。根据具体的应用以及所测定的被分析物或所使用的 配体，原则上所述过滤器可是亲水性或疏水性的，荷正点或荷负电的。 在测定朊病毒的情况中，聚偏二氟乙烯(PVDF)是特别优选的膜过滤器。

当允许诸如洗涤液体中的未结合的捕获配体和/或未结合的被分 析物的非反应试剂通过时，所述(半)透膜过滤器能结合被分析物和/或 被分析物的捕获配体。因此，原则上，在本发明的方法中除了待测的 被分析物和所用的捕获配体之外，所有试剂都可以不受阻挡地通过所 述(半)透膜，从而可被洗脱掉。

优选地，所述(半)透膜的标称孔径为约0.01到约15μm，优选为约 0.02-约2μm，更优选为约0.05-约0.45μm。

根据本发明，所述膜过滤器能结合感兴趣的被分析物。这样的结 合可以是直接结合，例如，通过静电相互作用，通过疏水相互作用， 共价结合，电荷转移相互作用等等使所述被分析物与所述膜过滤器结 合的结合。这样的直接结合可以是例如共价结合的永久或不可逆的结 合，或者是可逆的结合。

或者，所述目的被分析物与所述膜过滤器的结合也可以是间接的， 即通过以在所述膜过滤器上或之内的捕获配体的形式，优选以膜包被 的形式，提供适于所述被分析物的特异或非特异的结合部分来得以促 进。然后将所述捕获配体固定于所述膜过滤器上或其中，本领域所属 技术人员可采用任意适合的公知技术进行这样的固定。适合的捕获配 体可以是能与所述被分析物结合的任意结合部分，诸如(链霉)亲和 素或抗体，优选单克隆抗体，其可针对特定的被分析物且可随后被用 来将所述被分析物与所述膜过滤器间接地结合。其他适合的捕获配体 包括例如，互补的核酸，包括DNA，PNA或RNA探针等等。本领域 所属技术人员应理解在本发明的方法中可将多个结合部分用作捕获配 体。

对所述(半)透膜的结合优选是特异性的。如上所述，间接结合的优 点在于其结合在大多数情况下是特异的，尤其是将所述被分析物的特 异性结合部分用作捕获配体的时候。

不同于现有技术中包被程序的繁琐与耗时，本方法涉及在适合的 液体介质基中使用所述捕获配体，将含有所述捕获配体的液体培养基 用于所述容器，任选温育较短时间，通常为几分钟，然后将所述容器 中的全部内容物过滤通过所述膜过滤器，优选通过真空，由此将所述 捕获配体结合到所述(半)透膜上。任选地，之后还可以用少量的适合洗 涤溶液清洗未结合捕获配体的所述膜过滤器。这样的步骤比常规的包 被步骤快得多。

当然也存在捕获配体与所述被分析物先结合的可能性，例如，通 过向所述样品提供这样的捕获配体，由此产生捕获配体-被分析物的复 合体，然后将所述复合体与所述膜过滤器结合，由此完成了所述被分 析物与所述膜过滤器的间接结合。

如本发明所述，测定样品中被分析物的方法还包括第二步骤，即 将所述液体样品施用于所述一或多个样品容器，将所述样品过滤通过 所述膜过滤器，优选通过真空，由此将一或多个被分析物与所述膜过 滤器结合，并任选进行洗涤步骤。

如上所述，所述一或多个被分析物与所述膜过滤器的结合可以是 直接或间接的。在这两种情况下，需要特异的介质或缓冲液对所述被 分析物与所述膜过滤器的直接结合进行优化，从而促进所述被分析物 与所述膜过滤器-固定化捕获配体之间的相互作用，或优化所述被分析 物-捕获的配体复合体与所述膜过滤器之间的结合。

在实施本发明的检测方法时，有可能例如需要在所述温育介质中 包括某些“封闭剂”，从而确保在所述实验样品中存在的非特异蛋白或 蛋白酶不会与诸如抗体的捕获配体产生交联或对其进行破坏，进而产 生假阳性或假阴性结果。因此，“封闭剂”的选择可以向本发明所述的 分析方法中再加入特异性。本领域所属技术人员应该理解可在这些介 质或缓冲液中使用多个成分，从而能够使所述被分析物与所述膜过滤 器直接结合或与诸如抗体的捕获配体结合，并对其结合进行优化。

如本发明所述，对样品中一或多个被分析物进行检测的方法的第 三步包括通过在所述膜过滤器上进行结合分析在所述样品容器中测定 所述结合的一或多个被分析物。本领域所属技术人员应理解通过使用 结合分析在所述膜过滤器上对固定化的被分析物进行测定的多个可能 性。非常适合的分析方法是免疫分析方法，例如ELISA分析方法。

通常，结合分析包含结合阶段，其中特异的结合部分与所述被分 析物结合，以及随后的测定阶段，其中对信号进行测定。可以在将所 述液体样品施用于所述一或多个样品容器之前实施结合阶段，即在实 施本发明所述方法的第二步之前，向样品液体中加入结合部分，并允 许其与所述被分析物结合。所述结合阶段可优选地在第三步中进行。 相反，所述测定阶段总是在本发明所述方法的第三步中在所述膜过滤 器上进行。

原则上，任意类型的检测方法都适于在本发明的方法中使用。例 如，如本发明所述，例如显色方法，磷光方法，发光方法和荧光方法 都是适于在样品中测定一或多个被分析物的方法。发光技术包括生物 发光，电化学发光和化学发光。对后者而言，通过使用例如HRP或AP 对底物进行酶学转化的闪烁类型，通过活化鲁米诺(luminol)，二氧乙烷 (dioxethane)或吖啶酯标签的发光类型都是较为适合的。所使用的检测 方法的类型依赖于分析条件，本领域所属技术人员应该能够选择较为 适合的方法。与电化学发光相比，化学发光是更优选的，因为它允许 更简单的检测，无需用电极来对分析位点(即待测的所述容器或(半)透 膜表面)施加电荷，且无需特殊的检测设备。此外，设备与传染性材料 接触后需要进行彻底清洗，与朊病毒相关材料接触过的设备不可再次 使用，必须销毁。因此，如本发明所述的微滴定板优选较便宜且是可 消耗的。

对直接结合或通过特异捕获配体与所述膜过滤结合的固定化被分 析物进行检测的常见化学发光免疫分析包括：i)在适合的轭合缓冲液 中应用能与所述被分析物特异性结合的酶-抗体共轭物；ii)根据孵育条 件，进行简短的温育以使特异结合的发生，通常为30分钟至2小时； iii)通过将所述容器中的全部内容物过滤通过所述膜过滤器去除未结 合的共轭物，优选通过真空；iv)通过洗涤溶液任选地洗涤所述膜过滤 器；v)应用所述化学发光底物和vi)对所述容器中产生的化学发光进行 光测定。对化学发光应用而言，所述容器优选为白色材料，当进行荧 光应用时，优选为黑色材料。

因此，本发明的方法包括在所述被分析物与所述膜过滤器结合的 步骤中首先将结合部分用作捕获配体，以及使用第二结合部分作为检 测分析的一部分。在本领域中，这样的实施方案称为三明治型分析。

在本发明所述方法的优选实施方案中，以含有多个样品容器的微 滴定板的形式提供所述样品容器，然后将所述微滴定板用于实施本发 明的方法。所述微滴定板的整个底部都具有与每个容器壁密封连接的 (半)透膜过滤器，因此每个容器的底部都具有(半)透膜过滤器。

在本说明书中，术语“底部”可理解所述容器的较低部分或基本 上靠近所述容器基部的位置，从而使得所述容器在所述膜过滤器上具 有一定的体积，但低于所述通道或容器分隔壁，如果有的话，并且包 括所述容器壁的较低边缘或基部。

在另一优选实施方案中，所述方法包括在一个样品中使用对多种 被分析物进行不同测定的特定的微滴定板。对该实施方案而言，根据 从所述容器底部进行的测定，或基于在簇内将单个容器连接的通道， 基于将其分隔的所述壁的高度，在所述微滴定板中的单个容器以使两 个或更多个容器形成一簇容器的方法进行排列(参见图1和图2)。

在容器簇中将单个容器分隔开来的所述壁的特征是将两个或更多 相邻容器分隔的壁(容器分隔壁)要低于将两簇或更多簇容器分隔的壁 (簇分隔壁)。如本发明这种实施方案所述的微滴定板的使用情况是，当 将样品液体应用于第一簇容器的随机容器中并且所述样品液体的量使 所述液体水平升至高于所述容器分隔壁时，至少一部分所述样品液体 会溢出到所述相邻容器中。因此，原则上簇内的所述容器分隔壁的高 度是当应用的液体体积高于确定的临界体积时，所述样品液体可以在 所述第一簇内的相邻容器中自由流动的高度。然而，液体不会在两个 簇之间自由流动，因为所述液体量是所述液体水平不超过所述簇分隔 壁的量。

在第二方面，本发明涉及含有多个容器的微滴定板，其中每个容 器的底部都含有能直接或间接与被分析物结合的(半)透膜，且其中每个 容器都通过容器分隔壁与相邻的容器分隔，其中所述容器可被分为一 或多个簇的分组，每个簇含有至少两个容器，其中所述簇通过簇分隔 壁与相邻的簇分隔，且其中至少有部分所述容器分隔壁低于所述簇分 隔壁，或者其中所述容器分隔壁包含至少一条通道，所述通道将簇内 的至少两个相邻容器相连，所述通道与所述容器的底部有一段距离， 且至少部分地低于所述容器的顶部。

在每簇容器中，可优选地对来自一个样品的多种被分析物同时进 行测定，每种被分析物优选地在不同的容器中进行测定。同样地，可 用不同的捕获配体对不同的单个容器的膜过滤器进行包被，以下将对 其进行详细描述。

在本发明微滴定板的可选替换实施方案中，所述容器壁和簇壁无 需在高度上有所区别，而在簇内的单独容器之间，而不是在簇间的单 独容器之间提供有例如以凹痕或开口形式的孔或流道的通道。所述通 道大多数位于距所述容器底部一段距离的容器壁中，由此所述容器可 提供有一定量的液体而所述液体不会流到或溢出至相邻和连接的容器 中。这一特征的优点是单个容器可具有不同的试剂，即将所述试剂提 供于低于所述容器的溢出体积的液体中的情况下，所述试剂会保留在 一个容器中而不会横向流入相邻容器中。以这种方式中，单个容器中 的所述(半)透膜可以简单的方式提供有不同的捕获配体。

在本说明书中，术语“溢出体积”可理解为包括临界体积，高于 该体积所应用的液体就会流到簇内的相邻容器中。

本发明的微滴定板不仅支持本发明的方法，其中向容器进行样品 液体的单次递送行为或应用可将所述样品分配到多个容器中，还可支 持含有洗涤液体的单次递送以及检测介质和试剂的单次递送的方法。 在这样的微滴定板中，液体会自动且同时等分至多个容器中，条件是 所述递送提供的液体体积至少是单个容器的所述溢出体积乘以该簇中 的容器数。这极大地降低了进行所述检测分析所需要的递送次数。因 此，优选地，微滴定板上所有容器的溢出体积是完全相等的。

在本发明微滴定板的特定优选实施方案中，每簇容器包含至少2 个，优选为n2个相邻的容器，其中n为整数，优选为2-10，更优选为 2-5。簇中的最大容器数量依赖于所使用的微滴定板的类型(即其上提供 的容器或小孔的总数)以及在所述微滴定板上的所述簇的数量。原则上， 微滴定板可具有一个簇，但更优选为多个簇，每个簇优选地与其他簇 相同。

簇内的每个容器并不需要通过溢出与该簇内的每一个和每个相邻 的容器相连。例如，如图1和图2所示，当其体积至少为单个容器的 所述溢出体积乘以该簇内的容器数量时，标识为F，G，H，K，M和N 的簇都会完全且均匀地被充满。所述簇可以采用包含相互连接的容器 的任意形状或形式，线性形式的正方形，矩形是优选地，因为这可以 通过在所述板上的标记而变得更容易确定。

本发明的微滴定板优选适合于在每个容器中进行一种被分析物的 检测，以及在每簇中进行多种被分析物的检测。

本发明的微滴定板的排列方式可以是使一簇或多簇，或优选簇内 的一个或者多个容器用于内部标准，对照以及校准物的排列方式。例 如，一或多个容器可以不含有捕获配体或可用封闭剂对其进行包被从 而抑制所述被分析物与所述膜或生物材料的结合，而不会参与和样品 的反应；这些容器可用来测定和/或校正标记与所述容器表面的非特异 性结合。在另一实施例中，用标记试剂包被一或多个容器(例如用具有 检测标记标记的试剂)；这些容器可用来测定和/或校正影响从标记生成 的信号和对其进行测定的条件(例如pH，温度，化学干扰物，有色物质 等等)。在另一实施例中，一或多个容器可用来对所述分析混合物中峰 值的对照被分析物的对照分析。优选地，所述对照分析在形式上类似 于在簇内其他容器中进行的分析。对照分析可用来测定和/或校正非特 异性结合，影响从标记生成信号的条件以及影响分析反应的条件(孵育 时间，温度，混合的变化，等等)。

通过在本发明的所述微滴定板内的容器进行成簇排列目前很好证 实了对一个样品中的多种被分析物进行检测的方法。在本发明的微滴 定板中，相邻容器壁需要保留至少一定的高度，或者通道与所述底部 也有一段距离。其结果是在一簇相邻的容器中，每个容器都可提供有 含有不同特异性捕获配体的液体，从而在不同容器中的膜过滤器都提 供有不同的特异性捕获配体，作为其结果，可通过间接结合于单个容 器底部的膜过滤器上将来自一个样品的不同特异性被分析物捕获或固 定化。可在这些相邻容器中对来自单个样品的不同被分析物进行同时 测定。在一个实施方案中，本发明的微滴定板包括一簇容器中的至少 一个容器，其含有将被分析物与所述容器的膜过滤器结合的捕获配体。 在另一实施方案中，在一簇容器的每个容器中都包含与所述膜过滤器 上的被分析物间接结合的不同的捕获配体。

如果一簇内的多个容器提供有不同(优选为已知，最优选为较准) 量的捕获配体，这些不同(优选为已知，最优选为较准)量的被分析物会 与簇内的不同容器结合，这样的簇可用来测定所述样品中的被分析物 的量，或测定所述捕获配体的所述结合能力。

例如，固定化于单个容器所述膜过滤器上的特异捕获配体可选自 针针对传染性疾病因子的特异性抗体，或选自如上所述的传染因子的 结构或者部分。本领域所属技术人员应该理解可选择被分析物的许多 不同的捕获配体来将被分析物与特定容器的膜过滤器上的被分析物结 合。此外，本领域所属技术人员还应该理解可从许多不同的结合分析 方式中选择检测程序，并且甚至可用非特异性抗体实施这样的程序， 只要所述捕获物对所述膜过滤器本身是特异性的，尽管使用特异性的 抗体是优选的。

为了根据本发明的方法生产对一个样品中的多种被分析物进行不 同检测特别有效的本发明的微滴定板，本领域所属技术人员应该理解 可以通过将分隔两个或更多相邻容器的(部分)壁磨铣掉，降低标准微滴 定板中相邻容器的壁的高度或(部分)去除。或者，例如，可以在基部具 有(半)透膜过滤器的含有384个正方形容器的微滴定板顶部粘上含有 96个正方形无底容器的微滴定板。相对于低层的板，顶层板的小孔的 排列应该是一个96无底孔板的容器的每个壁的底角与低层板中的4个 容器对直。通过这个程序，含有96个簇的本发明的微滴定板中，每个 簇含有4个容器。也可以对如上所述的通道向簇内的相邻容器钻孔或 其他方式，从而使所述簇内的所有容器都以某种程度直接或间接地相 连。

在最后一方面，本发明涉及使用本发明的微滴定板测定样品中的 被分析物。在优选的应用中，可在所述板上同时测定多种不同的被分 析物。对样品必须用于多种结合分析的化学和(生物)医学分析的所有领 域而言，如本发明这方面所述的应用是较优越的。优选地，所述应用 涉及多种疾病因子的诊断。

在本发明多方面的尤其优选的实施方案中，提供了多种被分析物 的分析，该分析包括本发明微滴定板的应用，其中在每簇容器中，可 同时对一个样品中的多种被分析物进行分析，每种被分析物优选地在 分别的容器中进行分析。如上所述，可以通过用不同的捕获配体对众 多单个容器的所述膜过滤器进行包被来适当地实现。

在最优选地实施方案中，可选择不同的捕获配体使得本发明的所 述微滴定板能够支持如上所述的特异诊断菜单或诊断板的实施，例如， 当进行实施后，能指示疾病的所述特异病因。例如，可使用本发明的 微滴定板实施针对诊断乳腺炎病因因子的菜单，所述微滴定板的单个 容器的膜过滤器包被了能与例如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，子宫链 球菌(Streptococcus uteris)，Streptococcus galacticae和/或(Streptococcus agalacticae)的可能存在于怀疑的样品中的乳腺炎疾病因子特异性结合 的捕获配体。或者，或与其结合，可以在所述样品中检测由获得样品 的受试者产生的患者产生针对这些因子的抗体，从所述患者得到的样 品可在所述样品中进行测定。

其他适合的菜单包括对于特异疾病因子或特异疾病类型的菜单， 例如：

-瘟病毒(包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)，边境病病毒(BDV)，典 型猪霍乱病毒(CSFV)，等等病毒和/或其相应的抗体的捕获配体)

-腹泻(包括大肠杆菌，轮状病毒，冠状病毒(例如冠状病毒(BCV))， 隐孢子虫病，肠毒性大肠杆菌K99，沙门菌属和/或其相应的抗体的捕 获配体)

-呼吸性疾病(包括牛疱疹病毒1(BHV1)，BVDV，牛呼吸syncytical 病毒(BRSV)，牛副流感-3病毒(PI-3)，腺病毒，牛支原体(Mycoplasma bovine)，Pasteurella haemotytica和/或其对应的抗体的捕获配体)

-约内(氏)病(增高的敏感性)：(包括例如针对副结核分枝杆菌 (Mycobacterium paratuberculosis)，γ-干扰素等等的抗体的捕获配体)

-异常的朊病毒菜单(包括nvBSE，nvScrapie，nvCWD，nvCFJ的 捕获配体)

或者，可对本发明的微滴定板进行设计，从而使其能够支持涉及 特殊动物的特异性诊断材料的效果，例如，包括多种病因因子或在猪， 羊，马等动物中产生抗体的捕获配体。例如：

-牛(牛)：其菜单可包括用于测定牛呼吸syncytical病毒(BRSV)， 牛腹泻病毒(BVDV)；布氏杆菌属，任选分为流产杆菌和羊流产布氏杆 菌；口蹄疫病毒(FMDV)；钩端螺旋体病(例如哈尔乔血清变型问号钩端 螺旋体(Leptospira interrogans serovar hardjo)；胎生网尾线虫 (Dictyocaulus viviparous)(肺蠕虫)；BSE(疯牛病)；睡眠嗜血杆菌 (Hemophilus somnus)；(Pasteurella haemotytica)存在的捕获配体；

-猪：其菜单可包括测定典型猪霍乱病毒(CSFV)，可选择特异的 株系；口蹄疫病毒(FMDV)；猪Parvo病毒(PPV)；伪狂犬病病毒；猪水 泡病病毒(SVDV)；猪呼吸和繁殖综合征病毒(PRRSV或Lelystadvirus)； 猪环病毒1和2(多系统衰竭综合征的原因(PMWS))；猪流感病毒(SIV) 存在的捕获配体；

-羊：其菜单可包括测定布氏杆菌属，可选择的分为流产杆菌和 羊流产布氏杆菌；口蹄疫病毒(FMDV)存在的捕获配体。

也可将多种目的特异的菜单设计成依赖国家的出口特异性菜单， 例如含有能进行例如Aujeszky检测，沙门氏菌检测，SVDV检测以及 可根据该国家不同疾病的特殊状态进行变化的第四种检测的菜单。

特异性菜单的另一个目的是例如包含用于检测多种传染性疾病因 子的捕获配体的血液库特异性菜单，所述多种传染性疾病因子可在献 血设施中进行检测，例如人免疫缺陷病毒(HIV)1和2；乙型肝炎病毒 (HBV)；乙型肝炎核心抗体(AHBC)；丙型肝炎病毒(HCV)；人T亲淋 巴细胞病毒(human T-lymphotropic viruses)(HTLV)I和II；梅毒；淋病； 莱姆病和克雅氏病(CJD)的结合配体。

其他菜单还包括例如适于特异性过敏检测的菜单。