在国内养猪业需要依赖国外的伺料和猪供给的情况下，为增加在饲养公 猪的农场中的价值创造，创收外币，增加国内的猪饲养工业的竞争性，有必 要获得具有优良特性的猪种。为完成这一任务，本发明人筛选了猪体内与肉 品质相关的特定基因，并利用该基因制备了cDNA芯片。利用该特定基因 转化的猪进行生产，育种，并繁殖这种新品种，从而大大提高了养猪农场的 净增值，因此猪基因的功能分析成为必不可少的步骤。
在过去几年中，猪基因组连锁图谱和物理图谱的研究已经取得了显著的 进步。PiGMaP项目在欧洲启动，现在已有18个欧洲实验室、以及来自美 国、日本和澳大利亚的总共7个实验室参与该项目。目前，猪体内约1,800 个标记物和基因已经被定位(Archibald et al.1994；Marklund et al.1996； Rohrer et al.1996)。目前猪的物理基因图谱包括600多个基因。已在染色 体上发现候选基因一些数量性状座(QTL)的扫描和定位，且已经鉴定出与 猪的经济特性相关的主要基因。与生长和背部脂肪相关的基因存在于染色体 3，4，5，6，7，8，13和14上，与肉质相关的基因存在于染色体2，3，4，6，7， 12和15上，与繁殖特性相关的基因存在于染色体4，6，7和8上。此外， 还鉴别出了与产仔大小相关的候选基因ESR和PRLR、疾病抗性基因 FUT1、皮毛颜色基因SLA、NRAMP和KIT，以及MSHR。
具体观察猪的主要特性，利用Wild Boar和Large White三代家族分析 了重要的生长相关基因，该分析显示染色体4上背部脂肪和腹部脂肪的主 要QTL占表型方差的20％。在染色体13上发现的生长QTL占表型方差的 7％至12％。Andersson等人通过候选基因分析发现PRT1与背部脂肪和出 生重量相关，其定位在染色体13的中部。猪的MHC位于染色体7上。近 些年已经报道了MHC单模标本与一些性状之间的联系。利用MHC类的 DNA探针已经部分证明了上述联系。最近，在中国杂交种的染色体7上发 现QTL与生长和背部脂肪性状相关。显示出背部脂肪和出生重量的QTL位 于靠近TNFA和S0102的区域。迄今为止的所有结果显示，该区域中至少 存在一个生长和背部脂肪QTL。其它结果包括染色体6上的生长性状 QTL，但它似乎与引起恶性高热的RYR1或RYR1周围的其它未知基因所 产生的效果相关。已经报道了染色体3，6，8和14的一些类似的相关性。此 外，Gerbens和Tepas已经报道心脏中的脂肪酸吸收蛋白和主要的遗传因 子与平均日收益相关。包括Leptin CCK和CCKAR的其它候选基因已经被 定位，可证实它们与食欲、脂肪和生长性状相关。
接下来与肉质性状相关的内容，已知PSE猪肉是由染色体6上的 RYR1引发的。已经证明了其与几种肉质性状相关联，上述性状涉及来源于 Pietrain背景的F2种群的PSE。对于与肉中糖元含量增加和pH降低相关 的RN基因，将注意力集中在Hampshires。现在RN基因已经定位在染色 体15上，位于侧面标记物(flanking markers)之间。Andersson及其同事 利用191 F2动物上的234个标记物对肉质性状进行了最完整的QTL扫描 之一，用于遗传作图。已经发现肉质性状(pH、水容积和色素沉着)的几个 QTL位于染色体2和12上。Rothschild及其同事报道肉的颜色和坚实性评 分与染色体4和7上的区域相关。已经报道了染色体7上与肉质性状的其 它关联，染色体3与肌纤维的数量相关。已经显示肌肉中的一种脂肪生成 酶-Malic酶的活性与染色体7上的SLA复合物相关。此外，还发现了与公 猪性状相关的雄甾酮水平的主要QTL位于SLA复合物的区域。
在所研究的肌肉品质的候选基因中，HABP基因与肌肉内脂肪相关。发 现许多基因与骨骼肌肌细胞生成素(myogenin)相关。
接下来，对于繁殖性状来说，为获得相关信息，需要大量种族资源以及 大量的时间，因此难于进行该项研究，导致这些性状的QTL扫描结果受到 限制。Wilkie等人报道了子宫长度和排卵速率的QTL，它们在不同的染色 体位置上。Rathie等人报道了染色体8上与排卵速率相关的QTL，但是该 报道与Wilkie及其同事观察的与排卵相关的QTL有一些不同。在Milan等 人的French QTL实验中，发现增加猪仔大小的QTL位于Rathje所述的染 色体8的同一位置上。有趣地，染色体8上与高排卵速率相关的QTL与绵 羊中的Booroola基因定位在同一区域。令人感兴趣地，Short等人还发现 该基因座对商用种系中产仔大小也有显著的作用。繁殖性QTL的有限的染 色体QTL分析已经在染色体4，6，7，13和15中进行。已经明确证实雌激 素基因与产仔大小显著相关。尽管根据品种的不同，基因的效果也有所不 同，但在Meishan synthetics中，增加为1.15头猪/产仔，在Large White 种系中增加为0.42头猪/产仔。更加近期的结果显示泌乳刺激素受体基因座 与产仔大小显著相关。
最后，对于疾病抗性和免疫反应性状来说，迄今为止，对于疾病抗性或 免疫反应QTL的QTL扫描还是很有限。已经鉴别了一些与免疫相关的 QTL。氢化可的松水平的QTL也已经被定位在染色体7的末端位置，氢化 可的松与紧张相关，而且可能与免疫反应相关。还鉴别了猪染色体6上的 两个α基因：FUT1和FUT2。Vgeli及其同事公开了一种具有多态性的标 记物，在Large White，Landrace，Hampshire，Duroc以及Pietrain猪中该 标记物与ECF18R紧密相连，而且在这些种群中，它可作为E.coli F18黏 附抗性动物的辅助性选择的很好的标记物。近来有报道说，染色体7上的 SLA复合物与Trichinella sporalis感染抗性相关，但与弓形体病抗性不相 关。已知与小鼠中Salmonella免疫性试验的抗性相关的NRAMP1基因最 近在猪染色体15上得到定位。已经在猪体内鉴别到的与人类疾病相关的基 因包括凝血因子IX和高胆甾醇血基因。
结合前述，本发明人试图在猪体内发现具有经济特性的可用于基因改良 的候选基因，即，将猪改良使之具有良好的生长性能、肉质、疾病抗性以及 繁殖特性。
到目前为止，为检测猪体内的基因差别，已经使用了Northern印迹 法、差异显示法(differential display)、基因表达的序列分析法以及点印迹法 等多种mRNA水平的基因表达分析技术。然而，上述方法具有不适于同时 分析大量表达产物的缺点。近来，已经发展出的一种新的cDNA微阵列技 术，该技术可克服上述缺点。cDNA微阵列技术已经成为在多种活体内研究 基因表达的强大手段之一。该技术被用于同时表达多个基因并大范围发现基 因，以及用于基因DNA克隆的多态性筛选和图谱的制定。它是一种高度先 进的RNA表达分析技术，用来定量分析由已知或未知基因转录的RNA。这 种微阵列需要一种DNA芯片。根据待检测的核苷酸可将该基因芯片分成 cDNA(200-500bp)芯片和寡核苷酸(15-100bp)芯片。此外，根据制备方 法可将其分为机器打印芯片(robot printing chips)，例如针式微阵列，或者 利用半导体生产程序的喷墨以及照相平板芯片。通过将ORF(开放阅读框架) 的全长序列或者EST(表达序列标签)与载玻片(slide)连接，从而可利用 cDNA芯片特别地区分出具有互补序列的基因。

因此，本发明的目的之一就是提供一种cDNA芯片，该芯片包含固定 在其上的探针，该探针用来检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的标志 基因，从而可被用于猪的改良以及猪基因的筛选和功能分析，其中该探针能 够与该标志基因互补性结合。
本发明的另一目的是提供标志基因的表达谱，该标志基因与猪的经济的 性状相关。
本发明的再一目的是将本发明的cDNA芯片用于根据猪的品种和组织 来对基因表达进行比较，并可用于基因突变的筛选、基因多态性分析、以及 将本发明的cDNA芯片用于开发疾病诊断和疾病治疗的新药。
根据本发明，上述目的可通过制备一探针DNA来完成，该探针DNA 的制备包括：从猪的肌肉和脂肪组织中抽提出RNA，然后利用该抽提出的 RNA制备cDNA；克隆4434 ESTs并在数据库中分析和筛选核苷酸序列； 利用PCR扩增ESTs；接下来分离并纯化，然后利用DNA芯片阵列在载玻 片上用300个酵母控制的基因固定(点印)所得产物，从而制备DNA芯片； 通过荧光物质与从猪的肌肉和脂肪组织中分离的总RNA相结合来制备靶 DNA，将该靶DNA与所制备的探针DNA相杂交，然后扫描并分析图象文 件，检测在肌肉和脂肪组织中特异性表达的基因谱。
本发明包含下述步骤：从猪的肌肉和脂肪组织中制备ESTs，并鉴别其 序列信息；利用PCR扩增ESTs，并分离和纯化；使用DNA芯片阵列在 载玻片上固定ESTs；将荧光标记的靶DNA(ESTs)与探针DNA相杂交，其 中所述的靶DNA是利用从猪的肌肉和脂肪组织中分离的总RNA来得到 的；然后扫描并分析图象文件；接下来检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性 表达的基因表达谱。
用于猪基因的筛选和功能分析的cDNA芯片通过下述步骤制备：从猪 的肌肉和脂肪组织中分离总RNA，以此制备cDNA；克隆其4434 ESTs， 并分析、筛选数据库中所得的序列；利用PCR扩增ESTs，并分离和纯 化；使用DNA芯片阵列在载玻片上点印4434 ESTs，从而制备该DNA芯 片。
本发明的用于猪基因的筛选和功能分析的cDNA芯片包含探针和基 底，该探针能够与标志基因的cDNA或RNA互补结合，该探针固定在基底 上。
根据本发明，用于猪的筛选和功能分析的cDNA芯片的DNA微阵列上 所固定的DNA探针包含4434 ESTs，该4434 ESTs是从猪的肌肉和脂肪 组织中分离的。
基底优选是高分子膜，例如硅树脂晶片、玻璃、聚碳酸酯、薄膜、聚苯 乙烯或聚亚胺酯。本发明的DNA微阵列可通过常规的制备DNA微阵列的 方法将探针固定到基底上进行制备，所述的常规方法包括照相平板、压电影 印、微吸量、以及点印等。在本发明中，利用点印的方法。
根据本发明，利用探针DNA所能检测到的标志基因包括与细胞结构和 运动性相关的下列基因成分：1-α动力蛋白重链、19kDa-关联蛋白3-类似 物(19kDa-interacting protein 3-like)、肌动蛋白、肌动蛋白α-1、肌动蛋白 γ-2、膜联蛋白A2、膜联蛋白V、膜联蛋白II、β-肌球蛋白重链mRNA、 钙蛋白酶大分子多肽L2(calpain large polypeptide L2)、胶原蛋白、胶原蛋 白α-1、胶原蛋白α-2、胶原蛋白α-V、果蝇虫盘大分子同源物5(Discs， large(Drosophila)homolog 5)、纤维连接蛋白、肝素硫酸蛋白多糖2、核 纤层蛋白A/C(lamin A/C)、肌球蛋白、肌球蛋白重链、肌管素相关蛋白4、 原骨胶原-脯氨酸、酸性分泌蛋白、原肌球蛋白、原肌球蛋白α链、肌钙蛋 白C、微管蛋白β链和波形纤维蛋白(vimentin)，其中所述的探针DNA固 定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与代谢相关的下 列基因成分：醛缩酶A、碳酸脱水酶、细胞色素C、细胞色素C氧化酶业 单元I、细胞色素C氧化酶、果糖-1、6-二磷酸酯酶、L-乳酸脱氢酶M 链、LIM结构域1蛋白、NADH脱氢酶、NADH-泛醌氧化还原酶链1、 NADH4L、辛基转移酶(COT)、磷酸精氨酸磷酸酯酶(phosphoarginine phosphatase)、葡萄糖磷酸变位酶异构体2mRNA、蛋白-酪氨酸激酶、内 酮酸激酶、sarcolipin、酪氨酸磷酸酶IVA型、UDP葡萄糖焦磷酸化酶、糖 原磷酸化酶b和超氧化物岐化酶，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进 行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与蛋白和基因表 达相关的下列基因成分：延伸因子1-α、延伸因子1-α1、烯醇酶3、DNA 重复序列元件RPE-1、网状组织蛋白、核蛋白多肽B、核糖体蛋白、核糖 体蛋白L18a、核糖体蛋白P0、转运RNA-Trp合成酶、翻译起始因子 eif1、LIM结构域1蛋白和金属蛋白酶3组织抑制剂，其中所述的探针DNA 固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与细胞信号和通 讯相关的下列基因成分：全部的线粒体DNA、线粒体、钾通道以及类似肌 酸激酶，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的 cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与细胞分裂相关 的蛋白酶和半胱氨酸1(cystein 1)，其中所述的探针DNA固定在对猪基因 进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与免疫反应相关 的下列基因成分：白细胞介素-2受体α链、Kel-样蛋白23和MHC I型SLA 基因组区域，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的 cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与生长相关的下 列基因成分：如SEQ ID NOs：1至5所列的生长因子I，II，III，IV和V的核 苷酸序列，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的 cDNA芯片中的DNA微阵列上。
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒用来对猪基因进行筛选和功能分 析，其包含：cDNA芯片、结合Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA，该 cDNA是由待筛选组织的RNA制备的、以及荧光扫描系统和计算机分析系 统。
利用本发明的对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片检测特定基 因表达谱的方法，能够通过分析在某一类细胞内表达的标志基因来评价猪肉 的质量。该方法还可利用检测出的猪生长特异性基因对猪的生长性能进行改 良，从而用于猪品种的开发，还可通过鉴别与常规代谢和细胞疾病抗性的免 疫反应相关的基因谱来进行猪的疾病诊断和药物开发。

现在将通过下述实施例对本发明进行详细解释。但是，下述解释并非为 了对本发明作出限制。
实施例1：猪基因的筛选和用于功能分析的cDNA芯片的构建
为了制备用于对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片，采用下述 方法制备探针DNA：利用从Kagoshima Berkshire的肌肉和脂肪组织中分 离的总RNA进行PCR得到4434 ESTs，然后对ESTs进行克隆，分析和 筛选它们在数据库中的序列，利用PCR扩增ESTs，然后分离、纯化，接 下来利用DNA芯片阵列将所得的产物固定在载玻片上，从而得到对猪基因 进行筛选和功能分析的cDNA芯片。
制备实施例1：探针DNA的制备和排列
首先，制备探针DNA，并将其连接到载玻片上，该探针DNA是通过 PCR扩增的cDNA。利用RNA提取试剂盒(Qiagen，德国)按照说明书从 Kagoshima Berkshire(体重30kg和90kg)的背最长肌的肌肉和脂肪组织中 提取总RNA，并用oligo(dT)柱提取mRNA。提取出的mRNA样品利用 SP6、T3正向引物、T7反向引物(Amersham Pharmacia Biotech，England) 进行RT-PCR，从而合成cDNA。每一PCR反应物的总体积是100μl。分 别将100pM的正向引物和反向引物转移至96孔PCR板(Genetics， England)中。每孔包含2.5mM dNTP、10×PCR缓冲液、25mM MgCl2、 0.2μg DNA模板、2.5单位Taq聚合酶。在GeneAmp PCR system 5700(AB Applied BioSystem，Canada)中进行PCR，PCR条件为：94℃ 下30秒，58℃下45秒，72℃下1分钟，共30个循环。
扩增的DNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴别。在96孔板中用乙 醇沉淀PCR产物，然后干燥，储存于-20℃。
对按上述方法制备的总4434 cDNAs(ESTs)进行克隆，分析猪所具有 的基因的核苷酸序列，从NCBI的数据库鉴定它们的基因信息。分离具有信 息的基因并利用PCR进行纯化。构建总4434 cDNAs(ESTs)的基因座和图 谱。将总4434 cDNAs(ESTs)和300个酵母控制基因排列在1.7cm2的面 积上。然后，显微镜(Corning制造)下将探针DNA点印到载玻片上，采取 Microgrid II(Biorobotics)用CMT-GAPSTM氨基硅烷进行包被。利用一开 口针(split pin)将探针DNA打印到Microgrid II上。该针样装置靠近板孔， 将溶液注射进载玻片(1至2nL)。探针DNA打印完成后，干燥载玻片，利 用Stratalinker TM(Stratagene，USA)使点印的DNA和载玻片在90mJ进 行UV交联，在室温下用0.2％SDS洗涤2次，共2分钟，然后在室温下 用三蒸水洗涤1次，共1分钟。洗涤完毕后，将载玻片浸入95℃的水槽2 分钟，通过加入封闭溶液(1.0g的NaBH4溶解于300mL磷酸盐缓冲液 (pH7.4)和100mL无水乙醇的混合物)封闭15分钟。然后，将载玻片在室 温下用0.2％SDS洗涤3次，共1分钟，再在室温下用三蒸水洗涤1次，共 2分钟，在空气中晾干。
利用从猪的肌肉和脂肪组织制备的探针DNA能够检测的标志基因如下 所述：
1)细胞结构和运动性相关的基因
1-α动力蛋白重链、19kDa-关联蛋白3-类似物(19kDa-interacting protein 3-like)、肌动蛋白、肌动蛋白α-1、肌动蛋白γ-2、膜联蛋白A2、 膜联蛋白V、膜联蛋白II、β-肌球蛋白重链mRNA、钙蛋白酶大分子多肽 L2(calpain large polypeptide L2)、胶原蛋白、胶原蛋白α-1、胶原蛋白α- 2、胶原蛋白α-V、果蝇虫盘大分子同源物5、纤维连接蛋白、肝素硫酸蛋 白多糖2、核纤层蛋白A/C、肌球蛋白、肌球蛋白重链、肌管素相关蛋白 4、原骨胶原-脯氨酸、酸性分泌蛋白、原肌球蛋白、原肌球蛋白α链、肌钙 蛋白C、微管蛋白β链和波形纤维蛋白(vimentin)。
2)代谢相关的基因
醛缩酶A、碳酸脱水酶、细胞色素C、细胞色素C氧化酶亚单元I、 细胞色素C氧化酶、果糖-1、6-二磷酸酯酶、L-乳酸脱氢酶M链、LIM结 构域1蛋白、NADH脱氢酶、NADH-泛醌氧化还原酶链1、NADH4L、辛 基转移酶(COT)、磷酸精氨酸磷酸酯酶(phosphoarginine phosphatase)、葡 萄糖磷酸变位酶异构体2mRNA、蛋白-酪氨酸激酶、丙酮酸激酶、 sarcolipin、酪氨酸磷酸酶IVA型、UDP葡萄糖焦磷酸化酶、糖原磷酸化酶 b和超氧化物岐化酶。
3)基因和蛋白表达相关的基因
延伸因子1-α、延伸因子1-α1、烯醇酶3、DNA重复序列元件RPE- 1、网状组织蛋白、核蛋白多肽B、核糖体蛋白、核糖体蛋白L18a、核糖体 蛋白P0、转运RNA-Trp合成酶、翻译起始因子eif1、LIM结构域1蛋白和 金属蛋白酶3组织抑制剂。
4)细胞信号和通讯相关的基因
全部的线粒体DNA、线粒体、钾通道以及类似肌酸激酶。
5)细胞分裂相关基因
蛋白酶和半胱氨酸1(cystein1)。
6)免疫反应相关基因
白细胞介素-2受体α链、Kel-样蛋白23和MHC I型SLA基因组区域 (MHC class I SLA genomic region)。
7)生长相关基因
生长因子I，II，III，IV和V的核苷酸序列，如SEQ ID NOs：1至5所列
8)其它
cDNA flj13323 fis、KIAA0182蛋白、KIAA1096蛋白、AC015998、 AR078G0liTHYEG01S、Cn26h08.x1、COI、DJ466P17.1.1(Laforin)、 foocen-m、HWM012cA.1、假设的蛋白质、mandarina文库、MARC 1PI、MARC 2PIG、MR1-AN0039-290800-004-a01、NIH_MGC_4、 NIH_MGC_65、NIH_MGC_77、NIH_MGC_77、外周血细胞cDNA文库、 假定的蛋白(putative)、衣藻(reinhardtii)CC-1690、小肠cDNA文库、胸腺 素β-4mRNA、未知(unknown)、未命名的(unnamed)蛋白产物、染色体14 DNA序列、整合素β-1亚单位、衣藻(reinhardtii)CC-1690。
实验性实施例1：利用本发明的cDNA芯片筛选组织特异性基因的表达 谱
利用实施例1中制备的cDNA芯片对在猪的肌肉和脂肪组织中特异性 表达的基因表达谱进行检测。从体重30kg和90kg的Kagoshima Berkshires的背最长肌区域取肌肉组织。从体重30kg的Kagoshima Berkshires中取脂肪组织。将肌肉和脂肪组织切成5～8mm长，冷冻在液氮 中，保存于-70℃。
按照TrizolTM试剂盒(Life Technologies，Inc.)的说明书的方法从0.2至 1.0g实验组和对照组中分离总RNA，以此来制备靶DNA。每50至100mg 组织中加入1mL TrizoTM，然后用glass-Teflon或Polytron的匀浆器研磨。 将研磨后的颗粒在12,000g、4℃下离心10分钟，将1mL上清液等分。在 所分的每一份中加入200μl氯仿，震荡15秒，置冰上15分钟，在 12,000g、4℃下离心10分钟，然后再向其中加入同量的氯仿，震荡15 秒，置冰上15分钟，在12,000g、4℃下离心10分钟。将上清液转移至一 新管中。向管中加入500μl异丙醇，震荡并置冰上15分钟。在12,000g、 4℃下离心5分钟。移出上清液，与1mL 75％冰冷的乙醇混合，在 12,000g、4℃下离心5分钟。移出上清液，在净化台上冷冻干燥30分钟， 将其加到20μl不含RNase的水或DEPC水中以溶解RNA。将总RNA的 浓度调整至40μg/17μl，以备电泳。
利用标准的第一链cDNA合成的方法制备靶DNA。简言之，根据 Schuler(1996)所述的方法，取40μg的总RNA，与oligo dT-18mer引物 (Invitrogen Life Technologies)混合，在65℃加热10分钟，然后在4℃冷却 5分钟。然后，向其中加入1μl的下述混合物：25mM dATP、dGTP和 dTTP、1μl的1mM dCTP(Promega)、2μl的1mM氰蓝3-dCTP或2 μl的1mM氰蓝5-dCTP、20单位的RNase抑制剂(Invitrogen Life Technology)、100单位的M-MLV Rtase、2μl的10×第一链缓冲液，并 用吸液管混匀。将反应混合物在38℃温育2小时，利用乙醇沉淀法除去未 结合的核苷酸。此处使用DEPC处理水。
将上述制备的载玻片用杂交溶液(5×SSC，0.2％SDS，1mg/mL鲱鱼精 DNA)在65℃预杂交1小时。将靶DNA用氰蓝3(Cy-3)和氰蓝5(Cy-5)标 记，重悬于20μl的杂交溶液中，在95℃变性2分钟。然后，将载玻片用 该溶液在65℃杂交过夜。杂交在盖有防护玻璃罩(Grace Bio-Lab)的潮湿箱 中进行。
杂交后，在室温下用2×SSC、0.1％SDS洗涤载玻片4次，共5分 钟，同时用震荡器剧烈搅拌。然后在室温下用0.2×SSC洗涤载玻片1次、 共5分钟，用0.1×SSC洗涤载玻片1次，5分钟。
将载玻片在ScanArray 5000(GSI Lumonics Version 3.1)上用50μm 象素尺寸进行扫描。用氰蓝3-dCTP标记的靶DNA在565nm处扫描到， 用氰蓝5-dCTP标记的靶DNA在670nm处扫描到。通过氰蓝3-dCTP-和 氰蓝5-dCTP-标记点的线性扫描制作两种荧光强度的标准曲线。将载玻片 在Scanarray 4000XL上用10μm象素尺寸再次进行扫描。在Quantarray 软件2.1版本上对所得的TIFF图像文件进行分析，自动去除背景。将每一 点的强度在Quantarray上转化为Microsoft Excel数据。
将在猪的肌肉和脂肪组织中早期表达的ESM(早期肌肉)基因的全部表 达模式与在成熟期表达的ASM(成熟期肌肉)基因和在早期表达的ESF(早期 脂肪)基因的表达模式相比较。表1显示了“ESM-特异性”和“ASM-特异 性”基因，表2显示了“ESF-特异性”基因。与ESM相比，ASM中有20 个基因显示了增高5倍的表达水平。而且，与ESM相比，ESF中有18个 基因显示了增高5至10倍的表达水平，与ASM相比，ESM中有18个基 因显示了增高5至10倍的表达水平。
还发现在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的下述5个生长特异性基 因。
1.GF(生长因子)I基因：SEQ ID NO 1
gagaccagca aatactatgt gaccatcatt gatgccccag gacacagaga cttcatcaaa       60
aacatgatta caggcacatc ccaggctgac tgtgctgtcc tgattgttgc tgctggtgtt      120
ggtgaatttg aagctggtat ctccaagaac gggcagaccc gcgagcatgc tcttctggct      180
tacaccctgg gtgtgaaaca gctgattgtt ggtgtcaaca aaatggattc caccgagcca      240
ccatacagtc agaagagata cgaggaaatc gttaaggaag tcagcaccta cattaagaaa      300
attggctaca accctgacac agtagcattt gtgccaattt ctggttggaa tggtgacaac      360
atgctggagc caagtgctaa tatgccttgg ttcaagggat ggaaagtcac ccgcaaagat      420
ggcagtgcca gtggcaccac gctgctggaa gctttggatt gtatcctacc accaactcgt      480
ccaactgaca agcctctgcg actgcccctc caggatgtct ataaaattgg aggcattggc      540
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gctccagtca atgtaacaac tgaagtcaag tctgttgaaa tgcaccatga agctttgagt
2.GF(生长因子)II基因：SEQ ID NO 2
gctgactgat cgggagaatc agtctatctt aatcaccgga gaatccgggg caggaaagac       60
tgtgaacacg aagcgtgtca tccagtactt tgccacaatc gccgtcactg gggagaagaa      120
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caaccccctg ctcgaggcct ttggcaacgc caagaccgtg aggaacgaca actcctctcg      240
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cgaaacatat cttctagaga agtctagagt cactttccag ctaaaggcag aaagaagcta      360
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tgatgaccaa gaggagctga tggccacaga tagtgccatt gaaatcctgg
3.GF(生长因子)III基因：SEQ ID NO 3
gttgttcctt taaatatgat gttgccacaa gctgcattgg agactcattg cagtaatatt       60
tccaatgtgc cacctacaag agagatactt caagtctttc ttactgatgt acacatgaag      120
gaagtaattc agcagttcat tgatgtcctg agtgtagcag tcaagaaacg tgtcttgtgt      180
ttacctaggg atgaaaacct gacagcaaat gaagttttga aaacgtgtga taggaaagca      240
aatgttgcaa tcctgttttc tgggggcatt gattccatgg ttattgcaac ccttgctgac      300
cgtcatattc ctttagatga accaattgat cttcttaatg tagctttcat agctgaagaa      360
aagaccatgc caactacctt taacagagaa gggaataaac agaaaaataa atgtgaaata      420
ccttcagaag aattctctaa agatgttgct gctgctgctg ctgacagtcc taataaacat      480
tcagtgtacc agatcgaatc acaggaaggg cgggactaaa ggaactacaa gctgttagc
4.GF(生长因子)IV基因：SEQ ID NO 4
catttatgag ggctacgcgc tgccgcacgc catcatgcgc ctggacctgg cgggccgcga       60
tctcaccgac tacctgatga agatcctcac tgagcgtggc tactccttct gaccacagct      120
gagcgcgaga tcgtgcgcga catcaaggag aagctgtgct acgtggccct ggacttcgag      180
aacgagatgg cgacggccgc ctcctcctcc tccctggaaa agagctacga gctgccagac      240
gggcaggtca tcaccatcgg caacgagcgc ttccgctgcc cggagacgct cttccagccc      300
tccttcatcg gtatggagtc ggcgggcatt cacgagacca cctacaacag catcatgaag      360
tgtgacatcg acatcaggaa ggacctgtat gccaacaacg tcatgtcggg gggcaccac
5.GF(生长因子)V基因：SEQ ID NO 5
tatatagaac cgaatcacgt acactgggcc tgaccaagca gggccaaaac aaggcaacct       60
aggaggttat aaaataggta tacgcgcgct gacacataca tactcactac ccgaacgcgg      120
ggacaactag ggctccgcca taagccatcc tttcctggtc gtcgatgttg cgggctgcag      180
ttatagggct gccaaccgcc atacacacct taccagccac ttattaagtt acatccacga      240
gggctctgta ccacccctaa gcagtggcag tggtagccgc tgcccgctta ccctgcgcag      300
tgttggtgct agctccgtcc taagcttccc cgatagccgc cgctttttac acaccatcgg      360
cggactagac accgttggtt gcagcgtaag cgtctatggt agcagctgcg gcgaccgccg      420
tgtagccagc ttactacatg ttagtttcag caaccaccct gccaataccc gtgttcccta      480
ctccaactct gtcggtttca gccgcag
【表1】
在ESM和ASM中分别表达的基因的表达比率   ESTs   序号   登录号   描述**       基因表达比率      ESM(30)/ASM(90)   细胞结构和运动性   SM2149                CAB56598                       1-α动力蛋白重链                         -2.1   SM781                 NP_033891                      19kDa-关联蛋白3-类似物                   +2.1   SM635                 BAB19361                       肌动蛋白                                 +3.4   SM713                 AAA51586                       肌动蛋白                                 +6.3   SM106                 P53506                         肌动蛋白                                 +8.8   SM1068                AAF20165                       肌动蛋白                                 +5.3   SM363                 B25819                         肌动蛋白                                 +4.3   SM768                 X52815                         肌动蛋白                                 +3.4   SMk77                 NM_001100                      肌动蛋白，α-1                           +15.1   SM128                 NP_033740                      肌动蛋白，γ-2                           +6.9   SM902                 BC001748                       膜联蛋白A2                               -3.2   SM846                 P81287                         膜联蛋白V                                -2.8   SM653                 P04272                         膜联蛋白II                               -2.2   SMk340                U75316                         β-肌球蛋白重链mRNA                      +3.0   SM1605                AAF99682                       钙蛋白酶大分子多肽L2                     +4.7   SM541                 NP_000079                      胶原蛋白                                 -3.2   SM715                 L47641                         胶原蛋白                                 -6.8   SM430                 Q9XSJ7                         胶原蛋白α-1                             -6.8   SM758                 CGHU1S                         胶原蛋白α-1                             -2.1   SM62                  CGHU2V                         胶原蛋白α-2                             -3.2   SM949                 O46392                         胶原蛋白α-2                             -3.3   SM410                 CAA28454                       胶原蛋白(α-V)                           -2.3   SM1651                XM_039583                      果蝇虫盘大分子同源物5                    -2.0   SM1050                AAA30521                       纤维连接蛋白                             -2.4   SM491                 NM_005529                      肝素硫酸蛋白多糖2                        -2.2   SM1573                XM_044160                      核纤层蛋白A/C                            +2.6     SMk55    NP_006462    肌球蛋白                     +3.9     SMk338   P79293       肌球蛋白重链                 +2.0     SMk168   AB025261     肌球蛋白重链                 +9.0     SM1732   NP_004678    肌管素相关蛋白4              +3.8     SM1691   NP_000908    原骨胶原-脯氨酸              -2.3     SM690    NP_003109    分泌蛋白，酸性               -4.4     SMk173   X66274       原肌球蛋白                   +2.6     SM141    CAA38179     原肌球蛋白                   +2.7     SMk51    P18342       原肌球蛋白α链               +9.6     SM1043   P06469       原肌球蛋白α链               +11.5     SMk19    P02587       肌钙蛋白C                    +14.5     SMk50    Y00760       肌钙蛋白C                    +19.6     SMk57    AAA91854     肌钙蛋白C                    +14.6     SM1535   P02554       微管蛋白β链                 +2.8     SM1063   P20152       波形纤维蛋白                 -5.4     代谢     SMk56    AAA37210     醛缩酶A                      +5.5     SM995    CAA59331     碳酸脱水酶                   +3.2     SMk344   NM_012839    细胞色素C                    +3.4     SM800    AAG53955     细胞色素C氧化酶亚单元I       +3.0     SM51     T10974       细胞色素C氧化酶              +3.8     SMk151   CAA06313     果糖-1、6-二磷酸酯酶         +7.1     SM2070   P00339        L-乳酸脱氢酶M链             +12.7     SMk120   AJ275968      LIM结构域1蛋白              +8.6     SMk147   X59418        NADH脱氢酶                  +2.4     SM928    O79874        NADH-泛醌氧化还原酶链1      +5.3     SMk18    AAG28185      NADH4L                      +2.1     SMk81    O19094        辛基转移酶(COT)             +3.2     SM295    AB006852      磷酸精氨酸磷酸酯酶          +2.6     SMk346   M97664        葡萄糖磷酸变位酶异构体2mRNA +5.5     SM36    TVMVRR      蛋白-酪氨酸激酶            +4.3     SM887   P11980      丙酮酸激酶                 +8.5     SM698   S64635      丙酮酸激酶                 +9.7     SM723   P52480      丙酮酸激酶                 +7.3     SMk79   U44751      丙酮酸激酶                 +5.2     SMk135  Z98820      Sarcolipin                 +3.0     SM1033  XM_018138   酪氨酸磷酸酶IVA型          +2.9     SMk347  X99312      UDP葡萄糖焦磷酸化酶        +3.0     基因/蛋白表达     SM75    U09823      延伸因子1-α               -4.3     SM1989  AAH05660    延伸因子1-α1              -3.9     SMk61   NP_031959   烯醇酶3                    +3.6     SM968   Y00104      DNA重复序列元件RPE-1       -2.5     SMk91   AAC48501    网状组织蛋白               +4.6     SM2083  NP_003083   核蛋白多肽B                +3.1     SM896   AAH01127    核糖体蛋白                 +2.0     SM1668  AAH07512    核糖体蛋白L18a             +2.1     SM1784  228176      核糖体蛋白P0               +6.2     SM1801  AAA30799    转运RNA-Trp合成酶          +6.0     SM997   51077272    翻译起始因子eif1           +3.5     细胞信号/通讯     SM464   AJ002189    全部的线粒体DNA            +3.9     SM732   AF304203    线粒体                     +5.9     SMk11   XM_006515   钾通道                     -2.4     SMk187  BC007462    类似肌酸激酶               +3.5     细胞分裂     SM1067  XP_007399   蛋白酶，半胱氨酸，1        +3.1     免疫反应     SM154   AF036005    白细胞介素-2受体α链       -2.5     SMk1    AAAG52886   Kel-样蛋白23               +6.4     SM401    AJ251829    MHCI型SLA基因组区域           -3.0     EST     SM824    AK023385    cDNAFLJ13323 fis              +2.5     SM1776   XM_050494   KIAA0182蛋白                  +3.6     SM1556   XP_043678   KIAA1096蛋白                  +4.9     未知的     SM1785   AC015998    AC015998                      +2.1     SM2152   BI327422    AR078G01iTHYEG01S             -4.0     SM1469   BG938561    Cn26h08.x1                    -2.2     SM908    AAG28205    COI                           +2.8     SM851    AAG28192    COI                           +3.6     SM1738   CAA19420    DJ466P17.1.1(Laforin)         +4.8     SM1007   AAD31021    Foocen-m                      +3.8     SM1920   BE421626    HWM012cA.1                    +3.3     SM1972   XP_039195   假设的蛋白质                  +3.2     SM1536   T08758      假设的蛋白质                  +4.7     SMk137   XP_002275   假设的蛋白质                  +20.0     SM1724   XP_016035   假设的蛋白质                  -2.6     SM1539   AT001097    Mandarina文库                 -2.3     SM1474   BG384994    MARC 1PI                      +2.6     SM1853   BF198401    MARC 2PIG                     +3.6     SM1941   BE925069    MR1-AN0039-290800-004-a01     +4.4     SM379    AW328623    NIH_MGC_4                     +2.3     SM1911   BE872239    NIH_MGC_65                    -2.4     SM1676   BG548727    NIH_MGC_77                    +5.1     SM1914   BG534187    NIH_MGC_77                    -2.3     SM1650   BI337009    外周血细胞cDNA文库            +9.3     SM1064   BAB28119    假定的                        +3.4     SM618    BAB28422    假定的                        +2.1     SM1774   BAB30715    假定的                        +3.2     SM1690    BF864360    衣藻(Reinhardtii)CC-1690      +2.2     SM1898    F23148      小肠cDNA文库                  -2.3     SM96      M17733      胸腺素β-4mRNA                -4.2     SM1922    AAH03026    未知                          +4.0     SM210     BAA91923    未命名的蛋白产物              -3.1     没有匹配     SM107                 没有匹配                      -2.4     SM278                 没有匹配                      -2.2     SM384                 没有匹配                      -2.3     SMk37                 没有匹配                      +7.7     SM717                 没有匹配                      -3.0     SM1598                没有匹配                      +4.5     SMk6                  没有匹配                      +3.8     SMk68                 没有匹配                      +5.0     SM1100                没有匹配                      -2.6     SMk70                 没有匹配                      +3.9     SMk80                 没有匹配                      +17.7     SMk112                没有匹配                      +3.5     SM1639                没有匹配                      -4.0     SMk148                没有匹配                      +3.8     SM1665                没有匹配                      +3.8     SM1665                没有匹配                      +13.0     SMk95                 没有匹配                      +2.7     SMk133                没有匹配                      +2.4     SMk152                没有匹配                      +6.4     SM1897                没有匹配                      +3.4     SMk138                没有匹配                      +10.3     SM1902                没有匹配                      +2.1     SMk342                没有匹配                      +6.7     SMk181                没有匹配                      +11.0     SM904     没有匹配    -3.4     SMk262    没有匹配    +3.9     SM9       没有匹配    +2.4     SM1964    没有匹配    +2.6     SMk335    没有匹配    -3.9
：一致的登录号
**：与数据库一致的信息 
没有匹配：与数据库没有一致的信息；新的EST
ESM：早期肌肉(体重30kg)，ASM：成熟期肌肉(体重90kg)，SM：猪的肌肉
【表2】
在ESM和ESF中分别表达的基因的表达比率     ESTs     序号  登录号     描述**      基因表达比率     ESF(30)/ESM(30)   细胞结构和运动性   SM2149                 CAB56598                         1-α动力蛋白重链                          -2.1   SM781                  NP_033891                        19kDa-关联蛋白3-类似物                    +2.2   SM1068                 AAF20165                         肌动蛋白                                  +4.5   SM635                  BAB19361                         肌动蛋白                                  +2.6   SM106                  P53506                           肌动蛋白                                  +4.9   SM768                  X52815                           肌动蛋白                                  +2.4   SM363                  B25819                           肌动蛋白                                  +3.7   SM713                  AAA51586                         肌动蛋白                                  +5.6   SMk77                  NM_001100                        肌动蛋白，α-1                            +4.5   SM128                  NP_033740                        肌动蛋白，γ-2                            +3.9   SM1091                 JC5971                           α-b晶状体球蛋白                          +2.1   SM902                  BC001748                         膜联蛋白A2                                -4.2   SM846                  P81287                           膜联蛋白V                                 -3.5   SM653                  P04272                           膜联蛋白II                                -2.3   SMk340                 U75316                           β-肌球蛋白重链mRNA                       +2.2   SM1807   AAF99682    钙蛋白酶大分子多肽L2           +2.7   SM541    NP_000079   胶原蛋白                       -4.9   SM715    L47641      胶原蛋白                       -5.2   SM1023   Q9XSJ7      胶原蛋白α-1                   -4.6   SM758    CGHU1S      胶原蛋白α-1                   -4.3   SM62     CGHU2V      胶原蛋白α-2                   -4.4   SM949    O46392      胶原蛋白α-2                   -3.2   SM410    CAA28454    胶原蛋白(α-V)                 -2.3   SM1121   NM_000393   胶原蛋白，V型，α-2            -2.8   SM53     NP_000384   胶原蛋白，V型，α-2            -2.5   SM1651   XM_039583   果蝇虫盘大分子同源物5          -8.6   SM1050   AAA30521    纤维连接蛋白                   -3.1   SM381    FNHU        纤维连接蛋白前体               -2.6   SM122    P07589      纤维连接蛋白(FN)               -2.5   SM1573   XM_044160   核纤层蛋白A/C                  +2.1   SMk55    NP_006462   肌球蛋白                       +3.6   SMk168   AB025261    肌球蛋白重链                   +5.0   SM1732   NP_004678   肌管素相关蛋白4                +4.7   SM690    NP_003109   分泌蛋白，酸性                 -5.2   SM1043   P06469      原肌球蛋白α链                 +8.6   SMk173   X66274      原肌球蛋白                     +2.2   SMk19    P02587      肌钙蛋白C                      +6.9   SMk57    AAA91854    肌钙蛋白-C                     +7.1   SMk50    Y00760      肌钙蛋白-C                     +9.0   SM1535   P02554      微管蛋白β链                   +3.3   SM1063   P20152      波形纤维蛋白                   -5.1   SM730    CAA69019    波形纤维蛋白                   -3.2   代谢   SMk344   NM_012839   细胞色素C                      +2.4   SM800    AAG53955    细胞色素C氧化酶亚单元I         +2.9   SMk151    CAA06313    果糖-1、6-二磷酸酯酶             +4.2   SMk254    231300      糖原磷酸化酶b                    +2.6   SM2070    P00339      L-乳酸脱氢酶M链                  +10.6   SM928     O79874      NADH-泛醌氧化还原酶链1           +3.2   SMk81     O19094      辛基转移酶(COT)                  +3.9   SM295     AB006852    磷酸精氨酸磷酸酯酶               +2.3   SMk346    M97664      葡萄糖磷酸变位酶异构体2mRNA      +3.3   SM36      TVMVRR      蛋白-酪氨酸激酶                  +2.6   SM723     P52480      丙酮酸激酶                       +7.5   SM698     S64635      丙酮酸激酶                       +6.6   SM887     P11980      丙酮酸激酶                       +6.3   SM1594    AAA62278    超氧化物岐化酶                   -3.2   SM1033    XM_018138   酪氨酸磷酸酶IVA型                +2.2   基因/蛋白表达   SM75      U09823      延伸因子1-α                     -3.7   SM1989    AAH05660    延伸因子1-α1                    -3.8   SMk120    AJ275968    LIM结构域1蛋白                   +9.9   SMk91     AAC48501    网状组织蛋白                     +2.1   SM2083    NP_003083   核蛋白多肽B                      +3.2   SM21      NP_000994   核糖体的                         +2.2   SM1784    228176      核糖体蛋白P0                     +5.5   SM1820    BC014277    金属蛋白酶3组织抑制剂            -2.6   SM1801    AAA30799    转运RNA-Trp合成酶                +5.7   SM997     51077272    翻译起始因子eif1                 +2.3   细胞信号/通讯   SM464     AJ002189    全部的线粒体DNA                  +2.7   免疫反应   SMk1      AAG52886    Kel-样蛋白23                     +4.6   EST   SM1776    XM_050494   KIAA0182                         +3.2   SM1556    XP_043678    KIAA1096蛋白                +4.5   未知的   SM2152    BI327422     AR078G01iTHYEG01S           -5.5   SMk3      AL13277      染色体14 DNA序列            +2.3   SM908     AAG28205     COI                         +2.2   SM1738    CAA19420     DJ466P17.1.1(Laforin)       +3.5   SM1007    AAD31021     Foocen-m                    +3.0   SM1724    XP_016035    假设的蛋白质                -2.6   SMk137    XP_002275    假设的蛋白质                +10.0   SM1972    XP_039195    假设的蛋白质                +2.8   SM787     AF1_92528    整合素β-1亚单位            +2.0   SM1474    BG384994     MARC 1PI                    +2.8   SM1676    BG548727     NIH_MGC_77                  +2.3   SM1650    BI337009     外周血细胞cDNA文库          +7.3   SM1774    BAB30715     假定的                      +5.1   SM1064    BAB28119     假定的                      +3.0   SM1690    BF864360     衣藻(Reinhardtii)CC-1690    +2.5   SM96      M17733       胸腺素β-4mRNA              -3.9   SM1922    AAH03026     未知                        +4.7   没有匹配   SMk58                  没有匹配                    +2.9   SM717                  没有匹配                    -4.4   SMk6                   没有匹配                    +2.4   SMk68                  没有匹配                    +3.2   SMk80                  没有匹配                    +4.3   SMk112                 没有匹配                    +2.1   SM1639                 没有匹配                    -2.8   SMk148                 没有匹配                    +2.9   SM1665                 没有匹配                    +9.8   SMk95                  没有匹配                    +2.1     SMk152    没有匹配    +6.4     SM1897    没有匹配    +2.6     SMk138    没有匹配    +3.1     SM796     没有匹配    -2.2     SMk342    没有匹配    +3.9     SMk181    没有匹配    +4.4     SM904     没有匹配    -2.7     SMk262    没有匹配    +2.7     SM9       没有匹配    +2.9     SM1964    没有匹配    +2.6     SMk335    没有匹配    +3.8
：一致的登录号
**：与数据库一致的信息
没有匹配：与数据库没有一致的信息；新的EST
ESM：早期肌肉(体重30kg)，ESF：早期脂肪(体重30kg)，SM：猪的肌肉
由上述结果可知，本发明人利用本发明的用于对猪基因进行筛选和功能 分析的cDNA证明了在猪的肌肉和脂肪组织特异性表达的基因的表达谱， 并且利用该特性可对肉的品质进行改良和评估。我们还鉴定了生长相关因子 的核苷酸序列，并将其用于猪种改良，获得良好的生长性能。此外，利用本 发明的cDNA芯片预计还可能根据猪的品种和组织来筛选和比较表达谱， 并可进行基因突变的筛选、遗传多态性的分析、以及用于疾病诊断和疾病治 疗的新药的开发。
实施例2：用于对猪基因进行筛选和功能分析的试剂盒构建
制备用于对猪基因进行筛选和功能分析的试剂盒，其包含：实施例1 中制备的cDNA芯片、结合了Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA，该 cDNA是由待筛选组织的RNA制备的、以及荧光扫描系统和计算机分析系 统。
工业实用性
如实施例所述，本发明涉及对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯 片，并提供了一种cDNA芯片，该芯片包含探针，所述探针用于检测在猪 的肌肉和脂肪组织中特异性表达的标志基因，该探针能够与标志基因互补结 合。此外，本发明还使用cDNA芯片提供了与猪的经济特性相关的标志基 因的表达谱。因此，本发明的cDNA芯片能用来根据猪的品种和组织来对 基因表达谱进行比较，并可用于基因突变的筛选、遗传多态性的分析、以及 用于疾病诊断和疾病治疗的新药开发和猪种改良，因此，本发明是一种对遗 传工程工业非常有用的发明。
                                PIF040402c-sequence list.txt
                    SEQUENCE LISTING
<110>庆尚南道
     金哲旭
<120>用于对猪体内特定基因进行筛选及功能分析的cDNA芯片
<130>PIF040402C
<150>KR 2003-83651
<151>2003-11-24
<160>5
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>660
<212>DNA
<213>Kagoshima Berkshire
<400>1
gagaccagca aatactatgt gaccatcatt gatgccccag gacacagaga cttcatcaaa      60
aacatgatta caggcacatc ccaggctgac tgtgctgtcc tgattgttgc tgctggtgtt     120
ggtgaatttg aagctggtat ctccaagaac gggcagaccc gcgagcatgc tcttctggct     180
tacaccctgg gtgtgaaaca gctgattgtt ggtgtcaaca aaatggattc caccgagcca     240
ccatacagtc agaagagata cgaggaaatc gttaaggaag tcagcaccta cattaagaaa     300
attggctaca accctgacac agtagcattt gtgccaattt ctggttggaa tggtgacaac     360
atgctggagc caagtgctaa tatgccttgg ttcaagggat ggaaagtcac ccgcaaagat     420
ggcagtgcca gtggcaccac gctgctggaa gctttggatt gtatcctacc accaactcgt     480
ccaactgaca agcctctgcg actgcccctc caggatgtct ataaaattgg aggcattggc     540
actgtccctg tgggccgagt ggagactggt gttctcaaac ctggcatggt ggttaccttt     600
gctccagtca atgtaacaac tgaagtcaag tctgttgaaa tgcaccatga agctttgagt     660
<210>2
<211>530
<212>DNA
<213>Kagoshima Berkshire
<400>2
gctgactgat cgggagaatc agtctatctt aatcaccgga gaatccgggg caggaaagac      60
tgtgaacacg aagcgtgtca tccagtactt tgccacaatc gccgtcactg gggagaagaa     120
gaaggaggaa cctactcctg gcaaaatgca ggggactctg gaagatcaga tcatcagtgc     180
caaccccctg ctcgaggcct ttggcaacgc caagaccgtg aggaacgaca actcctctcg     240
ctttggtaaa ttcatcagga tccacttcgg taccactggg aagctggctt ctgctgacat     300
cgaaacatat cttctagaga agtctagagt cactttccag ctaaaggcag aaagaagcta     360
ccacattttt tatcagatca tgtctaacaa gaagccagag ctcattgaaa tgctcctgat     420
caccaccaac ccatatgact acgccttcgt cagtcaaggg gagatcactg tccccagcat     480
tgatgaccaa gaggagctga tggccacaga tagtgccatt gaaatcctgg                530
<210>3
<211>589
<212>DNA
<213>Kagoshima Berkshire
                                       PIF040402c-sequence list.txt
<400>3
gttgttcctt taaatatgat gttgccacaa gctgcattgg agactcattg cagtaatatt      60
tccaatgtgc cacctacaag agagatactt caagtctttc ttactgatgt acacatgaag     120
gaagtaattc agcagttcat tgatgtcctg agtgtagcag tcaagaaacg tgtcttgtgt     180
ttacctaggg atgaaaacct gacagcaaat gaagttttga aaacgtgtga taggaaagca     240
aatgttgcaa tcctgttttc tgggggcatt gattccatgg ttattgcaac ccttgctgac     300
cgtcatattc ctttagatga accaattgat cttcttaatg tagctttcat agctgaagaa     360
aagaccatgc caactacctt taacagagaa gggaataaac agaaaaataa atgtgaaata     420
ccttcagaag aattctctaa agatgttgct gctgctgctg ctgacagtcc taataaacat     480
tcagtgtacc agatcgaatc acaggaaggg cgggactaaa ggaactacaa gctgttagct     540
gatgaccaag aggagctgat ggccacagat agtgccattg aaatcctgg                 589
<210>4
<211>469
<212>DNA
<213>Kagoshima Berkshire
<400>4
catttatgag ggctacgcgc tgccgcacgc catcatgcgc ctggacctgg cgggccgcga      60
tctcaccgac tacctgatga agatcctcac tgagcgtggc tactccttct gaccacagct     120
gagcgcgaga tcgtgcgcga catcaaggag aagctgtgct acgtggccct ggacttcgag     180
aacgagatgg cgacggccgc ctcctcctcc tccctggaaa agagctacga gctgccagac     240
gggcaggtca tcaccatcgg caacgagcgc ttccgctgcc cggagacgct cttccagccc     300
tccttcatcg gtatggagtc ggcgggcatt cacgagacca cctacaacag catcatgaag     360
tgtgacatcg acatcaggaa ggacctgtat gccaacaacg tcatgtcggg gggcaccact     420
gatgaccaag aggagctgat ggccacagat agtgccattg aaatcctgg                 469
<210>5
<211>507
<212>DNA
<213>Kagoshima Berkshire
<400>5
tatatagaac cgaatcacgt acactgggcc tgaccaagca gggccaaaac aaggcaacct      60
aggaggttat aaaataggta tacgcgcgct gacacataca tactcactac ccgaacgcgg     120
ggacaactag ggctccgcca taagccatcc tttcctggtc gtcgatgttg cgggctgcag     180
ttatagggct gccaaccgcc atacacacct taccagccac ttattaagtt acatccacga     240
gggctctgta ccacccctaa gcagtggcag tggtagccgc tgcccgctta ccctgcgcag     300
tgttggtgct agctccgtcc taagcttccc cgatagccgc cgctttttac acaccatcgg     360
cggactagac accgttggtt gcagcgtaag cgtctatggt agcagctgcg gcgaccgccg     420
tgtagccagc ttactacatg ttagtttcag caaccaccct gccaataccc gtgttcccta     480
ctccaactct gtcggtttca gccgcag                                         507