混合室

本发明涉及含有悬浮在液体中的颗粒的液体样品的分配方法。具体 地说，本发明是涉及一种用于混合和保持细胞、珠粒或其它颗粒在液体 中悬浮的混合室，同时也涉及在将细胞、珠粒或其它颗粒由机器人工作 站移吸的同时，对细胞、珠粒或其它颗粒进行混合和使其保持液体悬浮 的方法。

在生物化学和分子生物学领域，通常要用例如细胞和珠粒等微粒样 品在液体介质中进行试验。例如，在诸如辐射免疫测定、受体结合测定 和酶测定等自动高物料通过量筛选测定中所使用的是含闪烁物质的珠 粒。在许多公开这类技术的出版物中，受体或其它结合剂被固定到珠粒 的表面并用在定量分析、竞争性结合的测定或酶的活性测定中。同样， 细胞也可在悬浮液中培养，然后用例如公认的或候选的药物分子等活性 剂进行处理，用于体外药物代谢机理、毒物学和药物形态的研究。为了 进行自动筛选测定，必须采用某种设备将珠粒、细胞或其它微粒材料分 配到微孔板上。许多供应商都可提供液体处理仪器，这些仪器就可用于 分配这类样品，这些仪器所包括的分配器可同时分配成96-和384-微孔 板形式。但是，微粒样品必须保持在均一的悬浮液中，以确保精确的分 配。传统的用于混合微粒物质悬浮液的装置依赖于各种机械混合装置。 这些装置包括可以买到的浆叶式混合器和转鼓式搅拌器。

美国专利4812856公开了一种采用喷墨原理，用于分配带有分散颗 粒的流体的方法和装置，该装置包括一个用于储存流体和分散颗粒的储 液器和用于搅拌流体使分散颗粒保持悬浮状态的设备。

本发明试图提供一种适用于混合和使微粒在液体中悬浮并将均一的 样品分配到微孔板中去的混合室，它可代替目前的装置和方法，并可用 于各种微粒粒度和类型，生物学的和非生物学的两者都可用。

按照本发明的一个方面，提供了用于混合和使微粒在液体中保持悬 浮的装置，该装置包括一个用于储存含有分散颗粒的流体的储液器，该 储液器有一个开口的顶部、侧壁和底座；一块安装在储液器内的基本上 为水平放置的混合板，该混合板上有多个穿透整块板的竖孔；和用于使 混合板相对于进行储液器升降的设备。

混合板可适当地包括一系列穿透整块板的孔，这些孔相互之间的关 系是固定的。该混合板优选包括24-、96-或384-排列的孔。

储液器安装在外壳之内，可以包括有助于混合板处理悬浮液的设 备，用于升降储液器中的混合板。在本发明装置的第一实施方案中，提 供了用于升降储液器中的混合板的设备，该设备包括至少一个与装置外 壳相接触并有效地与气源相连接的活塞。提供给活塞(图中未示出)的 空气由压力调节器、电磁阀和节流阀进行控制，以便产生空气的爆破或 脉冲，使活塞起动。在该装置的第二实施方案中，混合板可由驱动齿轮 升降，齿轮中装有一个偏心销(peg)，与装置外壳上的槽相咬合，驱 动轮通过齿轮传动链和驱动轴由伺服电机来驱动。

另一种可用于升降储液器混合板的设备包括螺线管机构、液压起动 活塞，或由磁性机构来升降。

该装置优选再包括能通过试剂进料管将悬浮液样品加到储液器中去 的设备和通过溢流管将来自储液器而未使用的液体移出或进行再循环 的设备。

第二方面，本发明提供了一种采用上述装置来混合和使微粒物质在 液体中保持悬浮的方法，该方法包括如下步骤：将微粒物质悬浮液引入 混合室储液器；起动储液器内的混合板，以便混合和使微粒物质在液体 保持悬浮。

微粒物质可适当选自生物的或非生物的来源，例如，细胞(真核生 物细胞、原核生物细胞)、病毒颗粒、玻璃珠粒、闪光珠粒(PVT、聚 苯乙烯、硅酸钇、氧化钇)、磁性乳胶珠粒、色谱介质和具有受控孔隙 的玻璃珠粒等。

为了阐明本发明的原理和作用，现参阅附图和曲线图，其中：

图1示出的是本发明装置(10)的俯视图，包括储液器(20)、混 合板(30)和装置的外壳(40)部件。

图2示出的是本发明储液器(20)的俯视图(图2a)和侧视图(图 2b和2c)。

图3示出的是本发明混合板(30)的俯视图(图3a)和侧视图(图 3b)。

图4示出的是本发明外壳(40)的俯视图(图4a)和侧视图(图4b 和4c)。

图5图示说明成象珠粒在实施例1的混合室中保持均一悬浮。

图6图示说明哺乳动物细胞经实施例2的混合室分配之后的存活能 力。

参见附图的图1-4，用于混合和使微粒在液体中保持悬浮的装置 (10)包括储液器(20)(如图2所示)，用于储存含分散颗粒的流体 样品。储液器(20)的横断面呈长方形，有一个开口的顶部、侧壁 (21a，21b)、端壁(22a，22b)和底座(23)。储液器(20)的大小可容纳 基本上为水平放置的混合板(30)，使储液器(20)内的混合板能做自 由的垂直运动。与储液器(20)每一端壁(22a，22b)的中心垂直连接的 是线形导轨(24)，每个线形导轨机构上都有一些点，用于使外壳(40) 与储液器固定在一起，引导外壳做相对于储液器(20)的向上和向下运 动。

储液器包括从一个侧壁(21b)中延伸出来的水平配置的托架(25)。 在该装置的一个优选实施方案中，活塞(26)垂直地装在水平配置的托 架(25)上。活塞(26)可以通过圆头锁紧螺母与活塞的外部螺纹相连 接，牢固地装到外壳上，这样，活塞的回缩就可做垂直运动将外壳拉到 储液器的下方。在另一个方案中，活塞与外壳不固定连接，在这种情况 下，外壳由于重力的作用而下降。在本发明的这个实施方案中，活塞由 气源起动，以便提升和降低外壳(40)和装置混合板(30)的部件。采 用已知方法即可控制气源，起动混合板。控制混合板的冲程是通过一个 电动定时器对电磁阀产生脉冲使它在预定的间隔时间内打开。空气在通 往活塞之前被节流，以改变冲程的强度。

在另一个实施方案(未示出)中，混合板由驱动齿轮来升降，该齿 轮中装有一个偏心销，与装置外壳上的槽相咬合。驱动轮由置于储液器 一个外侧壁(21a或21b)上的可拆式机套中的齿轮驱动链来驱动。在 这个实施方案中，没有水平配置的托架(25)和活塞(26)。齿轮驱动 链由与伺服电动机相连的驱动轴驱动，该电动机装在远离装置的位置 上。伺服电动机可以装在机套内，伺服驱动单元和程序逻辑控制器由一 个操作者界面进行控制，因此，装置的混合板可按预定的速率升降，该 速率与储液器中所装的流体液面有关。

另一种可用于升降储液器混合板的设备包括由液压来起动活塞，或 由电磁或磁性设备来起动。

该装置优选有通过设在储液器一端壁(22a)下方的试剂进料管 (27)将悬浮液微粒物质加到储液器中去的设备和在出口阀(未示出) 控制下通过管线(28)移出储液器中出来而未使用的液体样品或使其再 循环的设备。在操作过程中，试剂或洗涤溶液可通过与试剂进料管相连 的注射器或与第二储液器相连的蠕动泵或通过重力加到储液器中。可以 通过与废料管相连的吸入泵将试剂从储液器中移出。该装置最好包括设 在储液器(20)每一端壁(22a，22b)上的溢流管(29)。

适合的储液器是一种整体铸造的结构，可由硬质材料制成，该结构 可耐受分配操作中使用的含水和/或含水/有机介质。适用的材料可选自 不锈钢和硬质塑料或聚合物材料。另外，储液器可通过机械加工方法在 塑料或聚合物板材的表面上成型。优选的塑料选自聚苯乙烯、聚碳酸 酯、聚甲醛(聚甲醛均聚物或共聚物)，或聚四氟乙烯(PTFE；TeflonTM)。

混合板如图3所示，它包括一块带有侧壁(31)、端壁(32)、底 座(33)和顶部(34)的硬质长方形片材或板材(30)，在板材上形成 一系列从顶部至底座穿透整块板的竖孔(35)。如前所述，混合板的大 小可以装在储液器内，使该板能在储液器(20)内做自由的垂直运动。 在混合板的每一端，在钻入顶面(34)的孔(36)中装有吊柄(37)， 这些柄被插在孔中靠摩擦力固定。这些吊柄由不锈钢制成并向上延伸与 装在装置外壳(40)上的凸台(1ug)相连接。

参见图3，图中示出了384-孔板(30)，共有384孔，其尺寸为12.8 ×8.6×0.5cm，按16×24排列，相互隔开，使板上每个孔的中心与384- 微孔板上每个相应微孔的垂直轴精确地重合。根据需要，混合板可以造 成带有24-、96-或384-孔排列的孔板，以便将微粒样品分配到24-、 96-或384-微孔的孔板中。这一排列中每个孔的尺寸是基本相同的，直 径是适当的，可以将移吸管的顶端通过混合板上的孔插到储存在储液器 中的样品中去。这一排列中每个孔的直径可为2mm-7mm，优选的是 2mm-4mm。384-孔的排列中每个孔的直径优选的是3mm。适用的混合板 可由硬质塑性材料制成，优选的是聚甲醛(聚甲醛均聚物或共聚物)， 或聚四氟乙烯(PTFE；TeflonTM)。

装置的外壳(40)如图4所示，其大小能装在储液器(20)的上面， 包括导轨(24)和活塞(26)(或也可选用齿轮传动链套)，同时，要 让多头移吸管能自由地进入储液器的样品中。该外壳的横断面为长方 形，带有侧壁(41a，41b)、端壁(42a，42b)和从外壳的垂直壁中水平向 内延伸的法兰(44)。与外壳(40)每个端壁上的法兰相连的是凸台(45)， 它适合于与混合板(30)的吊柄(37)相连接，用于提升混合板。端板 可包括一个或多个槽(46)，以便让试剂和废料导管进入储液器(20)。 从侧壁(41b)水平向外延伸的是托架(47)，它于活塞内部相接，以 便外壳(40)能做向上运动。外壳装在储液器上面，并用例如螺丝等固 定件穿过每个端壁的外壳与齿轮传动链(24)连接。

适用的装置外壳是铸造的结构，可用硬质材料制成，该材料能耐受 分配操作中使用的含水和/或含水/有机介质。适用的外壳可用不锈钢制 成。

在操作中，微粒悬浮液通过试剂进料管引入组装装置的储液器中。 启动气源，以预定的间隔时间起动活塞，使外壳和混合板产生向上运 动，因而对悬浮液微粒进行搅拌和混合。当压力减低时，外壳(和混合 板)便下降(或由于重力的作用而返回原位)，准备做下一次循环。在 另一个实施方案中，混合板可以象描述的那样由驱动齿轮升降。

通过使用本发明的混合室和起动混合板来使混合板升降，这就有可 能混合和使微粒在液体中保持悬浮，并在微粒物质有机会在储液器中沉 降出来之前，移出悬浮液中的全部微粒物质。

现参考如下实施例对本发明做进一步的说明。 实施例1：表明成象珠粒在混合室中保持均一悬浮的试验 方法

20mg/ml Streptavidin涂覆的氧化钇(Y0x)珠粒(Amersham Pharmacia Biotech)在混合室中以0.2μCi/mg的比例与[3H]生物素混 合5小时。氧化钇珠粒的密度为5g/cm3，如不用采取任何混合措施，该 珠粒几分钟后便会从悬浮液中沉淀出来。混合室放置在MultimekTM 96(Beckman Coulter)液体处理器的台面上。Multimek按程序移出96 ×10μl并将其加到384微孔板的1/4象限中，这一过程再重复3次， 填充384微孔板余下的3/4象限。然后将该板放在LEADseekerTM均一成 象系统(Amersham Pharmacia Biotech)中成象。在整个5小时的混 合过程中，该板每30分钟被分配和成象一次。 结果

记录下从每个微孔中测得的信号，当作累积光学密度(IOD)。对横 穿每块板的平均IOD和每块板的变量系数(％CV)进行计算并示于图5。 结果表明，混合器保持了YOx珠粒的均一悬浮，如同整个混合过程中测 得的均一％CV和均一平均IOD所示。 实施例2：表明自混合室分配之后哺乳动物细胞存活能力的试验 方法

将V-79细胞(Chinese hamster lung，ECACC NO.86041102)置 于Dulbecco改良的Eagle最低基本要素培养基(DMEM)中培养，培养 基中补加了10％(w/v)牛胎血清(foetal bovine sera(FBS))、2mM L- 谷酰胺、50IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素，在37℃下，在湿度50％ CO2细菌培养皿中使其进行次代融合。然后，用胰岛素-EDTA进行处理，使 细胞再悬浮。在培养基中，细胞被稀释至5000细胞/ml。细胞在混合室 中混合，用Multimek 96将100μl分配到2×96微孔Cytostar-T板的 每个微孔中。此外，用手对细胞进行混合，并将100μl分配到96微孔 Cytostar-T板的每个微孔中。将微孔板在37℃下培养一夜，让细胞粘 附到一起，第二天早晨加入[14C]胸腺嘧啶脱氧核苷至0.5μCi/ml。立 即对微孔板进行计数，然后在37℃下培养。过5小时、19小时和24小 时后再次对微孔板进行计数。 结果

在MicrobetaTM(Wallac)上得到的结果示于图6。[14C]胸腺嘧啶脱 氧核苷的吸收图表明，平均CPM值随时间不断地增加，这说明V-79细 胞是生长了并结合了[14C]胸腺嘧啶脱氧核苷，因此，表明混合之后该 细胞还是能存活的。无论是人工混合，还是混合室混合，V-79细胞都能 生长得同样好。培养24小时后，经混合室混合的V-79细胞的横穿96 微孔板的％CV为2.9，而人工混合的细胞为4.1，这表明混合室混合得 到的细胞均一悬浮液比人工混合得到的均匀得多。