生物制剂的复制阵列已用来促进对许多样品的平行检验。例如，长 期以来应用无菌绒布和活塞环装置将细菌和酵母菌落复制到每个含有一 种不同生长培养基的琼脂平板上，作为一种用于快速筛选大量独立菌落 不同生长表型的方法(Lederberg和Lederberg，细菌学杂志(J. Bacteriol.)63：399，1952)。同样，也用96孔微量滴定板以易于获得的方 式安排并贮存大量例如细胞系、显示重组DNA文库的病毒分离株或单克 隆抗体细胞系。
大规模基因组计划的出现和分子诊断学的越来越多的应用，都需要 发展大容量流通量的筛选核酸的方法。最近，发展了合成与玻璃或硅表 面结合的短寡脱氧核苷酸(ODN)大型阵列的方法，该阵列代表所有可 能的核苷酸序列或其子集(Maskos和Southern，核酸研究(Nucl.Acids Res.)20：1675，1992)。已经利用这些ODN阵列通过杂交进行DNA序 列分析(Southern等人，基因组(Genomics)13：1008，1992；Drmanac 等人，科学(Science)260：1649，1993)、确定表达分布图、筛选突变， 等等。在所有这些应用中，ODN都共价连接于底物表面。然而，某些有 用的筛选技术和测定法不易适合于固定化ODN的格式。
特别地，核酸的扩增，尤其聚合酶链反应(PCR)及其多种变化，已广 泛适用于许多不同的生物学问题，并且不易转移为固定了ODN的格式 中。在标准格式中，对于商业应用PCR具有两个主要局限：试剂的成本 和使方法自动化的能力。如果减少每一反应的总体积则能降低试剂成本， 尤其是DNA聚合酶。利用机器人控制的针头(pin)工具排列小量试 剂的精确且可靠的方法将使反应小型化。使扩增转移至阵列格式中的其 它障碍包括在加热与冷却循环中防止蒸发，以及防止反应在阵列上的扩 散及混合。
本发明公开了不需固定成分的在阵列格式中进行扩增及其它酶反应 的方法和组合物，并进一步提供了其它有关优点。
发明概述
在本发明的一个方面中，提供了从模板扩增核酸分子的方法，其包 括：(a)将一种固体底物上的单链核酸模板与一种含有可与该模板杂交 的寡核苷酸引物和DNA聚合酶的溶液混合，其中这种混合发生于底物上 分离的区域中，并且该溶液保留于分离的区域中；(b)合成模板的互补 链，形成双链体；(c)变性该双链体；以及(d)合成模板的互补链， 从而扩增核酸分子；其中混合、合成和变性都在露点下进行。固体底物 可以是硅片或载玻片。模板可共价连接于固体底物或沉积于底物表面。 可在混合之前将模板均匀地施加于完整的阵列，或者个别地施加于底物 上的每一分离区。当个别施加时，优选地使用弹性(spring)探针进行施 加。在一种最优选的实施方案中，使用一种装置控制露点。
在一个相关方面，扩增方法应用可与模板杂交的第一种寡核苷酸引 物、可与模板互补链杂交的第二种寡核苷酸引物，并在合成后变性双链 体；合成模板与模板互补链的互补链，从而扩增核酸分子。
在优选实施方案中，变性和合成步骤多次进行。在其它优选实施方 案中，溶液中含有一种赋予粘性的化合物，如甘油或糖。在其它优选实 施方案中，DNA聚合酶是热稳定的聚合酶，并在不同温度下进行合成与 变性。
在其它优选实施方案中，该方法进一步包括检测双链体。最优选地， 用一种标记物标记寡核苷酸引物，该标记物可通过非荧光光谱测定法或 电位滴定法检测，优选地通过质谱分析法、红外光谱法、紫外光谱法或 恒压电流分析法。
在另一方面，提供了一种从模板合成核酸分子的方法，其包括：(a) 将一种固体底物上的单链核酸模板与一种含有可与该模板杂交的寡核苷 酸引物和DNA聚合酶的溶液混合，其中这种混合发生于阵列的分离的区 域中，并且该溶液保留于分离的区域中；(b)合成模板的互补链，形成 双链体；其中混合与合成都在露点下进行，其中用一种装置保持或达到 露点，这类装置包括：能耐压的容器；加热装置；产生压力的装置；以 及产生饱和蒸汽的装置；其中加热装置、压力生成装置和蒸汽生成装置 都是可控制的。
在又另一方面，提供了一种检测核酸分子中单碱基改变的方法，其 包括(a)将一种固体底物上的单链核酸分子与一种含有可与该核酸分子 杂交的第一种及第二种寡核苷酸和DNA连接酶的溶液混合，其中这种混 合发生于阵列的分离的区域中，并且该溶液保留于分离的区域中；及(b) 检测连接产物；其中当核酸分子接头碱基处存在单碱基改变时，第一种 和第二种寡核苷酸不连接，其中混合在露点下进行。
在又一方面，提供了一种进行单核苷酸延伸测定的方法，其包括(a) 将一种固体底物上的寡核苷酸与一种溶液混合，该溶液含有可与该寡核 苷酸杂交的单链核酸分子、单核苷酸和DNA聚合酶，其中这种混合发生 于底物的分离的区域中，并且该溶液保留于分离的区域中；以及(b)检 测该寡核苷酸的延伸产物；其中只有当单核苷酸与邻近的交寡核苷酸的 核苷酸互补时寡核苷酸才延伸，其中混合在露点下进行。
在其它方面，本发明提供了一种用于基因分型的试剂盒，其包含一 种含有标记寡核苷酸引物对阵列的固体底物。在优选实施方案中，该试 剂盒进一步包含核酸模板和一种粘性溶液。
参照下列详述和附图，本发明的这些及其它方面将变得明显。另外， 以下叙述了许多参考文献，它们更详细地描述了某些方法或组合物(例 如，质粒等)，因此完全引入作为参考。
本发明的方法和试剂盒可包括标记的生物分子，例如，与可切除的 标记物共价键合的寡核苷酸。典型的标记生物分子以及可使用这些分子 的试验在下列专利中有描述：1997年1月22日申请的美国专利申请号 08/786,835、08/786,834和08/787,521，以及1997年7月22日申请的三 种美国部分继续专利申请，申请号为08/898,180、08/898,564和 08/898,501，以及国际公开文本WO 97/27331、WO 97/27325和WO 97/27327。这六种美国专利申请和三种国际公开文本在此全部完整引入作 为参考。
本发明的方法和试剂盒可以与在一种单元(或“第一区”)中含有超 过一种寡核苷酸序列的阵列结合使用。在一种单元中含有超过一种寡核 苷酸序列的生物分子阵列及其应用在下列专利中有描述：于1997年7月 22日申请的美国临时专利申请号60/053,436，题目为“一种阵列元件中 的多种功能性及其应用”，以及与之同时申请的相同题目的美国非临时专 利申请号＿＿，两者在此都完全引入作为参考。
可与本发明的方法和试剂盒结合使用的生物分子阵列，可按照在下 列专利中公开的技术制备：1997年7月22日申请的美国临时专利申请号 60/053,435，题目为“在固体支持物上阵列溶液的装置与方法”，以及与 之同时申请的相同题目的美国非临时专利申请号＿＿，两者在此都完全 引入作为参考。
可与本发明的方法和试剂盒结合使用的生物分子阵列，可按照在下 列专利中公开的技术制备：1997年7月22日申请的美国临时专利申请号 60/053,352，题目为“基于聚乙烯亚胺的生物分子阵列”，以及与之同时 申请的相同题目的美国非临时专利申请号＿＿，两者在此都完全引入作 为参考。
用于关联数据的计算机系统和方法，可与在此所述对核酸阵列进行 的扩增及其它酶反应结合使用，其在下列专利中公开：1997年7月22日 申请的美国临时专利申请号60/053,429，题目为“用于关联数据的计算机 方法与系统”，以及与之同时申请的相同题目的美国非临时专利申请号 ＿＿(两者在此都完全引入作为参考)。
附图简述
图1显示在可见光照明(上图)和荧光照明(下图)下拍摄的经排 列的小球体的显微照片。
图2显示应用本发明的方法学由机器人生成的一种阵列的CCD摄影 图像，其中区域平均直径约为100-150微米，斑点之间中心距为200微米。 斑点直径的标准差约为15％。
图3显示按照本发明制备并使用Vector Blue(Vector Laboratories， Burlingame，California)显色并用CCD照相机和显微镜成像的微斑点的 阵列。
图4是显示如何按照本发明鉴定并部分定量单一阵列元件内存在的 两种不同寡核苷酸的图例。
图5是一种控制露点的装置的图例。
发明详述
如上所述，本发明提供从模板扩增核酸分子的方法和装置，以及对 核酸分子进行酶测定的方法和装置。通常对如在此所述制备的核酸分子 的阵列施行这些方法。在本发明中，在一种控制露点的装置中施行这些 方法。 I.模板向固体底物的施加 A.底物制备
由一种合适的材料制备用于阵列的底物。该底物优选地是刚性的， 并且优选地具有一个基本上平的表面。在某些实施方案中，该表面可提 高刚性，以勾出区域的轮廓。典型的底物是硅片和硼硅酸盐载玻片(例 如，显微镜载玻片)，尽管也可用本领域所知的其它材料代替。特别有用 的固体支持体的实例是硅片，它一般用于电子工业中半导体的构造中。 硅片的一个侧面是高度抛光呈镜面，并能用硅烷化学法轻易地包被不同 的连接剂，如聚乙烯亚胺。硅片可以从如WaferNet，San Jose，CA的 公司商品获得。
可以原位即在固体底物上合成或在别处合成核酸分子或其它生物聚 合体如肽，并施加于底物。此外，能购买(例如，从Affymetrix，Palo Alto， CA)含有已存在于阵列中的寡核苷酸的底物。在固体底物如硅片上合成 核酸的许多合适方法是易于应用的。这些方法依靠标准方案如亚磷酰胺 化学法来合成寡核苷酸。也可利用市售的机器以自动化方式合成核酸和 肽。一种优选的方法是制备核酸分子并将其施加于底物。在某些实施方 案中，分子共价连接于底物上。在优选实施方案中，核酸沉积于固体底 物上而不共价连接。
在某些实施方案中，为寡核苷酸准备底物的表面。表面的制备方法 可以是例如，包被一种增强或降低疏水性的化学制剂，或包被一种使核 酸分子或其它聚合序列共价键合的化学制剂。某些化学包被层既可改变 疏水性又允许共价键合。通过硅烷处理或本领域所知的其它处理能容易 地提高固体底物上的疏水性。允许共价键合的化学制剂一般被称为连接 剂。这些连接剂分子附着于底物表面，并且含有一种可与生物分子反应 的官能团。多种这样的连接剂是易于获得的。例如，用光不稳定保护的 羟基(见，美国专利号5,412,087；5,571,639；5,593,839)、烷氧基或脂 族衍生的羟基，美国专利号5,436,327)或其它化学制剂(见，例如，美 国专利号5,445,934；欧洲专利号EP-B1-0,373,203；美国专利号5,474,796； 美国专利号5,202,231)修饰固体支持体。
一种既降低疏水性又提供连接剂的优选的包被层是聚(乙烯亚胺)。 而且，聚(乙烯亚胺)(PEI)包被的固体底物也具有长贮藏期稳定性的 额外优点。用聚合物如聚(乙烯亚胺)对硅片和载玻片的包被能自己进 行或由公司如Cel Associates(Houston，Texas)进行。载玻片也能用一 种反射材料包被或者用硅烷化学法用PEI包被。PEI包被层使单链或双 链寡核苷酸、单链或双链长DNA分子或片段或其它任何含胺的生物分子 与固体支持体能共价连接。可利用己胺修饰使寡核苷酸在5’共价连接， 该修饰法将一个伯胺置于寡核苷酸的5’末端。然后寡核苷酸上的5’-胺可 与交联剂反应，使得寡核苷酸共价连接于固体支持体的聚合物包被层。
只要核酸含有伯胺，则任何核酸类型都能共价连接于PEI包被的表 面。通过使用5’-己胺结合的引物能修饰扩增产物(例如，PCR产物)使 之含有伯胺。通过使用烯丙基-dUTP(Sigma，St.Louis，MO)的切口平 移能将胺基引入扩增产物及其它核酸双链体中。同样，也可通过聚合酶 如末端转移酶或者通过含胺短寡核苷酸的连接将胺引入核酸中。也可用 本领域所知的其它适当方法代替。
适用于胺基的交联剂一般是可商业化获得的(见，例如，Pierce， Rockford，IL)。一种典型的交联剂是三氯三嗪(氰尿酰氯)(Van Ness等 人，核酸研究19：3345-3350，1991)。简言之，向0.01-1μg/ml、优选地约 0.1μg/ml典型寡核苷酸浓度的寡核苷酸溶液中加入过量的氰尿酰氯(例 如，氰尿酰氯比胺摩尔数过量10-1000倍)。用pH范围7.0-9.0的常用缓 冲液如磷酸钠、硼酸钠、碳酸钠或Tris HCl缓冲该反应。优选的缓冲液 是新鲜制备的0.2M pH8.3-8.5的硼酸钠。加入10μl 15mg/ml氰尿酰氯溶 液，并使之在连续搅拌下反应1-12小时、优选地约1小时。反应温度为 20-50℃，优选的反应温度为25℃(或环境温度)。
当氰尿酰氯用作交联剂时，在将核酸转印至固体底物上之前不需要 去除过量的交联剂。反应混合物中的过量氰尿酰氯不干扰或竞争核酸或 寡核苷酸与PEI包被的固体支持体的共价连接，因为固体支持体上的胺 超过氰尿酰氯分子数。在一种优选实施方案中，在转印步骤之前不纯化 交联的寡核苷酸。
如果核酸或其它含胺多聚体共价连接，则活化的多聚体可以与固体 支持体在20-50℃下反应1-20小时，优选地25℃下1小时。然后对固体 支持体上的游离胺加帽，以防止其它核酸的非特异连接。加帽的实现方 法是，使固体支持体与0.1-2.0M琥珀酸酐、优选地与1.0M 70％m-pyrol 和0.1M硼酸钠中的琥珀酸酐在25℃下反应15分钟到4小时，优选的反 应时间为30分钟。然后在含有0.1-5M甘氨酸(优选地0.2M甘氨酸)的 0.1-10.0M硼酸钠pH7-9(优选地0.1M硼酸钠pH8.3)溶液中温育该固 体支持体，然后用含去污剂的溶液洗涤。这使任何可与PEI表面共价连 接的二氯三嗪“加帽”。优选地，该固体支持体进一步在0.01M NaCl、0.05M EDTA和10mM Tris pH8.0中加热至95℃ 5分钟，以去除任何非共价附 着的核酸。在将双链核酸转印至固体底物的情况中，该步骤也使双链转 变(变性)为单链形式。 B.向固体底物施加核酸分子的方法
寡核苷酸、核酸分子或其它生物聚合体被“转印”(输送或施加)于 一种固体底物上。在优选实施方案中，以常规模式或阵列施加多聚体。 在其它优选实施方案中，将多聚体施加于固体底物的完整区域中，并使 之干燥，之后以一种阵列模式施加其它多聚体、缓冲液、酶等等。利用 移液器、尼龙滚子、图章等，可将不含去污剂的缓冲盐溶液如10mM Tris、 50mM NaCl和5mM EDTA中的多聚体施加于底物。
对于以阵列模式向固体底物施加核酸如寡核苷酸或DNA片段，多种 转印方法是有效的。作为总方针，输送机制必须能将极小量的液体(例 如纳升)定位于小区域(例如，10-200μm直径的圆点)中，其中这些区 域彼此非常接近(例如，25-500μm的中心距)。优选地使转印技术自动 化。一种这样的技术是使用多头的喷墨转印法。也可使用极细的移液管。 一种优选的转印方法是使用在此所述的弹性探针。
当使用一种具有亲水性表面的液体转移装置时，尤其是该装置是一 种改进的弹性探针时，样品挑取、转移和微滴沉积大大增强。通过应用 用于修饰探针表面的化学试剂或通过用一种亲水性物质包被探针，使弹 性探针亲水。在一种优选的方法中，使弹性探针的尖端浸于25-200mM 的1，4-二硫苏糖醇、0.1M硼酸钠溶液中15分钟到2小时。二硫苏糖醇通 过巯基-金配位与金表面反应，基本上羟化该表面，使其亲水。
当弹性探针浸泡于溶液中时，亲水性表面促进样品的均匀包被。有 沟槽的探针均匀且一致地装有被其亲水性质吸引到探针表面的液体。含 有增强粘度作用的化学制剂如甘油的溶液尤其利用亲水性表面提高处理 能力。用这些溶液，当甘油被从液体来源吸引时，附着于探针上。当样 品从其来源转移到固体支持体时，探针的亲水性表面通过在转运过程中 保留所转移的液体并阻止样品随机滴下或流出而继续有利于液体处理。 当带有弹性探针的样品与固体支持体接触时，尤其是在含有粘度增强液 的样品的情况中，样品从弹性探针尖端沉积到固体支持体表面上。斑点 区域的大小一般为10-200μm，具有25-500μm的典型中心距。
简言之，在一种典型方法中，在57％甘油中均匀地混合核酸溶液， 然后转印至固体支持体上。在本发明的范围内，生物聚合体可以是核酸 分子或蛋白质分子。当使用核酸时，可包括单链或双链DNA、单链或双 链RNA、寡核苷酸、杂合DNA-RNA分子或双链体、含有蛋白质主链的 PNA核酸，等等。 II.反应成分与条件
如上所述，本发明提供扩增固体底物上的核酸的方法以及其它酶反 应。如上所述，核酸可以共价连接于底物表面或者可以不经连接地沉积 于底物上。一般首先转印扩增模板，随后加入扩增或其它酶反应所需的 试剂。 A.试剂、缓冲液、辅因子等
经历反应的阵列的每一区域除模板核酸外还含有适当的酶及其它任 何必需的成分，包括但不限于：寡核苷酸引物、核苷酸、缓冲液、辅因 子，等等。例如，一种扩增反应包括模板、DNA聚合酶、核苷酸(例如， dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、寡核苷酸引物和含有二价阳离子通常为 Mg++的缓冲液。
扩增反应基于引物延伸(例如，聚合酶链反应，见美国专利号 4,683,195；4,683,202和4,800,159，循环探针技术，NASBA)、连接(LCR， 连接链反应)、RNA扩增(见Lizardi等人，生物工程学(Bio/Technology) 6：1197，1988；Kramer等人，自然(Nature)339：401，1989；Lomeli 等人，临床化学(Clin.Chem.)35：1826，1989；美国专利号3,786,600)、 差示展示(Liang和Pardee，科学，257：967-971，1992；Liang等人， 核酸研究，22：5763-5757，1994)，等等。优选地，扩增方法是聚合酶链 反应，其应用一种热稳定DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶、VentR DNA 聚合酶、VentR(外切-)DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶，等等。对于 这些酶，最适缓冲液和二价阳离子是众所周知的。寡核苷酸引物优选地 具有平均G+C含量，并且具有非配对的3’末端。寡核苷酸序列也部分地 取决于待扩增区域。寡核苷酸设计、缓冲液浓度和阳离子浓度的条件与 考虑是众所周知的(见，例如，Ausubel等人，《分子生物学通用方案》， Greene Publishing，1995；Innis等人，《PCR方案：方法与应用指南》， Academic Press，1990；Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，冷 泉港出版社，1987)。核苷酸一般为四种脱氧核苷酸dATP、dCTP、dGTP 和dTTP，但也可包括衍生物或稀有碱基。
本发明范围内的其它酶反应包括：由模板对核酸分子的合成、检测 核酸分子中单碱基改变的寡核苷酸连接测定以及单核苷酸延伸测定。对 于这些方法中的每一种，适宜条件是众所周知的。
此外，反应也可含有其它化学制剂或成分。(见，美国申请号 08/719,132和60/026,621，及要求对这两种美国申请的优先权的国际公开 文本WO 98/13527，全部在此完整引入)。例如，可加入hybotrope促进 寡核苷酸引物与模板的退火。Hybotrope是指当对照标准盐溶液(即，0.165 M NaCl)时能使核酸双链体的焓提高20％或更多的任何化学制剂。当含 50％ G+C的18bp寡核苷酸双链体溶液具有15℃或更低的螺旋-卷曲相 变(HCT)时，化学制剂显示hybotropic性质。HCT是80％与20％的 双链体变为单链的温度之间的差。然后选择退火温度作为辨别温度，该 温度是进行杂交反应使错配双链体与完全配对的双链体之间能可检测地 辨别的温度。温度范围满足辨别温度的标准。
在一种优选实施方案中，在一种粘性溶液中进行反应。这种溶液优 选地提高露点(即，降低蒸汽压)、具有高表面张力并提高转印能力。该 粘性溶液基本上不抑制酶活性。优选地，抑制低于1-20％的酶活性。提 高粘度的合适化合物包括甘油和糖。优选地，甘油以20-100％存在，更 优选地为20-70％。其它合适的化合物可通过下列方法鉴定：(a)测定化 合物的存在下的酶活性，及(b)在固体底物上形成液滴，在反应温度下 温育，观察剩余的分离的液滴(区)。一般而言，底物表面越疏水，则溶 液粘度越低，而底物表面越亲水，溶液粘度越高。 C.保持露点的装置
如上所述，反应在露点下进行。在此使用时，露点是指小滴大小不 明显改变的温度范围。如此处所述，可以用一种能控制温度、压力和含 水量的装置来保持露点。
同样，在防止水从微滴蒸发的规定的含水量和压力下进行反应。当 水从微滴蒸发的速度与水从覆盖底物阵列的湿空气向微滴冷凝的速度之 间达到平衡状态时，即达到该条件。当该平衡实现时，据说对于阵列的 平面表面而言空气是饱和的。水蒸汽产生的压力(Ps)是在反应过程中 给定温度下必须保持的任何饱和蒸汽压。饱和蒸汽压的大小仅取决于温 度，并且随温度的上升而迅速升高。即，对于所有达到的温度，都基本 上在露点下进行热循环扩增。例如，在0℃时饱和蒸汽的绝对压力为0.0885 psi，而在100℃时饱和蒸汽的绝对压力为17.186psi。因此，一种装置应 具有在扩增或其它酶反应过程中发生的所有温度循环中保持露点的能 力。实际上，饱和的清洁蒸汽将存在于该“容器”中。该装置一般由一 种含有固体支持体的压力室、一种可控制的加热装置、一种产生压力的 装置和一种产生饱和蒸汽的装置组成。所有参数优选地是可由计算机控 制的。在其它实施方案中，该装置是这样一种容器，其具有一种产生压 力的装置、一种产生饱和蒸汽的装置和一种密封装置，使得该容器被密 封于一种可控制的加热与冷却组件上(如那些可商品获得的装置)。设计 这种模块化装置以适合不同大小的加热与冷却组件的格式，例如从96孔 板大小到显微镜载玻片。
在一种优选实施方案中，并参照图5，本发明提供一种加热与冷却组 件101，其上放置有一个盖玻片102，其含有样品液滴103的分离的区域。 该组件被封包于构成容器的密封盖104中，其具有一种调节内部压力的 活塞105、一种测定露点的传感器106和一种水蒸汽源107。
在本发明的一种优选实施方案中，打开容器的装置、组件的温度、 活塞的位置和阀门都处于计算机控制之下。在本发明的一种实施方案中， 传感器(106)是一个CCD照相机和一个位于活塞透明部分之后的光源。 在该实施方案中，通过对液滴照相并将液滴图像与参照斑点相比较来连 续测定一个或多个液滴的大小。通过监测液滴大小估计露点，并调节压 力使液滴保持其原始大小。通过控制活塞的位置控制压力。在本发明的 另一种实施方案中，用常规传感器监测压力。在该实施方案中，压力向 取决于样品温度和样品组成的预置值变化，以处于预测的露点范围之内。
在本发明的一种优选实施方案中，水蒸汽源(107)由干气源组成， 其中干气穿过一种保持恒温的水饱和滤器。在控制的温度下从蒸汽源流 出的气体用水饱和。该气体用于在密封容器之前冲洗该容器，并用来确 保容器中的空气组成一致，并需要从样品蒸发来达到平衡。 III.反应产物的检测
可用多种方法检测反应产物。优选地，标记反应成分之一。在扩增 反应中，便利地标记寡核苷酸引物或核苷酸。优选地，引物含有一种标 记物。在单核苷酸延伸测定中，加入的核苷酸通常被标记，在寡核苷酸 连接测定中，一种或多种寡核苷酸被标记，在其它合成反应中，一般标 记引物或核苷酸。
常用的标记物包括但不限于：生物素、荧光分子、放射性分子、显 色底物、化学发光物等等。生物素化核酸的方法在本领域中众所周知， 向寡核苷酸和核苷酸中引入荧光分子和放射性分子的方法也众所周知。
当使用生物素时，用偶联于可检测标记物如酶(例如辣根过氧化物 酶)或放射性标记物(例如，32P、35S、33P)上的亲和素或链霉亲和素等 来检测。酶偶联物可从如Vector Laboratories(Burlingame，CA)购得。 链霉亲和素与生物素高亲和力地结合，洗掉未结合的链霉亲和素，然后 在过氧化物和适当缓冲液的存在下用一种沉淀底物检测辣根过氧化物酶 的存在。可用配备有可见光源和CCD照相机的显微镜(Princeton Instruments，Princeton，NJ)检测产物。利用这种仪器，一次能扫描大约 10000μM×10000μM的图像。
对于荧光、放射性、化学发光、显色标记物以及其它常用标记物的 检测方法众所周知。简言之，荧光标记物能根据其吸收和荧光发射波长 与强度最直接地鉴定并定量。应用适当波长的光源的显微镜/照相机装置 是一种检测荧光标记物的便利装置。放射性标记物可通过标准放射自显 影、磷成像分析或CCD探测器显示。其它检测系统也是可用的并且为本 领域所知。对于如生物素、放射性或荧光的标记物，一次能检测的不同 反应的数量是有限的。例如，如在DNA序列分析中常用的四种荧光分子 的应用，使分析限于一次四种样品。实际上，由于这种限制，当使用这 些检测方法时必须单独地估计每一反应。
一种更有利的检测方法使合并至少一种阵列上的样品反应及对产物 的同时检测成为可能。通过在每一反应中应用具有不同分子量或其它物 理属性的标记物，能同时收获并分析全套的反应产物。(见美国专利号 08/786,835；08/786,834；08/787,521；08/898,180；08/898,564；08/898,501 和国际公开文本97/27331；97/27325和97/27327，全部在此完全引入作 为参考)。简言之，一种“标记物”分子用作一种标记。在此使用时，“标 记”是指用于唯一地鉴定“目标分子”的化学部分，尤其是指标记可变 成分以及在标记反应物、标记成分和标记部分的任一种中可与之最紧密 键合的任何成分。
在本发明中有用的标记物具有下列几种属性：(1)它能与其它所有 标记物区别开来。这种与其它化学部分的辨别可基于标记物的色谱行为 (尤其在裂解反应后)、其光谱或电势性质或其某种组合。有效区分标记 物的光谱法包括质谱分析法(MS)、红外线(IR)、紫外线(UV)和荧 光，其中MS、IR和UV是优选的，MS是最优选的光谱法。电势电流分 析法是一种优选的电位法。(2)当标记物以10-22-10-6摩尔存在时能被检 测出。(3)该标记物具有一种化学柄，标记物通过它与MOI连接，以唯 一地鉴定该标记物。可直接与MOI进行这种连接，或者间接地通过一种 “连接体”基团进行。(4)该标记物对于所经受的所有操作都是化学稳 定的，这些操作包括连接与从MOI上的切除，以及在标记物连接于MOI 上时对MOI的所有操作。(5)当标记物与MOI连接时，该标记物不明 显妨碍对MOI进行的操作。例如，如果标记物连接于一种寡核苷酸上， 则该标记物不能明显妨碍对该寡核苷酸进行的任何杂交或酶反应(例如 扩增反应)。
一种为了通过特定光谱法或电位法检测的标记部分应具有能提高该 方法的检测敏感度及特异性的性质。一般而言，标记部分具有这些性质， 因为它们是对标记可变成分设计的，该成分一般构成标记部分的主要部 分。在下列论述中，词语“标记物”的应用一般是指标记部分(即，含 有标记可变成分的切割产物)，然而也可认为它是指标记可变成分本身， 因为它是标记部分的一部分，一般负责提供独特的可检测的性质。在通 式T-L-X的化合物中，“T”部分含有标记可变成分。当标记可变成分设 计用来通过如质谱分析法来表征时，T-L-X的“T”部分可被称为Tms。 同样，含有T的从T-L-X上的切割产物可被称为含Tms的部分。下列光 谱法和电位法都可用于表征含Tms的部分。
因此，在本发明的一个方面，提供了测定核酸分子或片段的身份(或 检测选定的核酸分子或片段的存在)的方法，其包括下列步骤：(a)从 一种或多种选定的靶核酸分子产生标记的核酸分子，其中一种标记物与 一种特定核酸分子关联，并可通过非荧光光谱测定法或电位滴定法检测， (b)按大小(例如HPLC、电泳)分离该标记分子，以去除未掺入酶生 成产物中的标记物质，(c)从标记分子上切下标记物，以及(d)通过非 荧光光谱测定法或电位滴定法检测该标记物，并由此确定该核酸分子的 身份。这些技术的实例包括如质谱分析法、红外光谱法、恒压电流分析 法或紫外光谱法。 IV.应用
如上所述，可以以多种方式应用在此所述的方法。例如，模板核酸 的扩增可用于对个体进行基因分型，用于突变扫描，用于确定表达分布 图，等等。寡核苷酸连接测定和单核苷酸延伸测定可用于突变分析、样 品中核酸的检测等等。下面简述了这些应用的每一种。 A.基因分型
在本发明的一个优选方面，提供了对选定的一种生物进行基因分型 的方法，其包括下列步骤：(a)从选定的靶分子产生标记的核酸分子， 其中一种标记物与一种特定片段关联，并可通过非荧光光谱测定法或电 位滴定法检测，(b)分离该标记分子，(c)从该标记分子上切下标记物， 以及(d)通过非荧光光谱测定法或电位滴定法检测该标记物，从而确定 该生物的基因型。在其它实施方案中，标记物可以是荧光的、放射性的 等等。
在本发明的另一种实施方案中，提供了利用DNA指纹法测定核酸分 子的身份或检测如生物样品中的一种选定核酸分子的方法。简言之，这 些方法一般包括下列步骤：产生一系列标记的核酸片段，随后按大小使 这些片段分离。通过例如凝胶电泳(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳)或优 选地HPLC能完成大小分离步骤。然后从分离的片段上切下标记物，并 通过相应的检测技术(例如，质谱分析法、红外光谱法、恒压电流分析 法或紫外光谱法)检测这些标记物。
多种类型DNA序列多态性的描述已经为理解人类基因组结构提供了 基础(Botstein等人，美国人类遗传学杂志(Am.J.Human Genetics)32：314， 1980；Donis-Keller，细胞(Cell)51：319，1987；Weissenbach等人，自 然(Nature)359：794)。利用这些DNA多态性有利于广泛构架连锁图的 构建，并且提供了一种通过连锁定位疾病基因的实用方法。除了单碱基 突变外，串联重复序列的长度变化在基因组中也是常见的，至少有上万 个散布的多态位点(称为基因座)。主要存在两组串联重复序列多态性： 小卫星/可变数量的串联重复序列(VNTR)，其具有数十个碱基对的典型 重复序列长度及数十到数千个总重复序列单位，以及微卫星，其具有最 高可达6bp的重复序列长度及约70bp的最大总长度。证明微卫星二核苷 酸重复序列在人类基因的鉴定中是非常有力的工具，是高度多态的 (Weber，1990，《基因组分析》(Genomic Analysis)1：159-181，冷泉 港实验室出版社，冷泉港，NY；Weber和Wong，人类分子遗传学(Hum. Mol.Genetics)2：1123，1993)，并可具有高达24个等位基因。为了进行 全基因组扫描用于连锁分析已经报导了允许高水平倍增的染色体特异的 标记(Davies等人，自然，371：130，1994)。
利用与二核苷酸重复序列周围的独特区互补的引物能扩增该重复序 列。扩增后，在捕获于阵列上之前能合并(倍增)几种扩增的基因座。
基因分型或DNA指纹法包括特定样品的一组DNA片段的展示。多 种DNA指纹法在当前是可利用的(Jeffreys等人，自然，314：67-73，1985； Zabeau和Vos，欧洲专利申请92402629.7；Vos等人，核酸研究 23：4407-4414，1996；Bates等人，于《植物分子遗传学的影响》(The Impact of Plant Molecular Genetics)第14章，239-255页，B.W.S.Sobral编， Birkhauser Publishing)。DNA指纹法包括特定DNA样品的一组DNA 片段的展示。多种DNA指纹法在当前是可利用的(Jeffries等人，自然， 314：67，1985；Welsh和McClelland，核酸研究19：861，1991)，其中 大多数利用扩增(例如PCR)产生片段。DNA指纹法产生不同片段长度 的“指纹”模式，其对于一种个体生物而言是特有的和可再现的。这些 指纹能用来辨别甚至非常密切相关的生物，包括近纯合系。片段长度或 序列的差异能被追溯到限制位点或引物延伸位点的碱基改变，或DNA片 段内的插入或缺失。
应用何种指纹技术的选择取决于用途(例如，DNA分型、DNA标 记作图)和待研究的生物(例如，原核生物、植物、动物、人)。已发展 了许多满足这些需要的指纹法，包括随机扩增多态DNA(RAPD)、DNA 扩增指纹法(DAF)和任意引物PCR(AP-PCR)。这些方法全都基于通 过任意选择的PCR引物对随机基因组DNA片段的扩增，这些引物使在 预先不了解序列的情况下能从任何DNA产生DNA片段模式。产生的模 式取决于扩增引物的序列和模板DNA的性质。用低退火温度使引物与 DNA上的多个基因座退火，当引物结合位点充分靠近在一起时这些基因 座扩增。原则上，单个引物足以产生带型模式。
已经描述了用于DNA指纹分析的另一种技术，称为AFLP(Vos等 人，核酸研究23：4407，1995)。AFLP技术基于通过扩增对基因组限制 片段的检测，并能用于任何来源或复杂度的DNA。简言之，该技术基于 限制片段从基因组DNA总消化物中的选择性扩增。该技术包括三个步 骤：1)DNA片段的限制性酶切及随后寡核苷酸接合体的连接，2)几组 限制片段的选择性扩增，3)扩增片段的分析。利用接合体和限制位点序 列作为引物退火的靶位点，能实现限制片段的扩增。应用延伸到限制片 段内的引物实现选择性扩增，只扩增其中引物延伸与位于限制位点侧翼 的核苷酸匹配的那些片段。因此该方法产生几组可通过多种方法(例如， PAGE、HPLC或其它类型的光谱测定法)显示的限制片段，而不需要预 先对核苷酸序列的了解。该方法也使大量限制片段的共扩增成为可能。 然而片段数量取决于检测系统的分辨力。一般地，能扩增并检测到50-100 个限制片段。
一种鉴定限制性片段长度多态性(RFLP)的扩增方法将分离技术与 特异性PCR引物相结合的标记物的检测相结合。通常，一种引物具有一 种特异性标记物。因此该标记物代表一组引物，并因而代表一种预定的 DNA片段长度。以凝胶中或从凝胶洗脱的标记片段长度的变化检测多态 性。HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳通常具有辨别相差一个重复单位的小 卫星/VNTR等位基因所必需的分辨力。微卫星多态性的分析包括：通过 聚合酶链反应(PCR)对含有一组重复序列的DNA小片段的扩增，随后 是在变性聚丙烯酰胺凝胶上对扩增DNA的电泳，或者随后通过HPLC 对DNA片段的分离。可用连接有标记物的引物标记扩增的DNA。这些 引物通过链延伸掺入到新合成的链中。这些引物与位于重复序列区侧翼 的独特序列互补。
能用标记物顺利实现利用微卫星的基因分型。简言之，构建PCR引 物使之携带标记物，并在仔细选择的PCR反应中用于扩增二、三或四核 苷酸的重复序列。然后通过如HPLC或PAGE的方法根据大小分离扩增 产物。然后以时间方式收集DNA片段，从其各自的DNA片段上切下标 记物，并通过在大小分离步骤中与内部标准对比而推断其长度。参照扩 增产物的大小进行等位基因的鉴定。
通过在基因分型中使用可切割的标记物，在一个分离步骤中结合多 种样品是可能的。有两种能实现这一点的普通方法。第一种用于高流通 量筛选的普通方法是一大群个体中单多态性的检测。在此情况下，使用 单个PCR引物或嵌套的引物组，并且每一反应用一种DNA样品类型进 行每次扩增。在分离步骤中能结合的样品数与每一检测技术能产生的可 切割标记物的数量(即，对于质谱仪标记物为400-600)成正比。因此在 一大群个体中同时鉴定几种多态性是可能的。第二种方法是应用能对单 一DNA样品鉴定大量多态性(例如对一种个体进行基因分型)的多组引 物。在该方法中，在单次扩增反应中结合这些引物，产生不同序列的扩 增产物。每一引物对或嵌套引物组由一种特异的可切割标记物所编码， 产生由特异标记物编码的每种扩增片段。对该反应进行单次分离步骤。 在分离步骤中能结合的样品数与每种检测技术能产生的可切割标记物的 数量(即，对于质谱仪标记物为400-600)成正比。 B.突变检测
疾病检测在预防和治疗中越来越重要。尽管多因子病难以设计遗传 试验，但超过200种的已知人类疾病是由单基因缺陷，常常是单氨基酸 残基的改变引起的(Olsen，《生物工程：一种成熟的工业》(Biotechnology： An Industry comes of age)，国家科学院出版社，1986)。许多这类突变 产生一种能引起病状的改变的氨基酸。
敏感突变检测技术为突变筛选提供了超常的可能性。例如，甚至可 在受精卵着床之前进行分析(Holding和Monk，柳叶刀(Lancet)3：532， 1989)。在健康检查方面，越来越有效的遗传试验也能够筛选从呼吸道或 膀胱上剥落的细胞中的致癌突变(Sidransky等人，科学252：706，1991)。 同样，当一种未知基因引起一种遗传病时，检测DNA序列变体的方法对 于通过遗传连锁分析研究疾病的遗传是有用的。然而，检测与诊断个体 基因中的突变存在技术与经济上的问题。已经研究了几种不同的方法， 但对于真正的大规模应用没有一种是既有效又便宜的。
通过物理、化学或酶学方法能鉴定样品中涉及单核苷酸的突变。一 般而言，突变检测方法可分为适于鉴定预先未知的突变的扫描技术，以 及用来检测、辨别或定量已知序列变体的技术。根据对来源于野生型和 突变体序列的错配互补DNA链的异源双链体显示异常的迁移行为的观 察，已经发展了几种用于突变检测的扫描技术。
检测DNA链突变的一种策略是用一种修饰的或标记的核苷酸(在合 成过程中)替换一种正常核苷酸，或改变产物的分子量或其它物理参数。 相对于野生型序列具有增加或降低数量的这种修饰核苷酸的链显示迁移 率的改变(Naylor等人，柳叶刀337：635，1991)。也能根据迁移率将经 扩增产生的含有内部错配的异源双链DNA分子与正确配对的分子分离 (Orita，基因组5：874，1989；Keen，遗传学趋势(Trends Genet.)7：5， 1991)，表明DNA的有限片段中突变的存在。
通过对短寡核苷酸探针与靶序列杂交的去稳定作用也能鉴定突变(见 Wetmur，生物化学与分子生物学评综(Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.) 26：227，1991)。通常，等位基因特异的寡核苷酸杂交这一技术包括靶序 列的扩增及随后与短寡核苷酸探针的杂交。因此通过确定与固定寡核苷 酸探针阵列的杂交模式，能对多种可能的序列变体筛选一种扩增产物。 另一种方法利用在3’次末端位点与靶序列错配的寡核苷酸引物，显示降 低作为PCR引物的能力下降这一性质。另外的错配可在从3’末端起的第 三个位点掺入引物中。这在可与一种等位变体杂交的引物的三种3’核苷 酸中产生两个错配位点，并在与其它等位变体杂交时在从3’末端起的第 三个位点产生一个错配(Newton等人，核酸研究17：2503，1989)。选 择明显有利于1bp错配扩增的扩增条件。 C.表达分布图/差示展示
哺乳动物如人在其基因组中具有大约100,000个不同的基因，其中 只有一小部分，或许15％，在任一单个细胞中表达。正常细胞生长与分 化的过程以及疾病如癌症中发生的病理改变都是由基因表达的改变所引 起的。差示展示技术使鉴定对于个体细胞型特异的基因成为可能。
如在此所公开的，提供了一种测定大量基因(1-2000)表达的高流 通量方法。在本发明的一个方面，提供了分析选择的生物样品中基因表 达模式的方法，其包括下列步骤：(a)利用一种或多种标记的引物从生 物样品中扩增cDNA，其中该标记物与一种特定的核酸探针关联，并可通 过非荧光光谱测定法或电位滴定法检测，(b)分离扩增的片段，(c)从 标记片段上切下标记物，以及(d)通过非荧光光谱测定法或电位滴定法 检测该标记物，从而确定生物样品基因表达的模式。
简言之，在差示展示中，扩增mRNA的3’端部分并根据大小鉴定。 应用设计用来结合聚腺苷酸尾的5’边界的引物进行反转录，随后利用上 游任意序列引物对cDNA扩增，获得mRNA亚群。大小分离方法(PAGE、 HPLC，等等)能够对两种目标生物样品之间mRNA长度或数量直接并 列比较。差示展示法具有利用多种引物组合显示哺乳动物细胞中所有表 达基因(大约10,000-15,000个mRNA种类)的潜力。
在固体底物上基于标记物的差示展示使差异表达的基因的表征成为 可能。这基于如下原理：通过利用反转录和PCR从mRNA亚型中扩增 部分cDNA序列，能在凝胶上直接比较在两种或多种细胞型或目标样品 中表达的大多数mRNA。简言之，三种单碱基锚定寡脱氧胸苷酸引物与 一系列任意13个碱基的寡核苷酸一起使用，从细胞或目标样品中反转录 并扩增mRNA。为了检测15000个基因的表达，优选地至少使用9种不 同的任意引物。对于两种细胞群体或两种目标样品的完全差示展示分析， 至少需要400次扩增反应。利用对两种细胞型的基于标记物的差示展示 分析，能轻易并快速地进行至少1500次扩增反应。 D.单核苷酸延伸测定
引物延伸技术可用于对核酸模板中单核苷酸的检测(Sokolov，核酸 研究18：3671，1989)。如最初所述，在标记的单核苷酸的存在下延伸与 囊性纤维化基因已知序列互补的30个碱基的寡核苷酸和20个碱基的寡 核苷酸。该方法具有正确鉴定该基因内单核苷酸改变的能力。该技术普 遍适用于对任何单碱基突变的检测(Kuppuswamy等人，美国国家科学 院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：1143-1147，1991)。
简言之，该方法基于可与邻近已知单核苷酸多态性的靶分子中序列 杂交的一种引物。在本发明的范围内，靶分子优选地共价连接于固体底 物上。如果模板中的下一个碱基与反应混合物中的标记核苷酸互补，则 如此处理引物DNA，即DNA聚合酶加入标记的dNTP或ddNTP。洗掉 游离的标记dNTP或ddNTP，检测延伸的产物。
在该技术的改进中，cDNA作为模板用于一种目标序列的扩增，该 序列具有两种等位基因之间的单碱基差异。然后将扩增产物转印于阵列 上。通过使多态性5’侧1个碱基的引物退火，并延伸一个标记的碱基(一 般为双脱氧核苷酸)，就每种等位基因的存在、不存在或相对量而分析每 种扩增产物。只有当正确碱基在反应中可得时，才在引物的3’末端发生 掺入。然后如上分析延伸产物。
在本发明中，用独特的标记物标记每种(双)脱氧核苷酸。在四种 反应混合物中，只有一种向引物序列中添加双脱氧终止子。如果存在突 变，将通过双脱氧核苷酸上的独特标记物检测该突变并确定其身份。通 过用一种独特标记物标记DNA引物，也能同时确定多个突变。因此，DNA 片段在四种分开的反应中反应，每一反应中包含一种不同的标记(双) 脱氧终止子，其中该标记物与特定的双脱氧核苷酸关联，并能用非荧光 光谱测定法或电位滴定法检测。通过例如凝胶电泳(例如，聚丙烯酰胺 凝胶电泳)或优选地HPLC根据大小分离该DNA片段，或者原位检测。 从该片段上切下标记物，并通过相应的检测技术(例如，质谱分析法、 红外光谱法、恒压电流分析法或紫外/可见分光光度法)检测。能使检测 的标记物与待研究的特定DNA片段以及突变体核苷酸的身份相关联。 E.寡核苷酸连接测定
如Landegren等人(Landegren等人，科学241：487，1988)最初 描述的寡核苷酸连接测定(OLA)用于超大型及复杂基因组中已知序列 的鉴定。OLA的原理基于当两种诊断寡核苷酸在特定DNA靶上彼此相 邻地杂交时，连接酶共价连接它们的能力。如果探针接点处的序列未完 全正确地碱基配对，则探针将不能被连接酶连接。当定位于“上游”探 针的3’末端时，热稳定连接酶辨别潜在单碱基对差异的能力提供了单碱 基对分辨的可能(Barony，美国国家科学院院报88：189，1991)。当使 用标记物时，它们连接于探针上，探针与扩增产物相连接。OLA完成后， 通过在解链未连接的寡核苷酸而不解链连接的寡核苷酸的温度下温育， 去除未连接的寡核苷酸。此外，也可根据大小分离片段。切下标记物并 通过质谱分析法检测。
在另一种实施方案中，寡核苷酸连接测定使用两种相邻的寡核苷酸： 一种“报道”探针(在5’末端标记)和一种5’-磷酸化/3’标记的“锚定” 探针。这两种已掺入不同标记物的寡核苷酸与靶DNA退火，如果具有完 全的互补性，则这两种探针被T4 DNA连接酶连接。在一种实施方案中， 3’标记物是生物素，固定的链霉亲和素上生物素化锚定探针的捕获以及对 共价连接的报道探针的分析用来检验靶序列的存在或不存在。
在本发明的一种实施方案中，提供了利用寡核苷酸连接测定技术确 定核酸分子身份或检测例如生物样品中一种选定的核酸分子的方法。简 言之，这些方法一般包括下列步骤：对靶DNA进行扩增，随后与5’标记 的报道DNA探针和5’磷酸化/非生物素化探针杂交。该样品与T4 DNA 连接酶一起温育。优选地通过例如LC或HPLC，能将含连接的探针的 DNA链与含未连接的探针的DNA分离。从分离的片段上切下标记物， 然后通过相应的检测技术(例如，质谱分析法、红外分光光度法、恒压 电流分析法或紫外/可见分光光度法)检测这些标记物。
在本发明中，可同时分析多个样品和多个突变。简言之，该方法包 括扩增含有目标突变的基因片段。扩增产物然后与一种通用的和两种等 位基因特异的寡核苷酸探针(一种含有突变而另一种不含)杂交，使得 等位基因特异性探针的3’末端与通用探针的5’末端直接相邻。这在每一 基因座处在两种等位基因探针和通用探针之间建立了一种竞争性杂交-连 接过程。用四种荧光团之一标记通用探针，并用提供大小差异的一种或 多种标记物标记每种等位基因特异性探针。然后根据修饰尾的长度分离 样品，并用通用探针上的荧光标记物检测。利用等位基因特异性探针的 大小差异和可用于通用探针的四种荧光团，能分析多种样品。
在本发明的一种实施方案中，提供了利用同时检测多种样品的寡核 苷酸连接测定技术确定核酸分子的身份或检测例如生物样品中一种选定 的核酸分子的方法。简言之，这些方法一般包括下列步骤：扩增靶DNA， 随后与通用探针(未标记)和两种根据本发明说明书标记的等位基因特 异性探针杂交。该样品与T4 DNA连接酶一起温育，并优选地通过例如 LC或HPLC分离片段。从分离的片段上切下标记物，然后通过相应的 检测技术(例如，质谱分析法、红外分光光度法、恒压电流分析法或紫 外/可见分光光度法)检测这些标记物。 F.其它测定
在此所述的方法也可用于病毒或微生物的基因分型或鉴定。例如，F+ RNA大肠杆菌噬菌体可作为肠道病毒污染指示物的候选者。通过核酸扩 增和杂交方法的基因分型是血清分型的可靠、快速、简单且便宜的备择 方法(Kafatos等人，核酸研究7：1541，1979)。扩增技术和核酸杂交技 术已成功地用于多种微生物分类，包括大肠杆菌(Feng，分子细胞探针 (Mol.Cell Probes)7：151，1993)、轮状病毒(Sethabutr等人，医学病 毒学杂志(J.Med.Virol.)37：192，1992)、丙型肝炎病毒(Stuyver等 人，遗传病毒学杂志(J.Gen.Virol.)74：1093，1993)和单纯疱疹病毒 (Matsumoto等人，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)40：119，1992)。
已经描述了多种实验哺乳动物和人瘤中的遗传改变，这些改变代表 在癌发生中观察到的形态变异序列的形态学基础(Vogelstein等人，NEJM 319：525，1988)。近年来，随着分子生物学技术的出现，已观察到某些染 色体上的等位基因丢失或肿瘤抑制基因的突变以及几种癌基因(例如，c- myc、c-jun和ras家族)中的突变。例如，已经确定了K-ras癌基因中 点突变的特定类型与结肠癌诊断阶段之间的相关性(Finkelstein等人， 外科学档案(Arch Surg.)128：526，1993)。因此，突变分析能提供肿瘤 攻击性的重要信息，包括转移的方式与扩散。实际上，已经证明了三期 结肠癌中TP53和K-ras-2突变分析的预测值(Pricolo等人，美国外科 学杂志(Am.J.Surg.)171：41，1996)。因此显然，肿瘤和癌变前细胞的 基因分型以及特定的突变检测在人类癌症的治疗中将变得越来越重要。
提供下列实施例作为说明而不是作为限制。
                           实施例
            实施例1  商品化弹性探针的排列尖端的制备
本实施例描述弹性探针尖端的制造和改进，其用于在阵列中沉积样 品。
XP54P弹性探针购自Osby-Barton(Everett Charles的一个公司 (Pomona，CA))。将探针“尖端向下”地置于一种极细的钻石磨石上， 并用轻度的压力使其沿该磨石横移约0.5cm。通过显微镜观察，从尖端去 除约0.005英寸(0.001-0.01英寸)的金属。通过用皮带摩擦然后用水冲 洗来磨光尖端。将尖端干燥贮存或在-20℃下贮存于50％甘油中。为了用 于阵列的制备，将尖端以阵列的方式安装于头部。头部固定于具有可控 制的z轴运动的机器人臂上。
              实施例2  载玻片上小球体阵列的制备
易于检测的小球体在载玻片上的沉积证明了阵列形成的重复性。在 该方法中，制备一种含有56％甘油、0.01M Tris pH7.2、5mM EDTA、0.01％ 肌氨酰和1％ v/v Fluoresbrite Plain 0.5μM小球体(2.5％固体-乳胶) (Polysciences，Warrington，PA)的溶液。将排列的针浸没于该溶液中 5mm持续5秒种。然后将小球体重复排列于载玻片上。在使用荧光滤片 的荧光下拍摄载玻片的显微照片。图1表明在阵列的每一区域中沉积的 溶液量非常一致。而且，每次挑取能制备至少100个实际上相同的沉积 物。
             实施例3  利用改性亲水性弹性探针对阵列的制备
当使用一种具有亲水性表面的液体转移装置时，尤其当该装置是一 种改性弹性探针时，样品挑取、转移和微滴沉积大大增强。通过应用用 于改进探针表面的化学试剂或通过用一种亲水性物质包被探针，而使弹 性探针亲水。在一种优选的方法中，使弹性探针的尖端浸于25-200mM 1，4- 二硫苏糖醇、0.1M硼酸钠溶液中15分钟到2小时。二硫苏糖醇通过巯 基-金配位与金表面反应，基本上羟化该表面，使其亲水。
排列溶液由56％的甘油和44％的用蓝色食品色素染色的水组成。将 排列的尖端浸没于排列溶液中5mm持续2秒种。然后用机器人控制的带 有甘油的尖端向硅片上12×6方格中印下72个微斑点。产生的斑点直径 约为100-150微米，斑点间的中心距为200微米。图2显示产生的方格的 CCD摄影图像。斑点直径的标准差约为15％。
           实施例4  排列的寡核苷酸的比色法检测
模板寡核苷酸(75μl，0.5μg/μl)(5’-己胺GTCATACTCCT- GCTTGCTGATCCACATCTG-3’)与5μl 20mg/ml氰尿酰氯在20μl 1M 硼酸钠中室温反应30分钟。通过该反应制备一种排列溶液，它由56％甘 油、56ng/μl寡核苷酸、0.06mM硼酸钠和0.3mg/ml氰尿酰氯组成。将排 列尖端浸没于该排列溶液中5mm持续2秒种。然后用机器人控制的带有 该溶液的尖端向聚乙烯亚胺(PEI)包被的硅片上12×6方格中印下72个 微斑点。产生的斑点直径约为100-150微米，斑点间的中心距为200微米。 排列后，硅片上未反应的PEI位点用100％正甲基吡咯烷酮 (pyrrolinidone)中的100mg/ml琥珀酸酐封闭15分钟，随后用水洗三 次。未反应的氰尿酰氯位点用0.01M Tris中的0.1M甘氨酸封闭15分钟， 并用Tens缓冲液(0.1M NaCl、0.1％ SDS、0.01M Tris、5mM EDTA) 洗4次。然后使模板寡聚体与生物素化的互补物(5’-生物素- TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)在37℃下杂交20分钟，随 后6×Tens和2×OHS(0.06M Tris、2mM EDTA、5×Denhardt溶液、 6×SSC[3M NaCl、0.3M柠檬酸钠，pH7.0]、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、 0.005％ NP-40)洗涤。然后将硅片浸于0.5μg/ml碱性磷酸酶偶联的链霉 亲和素中15分钟，随后2×Tens、4×TWS(0.1M NaCl、0.1％吐温20、 0.05M Tris)洗涤。然后用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame， California)(按照试剂盒规程)使微斑点显色，并用CCD照相机和显微 镜成像。图3显示生成的图像。经NIH图像(国家卫生研究所，Bethesda， MD)确定，产生的微斑点具有约15％的直径变异，密度值变化约10％。
        实施例5  单阵列元件中的多个寡聚体
两种0.5μg/μl的模板寡聚体(#1：5’-己胺- TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’、#2：5’-己胺- ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)分别 与5μl 20mg/ml氰尿酰氯和20μl 1M硼酸钠在100μl的总反应体积中室温 反应30分钟。通过这两种反应，排列溶液由56％甘油和稀释的两种反应 寡聚体的组合所组成(见下表)。将8种排列尖端浸于8种排列溶液的每 一种中5mm持续2秒种。用机器人控制的带有该溶液的尖端，向聚乙 烯亚胺(PEI)包被的硅片上印下每个含有72个微斑点的两组8个12×6 方格。每一方格代表一种排列溶液。产生的斑点直径约为100-150微米， 斑点间的中心距为200微米。
排列后，硅片上未反应的PEI位点用100％正甲基吡咯烷酮中的 100mg/ml琥珀酸酐封闭15分钟，并用水洗3次。未反应的氰尿酰氯位 点用0.01M Tris中的0.1M甘氨酸封闭15分钟，并用4×Tens(0.1M NaCl、 0.1％ SDS、0.01M Tris、5mM EDTA)洗涤。然后进行两种杂交。在第 一种杂交中，一组8种排列的寡聚体组合与互补于oligo#1的寡核苷酸5’- 生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’杂交。在第二种杂交 中，另一组8种排列的寡聚体组合与互补于oligo#2的寡核苷酸(5’-生物 素-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCGCGCCTGATCAGTAGT) 杂交。在Hybriwell密封盖(研究产品国际公司，Mount Prospect，Illinois) 下同时进行这两种杂交，37℃ 20分钟，随后用6×Tens、2×OHS(0.06M Tris、2mM EDTA、5×Denhardt溶液、6×SSC(3M NaCl、0.3M柠檬 酸钠，pH7.0)、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％ NP-40)洗涤。杂交 后，将硅片浸于0.5μg/ml辣根过氧化物酶链霉亲和素中15分钟，随后用 2×Tens、4×TWS(0.1M NaCl、0.1％吐温20、0.05M Tris)洗涤。然后 用0.4mg/ml 4-甲氧基1-萘酚(0.02％过氧化氢、12％甲醇、PBS)使微 斑点显色，最后用3×水洗。
与寡聚体#1的互补物杂交的一组混合寡聚体，对于含有最高浓度寡 聚体#1的方格显示最高的色强度，含有最低浓度寡聚体#1的方格显示最 低的色强度。然而，与寡聚体#2的互补物杂交的一组混合寡聚体，对于 含有最高浓度寡聚体#2的方格显示最高的色强度，含有最低浓度寡聚体#2 的方格显示最低的色强度(见图4)。  排列溶液 排列溶液中Oligo#1   的浓度(ng/μl) 排列溶液中Oligo#2   的浓度(ng/μl)     1     2     3     4     5     6     7     8        56        28        14        7        3.5        1.8        0.88        0.44        0.44        0.88        1.8        3.5        7        14        28        56
从前述中应当理解，尽管为了说明已经在此描述了本发明的特定实 施方案，但在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行多种修改。 因此，除了附加的权利要求书之外并不限制本发明。