在分子生物学和微生物学领域中，长期以来经常需要制备重复排列的 生物试剂以利于平行测试多个样品。例如，长期以来使用无菌丝绒布和 活塞环在各含有不同培养基的多个平板上复制细菌和酵母菌落的琼脂平 板作为快速筛选大量独立菌落的不同生长表型的方法(Lederberg和 Lederberg，细菌学杂志63：399，1952)。同样，96孔微量滴定板已长期 用于以有组织并且容易应用的方式保存大量细胞系和代表重组DNA文库 的病毒分离物或单克隆抗体细胞系。
对装有克隆群的96孔微量滴定板的实验性筛选通常通过使用硬金属或 塑料96针装置来完成，这种装置设计成每根针相对于其它针互相间隔开 使其准确地与微量滴定板吻合。根据手边的任务，将96针装置小心地降 低到营养琼脂板的表面(如果目的是重复培养生物样品)、到另一微量滴 定板中(为培养或稀释这些样品)、到尼龙膜上(用于通过DNA或RNA杂 交的分子筛选以鉴定特定重组克隆)或被转移以用于任何适于96孔微量 滴定板形式的其它筛选或方法。
当用一个浸入排列于主微量滴定板中的样品的针进行多次印迹时，在 每次连续印迹过程中保存的样品量下降。控制将溶液吸到印迹针上的能 力以及将溶液转移到印迹表面的能力对于获得达到基因组、分子生物学 和分子诊断学领域微阵列制备技术要求的等分装置是至关重要的。
开发成功的印迹方法的重要因素是控制针头接触待印迹表面时的移动 力和速度的能力。正如Drmanac和Drmanac(生物技术17：328，335，1994) 所观察到的，用常规平圆柱体针的两个问题是液滴可能粘附在针的侧面 从而导致不规则的印迹，并且当印迹针头从印迹表面太快取出时液滴可 能溅射。太大的力可能导致对印迹表面的重大损伤从而对印迹阵列的应 用产生负面影响。太小的力也可能是不行的，因为可能转移不同量的样 品或者印迹总体上可能有缺陷。例如，当将细菌或病毒样品印迹到营养 琼脂板表面上时，太大的压力导致琼脂表面的破坏，而太小的力可能导 致样品极少或没有样品转移。此外，许多核酸杂交膜表面是脆性的并且 容易在样品印迹过程中被太大的针头力损坏。
大规模基因组计划的出现和分子诊断逐渐增加的医学应用促进了大量 处理方法的开发以筛选代表完整基因组的重组DNA文库、进行大规模DNA 测序计划以及进行重复性免疫学分析、核酸杂交分析或聚合酶链式反应 分析。只是作为例证的以下公开文献(以及本文引用的参考文献)提供 依赖生物分子阵列的大量处理方法及制备这些排列的方法的总体和具体 综述：Eggers，M.D.等，DNA测序技术进展卷SPIE 1891：113-126，1993； Chetverin，A.B.等，生物/技术12：1093-1099，1994；Southern，E.M. 核酸研究22：1368-1373，1994；Lipshutz，R.J.等，生物技术19：442- 447，1995；Schena，M.BioEssays 18：427-431，1996；Blanchard，A.P. 等，生物传感器及生物电学11：687-690，1996；O’Donnell-Maloney，M.J. 等，遗传分析：生物分子工程13：151-157，1996；Regalado，A.Start- Up 24-30，1996年10月和Stipp，D.财富30-41页，1997年3月31日。
对大处理量方法学的需求在某些情况下已导致96孔微量滴定板形式向 384孔(Maier等，生物技术杂志35：191，1994)或864孔(Drmanac等， 电泳13：120，1992)形式的变化，这些形式也可与自动装置结合使用(参 见例如Belgrader等，生物技术19：426，1995；Wilke等，诊断微生物 学及传染病21：181，1995)。然而，所有这些自动化技术需要使用能可 重复地从一种阵列形式(即96孔微量滴定板)向另一种阵列形式(杂交 滤膜上的96点阵列)转移等体积液体的自动针附件装置。
最近，已经开发出合成大批与玻璃表面结合的代表所有或部分可能核 苷酸序列的短寡聚核苷酸(ODN)的方法(Maskos和Southern，核酸研究. 20：1675，1992)。一旦这样的ODN阵列得到制备，就可用于通过杂交进 行DNA测序(Southern等，基因组13：1008，1992；Drmanac等，科学260： 1649，1993)。如果存在转移和排列准确量的、合成与可杂交表面结合的 大量ODN所需的生化试剂的更好方法，那么这种DNA测序方法的效用将 得到大大改善。这将确保阵列内每个位置更加相同的ODN产量并且也增 加可能合成的寡核苷酸链长度。
已发现聚合酶链式反应(PCR)在许多不同生物学问题上的广泛应用。 PCR商业利用的2个主要限制因素是试剂的高成本和不能自动完成操作。 如果可以降低每反应的总体积，使DNA聚合酶和核苷酸也同时减少，就 可降低试剂成本。用自动控制的针附件排列小量试剂的准确可靠方法可 有助于解决这两个PCR问题。
如上所述，移液装置已在微生物学和分子生物学领域中使用了一段时 间。已经使用的这类装置大致可分为2个类别。由正/负压驱动的压力装 置(例如泵和自动移液器)，其通过移液头将固定的等分液体样品移到固 体表面或微量滴定板加样孔中。已经建立对应于标准96孔微量滴定板形 式的移液器阵列(Reek等，生物技术19：282，1995)。这些装置在5μl 及以上体积范围最准确，但是一般不太适于更小体积的任务。
固体表面针式装置依赖于针表面积和调节液体表面张力的因素而转移 液体，并且由于其简便性和转移小量液体的能力而得到广泛应用。数年 来已在自动装置中使用这些固定针式装置以印迹核酸微点阵列的多个拷 贝，然后将其用于杂交反应以测定基因表达。
研究人员已修饰了传统的固定微阵列印迹头，使它含有微管道，微管 道通过毛细作用发挥功能从而收集和容纳用于随后印迹到玻璃表面上的 液体(Schena等，科学270：467，1995；Schena，BioEssays 18：427， 1996；Shalon等，基因组研究.6：639，1996)。这样的印迹头已通过自 动系统用于将PCR扩增的cDNA插入片段印迹到微阵列中。使用此系统进 行小体积(每微点2μl)杂交反应以借助同时发生的双色荧光杂交测定45 个基因的差异表达(Schena等，科学270：467，1995)。
在本领域需要高效、价格合理的方法以将寡核苷酸和其它生物分子排 列到平坦的固体支持物上。本发明提供在此详细公开的这些及相关的优 点。
发明概述
在一方面，本发明提供一种弹性探头，包括包住压缩弹簧的管状套壳， 所述弹簧与活塞机械连接，所述活塞具有伸出所述套壳的第一个区域， 所述第一个区域包括以平坦表面终止的锥形端部，所述表面与所述套壳 的纵轴垂直，所述锥形端部在其剖面具有与上述表面相邻接的外侧边， 如果上述外侧边越过上述表面延伸，则相交于距上述表面约0.001-0.005 英寸处的点。
在另一方面，本发明提供一种组合物，包含基于组合物总体积约35 体积％至80体积％浓度的增稠剂、0.001μg/mL到10μg/mL浓度的寡核苷 酸以及水。
在另一方面，本发明提供一种将生物分子点样到固体支持物上的方法。 此方法包括以下步骤：
将弹性探头端部浸入生物分子溶液中；
将所述端部从所述溶液中移出以使生物分子溶液附着在所述端部上； 并且
使所述生物分子溶液与固体支持物接触从而将生物分子溶液从所述端 部转移到所述固体支持物上。
用于点样的弹性探头包括上述包住压缩弹簧的管状套壳。
在另一方面，本发明提供一种排列生物分子的方法。此方法包括以下 步骤：
将弹性探头端部浸入生物分子溶液中；
将所述端部从所述溶液中移出以使生物分子溶液附着在所述端部上； 并且
使所述生物分子溶液与固体支持物接触从而将生物分子溶液从所述端 部转移到所述固体支持物上。
重复接触步骤多次以使生物分子以阵列形式排列于固体支持物上。而 且，带有管状套壳的弹性探头如上所述。
参照附图和下面详细的描述，本发明的其它方面将变得显而易见。
附图描述
图1A是根据本发明实施方案所述的阵列的俯视平面示意图。
图1B是图1A的阵列的剖面示意图。
图2A是用于制备本发明阵列的移液装置的等轴视图。
图2B是根据本发明所述的移液头的实施方案的放大正面立视图。
图3是带有锥形设计的另一种移液头的正面立视图。
图4A是根据本发明另一实施方案所述的带有凹槽、锥形设计的移液头 的另一实施方案的正面立视图。
图4B是图4A的移液头的仰视平面图。
图5表示根据本发明制备并用Vector Blue(Vector Laboratories， Burlingame，California)显色且用CCD相机和显微镜拍摄的微点阵列。
图6表示同时存在于单一阵列单元中的两种不同寡核苷酸如何根据本 发明得到鉴定和部分定量测定。
图7表示用本发明方法学由机器人制备的阵列的CCD相机图像，其中 点区域直径约100-150微米，相邻点与点之间中心到中心的间距为200 微米。直径的标准偏差是约15％。
图8是用荧光滤镜在荧光下摄制的显微照片，显示从分析溶液转移的 非媒介物成分(在此情况下是荧光微球体)的可重复点样(通过肉眼观 察测定)。
发明详述
本发明提供一种使用特殊设计的移液装置和/或特殊制备的生物分子溶 液和/或特殊涂敷的固体支持物将生物分子以高度可控制方式点样到固体 支持物上的方法。更具体地，本发明提供了一种将生物分子点样到固体 支持物上的方法，其中方法包括以下步骤：
将弹性探头端部浸入生物分子溶液中；
将所述端部从所述溶液中移出以使生物分子溶液附着在所述端部上； 并且
使所述生物分子溶液与固体支持物接触从而将生物分子溶液从所述端 部转移到所述固体支持物上。
自从在印刷电路板工业发展的初期被引进以来，弹性探头已变得众所 周知。它们是设计用于在装配功能电路板时满足准确可靠构建和测试各 种电子元件及其连接要求的机械装置。弹性探头基本上是电子机械装置， 由包住压缩弹簧、球体和活塞的管状套壳组成。有些探针是特殊设计以 携带电流，而其它一些用于钻孔、弯曲和将元件固定到电路板上，还有 一些设计用于进行焊接。设计或销售弹性探头方面，还没证明它们作为 用于将溶液转移和排列到固体支持物上以在微生物学、生物化学或分子 生物学领域使用的机械装置的潜在用途。 改进的弹性探头
弹性探头可从数家供应商得到，包括Evertt Charles(Pomona CA)， Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)和Test Connections Inc.，(Upland，CA)。
图2A是表示用于选择性地将分离的、可控量生物分子溶液转移到阵列 10的PEI层30上的优选装置和方法的等轴视图。在一种实施方案中，装 置带有与致动器60可操作连接的弹性探头50和与弹性探头50相反端连 接的移液头70。弹性探头50一般包括包住偏置部件54的套壳52和活塞 56，活塞有与偏置部件54相邻接的第一端57和从套壳52中伸出的第二 端58。套壳52可以是管状筒而偏置部件54可以是将活塞56的第二端58 从套壳52推出的压缩弹簧。活塞56的第一端57因此带有与从套壳52 向内放射状伸出的止动物59咬合的凸肩57a从而限制活塞56相对于套 壳52的最大延伸量。适当的弹性探头50可从Evertt Charles(Pomona， California)，Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)、Test Connections，Inc.，(Upland，California)以及其它制造商得到。
致动器60优选地沿着与阵列10垂直的轴线(箭头V所示)并在与PEI 层30表面平行的平面(箭头P所示)移动弹性探头50。因此，致动器60 控制弹性探头50从而将移液头70浸入含有生物分子流体90的容器80 中，将弹性探头50定位到PEI层30的所需位点上，并且将移液头70压 至PEI层30的所需位点上。在另一实施方案中，致动器60可能仅仅与 至阵列10垂直地移动弹性探头50，而另一致动器(未显示)移动阵列10 和容器80以将移液头70定位至容器80或PEI层30的所需位点。致动 器60优选地是自动将生物分子溶液移至PEI层30上的机器人或其它计 算机控制的操作装置。此外，可将多个弹性探头50与一个致动器连接以 同时将多个生物分子物质移至PEI层30上。
移液头70优选地吸取足够量的生物分子流体90至其表面上以将多个 的生物分子物质移至PEI层30上并形成相应的多个点样区域32(图1A 中所示)。图2B是根据本发明一个实施方案所述的移液头70的放大正面 立视图。移液头70优选地具有截短的圆锥形状，带有端面72和多个凹 槽或沟道74。端面72可以是从假想的交点73凹进的平面，凹进的距离 “R”约在0.00001英寸和0.010英寸之间。并且更优选地约在0.001英 寸和0.005英寸之间。此外，凹槽74具有以约15°到120°、并且更优选 地以约60°到90°的角α向端面72聚集的翼或脊76。
弹性探头50、致动器60和移液头70一起运行从而在每次致动器60 将移液头70压至PEI层30上时，将可控量的生物分子流体移至PEI层30 上。致动器60开始将移液头70浸入生物分子流体90的容器80中以通 过毛细作用汲取和容纳较大体积的生物分子流体92(图2B)到移液头70 上。然后致动器60将弹性探头50定位至PEI层30上。在容器80中取 出移液头70后，一部分移液头70上的生物分子流体92在移液头的端面 72形成悬挂物94。然后致动器将移液头70压至PEI层上以从移液头70 上的生物分子流体部分形成阵列10的单个分开离的点样区域32(图1A 和1B中所示)。致动器60优选地将移液头70压至PEI层30上以使移液 头70以指定量的压力接触PEI层30。然而，用相同压力将移液头70连 续压至PEI层30上是困难的，因为致动器60不能总是以相同高度定位 移液头70并且PEI层70表面可能不一样平。偏置部件54因此储存把移 液头70压到PEI层30上产生的能量，从而允许弹性探头50在每次移液 时以基本上恒定的压力接触PEI层30而不论致动器60的行程或PEI层30 表面状态的微小不规则性。
因此上述移液系统提供在每次移液头70与PEI层30接触时可移送恒 定点样体积的生物分子流体的装置。应当理解应将精确、恒定体积的生 物分子流体移至每个点样区域的PEI层30上以在PEI层30中维持间隔 区34。点样至点样区域32上的PEI层30中的生物分子流体的量一般凭 经验确定，并且它是移液头70与PEI层30接触的时间、生物分子流体90 的粘度、移液头70的构造以及移液头70与PEI层30之间的压力的函数。 因为偏置部件54在移液头70与PEI层30之间提供了基本上恒定的压力， 所以影响移至PEI层30的生物分子流体量的首要因素是移液头70与PEI 层30之间接触的时间。
图3是根据本发明所述的移液头170的另一个实施方案的正面立视 图。在此实施方案中，移液头170具有无凹槽或翼片的截短的锥形状。 因此，移液头170在其锥形部分的表面容纳生物分子流体。虽然移液头170 可用于将生物分子流体移到PEI层30上，但是一般地使用带凹槽的移液 头是更理想的，因为这样的移液头容纳更多的生物分子流体。
图4A是带有多个凹槽274和翼片276的移液头270的另一实施方案 的正面立视图，图4B是其仰视平面图。移液头270基本上以与上述移液 头70相同的方式操作，并且因此也提供基本上相同的优点。
上述的移液头70、170和270代表一些可用于将生物分子流体点样到 PEI层30上的移液头实例。应当理解可对这些移液头进行多种改进，包 括使用不同形状的端面设计。例如，根据具体应用，这些移液头可以具 有角锥形、圆柱形、立方形或其它适当形状。此外，这些凹槽可以具有 除了本发明附图中所示的构造之外的其它构造。因此，移液头不一定局 限于图2B-4B中说明的那些种类。 生物分子溶液
本发明提供可用于将生物分子点样到平坦表面上的组合物。这些组合 物特别适于用上述改进的弹性探头转移到平坦表面上。当本发明的组合 物与改进的弹性探头一起使用时，在仅一次汲取液体后可重复将多个微 滴(例如10以上并且优选地100个以上微滴)点样到平坦表面上。
本发明提供一种也称为“布列溶液”的组合物，包含基于组合物总体 积约35体积％到约80体积％浓度的增稠剂、生物分子(优选地是0.001μg/mL 到10μg/mL浓度范围的寡核苷酸)和水。令人吃惊地发现在水性寡核苷 酸组合物中含有增稠剂时，增稠剂赋予组合物所需的流变学特性，因此 使组合物能与此处公开的改进的弹性探头一起使用，在仅一次从组合物 池汲取组合物的情况下将多个均匀的微滴移至有PEI涂层的平坦表面上。
对于液体增稠剂如甘油，浓度为35％V/V到80％V/V。组合物中优选的 增稠剂浓度在一定程度上取决于进行排列时的温度。排列温度越低，需 要使用的增稠剂浓度越低。温度和粘度控制的组合使得可以在大多数固 体支持物(例如玻璃、硅片、尼龙6/6、尼龙膜等)上进行排列。
增稠剂的存在还有其它好处，即允许各种其它低浓度物质与生物分子 同时存在。例如，0.001％V/V到1％V/V的去污剂可存在于布列溶液中。这 是有用的，因为PCR缓冲液含有少量的Tween-20或NP-40，并且直接从 PCR排列核酸样品而无须事先纯化扩增子通常是有利的。使用增稠剂允许 在布列溶液中含有盐(例如NaCl，KCl或MgCl2)、缓冲液(例如Tris) 和/或螯合剂(例如EDTA)。使用增稠剂还有其它好处，即允许交联剂和/ 或有机溶剂存在于布列溶液中。正如商业上得到的，交联剂通常溶解于 有机溶剂如DMSO、DMF、NMP、甲醇、乙醇等溶剂中。当使用增稠剂时， 常用的有机溶剂可以0.05％到20％(V/V)的水平用于本发明的布列溶液 中。
一般来说，增稠剂赋予布列溶液增加的粘度。当布列溶液中达到适当 粘度时，点样的第一滴基本上与例如第100滴大小相同。当布列溶液中 使用不适当粘度时，点样的头几滴显著大于后来点样的液滴。所需的粘 度在纯水与纯甘油的粘度之间。
本发明的布列溶液可用于将微滴点样到几乎任何表面上。因为固体支 持物的表面特性对微滴的点样几乎没有影响或没有影响，所以生物样品 可排列到几乎任何类型的有涂层表面或有聚合物涂层的固体支持物上。 例如，一般的水溶液在用亲水性聚合物如聚赖氨酸或聚乙烯亚胺涂敷的 固体支持物上倾向于迅速扩散而这些相同溶液不容易点样在疏水性表面 如硅片上。然而，含有根据本发明所述的增稠剂的布列溶液可用于将均 匀的微滴点样于任何这些基质上。
在排列过程中包括增稠剂如甘油的另一重要好处是质量控制。例如当 将甘油用于本文所述的排列方法时，将一小滴液体点样于固体支持物上。 以此处所述的方法中常用的浓度时，此甘油浓度足以防止微滴的蒸发。 因此，在化学处理阵列之前可检查每个排列针头的每个印迹。观察微滴 的能力实质上增强了对排列过程进行质量控制的能力。这导致排列方法 学价值的重要增加。
生物分子可以是核酸多聚物或其类似物如PNA、硫代磷酸酯和膦酸甲 酯。核酸指核糖核酸和脱氧核糖核酸。生物分子可包括非天然和/或合成 的碱基。生物分子可以是单链或双链核酸多聚物。
优选的生物分子是包括寡核苷酸(多达约100个核苷酸碱基)和多核 苷酸(超过约100个碱基)的核酸多聚物。优选的核酸多聚物由15到50 个核苷酸碱基形成。另一优选的核酸多聚物有50到1,000个核苷酸碱基。 核酸多聚物可以是PCR产物、PCR引物或核酸双链，在此列出几个实施例。 然而，如下文所述，当核酸含有伯胺时，基本上所有核酸类型可与PEI 涂敷的表面共价结合。布列溶液中核酸多聚物的一般浓度为0.001- 10μg/mL、优选地0.01-1μg/mL、更优选地0.05-0.5μg/mL。
优选的核酸多聚物为“胺修饰的”，因为它们经修饰在核酸多聚物的5’ 末端含有伯胺基，优选地在核酸多聚物的伯胺与核酸部分之间有一个或 多个亚甲基。6是亚甲基的优选数目。胺修饰的核酸多聚物是优选的，因 为它们可通过5’-胺基与固体支持物共价连接。可使用5’-己胺修饰的PCR 引物排列PCR产物。可在使用胺烯丙基-dUTP(Sigma，St.Louis，MO)通 过切口移位导入胺之后排列核酸双链。用氨基烯丙基-dUTP通过聚合酶如 末端转移酶或用连接酶通过将含胺的短核酸多聚物连接到核酸上可将胺 导入核酸中。
优选地，在与PEI涂层接触之前活化核酸多聚物。通过使胺功能化的 核酸多聚物与多功能胺-反应性化学物如三氯三嗪(Trichlorotriazine) 混合可方便地实现这一点。当核酸多聚物含有5’-胺基时，5’-胺可与也称 为氰尿酰氯的三氯三嗪反应(Van Ness等，核酸研究.19(2)：3345- 3350，1991)。优选地，将过量的氰尿酰氯加入核酸多聚物溶液中，其中 超过布列溶液中核酸多聚物胺数10-到100-倍摩尔数过量的氰尿酰氯是 优选的。在此方法中，大多数以胺终止的核酸多聚物与一分子三氯三嗪 反应，因此核酸多聚物变成以二氯三嗪终止。
本发明的有利特征是含有生物分子的布列溶液即使含有大量的三氯三 嗪也可点样到PEI涂层上。这提供了优于在进行排列之前需要从布列溶 液去除偶联剂的方法的显著优势。
当核酸多聚物是双链时，本发明优选的实施方案提供两条链或其中一 条链含有末端氨基。双链核酸多聚物可通过一个末端氨基结合到PEI涂 层上，由此固定此双链多聚物。然而，因为两条链中仅有一条链与PEI 涂层共价结合，所以另一链可在变性和洗涤条件下去除。此方法提供根 据本发明实施单链核酸多聚物的排列的一种方便方法。双链核酸多聚物 可例如作为PCR反应产物得到。
优选地，用常用缓冲液如磷酸钠、硼酸钠、碳酸钠或Tris HCl缓冲 布列溶液。布列溶液的优选pH范围是7到9，其中优选的缓冲液是新鲜 制备的pH8.3到pH8.5的硼酸钠溶液。
为了制备一般的布列溶液，将己胺修饰的核酸多聚物以0.1μg/ml置 于0.2M硼酸钠pH8.3中至50μl总体积。然后加入10μl 15mg/mL的氰 尿酰氯溶液，并且让反应于25℃持续搅拌下进行1小时。加入甘油(Gibco Brl，Grand Island，NY)至56％终浓度。 固体支持物
本发明提供一种将生物分子点样固体支持物上的方法，此方法包括以 下步骤：将弹性探头端部浸入生物分子溶液中；将所述端部从所述溶液 中移出以使生物分子溶液附着在所述端部上；并且使所述生物分子溶液 与固体支持物接触从而将生物分子溶液从所述端部转移到所述固体支持 物上。固体支持物优选地具有点样生物分子的平坦表面。
用于此目的的固体支持物实例是一般用于电子工业中构建半导体的硅 片。这些硅片在一侧是高度磨光和反光的并且可容易地使用硅烷化学法 用聚乙烯亚胺涂敷。这些硅片在商业上可从诸如WaferNet(San Jose，CA) 的公司得到。用聚合物如聚乙烯亚胺对硅片和玻片的涂敷可通过公司如 Cel Associates(Houston，Texas)在合同下进行。具有反光性涂层的玻 片也可容易地使用硅烷化学法用聚乙烯亚胺涂敷。
聚乙烯亚胺多聚物涂层允许使用商业上可得到的交联剂(Pierce， Rockford，IL)将寡核苷酸、PCR片段或扩增子、DNA分子或片段或其它 含有胺基的生物分子共价结合到固体支持物上。聚乙烯亚胺(PEI)涂敷 的载片也具有长保存期稳定性的额外好处。
另一理想的固体支持物是金属如不锈钢。这样的金属固体支持物可用 作MALDI-TOF分析中的基质，其中待通过MALDI-TOF分析的成分用此处 公开的印迹方法点样。 排列条件和排列后的处理
如上所述的布列溶液可直接用于排列过程。也就是说，在排列核酸多 聚物的优选实施方案中，在印迹步骤前没有从未反应的氰尿酰氯中纯化 活化的核酸多聚物。令人惊奇地发现在排列方法的印迹步骤前不必去除 过量的交联剂。也就是说，在反应混合物中过量的氰尿酰氯不影响或竞 争核酸多聚物与有PEI涂层的固体支持物的共价结合。这是因为固体支 持物上的胺多于将以任何给定体积(纳升到皮升)排列的氰尿酰氯分子 的数目。
一般让活化核酸结合到固体支持物上的反应在20到50℃进行1到20 小时。优选地，反应时间是于25℃1小时。
本发明的阵列在进行杂交分析中特别有用。然而，为了进行这种分析， 在进行杂交步骤前必须对固体支持物上的胺加帽。这可通过使固体支持 物与0.1-2.0M琥珀酸酐反应来实现。优选的反应条件是70％m-pyrol和 0.1M硼酸钠中的1.0M琥珀酸酐。一般使反应进行15分钟到4小时，其 中优选的反应时间是于25℃30分钟。残余的琥珀酸酐用3X水洗加以去 除。
然后将固体支持物与在pH7-9的0.1-10.0M硼酸钠中含有0.1-5M甘 油的溶液一起温育。该步骤对任何可以共价结合到PEI表面上的二氯三 嗪“加帽”。优选的条件是在pH8.3的0.1M硼酸钠中的0.2M甘油。
然后可以用含有去污剂的溶液洗固体支持物以去除未结合的物质，例 如微量的m-pyrol。
优选地，将固体支持物在0.01M NaCl、0.05M EDTA和0.1M Tris(pH8.0) 中加热至95℃5分钟。此加热步骤去除未共价结合的核酸多聚物如PCR 产物。在排列双链核酸的情况中，此步骤也具有将双链变成单链形式(变 性)的效应。
排列可通过生物素化的探针(例如寡核苷酸、核酸片段、PCR产物等) 加以检测。使核酸生物素化的方法在本领域众所周知并且由Pierce进行 了充分描述(抗生物素蛋白-生物素化学：手册，Pierce化学公司，1992， Rockford Illinois)。探针一般以0.1ng/mL到10μg/ML在包括GuSCN、 GuHCl、甲醛等的标准杂交液中使用(参见Van Ness和Chen，核酸研究 19：5143-5151，1991)。
为检测杂交事件(即生物素的存在)，将固体支持物与链霉抗生物素蛋 白/辣根过氧化物酶偶联物一起温育。这样的酶偶联物在商业上可获自例 如Vector Laboratories(Burlingham，CA)。链霉抗生物素蛋白以高亲和 性结合生物素分子从而使辣根过氧化物酶与杂交探针靠近。未结合的链 霉抗生物素蛋白/辣根过氧化物酶偶联物用简单洗涤步骤洗去。然后在过 氧化物和适当缓冲液存在的情况下利用沉淀底物检测过氧化物酶的存 在。
对于比色分析基质，点样于反光性表面如硅片上的蓝色酶产物具有与 预期相比低许多倍水平的检测(LLD)。此外，LLD对于不同的有色酶产物 有很大不同。如实施例5中所示，每50μM直径点4-甲氧基-napthol(产 生沉淀的蓝色产物)的LLD是约1000个分子，而红色沉淀的物质每50μM 直径点给出约1000倍更高1,000,000个分子的LLD。通过用装有可见光 源和CCD相机(Princeton Instruments，Princeton，NJ)的显微镜(如 可从Zeiss商业上得到的Axiotech显微镜)检测表面来测定LLD。一次 可扫描约10,000μM×10,000μM的图象。
为了用蓝色比色测定方案，表面在酶反应后必须很干净并且硅片或载 片必须在干燥状态下扫描。此外，酸反应必须在对照点饱和之前终止。 对于辣根过氧化物酶，这大约是2-5分钟。
也可以使用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物或HPP 或碱性磷酸酶的荧光底物。实例包括可获自Perkin Elmer的碱性磷酸酶 diox底物或可获自JBL Scientific(Scan Luis Obispo，CA)的Attophos HRP底物。 生物分子溶液的自动转移
本发明提供一种将生物分子点样到固体支持物上的方法，此方法包括 以下步骤：将弹性探头端部浸入生物分子溶液中；将所述端部从所述溶 液中移出以使生物分子溶液附着在所述端部上；并且使所述生物分子溶 液与固体支持物接触从而将生物分子溶液从所述端部转移到所述固体支 持物上。在优选实施方案中，接触步骤自动进行，换句话说，是可在x，y 和z轴上加以控制的精密自动系统。精密Cartesian自动系统将由与适 当马达、放大器、移动控制器、个人计算机和软件连接以驱动工作台的 精密线性定位工作台组成。精密线性定位工作台可获自Parker Hannifin 公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本 东京)。马达、放大器和移动控制器可获自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司 (Mountain View，CA)。软件将最可能是自定义的并且可用语言如Borland C++4.5(Borland International Inc.，Scotts Valley，CA)或Visual Basic 4.0(微软公司，Redmond，WA)编写。个人计算机可获自众多生产商 如Dell计算机公司(Austin，TX)。
如上所述的弹性探头制备成装在任何类型的接受器中，本发明中有用 的机器人含有适当大小的接受器以容纳弹性探头。优选的接受器由镍-银 或青铜制成，然后在坚硬的镍上镀金。优选的接受器设计是直径0.5mm 到2.0mm、更优选地1.68毫米的金属管。将0.5mm到1mm厚、更优选地 0.64mm厚的方线弯入金属管的一端并封闭。每个套壳制备有凹痕和压环 以安全地容纳弹性探头。将探头插入接受器中，因此探头管与接受器末 端平齐。
为了排列液体的目的，将安装头部安装到机器人上。该头部具有可在 不同印迹应用时拆卸的扣栓。例如，通过取下2个螺丝并用一个设计以 容纳从384孔板点样的弹性探头的扣栓代替一个设计以容纳从96孔板点 样的弹性探头的扣栓可容易地改变扣栓。用精密钻出的、双水平的孔与 接受器的绕线和弯曲区域适当匹配借助摩擦力将接受器固定在扣栓上。 这种设计使得可以容易地更换损伤或操作不灵的接受器和/或弹性探头。 一旦插入，接受器/弹性探头组件从扣栓向下伸出25mm，从而允许探针到 达装有待排列样品液的微量滴定板底部。
印迹方法和溶液以及将生物分子点样的方法可用于制备阵列。这些阵 列可用于各种分析，其中那些分析可包括作为探针的标记生物分子(例 如标记的寡核苷酸)。标记的生物分子的实例和使用其的分析法描述于美 国专利申请Nos.08/786,835；08/786,834和08/787,521(各于1997 年1月22日提交)，以及具有申请Nos.08/898,180；08/898,564和 08/898,501的三个美国部分继续专利申请(各于1997年7月22日提交)， 以及PCT国际公开Nos.97/27331；97/27325和97/27327中。在此完全 引用这6个美国专利申请和3个PCT国际公开的全文作为参考。
此外，本发明的装置和方法可用于制备在单元中含有一个以上寡核苷 酸序列的阵列。在成分中含有一个以上寡核苷酸序列的生物分子阵列及 其使用描述于1997年7月22日提交的题为“排列单元内的多功能性及 其用途”的美国临时专利申请No.60/053,436和与其同时提交的类似题 目的美国非临时专利申请No.＿＿中，在此完全引用二者的全文作 为参考。
本发明的装置和方法也可用于制备在进行扩增和其它酶反应中有用的 阵列，如在我们1997年7月22日提交的题为“对核酸阵列进行的扩增 和其它酶反应”的美国临时专利申请No.60/053,428和与其同时提交的 类似题目的美国非临时专利申请No.＿＿中所述，在此完全引用二 者的全文作为参考。
本发明的装置和方法可用于制备生物分子阵列，如于1997年7月22 日提交的题为“基于聚乙烯亚胺的生物分子阵列”的美国临时专利申请No. 60/053,352和与其同时提交的类似题目的美国非临时专利申请 No.＿＿中所述，在此完全引用二者的全文作为参考。
如1997年7月22日提交的题为“使数据相关的计算机方法和系统” 的美国临时专利申请No.60/053,429和与其同时提交的类似题目的美国 非临时专利申请No.＿＿(在此充分引用二者的全文作为参考)中 所述的使数据相关的计算机系统和方法、更具体地使标记的数据与和标 记数据有关的信息相关的计算机系统和方法可与本文公开的方法和装置 结合使用。
对于许多生物技术应用，本发明有很大的用途，特别是那些涉及利用 聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交，通过杂交的核酸测序，病毒、细菌 或细胞文库的复制开发大规模诊断筛选方法的方法以及任何其它涉及反 复将溶液排列到固体表面上的方法。
提供以下实施例作为举例说明而不是限制。 实施例 实施例1一步法制备有PEI涂层的玻片
用0.1N乙酸洗玻片，然后用水冲洗直到从玻片上洗出的水的pH与用 于冲洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足够量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.， Tullytown，PA，目录号SSP060)中的50％w/w三甲氧基甲硅烷基丙基- 聚乙烯亚胺(600MW)以达到2％w/w终浓度。搅拌此2％溶液5分钟后， 将玻片浸入溶液中，轻轻搅拌2分钟，然后取出。为了洗去过多的甲硅 烷基化试剂，将玻片浸入乙醇中。然后使玻片空气干燥。 实施例2一步法制备有PEI涂层的硅片
用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)，然后用水冲洗直到 从硅片上洗出的水的pH与用于冲洗硅片的水的pH相同。然后使硅片干 燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足够量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.， Tullytown，PA，目录号SSP060)中的50％w/w三甲氧基甲硅烷基丙基- 聚乙烯亚胺(600MW)以达到2％w/w终浓度。搅拌此2％溶液5分钟后， 将硅片浸入溶液中，轻轻搅拌2分钟，然后取出。为了洗去过多的甲硅 烷基化试剂，将硅片浸入乙醇中。然后使硅片空气干燥。 实施例3一步法制备有PEI涂层的玻片
用0.1N乙酸洗玻片，然后用水冲洗直到从玻片上洗出的水的pH与用 于冲洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足够量的亲电子甲硅烷基化试剂，同时 搅拌以达到2％w/w终浓度。亲电子甲硅烷基化试剂是2-(3，4-环氧环己 基)乙基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4670.0)，3，4-环 氧丁基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4665.0)或3-异氰 酸根丙基三乙氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SII6454.0)之一。 搅拌此2％溶液5分钟后，将玻片浸入溶液中，轻轻搅拌2分钟，然后取 出。为了洗去过多的甲硅烷基化试剂，将玻片浸入乙醇中。
通过用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)稀释30％聚乙烯亚胺(Polysciences， Warrington，PA)水溶液来制备70,000分子量聚乙烯亚胺的3％(w/v)溶液。 将处理的玻片浸入3％溶液中并轻轻搅拌24小时。为了去除玻片上过多的 PEI，将玻片浸入NMP中(2X)，然后浸入同时含有0.09M NaCl、50mM Tris pH 7.6和25mM DETA的0.1％十二烷基磺酸钠水溶液中(2X)，然后浸入水 中(2X)，并且最后浸入乙醇中(1X)。然后使玻片空气干燥。 实施例4一步法制备有PEI涂层的硅片
按照实施例3中所述用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)， 然后也按照实施例3中所述用甲硅烷基化试剂和PEI处理。 实施例5从商业弹性探头制备点样头
XP54P弹性探头购自Osby-Barton〔Everett Charles(Pomona，CA)的 分公司〕。将探头“端部向下”对着超细的金刚磨石(DMT Inc.，Miami Lattes， FL)并以轻轻的压力在磨石上横移约0.5cm距离。通过显微镜观察到由 此从点样头的末端去掉约0.005英寸(0.001到0.01英寸)的金属。然 后通过在皮带上摩擦端部将点样头末端磨光。然后用水洗端部。在开始 使用前或使用之间，将点样头干燥保存或于-20℃保存在50％甘油中。 实施例6用改进的弹性探头装配排列装置
将实施例5中制备的端部安装到布列头部中，布列头部装在可在x，y 和z轴上控制的精密自动系统上。精密Cartesian自动系统将由与适当 马达、放大器、移动控制器、个人计算机和软件连接以驱动工作台的线 性定位工作台组成。精密线性定位工作台可获自Parker Hannifin公司 (Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本东京)。 马达、放大器和移动控制器可获自Parker Hannifin公司(Daedel Division， Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View， CA)。 实施例7用亲水性表面促进液体汲取、液体转移和微滴点样
按照实施例5将弹性探头端部浸于100mM 1，4-二硫苏糖醇和0.1M的 硼酸钠溶液中60分钟。二硫苏糖醇将通过硫醇-金配位与金表面反应以 制备金亲水性表面(表面基本上羟化)。 实施例8反应性寡核苷酸的制备
将75μl 5’-己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’(0.5μg/μl) 溶液与5μl 20mg/ml的氰尿酰氯和20μl 1M的硼酸钠在室温反应30分钟。 实施例9寡核苷酸的布列溶液
制备由12.5μL pH8.3的1M硼酸钠(新鲜制备或从-20℃储液冻融)、 50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATC CACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿酰氯组成的布列溶液。将此 混合物在室温下温育30到60分钟。然后向溶液加入155μL 80％甘油并将 所得溶液充分混合。在某些情况下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％ 的Tween 20或10％的Triton X-100(Rohm和Hass，费城)。当排列基质 由尼龙或硝酸纤维素膜组成时，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。 实施例10 PCR扩增子的布列溶液
当排列PCR扩增子时，在完成热循环步骤后将2.5μL pH8.3的1M硼 酸钠(新鲜制备或从-20℃储液冻融)、50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷 酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的 15mg/mL氰尿酰氯加入含有PCR内容物的PCR管中。将此混合物在室温下 温育30到60分钟。然后向溶液加入155μL 80％甘油并将得到的溶液充分 混合。在某些情况下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20 或10％的Triton X-100。当排列基质由尼龙或硝酸纤维素膜组成时，向 布列溶液加入25μL 5M的NaCl。 实施例11排列寡核苷酸的制备
按照实施例6将实施例5的改进的弹性探头安装在自动移液装置中， 并且按照实施例7处理弹性探头端部。将端部浸入实施例9的布列溶液 中5毫米2秒种。然后机器人用带有溶液的端部以12×6网格在有聚乙烯 亚胺(PEI)涂层的硅片上印迹72个微点，硅片根据实施例2、4中的任 一项制备或由将会根据合同制备有PEI涂层的基质的Cell Associates (Houston，Texas)等提供。产生的点直径约100-150微米，相邻点之间 中心到中心的间距是200微米。 实施例12活性PEI位点的封闭
为了封闭排列上未反应的PEI位点，用100mg/mL 100％ NMP中的琥珀 酸酐处理实施例11的阵列15分钟。 实施例13未反应的氰尿酰氯位点的封闭
为了封闭排列上未反应的氰尿酰氯位点，用0.1M 0.01M Tris中的甘 油处理实施例12的阵列15分钟，然后用Tens(0.1M NaCl，0.1％SDS，0.01M Tris，5mM EDTA)洗4次。 实施例14杂交方法
使实施例13的阵列中的固定寡核苷酸与其生物素化的互补产物(5’- 生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)在37℃杂交20分钟，用6XTens、 2XOHS[0.06M Tris，2mM EDTA、5XDenhardt’s溶液、6XSSC(3M NaCl， 0.3M柠檬酸钠，pH7.0)、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％NP-40]洗。
杂交后，将硅片浸入0.5μg/ml碱性磷酸酶链霉抗生物素蛋白中15分 钟，用2XTens、4XTWS(0.1M NaCl，0.1％Tween20，0.05M Tris)洗。 然后用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，Califor- nia)(按照试剂盒方法)使微点显色并用CCD相机和显微镜照相。图5显 示产生的图象。 实施例15单一阵列单元内的多个寡核苷酸
浓度均为0.5μg/μl的2种模板寡核苷酸(寡核苷酸#1＝5’己胺- TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’，寡核苷酸#2＝5’己胺-ACTACTGATCAGGCG CGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)分别与20μl 1M硼酸钠中的5μl 20mg/ml 氰尿酰氯于室温反应30分钟(总反应体积＝100μl)。从这两个反应制备 由56％甘油和这两种寡核苷酸的稀释组合组成的布列溶液(见表1)。将8 个点样头各浸入8种布列溶液中5毫米2秒钟。然后机器人在聚乙烯亚 胺(PEI)涂敷的硅片上用带有溶液的端部印迹2套8个各含有72个微 点的12×6网格。每个网格代表单一的布列溶液。产生的点直径约100-150 微米，相邻点之间中心到中心的间距是200微米。
排列后，硅片上未反应的PEI位点用100mg/mL 100％N-甲基吡咯烷酮 中的琥珀酸酐封闭15分钟，水洗3X。未反应的氰尿酰氯位点用0.01M Tris 中的0.1M甘油封闭15分钟，Tens(0.1M NaCl，0.1％SDS，0.01M Tris， 5mM EDTA)洗4X。然后进行两种杂交。
在第一种杂交中，将一套8种排列的寡核苷酸组合与互补于寡核苷酸 #1的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’) 杂交。在第二种杂交中，将另一套8种排列的寡核苷酸组合与互补于寡 核苷酸#2的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAGGCGCGCCTGATCAGTAGT-3’)杂交。杂交于37℃在Hybriwell Sealing Covers(Research Products Internat ional Corporation，Mount Prospect， Illinois)下同时进行20分钟，用6XTens、2X CHS(0.06M Tris，2mM EDTA)、5XDenhardt’s溶液、6XSSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)、 3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％NP-40洗。
杂交后，将硅片浸入0.5μg/ml辣根过氧化物酶链霉抗生物素蛋白中15 分钟，用2XTens、4XTWS(0.1M NaCl，0.1％Tween 20，0.05M Tris)洗。 然后用0.4mg/ml的4-甲氧基-1-napthol(0.02％过氧化氢，12％甲醇，PBS) 使微点显色，最后水洗3X。
与寡核苷酸#1的互补产物杂交的混合寡核苷酸系列对于含有最高浓度 寡核苷酸#1的网格表现最强的颜色强度而对于含有最低浓度寡核苷酸#1 的网格表现最低的颜色强度。而且，与寡核苷酸#2的互补产物杂交的混 合寡核苷酸系列对于含有最高浓度寡核苷酸#2的网格表现最强的颜色强 度而对于含有最低浓度寡核苷酸#2的网格表现最低的颜色强度(见图6)。
表1 布列溶液中的寡核苷酸   浓度(ng/μl) 布列溶液中的寡核苷酸     浓度(ng/μl)  布列溶液  寡核苷酸#1     寡核苷酸#2     1     26     0.44     2     28     0.88     3     14     1.8     4     7     3.5     5     3.5     7     6     1.8     14     7     0.88     28     8     0.44     56 实施例16测定单元大小的一致性
制备由56％甘油和44％用蓝色食物染料染色的水组成的布列溶液。将 点样头浸入布列溶液中5毫米2秒钟。然后机器人用带有甘油的端部以 12×6网格在硅片上印迹72个微点。产生的点直径约100-150微米，相邻 点之间中心到中心的间距是200微米。图7显示机器人产生的网格的CCD 相机相片。点直径的标准偏差约为15％。 实施例17测定排列方法内的可重复性
制备由56％甘油、0.01M Tris pH 7.2、5mm EDTA、0.01％肌氨酰和1％ V/V Fluoresbrite Plain 0.5μM微球体(2.5％Solids-latex) (Polysciences，Warrington，PA)组成的布列溶液。将点样针头浸入溶 液中5毫米5秒钟并且然后用于在玻片上印迹多个微点。然后用荧光滤 镜在荧光下进行显微摄影。图8显示每个微点(阵列单元)荧光微球体 的高度重复性点样(通过肉眼观察测定)。 实施例18测定每单元核酸多聚物的浓度
将与点样的寡核苷酸互补的寡核苷酸(5’-德克萨斯红- CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGAC)与3M硫氰酸胍(GcSCN)、0.01M Tris pH 7.5、5mM EDTA和0.1％肌氨酰中的阵列杂交。体积足以覆盖固体支持 物〔对于玻片(1×3英寸)为1mL〕。德克萨斯红寡核苷酸的浓度为5μg/ml， 并且反应在室温进行。使杂交进行30分钟。然后用Tens洗玻片(5X)。 然后用1mL洗脱缓冲液(0.005M Tris pH7.6，0.0005M EDTA，0.01％肌 氨酰)覆盖玻片并加热到95℃2分钟。从玻片上汲取溶液并将其置于黑 色微量滴定板中。在黑色微量滴定板中测定荧光。从温育管汲取溶液 (200μL)并将其置于黑色微量滴定板中(Dynatek Laboratories， Chantilly，VA)。然后用Fluoroskan II荧光计(Flow Laboratories， McLean，VA)直接对平板读数，对于荧光素用495nm的激发波长并且在520nm 处监测发射光，对于德克萨斯红用591nm的激发波长并且在612nm处监 测发射光，并且丽丝胺或TAMRA用570nm的激发波长并且在590nm处监 测发射光。洗脱的寡核苷酸的量通过用测得的荧光量〔3.84个相对荧光 单位(rfu)〕除以德克萨斯红寡核苷酸的比活(每μg寡核苷酸6.9rfu) 加以测定。因此测得阵列中的每单元中存在108个寡核苷酸。
从前述应当理解，虽然在此为了举例说明的目的描述了本发明的具体 实施例，但在不偏离本发明精神和范围的情况下可进行各种修饰。因此， 除了所附的权利要求外，本发明不受其它限制。