有多种系统和装置可用来检测不同介质中的多种分析物。这些系 统和装置大多比较昂贵，并且要由经过培训的技术人员来进行测试。 在很多情况下，最好是能够快速而廉价地测定分析物的存在情况。而 所需要的正是一种易于生产、造价低廉，并且能够灵敏可靠地检测分 析物甚至微量分析物的生物传感系统。
Sandstrom et al.，24 Applied Optics 472，1985对一种硅制 光学基质的应用进行了描述，该基质含有一层一氧化硅，并含有一层 作为介质薄膜的硅。文中指出，薄膜的厚度变化可改变光学基质的特 性，从而随薄膜的厚度产生不同的颜色。薄膜的厚度与观察到的颜色 相关，而光学基质上覆盖的一层薄膜能够产生可见的颜色变化。作者 指出，颜色变化可利用数学模型来定量，而“利用计算机模型进行计 算的结果表明，使用多层结构不会引起光学特性的变化……但表面的 生物层几乎不改变这种结构的反射作用，因为其光学特性主要由该多 层结构的内界面决定。尽管可由额外的介质层来实现其它大多数应用 性能，但最灵敏的生物层检测系统为单层系统”。
Sandstrom et al.还指出，金属表面的金属氧化膜具有一些缺 点，并且金属离子的存在还会在许多生化应用中产生有害作用。他们 指出，理想的表层介质薄膜是将一氧化硅层置于环境大气中时自然形 成的2-3nm厚的二氧化硅层，在玻璃或塑料基质上则可采用在40- 60nm一氧化硅层上形成70-95nm二氧化硅层的方案。另外，他们还 描述了一氧化硅楔的形成，方法是对一氧化硅进行选择性蚀刻、用二 氯二甲基硅烷处理二氧化硅表面，并施加抗原与抗体生物层。他们可 通过该楔形结构由一种偏振光椭圆计来测量薄膜厚度，并指出“最大 的反差位于约65nm区域，这里的干涉色由紫色变为蓝色”。他们指 出，这种系统的灵敏度之高足以通过固定化抗体来检测蛋白抗原。他 们断定“提供的该设计方案具有足以适用于广泛应用领域的灵敏 性”。所用原料，即玻璃、硅和氧化硅，具有化学惰性，并且不会影 响所研究的生化反应。利用上述计算方法可设计出针对不同应用而优 化的薄片。这种薄片可通过工业方法来生产，并且可确保其品质，目 前能够以商品形式购买的有两种设计款式。
Kumar et al.发表的美国专利5,512,131描述了一种装置，该装 置含有一种带金属涂层的聚合物基质。分析物特异性受体层则压印在 带涂层基质的表面。该装置可用于模压过程，或可作为一种开关。当 分析物与该装置结合时可产生一种衍射图像。因而可使用一种显象装 置，如摄谱仪，来确定该衍射图像的存在情况。
但Kumar et al.描述的该装置具有一些缺点。其中之一就是需 要额外的显象装置来观察所有的衍射图像。由于需要衍射装置而不能 裸眼来确定分析物的存在情况，所以Kumar et al.的装置不能对大 量的样品进行测试。此外，该装置还不能检测小分析物，因为小分析 物不能产生明显的衍射图像。
Bogart et al.的美国专利号5,482,830描述了一种装置，该装 置包含一种带有光学活性表面的基质，这种光学活性表面可随光照而 显示出第一颜色。第一补颜色被定义为发射光的光谱分布。该基质还 可显示出与第一颜色不同的第二种颜色(通过与第一颜色的波长组合 不同的光波长组合，或不同的光谱分布，或通过与第一颜色不同的一 种或多种波长的强度)。当分析物出现在该表面时，在相同的光的刺 激下可显示出第二种颜色。由一种颜色向另一种颜色的变化可通过仪 器或眼睛来测量。这种灵敏的检测方法相对于上文Sandstrom和 Nygren描述的装置而言是一种进步，从商业角度考虑，使用该装置 更具前途和竞争力。
但在Bogart et al.的专利中描述的方法和装置也有一些缺点。 一是该装置造价昂贵。另一问题是难以控制薄膜上的不同薄层以获得 可靠的数据。
此外，还有利用具有带自组装单层的生物传感器来对分析物进行 检测，这些生物传感器在美国专利号08/768,449和08/991,844中 有所描述，在此均全面引入作为参考。但目前这些生物传感器不具有 检测小分析物所必需的灵敏性，因为这些较小的分析物不能产生足以 可视的衍射图像。
目前已被使用的一些商品化横流技术(lateral flow)采用的是 乳胶粒技术。这些技术目前被大多数商品形式的家用诊断试剂盒所采 用(如妊娠诊断试剂盒及排卵诊断试剂盒)。这些试剂盒使用的是着 色小珠，这些小珠可在特定的“捕获带”聚集，直至小珠的量可被裸 眼所见。但这些系统不具有对多种分析物进行检测所必需的灵敏性， 因为必须要有大量的乳胶粒结合到捕获带才能被裸眼所见，这个量要 比导致相同大小的带产生衍射所需的量大得多。一般而言，其所需的 小珠量要比本发明的传感器高约2-3个数量级。
而所需要的正是一种易于生产、造价低廉，并且能够灵敏可靠地 对分析物，其中包括较小的分析物，进行检测的生物传感装置。
发明概述
本发明提供一种廉价而又灵敏的系统以及用来检测介质中存在 的分析物的方法。该系统包含一种生物传感装置，该生物传感装置包 括一种聚合物膜，膜上印制有特定的、预定模式的分析物特异性受 体。该聚合物膜可涂有一层金属层。此外，该系统还利用“衍射增强 元件”，这些衍射增强元件能够与目标分析物结合并与该生物传感器 结合，并且能够使振幅和/或折射率发生极大变化，从而提高该生物 传感器的衍射效率并使较小分析物的检测得以进行。在使用时，目标 分析物可直接与印制有受体的聚合物膜的特定区域结合，也可与衍射 增强元件结合，继而由该元件与生物传感器结合。然后通过该分析物 的确定尺寸和特定精确位置产生透射光衍射和/或反射光衍射。产生 的衍射图像可用眼睛方便地观察，也可选择性地使用一种传感装置。
本发明的系统与目前的廉价系统相比要灵敏得多。本发明的系统 可检测流体样品中低分子量至高分子量的分析物、微生物以及DNA或 RNA种类。更详细地说，该系统可检测包含在其它物质中的激素。类 固醇、抗体、药物代谢产物，甚至是核酸。这是对美国专利申请号 08/768,449和08/991,844中描述的基于光衍射的传感技术的一种重 要扩展。
本发明利用了有助于检测较小分析物的衍射增强元件，如乳胶微 球体。在分析物与生物传感器上的分析物特异性受体结合后，该分析 物一般会将透射光衍射或反射，从而产生一种衍射图像。如果该分析 物较大，则该衍射图像可用裸眼观察。但一些分析物太小，其产生的 衍射图像无法看到。通过使用衍射增强元件，可利用带有分析物特异 性受体物质的生物传感器对这些较小的分析物进行检测。所使用的衍 射增强元件能够与分析物结合，并且结合了分析物的该元件能够与生 物传感器结合。此时，当光透射该生物传感器或由其反射时，该元件 可使分析物产生的衍射图像增强，从而使所得衍射图像可用裸眼观 察。
本发明还利用将模式化的(patterned)分析物特异性受体进行晒 图(contact print)的方法。该分析物特异性受体上结合有接受性物 质。该接受性物质则根据所用的受体而对特定的一种或一类分析物具 有特异性。适于产生该系统所用传感装置的晒图方法完全公开于美国专 利申请号08/707,456和08/769,594，在此均全文引入作为参考。但由 于这些方法涉及单层膜的自我组装，而该接受性物质不能自我组装，因 此需如下文所述将这些方法稍做修改以印制分析物特异性受体物质。
通过分析物特异性受体的模式，使模式化分析物特异性受体层实 现分析物和/或衍射增强元件的受控排布。由此产生的本发明所述生 物传感装置的使用方法是，首先将该生物传感装置暴露于含有选定分 析物并混有衍射增强元件的介质。保温适当时间后再用一种光，如激 光或其它点光源，透射该薄膜或使其由薄膜反射。如果分析物存在于 介质中并且与模式化分析物特异性受体层上的受体结合，那么无论是 直接结合还是与衍射增强元件连接，都可使光衍射并产生可见图像。 换句话说，带有分析物和/或结合了分析物的衍射增强元件的分析物 特异性受体层可产生光学衍射图像，该图像由于分析物特异性受体层 上的受体与目标分析物的反应的不同而有所不同。使用的光可以是可 见光，也可以是薄膜的反射光或透射光，分析物可以是能与分析物特 异性受体层反应的任何化合物或颗粒。使用的光可以是白光，也可以 是位于可见区内的单色电磁辐射。尽管预定光源为可见光，但本发明 也可使用不可见点光源，如近红外光，并结合使用一种检测器。为满 足不可见光源的需要，可对薄膜的厚度及微颗粒大小进行调整。此 外，本发明还提供一种柔性支持物，用于直接在基质上或金或其它适 当金属或合金上支持分析物特异性受体层。
本发明提供一种位于金或其它物质上的适于批量生产的分析物 特异性受体层。本发明的生物传感器可制成用于单次分析物检测的形 式，也可定制成多重测试装置。本发明的生物传感器可用来检测(1) 与医学疾病相关的抗原或抗体，(2)诸如尿布等衣物中的污染物，以 及(3)微生物污染物。
在本发明的另一项实施方案中，可在分析物特异性受体层中加入 特定种类微生物的营养物。这样就可以检测极低浓度的微生物，方法 是首先将本发明的生物传感器与加入的营养物相接触，然后，如果需 要，可在适于所结合微生物生长的条件下将该生物传感器保温。使微 生物生长，直至其数量足以形成衍射图像。
本发明还可用来检测接触透镜、眼镜、窗玻璃、药剂瓶、溶剂容 器、水瓶、胶布绷带等之上的污染物。
在审阅以下公开实施方案的详细描述之后，将会了解本发明的这 些及其它特点和优点。
附图简述
图1显示可同时测量一种介质中数种不同分析物的生物传感器。
图2为分析物特异性受体层的晒图示意图。
图3为蒸发在MYLAR上的金的原子力显微镜图像，MYLAR购于 Courtaulds Performance Film(Canoga Park，CA)。金层的平均 粗糙度为3-4纳米，最大粗糙度为9纳米。
图4为SEM显微照片，显示衍射增强元件在存在分析物情况下的 模式化连接。
发明详述
本发明的特征是提供改进型生物传感装置以及该生物传感装置 的使用方法，用于对介质中特定分析物的存在情况或数量进行检测和 定量。本发明的灵敏性更高，可用来检测较小的分析物，这些较小的 分析物到目前为止除借助昂贵仪器外还无法检测。可通过本发明加以 检测的分析物包括，但不局限于，激素、诸如抗体等蛋白、类固醇、 药物代谢物、核酸、诸如细菌、酵母、真菌和病毒等微生物。与此前 的装置相比，本发明的装置可通过持续时间仅数分钟的快速测定方法 来检测介质中极少量并且尺寸极小的分析物。此外，本发明无需信号 部件或相关电子部件。
本发明包括将分析物特异性受体微晒图(micro-contact print) 在一种聚合物膜上，该聚合物膜可带有一种金属涂层。本发明可产生 基于光衍射的一次性专用传感器，可用来表明分析物的存在情况。此 外，本发明还包括能提高生物传感器衍射效率的衍射增强元件，由此 可对任意数量的不同分析物进行检测。一旦目标分析物与含有受体的 聚合物膜的特定区域连接，无论是直接结合还是与衍射增强元件连 接，都可通过该分析物的确定尺寸和特定精确位置产生透射光衍射和 /或反射光衍射。举例来说，当酵母、真菌或细菌被有序地排列在表 面时，其大小均足以充当可见光的衍射单元。但较小的分析物，如病 毒、蛋白、分子、激素、类固醇、药物代谢物及核酸，只有同时与衍 射增强元件结合时才能充当适当的衍射单元。分析物除采用可产生简 单衍射图像的模式之外，也可采用产生全息传感图像和/或可见的颜 色变化的模式。此时，全息图的出现或现有全息图的改变表明一种阳 性反应。透射光的衍射模式可以是任何形式，其中包括，但不局限于， 当分析物与接受性物质结合时即由一种模式转变为另一种模式。在特 别优选实施方案中，该衍射模式应在分析物与本发明的生物传感装置 接触后不到1小时内即可被辨别。
在与分析物和/或衍射增强元件相互作用后即产生光衍射的衍射 光栅应具有最小的入射光波长频率。极小的分析物则可通过使用对其 有特异性的衍射增强元件颗粒来间接检测。检测小分析物的实施方案 包括，用一种能够与目标分析物特异性结合的受体物质包被该元件颗 粒，如乳胶粒。
有多种方法可用来将受体物质连接在衍射增强颗粒上。这些方法 包括，但不局限于，简单地物理吸附于疏水性颗粒(例如将蛋白结合 在聚苯乙烯颗粒上)；利用蛋白A或蛋白G接头进行连接；利用链霉 抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-生物素接头进行连接；或利用共价结 合进行连接。本发明的优选实施方案是利用碳二亚胺将蛋白性受体结 合于羧化颗粒。也可采用该领域普通技术人员所熟知的其它结合方 法。
可在本发明中使用的颗粒包括，但不局限于，玻璃、纤维素、合 成聚合物或合成塑料、乳胶、聚苯乙烯、聚碳酸酯、细菌或真菌细胞 等。颗粒的优选外形为球形，但该颗粒的结构及空间构型对本发明而 言并不严格。举例来说，该颗粒可以是长条形、椭圆形、立方形等。 合乎需要的颗粒大小为直径约0.1μm-100.0μm，理想的则约为 0.3μm-1μm。颗粒的成分对本发明而言并非决定性因素。介质与增强 元件的优选折射率差值为0.1-1.0。介质与增强元件的更优选折射率 差值为0.2-0.7。
聚合物膜上的分析物特异性受体层含有一种接受性物质，如一种 抗体，该接受性物质能够与分析物上的某种表位特异性结合，该表位 与其结合颗粒的表位不同。因此，在检测诸如病毒颗粒等小分析物 时，可首先将介质暴露于结合有该病毒颗粒的衍射增强元件颗粒，如 乳胶粒。然后选择性地冲洗该衍射增强元件颗粒，再将其暴露于带有 分析物特异性受体层的聚合物膜，分析物特异性受体层上含有病毒特 异性抗体。此时，抗体可结合元件颗粒上的病毒颗粒，从而将元件颗 粒固定在膜上，其模式与受体自身的模式相同。由于结合的元件颗粒 能够导致可见光衍射，所以可形成一种衍射图像，以指示该流体中该 病毒颗粒的存在。此外，该聚合物膜上可含有一层金属涂层。此时分 析物特异性受体层应位于薄膜的金属化表面上。
作为选择，分析物的检测方法也可以是，首先将基质暴露于含有 分析物的介质，使该分析物与分析物特异性受体层物质结合。接着将 含有衍射增强元件颗粒的溶液与结合有分析物的该基质相接触。从而 使颗粒与分析物结合。由于结合的元件颗粒能够导致可见光衍射，所 以会形成一种衍射图像，以表明该流体中存在有该分析物。
最后，在一项优选实施方案中，可将生物传感器、衍射增强元件 颗粒以及含有分析物的介质同时混合。这将使上述结合过程一同发 生。一些分析物会在与基质结合前先与衍射增强元件颗粒结合。另一 些分析物则是先与基质结合，然后与元件颗粒结合。当使用点光源透 射该传感器时可形成一种衍射图像，即表明该流体中存在有该分析 物。
可考虑使用本发明来进行检测的分析物包括，但不局限于，细 菌；酵母；真菌；病毒；类风湿因子；抗体，包括但不局限于，IgG、 IgM、IgA和IgE抗体；癌胚抗原；链球菌A类抗原；病毒抗原；自 身免疫疾病相关抗原；变应原；肿瘤抗原；链球菌B类抗原；HIV I 或HIV II抗原；或对这些病毒及其它病毒的宿主应答(抗体)；RSV 特异性抗原或对该病毒的宿主应答(抗体)；抗原；酶；激素；多糖； 蛋白；脂类；糖类；药物或核酸；沙门菌；念珠菌，包括但不局限于， 白色念珠菌和热带念珠菌；沙门菌；脑膜炎奈瑟菌A类、B类、C类、 Y类和W类135亚类、肺炎链球菌、大肠杆菌K1、B型流感嗜血菌； 来源于微生物的抗原；半抗原、滥用药物；治疗药物；环境剂；以及 肝炎特异性抗原。
在本发明的另一项实施方案中，可在分析物特异性受体层中加入 特定种类微生物的营养物。这样就可以检测极低浓度的微生物，方法 是首先将本发明的生物传感器与加入的营养物相接触，然后在适于所 结合微生物生长的条件下将该生物传感器保温。使微生物生长，直至 其数量足以形成衍射图像。当然，在某些模式化单层中不存在营养物 的情况下，微生物有时也会自身倍增即足以形成衍射图像或可增殖至 足以形成衍射图像。
可被缩微印制(microprint)在聚合物膜上并能够与目标分析物 特异性结合的分析物特异性受体物质均可作为本发明的一部分。此 时，该受体物质的定义是特异性结合对的一个部分，其中包括，但不 局限于，抗原/抗体、酶/底物、寡核苷酸/DNA、螯合剂/金属、酶/ 抑制剂、细菌/受体、病毒/受体、激素/受体、DNA/RNA、或RNA/RNA、 寡核苷酸/RNA，以及这类物质与其它任一类物质的结合，也包括这类 物质与无机物的相互作用。此外，当使用金属化聚合物膜时，可将分 析物特异性受体物质缩微印制在薄膜的该金属表面上。
与附着层(attachment layer)结合的受体物质的特征在于，能够 与一种或多种目标分析物特异性结合。有多种物质可用作受体物质， 其仅限于同分析物选择性结合(对任何选定样品而言)的物质的类 型。可作为受体物质的物质亚类包括毒素、抗体、抗原、激素受体、 寄生虫、细胞、半抗原、代谢物、变应原、核酸、核物质(nuclear material)、自身抗体、血液蛋白、细胞碎片、酶、组织蛋白、酶底 物、辅酶、神经递质、病毒、病毒颗粒、微生物、蛋白、多糖、螯合 剂、药物，以及特异性结合对的其它任何部分。该列表只包含了可涂 覆在附着层上而产生一种薄膜测定系统的多种不同物质中的一部 分。无论选择何种目标分析物，都可通过设计使受体物质与该目标分 析物结合。在优选实施方案中，该生物传感装置的设定和安排方式能 够使其在目标分析物被夹在受体物质和衍射增强元件之间时对点光 源透射发生反应而产生一种裸眼可辨的图像。
在许多情况下，需要用一种“阻断物”来避免非特异性结合。此 处使用的术语“阻断物”是指一种可附着于传感器表面从而“阻断” 或避免非分析物与该表面(模式化区域或非模式化区域)结合的试 剂。阻断可作为后处理步骤在表面已被晒图之后进行(“后阻断”)， 这属于用另一种巯基试剂来填补非晒图区域的常规技术。但本发明人 发现，“前阻断”技术要优于后阻断技术。前阻断技术是用一种不会 巯基的阻断物对基质表面进行预处理，然后再晒图。尽管不希望受任 何理论的约束，但从理论上讲，晒图原料(通常含有硫)可以取代物 理吸附的阻断物，从而使分析物特异性受体物质可直接与基质的表面 结合。如果需要，也可随后进行后阻断。阻断物包括，但不局限于， β-酪蛋白、白蛋白如牛血清白蛋白、非离子型表面活性剂或其它表面 活性剂、聚乙二醇、聚乙烯醇，或上述化合物的硫衍生物，以及该领 域普通技术人员所了解的其它任何阻断物。
含有目标分析物的基体可以是间质液、固体、气体、或一种体液， 如粘液、唾液、尿液、粪便物、组织、骨髓、脑脊液、血清、血浆、 全血、痰液、缓冲液、抽提液、精液、阴道分泌物、心包液、胃液、 腹膜液、胸膜液、喉吸取液或其它洗液等。目标分析物可以是抗原、 抗体、酶、DNA片段、完整基因、RNA片段、小分子、金属、毒素、 环境剂、核酸、细胞质成分、伞毛或鞭毛成分、蛋白、多糖、药物， 或其它任何物质。例如，细菌的受体物质可特异性结合其表面膜成 分、蛋白或脂类、多糖、核酸或酶。表明细菌存在的分析物可以是糖 类或多糖、酶、核酸、膜成分、神经节苷脂或宿主对该细菌应答而产 生的抗体。分析物的存在可表明一种感染性疾病(细菌性或病毒性)、 癌症、变态反应或其它医学病症或病情。分析物的存在也可表明水污 染或食物污染，或表明其它有害物质的存在。该分析物可表明药物滥 用或用来监控治疗剂的水平。
免疫测定法是可采用此技术的一种最常见的测定方法。但一般也 考虑采用核酸探针、酶/底物及其它配体/受体的测定。对免疫测定而 言，抗体可作为受体物质，并且/或作为目标分析物。受体物质，如 抗体或抗原，必须在测试装置的附着层上形成一种稳定的反应层。如 果受体物质为一种抗体，那么该抗体必须对目标抗原具有特异性，并 且该抗体(受体物质)与抗原(分析物)结合的亲合力必须足以将抗 原保留在测试表面。在某些情况下，分析物不仅能够与受体物质结 合，还可导致该受体物质发生可检测的变化。这种相互作用可导致测 试表面的质量提高，也可导致测试表面的受体物数量降低。后一情况 的实例是降解酶或降解物质与一种固定化特异底物发生相互作用。此 时，在与目标分析物发生相互作用前可看到一种衍射图像，而如果分 析物存在，则该衍射图像将消失。分析物与受体物质结合、杂交或相 互作用的具体机制对本发明而言并不重要，但它会影响最终测定方案 所使用的反应条件。
一般而言，受体物质可被动涂覆于基质层(substrate layer)。 如果需要，也可通过附着层在测试表面上引入游离功能基团，以使受 体物质共价连接于测试表面。
有多种技术可用来将受体物质涂覆在基质层上。用受体物质包被 测试表面的方法可以是以离散点阵(discrete array)或模式涂覆溶 液；喷洒、喷墨、晒图或其它印制方法；或是以某种模式印制阻断物 后再完全浸没于受体物质或用受体物质进行旋涂(spin coating)。所 选的技术应能够使包被大量测试表面所需的受体物质量达到最小，并 且能够在涂覆过程中保持受体物质的稳定性/功能性。此外，该技术 必须可通过十分均一的受控方式将受体物质施加或粘连在附着层 上。
本发明的生物传感装置采用在聚合物膜或金属化聚合物膜上，理 想的是透明或半透明的聚合物膜或金属化聚合物膜上，进行分析物特 异性受体层的模式化晒图的方法，同时涉及由此产生的组合物以及这 些组合物的应用。模式化分析物特异性受体层可将分析物受体进行受 控的连接(或结合)排布。此处使用的术语“模式化分析物特异性受 体层”是指聚合物膜或金属化聚合物膜上任何模式的，包括固体模式 (solid pattern)的，分析物特异性受体层。
当带有模式化分析物特异性受体层的薄膜暴露于可与分析物特 异性受体层反应的分析物时，该薄膜将根据模式化分析物特异性受体 层与目标分析物的反应而产生不同的光学衍射图像。其介质中需含有 衍射增强元件颗粒。该介质可以是一种高表面张力流体，如水。使用 的光可以是可见光，也可以是薄膜的反射光或是透射光，分析物可以 是能够与分析物特异性受体层反应的任何化合物(compound)。
在优选实施方案中，该方法涉及将传感装置与一种含有衍射增强 元件并可能含有分析物的测试样品相接触。如果样品中存在分析物， 那么当光透射过带有分析物特异性受体层的金属化聚合物膜时可形 成一种可见的衍射图像。
分析物所处的介质可以是固体、类凝胶、流体或气体。对检测体 液中的分析物而言，该流体可选自，但不局限于，尿液、血清、血浆、 脊髓液、痰液、全血、唾液、尿殖分泌物、粪便提取物、心包液、胃 液、腹膜液、胸膜液、阴道分泌物，或喉吸取液。本发明所述生物传 感装置可考虑使用的最常见气体为空气。
在一项实施方案中，本发明是采用将微晒图的金属化膜装在量尺 (dipstick)末端的量尺方式来加以实施。在使用时，将量尺浸入可能 含有待检分析物的流体中。该流体需另含有衍射增强元件颗粒。将量 尺维持数分钟。然后取出量尺，并用光透射该金属化膜或是通过薄膜 后的光对其进行观测。如果观测到图像，则该流体中存在目标分析 物。
本发明的另一项实施方案是在同一支持物上建立多重分析物测 试系统。如图1所示，条带10上带有若干微晒图的薄膜20、25、30 和35，每种膜上均印制有一种模式40。各微晒图的薄膜15、20、25 和30含有对不同分析物具有特异性的不同受体物质。可以看到，本 发明可以使用多种微晒图膜以任何点阵进行格式排列，因而本发明所 述生物传感装置的使用者可通过单次测试对介质中多种分析物的存 在情况进行检测。
有多种支持物可用于本发明的分析物特异性受体层。在许多物质 上都可发生简单的物理吸附，如聚苯乙烯玻璃、尼龙或该领域普通技 术人员所熟知的其它物质。固定分析物特异性受体层的优选实施方案 涉及共价连接，如含有硫羟基(thiol)或二硫键的化合物与金之间可 能产生的共价连接。典型的是用Si/SiO2晶片、玻璃片或聚合物膜来 支持5-2000nm厚的金膜。也可选择性地利用钛来作为金与支持物的 增粘剂。分析物特异性受体可在用溶液进行晒图或浸没于该溶液的过 程中附着于金的表面。优选的支持物是在MYLAR上带有金膜。
图2概述了微晒图的方法。用一种弹性印模(stamp)将分析物特 异性受体“印墨”经接触转移到金的表面；如果印模被模式化，那么 即可形成模式化的分析物特异性受体层。印模的制作方法是将聚二甲 基硅氧烷(PDMS)浇注在具有所需模式的相反形式的底板上 (master)。底板的制备采用标准的影印技术，也可利用具有微观表面 特性的现有材料构造而成。
在一项优选的典型实验方法实施方案中，将通过光刻法产生的底 板置于玻璃或塑料培养皿内，并倒入比率为10∶1(w∶w)的SYLGARD 聚硅氧烷弹性体184与SYLGARD聚硅氧烷弹性体184固化剂(Dow Corning Corporation)的混合物。在室温下将弹性体静置约30分 钟并减压脱气，然后在60℃下至少固化4小时，再温和地将其由底 板剥落。弹性印模的“上墨”方法是将印模暴露于0.1-10μM的二硫 化衍生抗体水溶液，印模通常是面朝下在该溶液中置10秒-10分钟。 在环境条件下或是一般通过暴露于空气流或氮气流使印模干燥。将上 墨后的印模施加于金表面。利用轻微压力来确保印模与该表面完全接 触。1秒-5分钟后，温和地将印模由该表面剥离。然后将表面漂洗并 干燥。作为选择，还可通过使用第二种印模或将整个表面暴露于不同 试剂来对未印制区域做进一步衍生化。随后还可暴露于蛋白阻断剂， 如BSA或β-酪蛋白，或该领域所熟知的其它任何制剂。
印模的弹性特性对该方法的成功实现非常重要。聚二甲基硅氧烷 (PDMS)在固化后的弹性足以使印模与表面发生良好的共形接触，甚 至在该表面具有明显起伏时也是如此；这种接触对受体被高效接触转 移至金膜而言至关重要。PDMS的弹性特性在由底板剥离印模时也发 挥着重要的作用：如果印模为刚性(象底板那样)，那么当固化完成 后将很难在两种基质均不损坏的条件下将印模与底板分离。PDMS还 具有充分的刚性来维持其形状，甚至亚微米大小的特征也是如此。该 印模十分耐用，同一印模可在持续一年的时间里使用多达200次而不 出现性能的明显降低。利用印辊印模可实现连续的印制操作。作为选 择，若可以产生衍射所需的特征尺寸，如≤100μm，那么也可通过喷 墨印制来获得所需的模式。
以下是本发明所述方法和组合物的更详细描述。其中引用的所有 出版物均全面引入作为参考。
任何塑料薄膜均适用于本发明。优选而言，该塑料薄膜上还可带 有一层沉积的金属层。这些塑料薄膜包括，但不局限于，多种聚合物， 如：聚对苯二酸二乙酯(如MYLAR)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、丙 烯腈-丙烯酸甲酯共聚物、玻璃纸，纤维素聚合物，如乙基纤维素、 醋酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、三醋酸纤维素、三醋酸 纤维素，聚乙烯、聚乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、离聚物(乙烯聚合物) 聚乙烯-尼龙共聚物、聚丙烯、甲基戊烯聚合物、聚氟乙烯和芳香聚 砜。优选而言，该塑料薄膜的光学透明度应大于80％。其它适当的热 塑性塑料及供应厂商可在，例如，Modern Plastics Encyclopedia (McGraw-Hill Publishing Co.，New York 1923-1996)的参考文 献中找到。
在本发明的一项实施方案中，聚合物薄膜上具有一层金属层，并 且光学透明度约为5％-95％。本发明使用的塑料薄膜的更理想光学透 明度约为20％-80％。在本发明的一项理想实施方案中，聚合物薄膜的 光学透明度至少约为80％，金属层的厚度可使光学透明度维持在约 60％以上，从而可通过透射光产生衍射图像。这相当于金属层的厚度 约为10nm。但是在本发明的其它实施方案中，金的厚度约为1nm- 1000nm；例如，较厚的金膜(＞20nm)仍适用于通过反射光产生衍射 图像。
在薄膜上沉积的优选金属为金。但也可使用银、铝、铬、铜、铁、 锆、铂和镍，以及这些金属的氧化物。
具有适当大小皱折的任何表面原则上都可作为底板。微晒图方法 首先需要一种适当的凸纹(relief)表面结构来浇注弹性印模。这种 “底板”模板的产生可采用光刻法或其它方法，如商品形式的衍射光 栅。在一项实施方案中，该印模是由聚二甲基硅氧烷制成。
印模的使用可在空气中进行，也可在能够避免受体物质过度扩散 的流体中进行。对大规模或连续印制方法而言，最理想的是在空气中 印制。
本发明的一项实施方案是利用分析物特异性受体层在金属化塑 料聚合物上形成模式。在模压过程完成后，可选择性地使用诸如β酪 蛋白等蛋白排斥剂来阻断塑料上的金属化区域。
本发明将通过以下实施例做进一步的说明，这些实施例决不是要 对本发明的范围加以限制。相反，应清楚了解的是，可能采取其它多 种实施方案、修改方案及其等价方案，在阅读本文的描述后会发现， 这些方案对该领域的技术人员而言并未脱离本发明的精神主旨。
实施例
实施例1
通过碳二亚胺与二甲氨基二碳二亚胺乙酯(EDAC，Polysciences 试剂盒3号瓶，目录编号19539)的偶合产生结合有抗体的聚苯乙烯 颗粒。该实施例是用EDAC水溶液将0.5微米直径蓝色羧化颗粒(Bangs Laboratories；Fishers，Indiana；Cat #D0005070CB)的10％悬浮 液共0.125mL活化1-4小时，漂洗，然后暴露于300微克的黄体生成 素α亚基单克隆抗体(Fitzgerald Industries，Cat.No.10-L10， Clone No.M94136)。将颗粒再次漂洗，用牛血清白蛋白阻断，并 以2.5％的浓度保存在磷酸缓冲盐溶液中。
接着，用5mg/mL β-酪蛋白溶液将金/MYLAR膜预处理(或阻断) 10分钟，然后将膜彻底清洗，并置于空气流下干燥。用硫醇化 (thiolated)抗体包被10微米圆圈二维排列的PDMS印模，方法是将 该印模面朝下置于0.5mg/mL硫醇化抗体溶液中并浸泡10分钟。利用 强空气流将印模表面彻底干燥。将包被的印模与金/MYLAR膜接触5 分钟，然后移开。将印制的所得金/MYLAR膜置蒸馏水中清洗并干 燥。
将1.3mg Sulfo-LC-SPDP(Pierce Chemical Co.；Rockford， IL)溶于2.07mL去离子水，制备成10mM的Sulfo-LC-SPDP水性储 液。结合反应是在含有20mM磷酸钠缓冲液、150mM NaCl、1mM EDTA 和0.02％叠氮化钠的pH7.5的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中进行。将1 毫克冻干的抗体溶解在450ml PBS中，并在该抗体溶液中加入50ml Sulfo-LC-SPDP储液。将混合物置室温下反应60分钟。把该样品加 到此前已用5倍床体积(25mL)PBS平衡的5mL聚丙烯酰胺脱盐柱上。 以PBS为洗脱缓冲液来洗脱组分，并用COOMASSIEProtein Assay (Pierce Chemical Co.)监测各组分中的蛋白。通常是在微量滴定 板中将50μl COOMASSIE试剂与50μl各组分相混合。COOMASSIE Blue底物与蛋白反应，产生蓝颜色，颜色的强度取决于组分中的蛋 白含量。蓝色最强的组分即为含有大部分洗脱蛋白的组分。将这些组 分合并，用来产生二硫化物形式的最终衍生产物。晒图通常即采用这 种形式。
也可选择性地通过还原反应将二硫化物形式的硫醇化结合物上 的二硫化物一吡啶基还原成巯基。此时衍生蛋白的脱盐不是在PBS平 衡的柱上进行，而是在醋酸缓冲液(100mM醋酸钠缓冲液、100mM NaCl，pH4.5)平衡的柱上进行。该醋酸缓冲液的酸性pH值可避免天 然蛋白上的二硫键发生不必要的还原。该还原反应是将12mg二硫苏 糖醇(DTT)溶于500mL醋酸缓冲液，并加入1mL经SPDP衍生的蛋白。 将反应混合物置室温下保温30分钟，然后在已用5倍床体积(25mL) 醋酸缓冲液平衡的5mL脱盐柱上脱盐。再次利用上述COOMASSIE Protein Assay对洗脱组分的蛋白含量进行监测，并将所含蛋白量最 高的组分合并。
二硫化物形式及还原形式的硫醇化结合物在晒图前均以水溶液 形式保存于4℃。
然后利用该传感器来检测分析物。再将分析物溶液与微颗粒相混 合(通常是将50-70微升含有1％牛血清白蛋白的分析物溶液与10-25 微升的1.5-2.5％颗粒悬浮液相混合；分析物溶液与颗粒悬浮液的优 选比率为50∶25)，并加在1平方厘米的传感器样品上。5分钟后， 将中心凿有小孔(如3/16”)的硝化纤维素圆片(孔径5或8微米， Sigma No.N3771或N4146)置于传感器上。使用该圆片可吸走过量 的液体和未结合的微颗粒。此时用点光源透射传感器样品(通过硝化 纤维素膜上的小孔)。如果目标分析物存在，则可在光束的另一侧观 测到衍射图像。
如图4所示，SEM显微照片显示出微颗粒的模式化排布。
实施例2
利用与靶DNA链互补的硫醇化30聚体寡核苷酸(“30聚体”； 由Genosys，Inc.，The Woodlands，Texas制备的硫醇间隔区-5’- CAATCCACGTCACGGACAGGGTGAGGAAGA-3’碱基序列)对10微米圆圈二 维排列(x，y array)的PDMS印模上墨，方法是将印模面朝下置于带 有烘干(50℃，真空)的30聚体与醋酸乙酯混合物的玻璃上并施加 重量。10分钟后，将上墨的印模移开。同时在60℃热板上将金/MYLAR 膜预热5分钟。然后进行印制，方法是在60℃下将上墨的PDMS印模 置于MYLAR膜的金膜上侧；恒温加压并保持接触5分钟。此时移去 印模，用蒸馏水清洗印制过的金/MYLAR膜并空气干燥。然后用 2.5mg/mL β-酪蛋白溶液(溶于pH7.2的磷酸缓冲盐溶液)将该金 /MYLAR膜样品阻断10分钟，再用蒸馏水清洗并空气干燥。
利用这些传感器对靶DNA进行检测。靶DNA与传感器表面的模式 化捕获DNA杂交的实施方法如下：将含有特定DNA链(购于Genosys 的生物素标记70聚体，碱基序列为生物素-5’-GGTAGACCGGA GAGCTGTGTCACCATGTGGGTCCCGGT TGTCTTCCTCA CCCTGTCCG TGACGTGGATTG-3’)的预热的分析物溶液(60℃水浴，2分钟)加 在预热的传感器(60℃热板，5分钟)上，1平方厘米的传感器约加 75微升，再保温10分钟。然后用水清洗传感器样品并空气干燥，用 于随后的微颗粒检测。该方法的一种变化是，例如在PCR扩增过程 中，将分析物溶液与微颗粒同时暴露于传感器。
接着将20-30微升购于Bangs Laboratories(目录号CP01N)的 链霉抗生物素蛋白包被颗粒加在传感器上，颗粒直径1微米，浓度 2.4×1011颗粒/mL。在60℃热板上将该传感器和颗粒加热10分钟(加 盖并确保不出现完全蒸发)，然后用蒸馏水温和清洗。此后用点光源 透射该传感器样品。若靶DNA分析物存在，则可在光束的另一侧观测 到衍射图像。
SEM显微照片显示微颗粒的模式化排布。
实施例3
通过碳二亚胺与二甲氨基二碳二亚胺乙酯(EDAC，Polysciences 试剂盒3号瓶，目录编号19539)的偶合产生结合有抗体的聚苯乙烯 颗粒。该实施例是用EDAC水溶液将0.3微米直径蓝色羧化颗粒(Bangs Laboratories，Cat #DC02/1836)的10％悬浮液共0.125mL活化1- 4小时，漂洗，暴露于300微克IgE多克隆抗体(Fitzgerald Industries，Cat#20-IR77)。将颗粒再次漂洗，用牛血清白蛋白阻 断，并以1.7％的浓度保存在磷酸缓冲盐溶液中。
接着，用5mg/mL β-酪蛋白溶液将金/MYLAR膜预处理(或阻断) 10分钟，然后将膜彻底清洗，并置于空气流下干燥。用硫醇化抗体 (起初的抗体为Fitzgerald Catalog#10-I10，然后用Pierce的 Sulfo-LC-SPDP衍生或“硫醇化”)包被10微米圆圈二维排列的PDMS 印模，方法是将该印模面朝下置于0.5mg/mL硫醇化抗体溶液中并浸 泡10分钟。利用强空气流将印模表面彻底干燥。将包被的印模与金 /MYLAR膜接触5分钟，然后移开。将印制的所得金/MYLAR膜置蒸 馏水中清洗并干燥。
将分析物溶液与微颗粒相混合(通常是将50-70微升含有1％牛血 清白蛋白的分析物溶液与10-25微升的1.5-2.5％颗粒悬浮液相混 合；分析物溶液与颗粒悬浮液的比率为50∶25)，并加在1平方厘米 的传感器样品上。5-10分钟后，将中心凿有小孔(如3/16”直径) 的硝化纤维素圆片(孔径5或8微米，Sigma No.N3771或N4146) 置于传感器上。使用该圆片可吸走过量的液体和未结合的微颗粒。此 时通过硝化纤维素膜上的小孔用点光源透射传感器样品。在光束的另 一侧观测到高度有序的衍射图像，这表明了目标分析物的存在。
实施例4
用溶于磷酸缓冲盐溶液(pH～7.2)的5mg/mL β-酪蛋白溶液将 金/MYLAR膜预处理(或阻断)10分钟，然后将膜彻底清洗，并在空 气流下干燥。用硫醇化抗体(如购于Fitzgerald Industries，Inc. 的兔抗白色念珠菌，Cat#20-CR04)包被10微米圆圈的PDMS印模， 方法是将该印模面朝下置于0.5mg/mL硫醇化抗体溶液中并浸泡10 分钟。利用强空气流将印模表面彻底干燥。将包被的印模与金 /MYLAR膜接触2分钟，然后移开。将印制的所得金/MYLAR膜置蒸 馏水中清洗并干燥。
将该传感器样品暴露于以10％浓度稀释于pH7.2磷酸缓冲盐溶液 的羊抗兔IgG包被的40nm金颗粒(金结合物购于Polysciences， Catalog#22705)。1小时后用蒸馏水将样品彻底清洗并在氮气流或 空气流下干燥。此时样品不能使HeNe激光束发生衍射。
然后将该样品暴露于购自BBI的银增强剂(使用的为BBI International试剂盒#SEKL15(Batch#2575)或大试剂盒#SEKB250 (Batch#2484))。预先将试剂盒中的增强剂和引发剂以1∶1(v/v) 比率混合，然后立即加到金颗粒包被的样品上。暴露10-20分钟(优 选的为10分钟)后，用水将样品清洗，干燥并检测。此时的样品能 够使光发生衍射(无论是激光束还是白色点光源)，这多半是由于较 大尺寸的银集结在金纳米颗粒周围的原因。
实施例5
在分析物存在的情况下，按实施例1或4制备的样品还可通过进 一步处理而产生衍射图像，方法是将其暴露于一种酶联二级抗体，若 分析物存在，则该二级抗体可结合并通过酶特异性致沉淀底物而导致 随后的沉淀出现。
用溶于磷酸缓冲盐溶液(pH～7.2)的5mg/mL β-酪蛋白溶液将 金/MYLAR膜预处理(或阻断)10分钟，然后将膜彻底清洗，并在空 气流下干燥。用硫醇化抗体(如购于Fitzgerald Industries，Inc. 的鼠抗黄体生成素β，Cat#10-L15)包被10微米圆圈的PDMS印模， 方法是将该印模面朝下置于约0.3mg/mL的硫醇化抗体溶液中并浸泡 10分钟。利用强空气流将印模表面彻底干燥。将包被的印模与金 /MYLAR膜接触5分钟，然后移开。将印制的所得金/MYLAR膜置蒸 馏水中清洗并干燥。
将该传感器样品暴露于溶解在1％牛血清白蛋白、磷酸缓冲盐溶 液，pH7.2的黄体生成素(购于Fitzgerald Industries，Inc. Cat#30-AL15)分析物溶液。抗原的浓度为0.1-1000ng/mL不等。置 于室温下1小时后，样品用0.02％TWEEN 20溶液清洗，再用蒸馏水 清洗。然后在二级抗体(Fitzgerald Catalog#61-L05，1∶100稀释 于蒸馏水)中暴露1小时，再如上清洗。将TMB膜增强剂(enhancer) (如Kirkegaard和Perry Laboratories’试剂的10∶1混合物， Cat#50-76-18和Cat#50-77-01)加在样品上，保持10分钟，在圆 圈或部件上显示出蓝色沉淀。该沉淀可在点光源的照射下形成衍射图 像。