用于生物反应的高度特异性的表面，制备它们的方法及其使用方法

本发明尤其涉及可用于生物学的具有很高特异性的表面以及它 们的应用和制备方法。

一些生物反应的很高特异性和很高选择性，尤其抗原/抗体反 应、DNA或RNA杂交反应、蛋白质间或抗生物素蛋白/抗生蛋白链 菌素/生物素类型的反应以及配体和其受体的反应已被认识很长时 间。

现已知道如何利用这些特异性的优势，尤其用于检测一样品中 反应对成分之一的存在与否或作为选择从较复杂的介质中分离一个 反应对成分。

然而，当需要在很复杂的介质中检测一极低浓度分子存在时，目 前已知的方法有时产生很无法预料的结果，尤其在分离和/或检测阶 段产生的背景噪声问题。

因而，将在下文所称的“分子捕鱼”(molecularfishing)，也就是说 当浓度很低时能够检测出每个要寻找分子的可能性，到目前为止还 是不可能的。

例如，DNA样品的分析需要对应于与所需序列互补的所谓“杂 交”探针的使用。在这些条件下，带来的问题是从介质中分离杂交物 并且用良好的信/噪(S/N)比检测阳性反应可能减少的数目。

因此，在大多数情况下，现使用试图扩增所需序列(Sought seq- uence)的中间阶段，如使用PCR方法或导致相同结果的扩增方法， 在这些条件下，增加样品中待测定的序列浓度，且其检测显然更容 易。

然而，扩增阶段对污染物敏感并会导致其特异性的错误。

因此，最好尽可能地不用扩增阶段就能够检测核酸序列的存在。

为了检测特异性的杂交反应，建议在具一定特异性的固体表面 上使用锚定杂交产物的中间阶段。例如，可使用特定的预处理表面， 它使吸附特定的被修饰或未被修饰的蛋白质或DNA成为可能。

在其表面具有如COOH，NH2或OH基团的小珠或小井形式存 在的这类表面在商业上是可得到的(如Covalink，Costar，Estapor， Bangs，Dynal)。

为了获得这样的基团，也建议使用具乙烯基的中间阶段，乙烯基 然后被氧化以产生COOH或OH基团(USA 4,539,061和EP435 785)。

然后，可用如胺基的反应基团活化DNA并且用这些表面完成 反应。然而，这些方法需要将要被吸附的DNA特异性活化。

允许不用前面DNA处理的锚定技术也被描述。该方法在于分 子5＇末端的自由磷酸基与仲胺(NH Coralink表面)起反应。

为了使其与涂有能够与P0起特异反应的基团或蛋白质P1的表 面起反应，也可将DNA吸附到基团或蛋白质P0上。P0/P1对可以 是下面类型的一对：如生物素/抗生蛋白链菌素或针对异羟基毛地黄 毒的异羟基毛地黄毒/抗体(抗-DIG)。

然而在大多数情况下，这样的表面没有足够的特异性(V.Lund et al.，Nucl.Acids Res.，16，1861(1988))。这样，不需要的、甚至微 弱的非特异的吸附型相互作用的存在导致能够与固体形成大量弱相 互作用点的长分子的有效吸附。在要检测少量分子的情况下，这些 表面导致潜在应用缺乏敏感性和/或带有高水平的背景噪声。此外， 这些表面中的一些具有在检测阶段中可能是破坏性的不需要的高水 平荧光。

至于检测本身，尤其对于DNA的检测，法国专利78 10975描述 了探针与允许用生色底物手段显示的与酶偶联的方法。此外，可通 过色度测定来定量反应。

然而，这样的技术不直接适应于定量检测；因而，在这里，大多数 情况下为了所需的核酸数量，也应通过扩增阶段，如通过PCR方法 来完成。

为了避免放射性标记物的使用，这里发展了一种所谓用“冷探 针”的检测方法，就灵敏性而言，放射性标记物产生更接近的结果，但 显然带来处理上的问题，如果需要高灵敏性的话，存在放射性产物及 长的显示时间的问题。

对于一些具体的应用，尤其是来自活体图像(ex vivo imaging)的 方法，建议用偶联杂交产物与(尤其是PMMA)表面适于被化学处理 的微珠来观察反应的直接方法。该方法基于在扫描电镜下对这些典 型直径为60nm微珠存在的直接鉴定、并且此外基于上述已知的但 对在固体上锚定不足够特异的技术。

上述技术显然不只限于核酸的检测。基于同样的精神，建议检 测抗体。它们将在这里不被描述，并且一般来说它们是使抗体的存 在与抗原分子在固体上的相关锚定的偶联成为可能的ELISA型测 试。又一次，存在着特异性和不必要的反应的问题。那么，检测阶段 可基于与具有自身灵敏性问题的生色反应偶联。

总之，前面的技术方法或其联合具有许多不利因素，尤其： —  或者是由于放射性产物的使用而有潜在危险， —  或者是需要太长的显示时间， —  或者是在扩增阶段的水平上为具体的问题破坏， —  或者是需要不足够特异的固体表面 —  或者是太微弱的灵敏性， —  或者除了吸附于固体阶段外，最后还需显然不太方便的电子显 微镜的使用。

最后，在大多数情况下，已知方法不能够在给定分子上识别所需 单位的具体位点。现在，当需要完成作图，尤其是在基因组范围内作 图，这种识别是重要的，首先就需要识别相对于给定DNA或RNA 分子末端的大致空间位置。

建议克服前面方法不利因素的本发明是基于高度特异性表面的 使用，在使用表面的过程中，导致极度有限的背景噪音，尤其是由于 它们排除掉不需要吸附的事实。

更为特别的是，本发明涉及用于生物反应的高度特异性的表面， 其特征在于其包含在其表面上至少有一基本上紧密的有机化合物层 的支持物，该层外面具有在一定反应条件下(尤其是PH或离子含 量)对一种生物活性分子具有吸附的乙烯双键，尤其是乙烯基，该层 的其它成分在所述反应条件下对所述的分子基本上是不可接近的。

关于“亲和性”，这里应该明白是指化学反应性和任何类型的吸 附，这是在所述生物分子吸附的条件下。

关于“支持物”，意思是指固体支持物和由诸如尤其具有上述紧 密层的液体或气体颗粒的非固体成分组成的支持物。

表面“基本上紧密”，就是说其限制了具生物活性的分子进入到 内层和/或支持物，应明白表面的涂层缺陷是可以容忍的。

这些对生物反应高度特异性的表面包含其表面具有能够进入溶 液的双键(尤其乙烯基(-CH＝CH2，下文C＝C表面))的支持物。 在特定的介质PH或离子浓度条件下，它们能够直接锚定生物类 (DNA、RNA、PNA、蛋白质、脂类、多糖)分子。尤其，这些表面不需 要表面或待锚定的生物分子的特异性化学修饰，还没有提及具乙烯 基团表面如此使用的资料。

关于“锚定”，这里应该明白是指通过由化学反应产生的共价键， 或者作为选择由诸如任何类型吸附的理化相互作用产生的非共价键 进行的吸附，这些是在对所述生物分子吸附的介质PH或离子强度 条件下。

根据本发明，表面可通过多种方法获得。可以提及如： (A)一任选分枝的含碳多聚物层，至少1nm厚，具有：

·含乙烯双键的基团，

·由碳氢或碳氟基团组成的保留层； (B)通过在一固体或多分子层上沉积或锚定而获得的表面，后者可 通过用Langmuir-Blodgett胶型非共价键吸附的连续层形成或通过 分子自身装配而获得，这允许用共价键吸附的一层形成。

在第一种情况下，表面可通过至少一个单体的多聚化以在多聚 体表面产生具有乙烯双键的所述基团而获得，或者作为选择，通过多 聚体表面的部分解聚，以产生所述基团，或者作为选择通过多聚体的 沉积产生。

在这个方法中，形成的多聚体具有类似多聚烃衍生物，尤其是合 成橡胶型(如聚丁二烯，聚异戊二烯)表面的乙烯双键。

在第二种情况下，根据本发明，用于生物反应的高度特异性表面 含有： —  在支持物上一个基本上具有延伸结构的有机化合物单分子紧密 层，至少具有：

·对支持物具有亲和力的附着基团和

·含有在附着条件下对所述支持物和所述吸附基团具有很少或 不具亲和力，但对一类生物分子具有亲和力的乙烯双键的裸露基团。

为了获得基本上紧密的层，除裸露基团外，各种有机化合物最好 能相互起反应以产生交联键；这样，“基本上”紧密的单分子层通过支 持物不能进行或几乎不能进行不需要的反应的特征而获得。

最好，有机化合物在一端具吸附基团，另一端具裸露基团。当 然，用考虑各种如其吸附基团位于分子的中央，后者的每个末端具一 个裸露基团的实施方案。

可分析表面，根据： a)支持物， b)在支持物上具裸露基团和吸附基团的分子， c)确保及附的支持物和所述分子之间的相互作用。

吸附可首先是非共价型，尤其是亲水/亲水和疏水/疏水型，如在 Langmuir-Blodgett膜中(K.B.Blodgett，J.Am.Chem.Soc.57，1007 (1935)和US5,102,798)。

在这种情况下，吸附基团将或者是亲水的，或者是疏水的，尤其 诸如CH3、CF3，CHF3、CH2F的烷基或卤代烷基。

吸附也可以是共价型的，在这种情况下，吸附基团将与支持物起 化学反应。

一些类似结构的表面在电子领域已被提及，尤其当吸附是共价 的，L.Netzer and J.Sagiv，J.Am.chem.Soc.105，674(1983)and USA -4539061。

本领域的技术人员有较宽的基团范围可得到。作为非限定的例 子，可提及金属烷化物型基团，如硅烷，氯硅烷、羟乙硅烷、甲氧硅烷。

吸附基团显然选作使用的支持物功能。根据本发明，支持物至 少在表面可由多聚体、金属、金属氧化物、半导体元素或诸如氧化硅 或其结合物的半导体元素氧化物组成。尤其可提及玻璃及表面氧化 的硅。

在吸附基团中，应更特别提及金属烷化型基团，如硅烷、氯硅烷、 氯硅烷、硅烷醇、甲氧硅烷、羟乙硅烷、硅氮烷、磷酸盐、羟基、酰肼、酰 肼定、胺、酰胺、重氮基、吡啶、硫酸盐、磺酸、羧基、硼酸、卤素、卤酸、 醛。

更具体地说，作为吸附基团，将优先选用能够与邻近等价基团起 交联反应以产生交联键的基团；例如，这将是硅烷型衍生物，尤其是 二氯硅烷、三氯硅烷、二甲硅烷、三甲硅烷、二羟乙基硅烷和三羟乙基 硅烷。

借助于也许存在于吸附位点和裸露基团间链内的反应基团将其 聚合，也可在单层深度内的任意点完成这些交联键。因此，已知联乙 炔基允许单层的单维或双维的聚合。

吸附基团的选择将显然依赖于支持物的性质，硅烷型基团十分 适宜在玻璃和硅上的共价结合。

最好，连系裸露基团与吸附基团的链是至少包含1个碳原子的 链，最好多于6个并且一般来说从3～30个碳原子。当实际上层内 的侧面偶联形成时，无论是通过离子、配位还是共价的偶联，便获得 通过自我装配的高度有序面，尽管与在紧密单层获得的分子数目相 比，起始的表面仅具有有限数目的活性锚定位点。

已知的用硅烷衍生物，例如：Si-OH＋Cl3-Si-R-CH＝CH2产生Si-O-Si-R-CH＝CH2，(R代表如(CH2)4)对表面活化的技 术在玻璃或硅的情况下可被优先使用。文献中已知使用超纯溶剂的 这种反应。反应导致了其C＝C末端位于暴露在外界表面的分子 层。

在高度特异性表面生产的范围内，本发明也涉及将带有双键的 分子移植于使避免溶剂的使用成为可能的气相使用的这类反应的内 容。

在使用金的情况下，后者任选地以底物上的薄层形式存在，已知 的表面活化技术使用硫醇衍生物，例如：Au＋HS-R-CH＝CH2产 生Au-S-R-CH2CH2，R代表如(CH2)4。在液体介质中的这种反 应被描述并且如以前的三氯硅烷一硅反应一样，导致其C＝C末端 位于裸露于外界的表面的分子层。

当然，术语“支持物”也包括诸如玻片的单一表面，但也可是粒 子，无论是硅粉还是多聚物小珠，并且也可是像在各种分析技术中所 知的此外还可被制成磁性、荧光或有色的(如棒形、纤维状或有结构 的支持物的)任何形式。

当检测是用荧光完成时，要选择的支持物最好不具有荧光或几 乎不具有荧光。

通过存在来自裸露基团或吸附分子的特异性反应位点的优点， 根据上述模式(A)或(B)获得的表面具有高度的特异性。

此外，根据模式(A)或(B)获得的表面具有以下的意想不到的和 显著的特征：

(i)通过无需分子的特异性活化的末端伴随很低水平的非特异 性反应的特异性和高度PH依赖性的DNA锚定。

(ii)没有特殊的化学修饰，将它们锚定于蛋白质或其它生物类分 子上的可能性；

(iii)制备对抗原(如异羟基毛地黄毒)或配体(如生物素)特异性 表面的可能性；

(iv)很低的内部荧光水平，当需要时，低于待测单分子荧光信号 的荧光背景噪声(典型面积100×100μm)；

(v)用与分子数目无关的S/N比检测分离分子的可能性，用下 述的并且基于鉴定对表面有微弱非特异性相互作用的肉眼可见的标 记物的存在的高S/N比，通过各种技术优势是可能的。

这样获得的表面最好涂有生物活性分子，(它们)选自： —  蛋白质 —  核酸 —  脂类 —  多糖及其衍生物。

在蛋白质中，应提及抗原和抗体，配体，受体，但也可是抗生物素 蛋白或抗生蛋白链菌素型以及这些化合物的衍生物的产物。

在RNAs和DNAs中，应提及α、β衍生物及硫醇衍生物和诸如 PNAs的混合化合物。

生物分子的吸附可以是共价的或非共价的，例如通过吸附、氢 键、疏水或离子相互作用，其中如为了增加它们的粘附，优先用已知 方法(“Chemistry of Protein Coijugation and Cross-Linking”，S.C. Wong，CRC Press(1991))完成嫁接的分子与吸附分子之间的交联 是可能的。

有了一个含有-CH＝CH2基团，将被在下文中称为“C＝C表 面”或“带有乙烯双键的表面”的裸露基团，直接锚定，尤其是DNA 或蛋白质是可能的。在本发明的框架内，已证明这些表面具有高度 PH依赖性的反应性。该特征使锚定核酸或蛋白质，尤其通过其末 端，用给定的PH范围并常可以PH控制的反应速度成为可能。

这样，对于PH5-5的DNA，锚定反应在一小时(如果其不受扩 散限制)完成并且通过末端发生。另一方面，PH为8时，吸附很低 (反应速率小5～6个大小的数量级)。与需要DNA(生物素、DIG、 NHS及类似物)活化或在-NH2和-COOH或-POOH之间形成肽 或磷酰胺(phosphorimide)键的特异性试剂(碳化二亚胺、二甲庚二酸 盐(dimethyl pimelidate))的其它表面相比，该PH依赖性的末端特异 性吸附效果是一种改进。

根据本发明的表面可以直接锚定蛋白质(蛋白A、抗-DIG、抗 体、抗生蛋白链菌素及类似物)。已观察到(i)可保留分子的活性及 (ii)制备表面(起初C＝C)的反应性被完全掩盖以利于一类分子的单 一反应性。因此，可以用相对较高的起始反应性开始过渡到具有高 度特异反应性(如蛋白质上特异位点)的表面。

通过在表面(如抗-DIG锚定特异性抗体，产生其反应性限于 抗原(如DIG基团)的表面。这意味着起初的化学基团均被锚定的 抗体所掩盖。

在反应(化学或生化)表面锚定其它生物活性分子，尤其病毒或 其它成分：尤其膜、膜受体、多糖、PNA，也是可能的。

在制备的表面上吸附生物类反应产物(如PCR)也是可能的。

本发明也涉及用根据本发明方法及所有使用这种类型表面的方 法获得的表面，无论它们是允许对生物分子的检测和/或定量的方 法，还是一些生物分子的分离，尤其是用抗原/抗体和/或DNA， DNA/RNA偶联技术对样品的分离方法。

为了根据(A)和(B)产生表面层，本发明也涉及制备对上述生物 反应高度特异性表面的方法，及尤其该方法特征在于： —  基本上具有延伸结构的有机化合物单分子层和紧密层，至少具 有：

·对支持物具有亲和力的吸附基团，及

·含有在吸附条件下对所述支持物及吸附基团不具或很少具有 亲和力，但对一种生物分子具有亲和力的乙烯双键的裸露基团被吸 附于支持物上。

本发明也涉及处理的表面通过特异性试剂手段和通过用与检测 分子数目无关的S/N比检测方法在对分离分子检测中的应用。

因此，总的来说，本发明涉及在样品中具有生物活性分子的检测 和/或分析方法，其特征在于使用了其上吸附有能够识别样品分子的 具有生物活性分子的上述表面，并且在于检测或分析是用检测吸附 分子存在的试剂、荧光或其它物质来完成。

在试剂中，有荧光和非荧光试剂。

荧光试剂含有荧光分子，优选的是直径大于0.1μm并且与预处 理表面起直接或间接特异性反应的长分子。例如，但并不意味局限 于此，通过荧光探针(溴化乙锭、YOYO、荧光核苷酸及类似物)手段 染色的能够直接锚定于C＝C表面，或通过在具有互补蛋白质(抗- DIG，抗生蛋白链菌素及类似物)表面上分子(DIG、生物素及类似 物)修饰的双链DNA分子。

非荧光试剂尤其由通过特异性吸附的分子、直接或间接地锚定 于预处理表面的小珠组成。由于表面的处理，这些小珠与表面仅显 示出微弱的非特异性相互作用。例如，但并不意味局限于此，涂有抗 生蛋白链菌素并根据本发明通过生物素化DNA锚定于表面、具有 能与DNA分子另一端起反应的位点的Dynal小珠。

依据所需分子是通过荧光直接检测还是通过上述试剂手段间接 检测，检测将被描述为“直接检测”或“信号检测”(“flag detection”)。

为了减少与抑制性慢反应时间有关的问题，使用小的反应体积 可优先减少试剂向表面的扩散时间。例如，但并不意味局限，通过在 由两个表面(其中一个被根据本发明处理以产生反应位点并且另一 个失活或被处理以不具有反应位点)之间的空间决定的几微升体积 内完成反应。

对小数目分子(典型1～1000)发生的特异性反应数目的检测可 通过既不需电子显微镜也不需放射性和PCR的低噪声宏观物理测 试来完成。

检测方法可由仅具有有限实验室经验的人员来完成。

依靠试剂，对于用于锚定试剂的小数量反应的低噪声宏观检测， 可使用本发明的两种实施方法(模式A和模式B)。

在本发明的所谓×模式的实施中，产生的特异性反应数目的测 试可通过荧光技术直接获得，对于本发明的一些具体实施例，这将使 单独地鉴定起反应位点的数目成为可能。在这种情况下，高度特异 性表面被优先选用以具有很低的荧光水平；尤其支持物应具有低荧 光。

锚定荧光试剂以后，可能是小数目锚定反应的检测和计数可通 过借助于宽数值孔经镜头的荧光显微镜来优先完成，这使直接用肉 眼，或者经信号识别后，寻找锚定荧光分子的数目成为可能。

为了搜索比仅固定的范围更大的表面，可优先完成视野的扫描。

在本发明的所谓Y模式的实施中，检测了小珠型(例如，荧光 的、磁性的、有色的)宏观试剂。

这样的技术衍生自Manning et al.在此意义上，反应是通过微珠 的存在与否来显示。在一实施例中，新方法包括：

(i)具特异反应性小珠的使用，

(ii)在大小方面非毫米(nanoscopic)检测的但位于0.1μm～ 200μm范围，可通过宏观技术检测的小珠的使用和

(iii)由于根据本发明的产物的使用，小珠和表面间非特异性反 应的缺乏。

然后，每个表示锚定反应特性的这些宏观小珠的数目通过宏观 物理方法测定，方法中(但并不意味局限)，可提及小珠上的光扩散， 光学显微镜及小珠的荧光。

一些生物反应的特异性也许是有限的。这样，在杂交领域内，当 配对数目较少并因此结合质量较低时，杂交可能是不完善的(与其它 位点反应)。本发明也涵盖对获得键质量测试阶段的可能使用。该 测试使分离以微弱非特异性方式，尤其通过吸附、疏水力、不完善氢 键、不完善杂交配对的产物成为可能。

因而，在如上述的检测或分析方法中，本发明也涉及其具生物活 性分子与样品分子间的反应产物为了破坏检测前的错配而进行强制 的方法。

除了破坏错配对的可能性，该方法还提供了使测量或观察变容 易的定向偶联产物的可能性。

这样，经互补成分的吸附之后，在表面上应用，强制是可能的，该 强制包括单独或联合使用：

—离心，

—应用于非荧光试剂(在这种情况下，采用包括可磁化的或磁性 微珠)的磁场梯度，

—搅拌，

—液体流，

—凹液面移动，

—电泳，

—温度差异和/或温度梯度。

然后，维持其整体性或要被破坏的系统数目通过下述的低噪声 检测技术来测定。

应该注意到使用根据本发明的表面，在其吸附以后通过空气/水 凹液面的移动，尤其是经过DNA，至少在一点定向分子是可能的。 这样，观察到空气/水凹液面通过溶液中及锚定于表面的DNA的移 动导致了锚定分子一致的延伸。在这种情况下，它们似乎在开放的 空气中以延伸的荧光杆形式存在。延伸的分子在开放的空气中是稳 定的并且甚至可在数周后观察而没有显示明显的降解。

这些异常的意想不到的观察资料暗示对锚定于表面的DNA分 子计数的可能性：一方面，表面没有高度荧光，信/噪(S/N)比良好， 另一方面，寻求高度相关的对象(杆形)，增加S/N比很容易。就是 说如果不考虑灰尘，没有与特殊空间相关的不均一性。应该注意在 溶液中，以随机卷曲形式存在的分子要热运动，因而导致收集到的它 们荧光信号的很大差异，一般来说，以小的场深并限制对它们的观 察。本发明也涵盖序列比较并因此允许用很高的S/N比对分离分 子观察的固定技术。

较显著的是该比例与锚定分子数目无关。由对分子检测而产生 的S/N比相当于10,000。此外，该延伸技术使容易地区分不同长度 的分子成为可能。

为了进一步提高S/N比，可优先进行以下阶段： —  分子是静止的，其荧光信号可被整合。 —  显微镜观察显示一较小的视野(典型100μm×100μm，用×100 油镜镜头，N.A.＝1.25)。对于1cm2样本，可进行扫描，或可设想使 用低倍放大镜头(×10或×20)但具有高的数值孔径。 —  杆总是平行的，为了进一步增加S/N比，可设想一光学空间滤 过方法。 —  可设想(使用)其它的珠形荧光方法(印#103426)。 —  在化学嫁接(C＝C)范围和免疫型键(DIG/抗-DIG)情况下，分 子的线型化被观察到。 —  一旦表面存在于开放的空气中，DNA分子是稳定的(它们甚至 在数周后维持其整体性)和发荧光的。例如，如果该检测是通过荧光 显微镜完成(但并不意味着局限于此)，为了延缓锚定分子的锚定时 期和寻找/计数时期，该特性可被优先选用。本发明也涵盖这样的使 用方法： —  可使用双(或多)荧光技术以改进S/N比或检测双或多官能度。 —  为了将分子延伸到其它系统，尤其如油/水或水/表面活性剂/空 气系统，可扩展这里使用的空气/水凹液面。

通过一个或更多个连续方向和电泳或流动，使用在溶液中一端 被锚定的分子动力学定向是可能的，因此，通过对相应于给定方向 (例如，但并不意味局限于此，通过使用经适当安排的允许被观察分 子一些定向的优先信号获得的光学空间滤过器(filter)荧光信号暂时 差异的分析，可用这样的技术导致对给定方向分子存在的同时检测。

然而，观察结果显示该技术在其最简单的形式(在单一方向伸 展，没有同时检测)要比使用凹液面效果差得多。

本发明描述的表面和/或试剂和/或检测技术可用于许多应用 中，其中(但并不意味局限于此)： —  用于可利于病原体诊断或遗传作图的DNA或RNA测序的一 个或更多个成分的鉴定； —  对可优先用于遗传作图的DNA片段大小的测定； —  具有检测小数目(可能不到1000)免疫反应可能性的ELISA技 术灵敏性的改进。

DNA/RNA序列的鉴定首先可通过在溶液体积内DNA/RNA 分子与互补探针(例如，通过杂交或通过对所需片段特异的蛋白质手 段)反应来完成。在这种情况下可以有两种方法。

下面的描述有些将参照附图，其中： —  图1图示了用荧光DNA分子通过与锚定分子杂交来检测病原 体； —  图2图示了通过DNA延伸和使用标记DNA的遗传作图； —  图3图示了借助于“信号”分子(：用作反应标记的荧光DNA)对 免疫反应的检测(ELISA)； —  图4为显示通过凹液面移动入噬菌体DNA延伸的荧光显微图 谱，在左边可看到在溶液中被平行于凹液面的蒸发流延伸的DNA 分子，右边可看到暴露于空气中的经垂直于凹液面延伸的DNA分 子； —  图5(a)和5(b)为分别显示在涂有抗—DIG表面以异羟基毛地 黄毒(DIG)标记的并被凹液面延伸的DNA和作为对照的抗DIG表 面的未标记DNA的荧光显微图；可注意到表面的很高特异性及不 存在非特异性锚定； —  图6为显示常规的商用表面(如NUNC)的光显微图谱，应注意 导致表面不可能用于单分子荧光检测的很高的荧光不均一性。

在“诊断”模式中，探针(“锚定物”)拥有根据本发明(例如具有抗 -DIG抗体或抗生蛋白链菌素作为锚定位点)的能够特异性锚定于 表面的反应基团(DIG、生物素及诸如此类)。锚定反应的检测可通 过用荧光分子(溴化乙锭、YOYO、荧光核苷酸)染色的DNA分子的 荧光检测直接完成(图1)。锚定反应的检测也可通过“信号分子”(： 根据本发明，能够吸附DNA/RNA分子(如通过杂交、蛋白质-DNA 相互作用及类似方法)，但对探针锚定位点不具有亲和力的试剂)的 检测间接完成。

在“作图”模式中，互补探针可根据本发明直接被偶联于荧光试 剂。例如其可以是具有修饰碱基以发荧光的互补DNA单链或以荧 光团A染色的且末端具有互补与所需序列的单链片段的较长双 DNA链。对于不同的探针，可使用不同颜色的荧光团。也可优先染 色具不同颜色荧光团的探针刚被杂交于其上的DNA分子。DNA- 探针杂交物一端被锚定并按上述之一的方法被伸展。锚定点到杂交 点的距离或杂交点之间的距离根据上述方法(图2)通过检测探针荧 光来测定。

例如，但并不意味着局限于此，约3000碱基对并一端具有互补 于所需基因单链片段的标记DNA用荧光团A(YOYO1)染色。该 DNA被杂交然后联结于待作图的单链DNA，并且然后后者以第二 荧光团B(POPO1)染色(经随机引物反应后以将其转换为双链 DNA)。该分子然后一端被锚定(例如DIG/抗-DIG键)并通过凹 液面行为被延伸。可通过双荧光显微镜(2色A和B)观察的分子末 端与标记基因位置间的距离使用精确性为1000碱基对(0.3μm)数 量级来建立所需基因位置成为可能。

DNA/RNA序列鉴定也可根据本发明通过所需序列和表面反 应位点之间的反应来完成(例如互补寡核苷酸或对所需片段特异的 蛋白质反应位点)。在这种情况下，锚定反应的检测可按上述直接或 间接地(通过“信号分子”手段)完成。

应非常明白根据本发明的DNA/RNA序列的鉴定既可用于诊 断目的(例如病毒或染色体抗原存在或缺失的检测)又可用于遗传作 图的目的。该序列事先可经过用任何方法，尤其PCR进行扩增的阶 段。

此外，如K.R.Auan et al(US 84 114)所提及的，遗传作图可通 过测量DNA片段大小来完成。现在，根据本发明的表面和伸展上 述分子的新技术(尤其并且优先地通过凹液面伸展)之间的偶联使测 量伸展分子的长度成为可能，并且这是基于对很小的样本(几千个分 子)。

例如，但并不意味局限于此，可用下面的方式完成该方法：

DNA样本被裂解(通过限制性酶手段)，荧光团染色并且然后锚 定于具反应基团的表面(如C＝C表面)。分子然后通过凹液面延伸 且其伸展片段的大小用分辨率及最大长度为1000bp(0.3μm)数量 级的荧光光学显微镜加以测定。

根据本发明的表面可用于完成已知的允许对抗原或抗体检测和 /或定量的方法，尤其是使用酶系统的ELISA方法或使用放射性标 记的RIA型方法。这些技术将不作详细描述。

将根据本发明的表面用作ELISA方法中(具有根据本发明将一 试剂(“信号”)锚定于ELISA中一试剂(图3)上的阶段)的免疫反应 支持物也是可能的和优越的。检测可完全通过荧光测定自然完成。 也可计数反应数目；这可根据本发明描述的检测方法优先完成，尤其 是通过凹液面延伸，并且这是凭借本发明产物的低水平荧光和非特 异性相互作用。该方法允许对小数目反应，尤其不到1000，以良好 的S/N比加以测定。

因此，通过夹心ELISA方法(抗体-抗原-修饰抗体，例如生物 素化的)的微小变动，根据本发明在表面上嫁接试剂，如可将荧光 DNA锚定于抗生蛋白链菌素。

所有ELISA技术的变通方法的应用都更为灵敏。整体荧光测 定技术已被用于测定ELISA反应的质量。然而，根据本发明的方法 允许更好的测定，因为其对来自单分子的荧光信号敏感。

当然，可将这些表面用作至少吸附生物类反应的一个产物的表 面，例如，但并不意味局限于此，扩增反应产物，无论PCR或相关的 方法及最终，使用这种表面作为亲和色谱支持物，无论是制备型的还 是用于检测的是可能的。

在这种情况下，例如将给定数量的寡核苷酸嫁接于将构成柱固 定相的硅珠上是可能的。

层析阶段应允许柱相对于洗脱剂的特征性特异性，例如其中一 些具有互补序列或很接近于嫁接的寡核苷酸序列的DNA混和物。

本发明最后涉及根据本发明的表面在诊断或分离试剂盒中的使 用。

当阅读下面实施例时，本发明的其它特征和优势将会出现。 材料和方法

λDNA和单克隆抗体(抗-DIG)获自BoehringerMannheim。三 氯硅烷获自Roth-Sochiel。荧光核酸探针(YOYO1，YOYO3和 POPO1)获自Molecular Probes。超净玻璃盖片获自Erie Scientific (ESCO)盖片。磁性颗粒获自Dynel。显微镜为NIKKON Diaphat 倒置显微镜，配有用于表面荧光(epifluorescence)的氙灯及用于成像 的Hamamatsu增强CCD相机。 表面处理

玻璃盖片在有氧环境下以紫外光照射1小时来净化(通过形成 臭氧)。然后立即将其置于预先用氩气流除水的干燥器内。约100 ～500μl体积的适当三氯硅烷(H2C＝CH-(CH2)N-SiCl3)导入干 燥器内，约12小时(n＝6)或1小时(n＝1)后表面从中取出。至取出 时，表面纯净且无水。

被这样活化的盖片可与蛋白质反应。300μl体积的蛋白质水溶 液(20μg/ml)(蛋白质A、抗生蛋白链菌素及类似物)置于从( H2C＝CH-)基团活化的盖片上。盖片在室温下孵育约2小时，然后以超 净水冲洗三次。被这样处理的表面是干净且无水的。以蛋白A处 理的表面通过在20μg/ml抗体溶液中孵育，可与抗体，如抗-DIG 抗体起反应。 天然DNA在双键表面上的锚定

不同浓度和处于不同缓冲液(分子总数＜107)的一滴2μl荧光 标记λDNA溶液(YOYO1，POPO1或YOYO3，但无具体的末端标 记)置于预处理的盖片(H2C＝CH)上并且盖以未处理的玻璃盖片 (直径15mm)。制备的样品在水蒸汽饱和的环境中室温孵育1小 时。在0.05M MES缓冲液中(PH＝5.5)，实质上已观察到DNA分 子的总的锚定。相比之下，在0.01M Tris缓冲液(PH＝8)中，特别 的是没有被锚定的分子(比率＞106)。这种依赖使通过PH控制表 面的活化/失活(相对于DNA而言)成为可能。 通过凹液面行为对锚定的检测

通过将上述的制品转移到干燥的环境中。当蒸发时，溶液将垂 直于凹液面伸展锚定于表面上的DNA分子。DNA分子的毛细力量 (几十皮可牛顿)的确足以完全地伸展分子(大于熵的弹性力)，但太 微弱而不能打破分子末端和处理表面间的键。荧光标记的DNA，伸 展的分子(总长约22μm)可单独地且容易的观察。表面和DNA之 间的锚定可限于末端，伸展可以是λ噬菌体，YAC DNA，或者是E. coli(总长度大于400μm)DNA。该延伸的暴露于空气中发荧光的 DNA制品在数天内稳定并且可通过表面荧光(Nikkon Diaphot倒置 显微镜，用×100镜头，O.N.：1.25)以非破坏性方式观察。 通过电泳对锚定的检测

电泳槽通过处理盖片与未处理玻璃盖片之间的石蜡环(约 100μm厚)而形成，两盖片间插入铂电极。通过简单地融化石蜡环， 装置被严格地铸为一起。用经过留在石蜡环上的二个开口的毛细作 用将DNA溶液导入电泳槽，然后石蜡中的两开口被封闭。按上述 在室温中进行温育。当在两个铂电极间加低电压(几伏)时，通过荧 光观察到自由DNA分子的移动(每秒几十微米)及可因此用表面荧 光显微镜容易且单独鉴定的沿着锚定分子流方向的延伸。 特异性锚定和检测

通过用特异性单克隆抗体，按上述处理表面，可很精确地控制它 们的特异性。这样，测试抗-DIG处理的表面相对于以互补于COS 末端之一的寡核苷酸杂交的并具有异羟基毛地黄苷毒基团(DIG)的 λDNA及相对于未杂交DNA的特异性。在第一种情况，通过凹液面 行为，观察到锚定分子实质上总的延伸。在第二种情况，在整个样品 中仅观察到几个被锚定的分子(＜10)。因此，估计根据本发明方法 的特异性大于106。 检测的灵敏性

为了测定通过凹液面延伸的测定方法的灵敏性，含总分子数为 105、104及1000的位于0.05M MES(PH＝5.5)的λDNA液滴2.5μl 置于双键表面。锚定按上述完成。盖片后用表面荧光显微镜观察以 测定锚定分子的密度。后者的确对应于预先估计的：对于总数为 105DNA分子，每视野(100μm×100μm)约4-6个DNA分子。对于 最低浓度，可观察到约10个由凹液面行为延伸的分子。该数字实际 上受需要覆盖整个样本(约25,000)的大数目视野的限制，这将使人 工搜索变得困难，但其可用较弱的但视野较大的镜头优先自动完成。 总之，根据本发明方法的灵敏性允许对不到1000DNA分子的检测 和单独计数。