分子生物学包括了各种各样的用于分析核酸和蛋白质的技术，许多这 样的技术和方法构成了临床诊断试验和检测的基础。这些技术包抬核酸杂 交分析，限制性酶分析，基因序列分析，核酸和蛋白质的分离纯化(见， 例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆：实验指南，第二 版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
大多数这类技术涉及到对大量的样品进行大量的操作(例如移液、离 心、电泳)。这些操作通常是复杂而耗时的，并通常需要高度的准确性。 由于缺乏敏感性、专一性及重现性，许多这类技术在应用时受到局限。例 如，上述问题限制了核酸杂交分析在诊断方面的许多应用。
进行一种遗传病或传染病的DNA杂交分析的全过程是很复杂的。概 括地讲，全过程可分为许多步骤和分步骤(见图1)。在诊断遗传病的情 况下，第一步是得到样品(血液或组织)。依据样品的类型，进行不同的 预处理。第二步是裂解或溶解细胞，释放出粗DNA物质及其它细胞组分。 通常还需要几个分步骤来去掉细胞碎片及进一步纯化粗DNA。在这一点 上，有几种方案供进一步的处理与分析。第一种方案包括使纯化的DNA 样品变性，并在多种方式(点印迹、微珠、微量滴定板等)的一种上进行 直接杂交。第二种方案是Southen印迹杂交，包括用限制性酶切割DNA， 在电泳胶上分离DNA片段，印在一滤膜上，然后用特异性DNA探针杂 交印记。此方法有效地降低了基因组DNA样品的复杂性，因而有利于提 高了杂交的专一性与灵敏度。不幸的是，此方法既耗时又费力。第三种 方案是进行聚合酶链式反应(PCR)或其它的扩增方法。PCR方法扩增(增 加)大量的靶DNA序列。靶DNA的扩增有利于克服基因组DNA分析中 存在的有关复杂性和灵敏度问题。所有这些方法都是耗时的，相对复杂 的，大大增加了诊断试验的费用。在这些样品制备及DNA加工步骤完成 以后，进行真正的杂交反应。最后，通过检测和数据处理将杂交结果转 变为分析结果。
样品制备和加工步骤典型地独立完成，与其它的杂交主要步骤以及 检测和分析区分开来。实际上，包括样品制备和DNA加工的各个分步骤 常与其它分步骤分离开来，单独进行操作。就这些分步骤具体而言，样 品可通过许多手段获得，例如以全血，组织或其它生物流体样品中得到。 在以血液为样品时，首先需加工样品除去红细胞，保留需要的有核细胞 (白细胞)。这个方法通常采用密度梯度离心来完成。然后，将细胞裂解或 溶解，优选地用超声波、冻融技术或加入细胞裂解剂。通过离心，将粗 DNA与细胞碎片分离开来。在杂交反应之前，双链DNA被变性为单链 形式。双链DNA的变性通常采用下列技术，包括加热(＞Tm)，改变盐浓 度，加碱(NaOH)或加入变性剂(尿素、甲酰胺等)。工作人员建议在电化 槽中将DNA变性为单链。该理论呈述如下：在电极的界面处有电子转移 到DNA，这有效地削弱了双链结构，使得双链分离。综述见Stanley， “通过电压使DNA变性”，英国专利申请2,247,889，公开于1992年3 月18日。
核酸杂交分析通常包括用过量的DNA探针在相对大量的复杂的非 靶核酸中检测微量的特异性的靶核酸(DNA或RNA)。在样品制备中，使 DNA复杂性降低的分步骤被用来帮助检测低拷贝数(即10,000到100,000) 的靶核酸。利用聚合酶链式反应(PCR)扩增靶核酸序列能在一定程度上克 服DNA的复杂性(见M.A.Innis等， PCR方案：方法和应用指南，学术 出版社，1990)。扩增产生了大量的靶核酸序列，促进了随后的直接探针 杂交步骤，但扩增方法费时，繁琐，通常必须在一个相对于其它分步骤 独立的基础上进行。进行扩增所用的装置比较大并且很复杂。
实际的杂交反应代表着整个方法中最重要也是最核心的步骤。杂交 步骤包括，在一组最适条件下，将制备的DNA样品与专一性报道探针 (reporter probe)接触，使探针与靶DNA序列发生杂交。杂交可以以众多 方式的任意一种进行。例如，多重样品核酸杂交分析已经在多种滤膜和 固体支持物上进行(见G.A.Beltz等，酶学方法，Vol.100，Part B，R.Wu， L.Grossman，K.Moldave编，学术出版社，纽约，第19章，pp.266- 308，1985)。一种方式，即所谓“点印迹”杂交，包括靶DNA与滤器 非共价连接，然后，再与放射性同位素标记的探针进行杂交。“点印迹” 杂交被普遍采用，已有许多版本(见M.L.M.Anderson和B.D.Young， 核酸杂交-一种实用方法，B.D.Hames和S.J.Higgins编，IRL出版 社，华盛顿特区，第4章，pp.73-111，1985)。它已经被改进，可用 于基因组突变的多重分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，EPA 0228075， 1987年7月8日)，以及重叠克隆的检测和基因组图谱的构建(G.A. Evans，美国专利5,219,726号，1993年6月15日)。
能在微型方式的多路或矩阵装置上进行多重样品核酸杂交分析的新 技术正在发展起来(例如，DNA芯片)(见M.Barinaga，253 Science，PP. 1487，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，PP.757-758，1992)。 这些方法通常将专一性DNA序列连接到固体支持物上的一个微小的特 殊区域里，例如一个DNA芯片的微孔里。这些杂交方式是传统的“点印 迹”和“三明治”杂交系统的微型版本。
这种微型杂交方式可用于完成“通过杂交进行测序”(SBH)(见M. Barinaga，253 Science，PP.1489，1991；W.Bains，10 Bio/Technology，PP.757-758，1992)。SBH利用所有可能的n-核 苷酸寡聚物(n聚物)来确定一个未知DNA样品中的n聚物，再通过算 法分析对其进行排列，得出DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov， 南斯拉夫专利申请#570/87，1987；R.Drmanac等，4 Genomics， 114，1989；Strezoska等，88美国国家科学院院刊10089，1992；R. Dramanac和R.B.Crkvenjakov，美国专利#5,202,231，1993年4月13 日)。
有两种方式可用于SBH。第一种方式包括将所有可能的n聚物在一 种支持物上进行排列，然后再与靶序列进行杂交。第二种方式包括将靶 序列连到支持物上，后者再依次与所有可能的n聚物进行探针反应。两 种方式都有直接探针杂交的基本问题，以及多重杂交带来的额外困难。
Southern在英国专利申请GB 8810400，1988；E.M.Southern等， 13 Genomics 1008，1992中提出用第一种方式分析或测序DNA。 Southern用PCR扩增基因组DNA，确定了一个已知的单位点突变。 Southern还描述了一种在SBH固体支持物上合成一组寡核苷酸的方法。 但Southern没有说明对于在一组中的每一种寡核苷酸怎样达到最适的严 格条件。
同时，Drmanac等，260 Science 1649-1652，1993，用第二种 方式测定了几种短链DNA(116 bp)的序列。将靶DNA连到膜支持物上 (“点印迹”方式)。每一种滤膜连续地与272个被标记的10聚物和11 聚物的寡核苷酸杂交。要完成对每一种n聚物探针的专一性杂交，需采 用范围很宽的一整套严格的条件；洗涤时间从5分钟到过夜不等，温度 从0℃到16℃不等。大多数探针需要在16℃洗3小时。为了检测杂交 信号，滤膜必须曝光2-18小时。尽管靶序列简单，寡聚物探针组数减 少，采用了最严格的条件，但总体假阳性杂交率仍为5％。
有各种方法可用于杂交事件的检测和分析。根据所采用的标记DNA 探针的报道基团(荧光团、酶、放射性同位素等)的不同，可用荧光测定， 比色法或放射自显影来进行检测和分析。通过观察或测定发出的辐射， 如荧光辐射或粒子发射，能得到有关杂交结果的一些情况。即使检测方 法具有很高的内在的灵敏度，杂交结果的检测也是困难的，因为存在一 些非特异性结合物的背景。许多其它的因素也可降低DNA杂交检测的灵 敏度与选择性。
人们已试图将某些操作步骤或分步骤结合起来。例如，已提出将各 种不同的微自动系统用于在一支持物上制备成组的DNA探针。例如， Beattie等，1992 San Diego会议：基因识别，1992年11月，用微自动 系统将含有特异性DNA序列的微滴放入位于玻璃基质上的各个独立的 微型样品池中。
通常，现有技术的方法既费时又费力。例如，PCR扩增过程很费时 间，增加了诊断检测的费用。在各过程中或之间需要人类介入的多个步 骤不是处于最佳条件，可能存在着污染或操作失误。再者，用于完成每 一个独立步骤的众多的机器或复杂的自动化系统，除了最大的实验室 外，不论物力财力，对于普通实验室都是无法承受的。
如前所述，为了提供有效地进行多步骤的多样化的分子生物学反应 的技术，人们已做了大量的努力。然而，由于前述的众多原因，这些技 术是“零碎”的并且有限的。要将这些不同的方法结合在一起形成一个 能进行完整的DNA诊断检测的系统是不容易的。尽管人们一直认为需要 有这样一个系统，但到目前为止，仍未提出任何满意的解决方法。
发明概述
本发明涉及到一种能自我编址，自我组装的微电子装置和系统的设 计，制作和应用，该装置和系统能以微观方式有效地进行受控的多步骤 方法和多重反应。这些反应包括，但不限于，大多数的分子生物学方法， 如核酸杂交，抗体/抗原反应，及相关的临床诊断。此外，这个要求保护 的装置和系统能够进行多步骤的联合的生物聚合物的合成，包括，但不 限于，在一给定装置的特异性微位点上合成不同的寡核苷酸或多肽。
这个要求保护的装置和系统的制造利用了微印刷技术与微加工技 术。在基本装置的表面有一个可编址的微位点矩阵；对每一个独立的微 位点能够电子控制，并指导特异性结合物(如核酸、酶、抗体)转运及连接 到它的上面。所有的微位点能够通过其特异性结合物被编址。这个自编 址过程依流控或机械部件而需要最少的外部干涉。
这个装置能够控制和有效地进行各种的检测和反应。分析物或反应 物可通过自由电场电泳被运送到任何一个特异性微位点上，在那里，这 些分析物和反应物被有效地浓缩，并与结合在微位点上的特异性物质发 生反应。在杂交分析时，由于杂交反应物在特异性微位点上被浓缩，因 而提高了检测特异性分析物或反应物的灵敏度。通过转变微位点的极 性，可将任何未结合的分析物或反应物移去。因此，这个装置还能增进 反应的专一性。这个用于核酸杂交或其它分析的基本装置还可叫做APEX 装置，意思是可编址可编程的电子矩阵(addressable programmable electronic matrix)。
在本发明的一个方面中，其它的处理步骤或分步骤可以用一个“系 统”依次进行。该系统是若干部件的集成排列。每一个部件被适当地设 计，按比例缩小，以行使特别的功能。在其最完备的实施方案中，系统 能行使各方面的功能，包括样品制备、杂交、检测和分析。在这种最完 整的方式中，首先是进行样品的制备，如通过一个电子细胞分选器部件。 通常，电子装置特别地具有通过电泳转移带电物体离开或进入部件的能 力。随后的DNA加工和复杂性降低可选地由一个粗DNA选择器部件和 限制性片段选择器部件来完成。将最后处理的靶DNA转移到分析部件 上，在其上以微观多重方式进行电子杂交分析。这个分析部件还可叫做 APEX或分析芯片。与之相连的检测和图象分析部件给出结果。
在此系统中，各种材料可通过自由电场电泳、沟流、流控或其它技 术在各部件(装置)间转移。可选地装有一个电子试剂分配器，该部件能通 过电泳将各试剂提供给该系统的其它加工部件。可选地装有一个废弃物 电子处理系统，该系统由一个电极和带电的矩阵材料(matrix material)构 成，能吸附带电废弃物。可选地装有一个DNA片段电子贮存系统，该系 统能暂时容纳用于以后杂交分析的其它DNA片段。
在本发明的一个方面，基因组DNA复杂性的降低是通过下述步骤实 现的，将含有所需目的序列的特异性DNA片段从大量的不含目的序列的 DNA物质中分离出来。粗DNA被转移并连接到一支持物上。然后用适 当的限制性酶切割结合物。切下的DNA片段被转移到一个能选择性杂交 特异性DNA片段的部件上。经过进一步的限制性酶切作用，那些含有待 分析靶序列的片段被选择性释放，并被转移到系统的分析部件(APEX芯 片)上。这个方法可以重复，用于测定含有其它目的序列的其它片段。
这个装置(或系统)有一个控制器，能分别控制该装置的各个方面。当 运用包含有可编址微位点的APEX装置或芯片时，控制器使独立的微位 点受电子控制，使其能指示特异性结合物转移并连接到该位点上。该装 置能在完全的，精确的电子控制下，优选地是在一个具微处理机的部件 控制下进行多步骤的多重反应。在该装置的特异性微位点上，多步骤多 重反应的速率、专一性、灵敏度被大大提高。这个控制器通过输入/输出 装置如显示器和键盘与用户联系。优选地是有一个图形用户接口，更能 方便用户。输入/输出装置连接到一控制器上，后者再依次控制系统的可 编址电子位点的电子状态。这个控制器能特异性地指示电源/波形发生器 产生不同微位点的电子状态。可选地，在电源/波形发生器与APEX装置 或系统之间安装一个接口。这个接口优选地包括一组继电器，这些继电 器通过一个多功能输入/输出连接器与控制器相连。这些继电器优选地通 过控制连接器的极性，连接存在与否，提供给独立位点的电压或电流量 而将电源/波形发生器与APEX装置连接起来。该控制器优选地能控制指 示杂交系统的照明源。将一个检测器、图像处理和数据分析系统与APEX 装置进行光学连接。在一优选的实施方案中，一个荧光显微镜被用来接 收和放大发生在该装置中各微位点上的杂交事件的图像。其发射由一个 电荷耦合器件(CCD)阵列或微通道平板检测器进行光学过滤和检测。然后 将图像贮存和分析。结果优选地在显示屏上呈现给用户。
本发明的另一方面，形成了具有众多微位点的杂交系统，这些微位 点位于包含有电子控制器件的基底的上面。特别地，提供开关电路来为 微位点独立地编址。通过相对于样品接触之处的后部建立电子连接。另 外，将一个光路例如波导管置于微位点下，使得能从后部接近微位点。 如有必要，可通过波导管将光刺激导向微位点。通过后部的波导管可检 测发出的辐射。在本发明的另一方面，一个样品容纳系统被置于该系统 之上，特别是在杂交矩阵区域。在优选的实施方案中，矩阵杂交区域(包 括样品容纳部件)可被改造以便从提供电子控制和检测元件的装置的剩 余部分中除去。
在本发明的另一方面，描述了形成矩阵杂交系统的一些改进方法。 在一种方法中，一种基质，例如硅，与一绝缘层如厚氧化物一起形成。 导电的微位点可通过将金属(如铝或金)沉积在上面而形成，然后通过常规 的光刻技术形成图形。可通过如由PECVD形成TEOS来形成一绝缘层。 可选地，在TEOS层上形成一个氮化物钝化层。通过氮化物和玻璃可以 形成到微电极的开口。可选地利用增粘物如钛钨合金与金属层相连，以 增加对氧化物和/或玻璃的粘附。在进一步的改进方法中，通过从下部切 去由基底支持的氧化层上的氮化物层，可在电极的上部形成凹孔。
可对独立的微位点进行电子控制，以便控制电压或电流。当其中一 个被设定，另一个可被监控。例如，当电压被设定后，可监控电流。电 压和/或电流可以为直流方式，或可以随时间变化。例如，可利用脉冲电 流或直流偏置。
因此，本发明的一个目的是提供一个  生物材料的样品制备、加工、 杂交、检测和分析的系统。
本发明的另一个目的是提供一个能将多个步骤或分步骤结合到一起 的集成系统。
本发明的另一个目的是提供一个自动DNA诊断系统。
                        附图简述
图1显示样品制备、杂交、检测及数据分析等各步骤及分步骤的顺 序。
图2A和2B为有源可编程矩阵系统的截面图(图2A)和透视图(图 2B)。
图3显示位于金属掩膜层上的有源可编程矩阵系统的结构。
图4为有源可编程矩阵系统的详细平面图。
图5为单一微位点和电子连接的透视图。
图6为包括电子细胞分选器矩阵、DNA选择器、限制性片段选择器 和杂交矩阵的系统的平面图。
图7为控制系统的框图说明。
图8为带有相关电子装置的有源可编程矩阵系统的截面图。
图9为另一种层状的有源可编程矩阵系统的截面图，该系统具有到 达微位点后部的光电通路和生物容纳覆盖物。
图10为安装在配套载体中的APEX系统的透视图。
图11A-G显示制备装置的各加工步骤。
图12为利用多晶硅结构制备的装置的截面图。
图13为利用增粘层制备的装置的截面图。
图14显示在电极上部有一加大的贮存空间的装置。
图15显示适于各种电压电流状况的用户显示器。
图16为DNA纯化系统的截面图。
图17为一种毛细管阵列制造系统和装置的截面图。
图18为一同心结构的微位点的透视图。
                         发明详述
图2A和2B表明应用本发明设计的一个有源可编程电子矩阵杂交系 统的简化形式。通常情况下，由基底10支持着整个矩阵或排列整齐的电 子控制的可编址的一系列微位点12。为易于解释，图2A中的各个微位 点被标明12A、12B、12C和12D。渗透层14位于独立的电极12之上。 渗透层允许相对小的带电物质穿过，但阻止了大的带电物质如DNA与电 极12直接接触。这个渗透层14避免了当DNA直接与电极12接触时可 能发生的电化学降解。它还能避免DNA牢固地非特异性地吸附到电极上 面。附着部位16位于渗透层14之上，为靶物质提供专一性的结合位点， 与对应的电极12A-D一致，附着部位16被分别叫做16A、16B、16C 和16D。
在操作过程中，样品池18包括了附着部位16上部的空间，样品池 中装有待检测、待分析或使用的目的物或非目的物。带电物20，如带电 荷的DNA位于样品池18中。在本发明的一个方面，这个有源可编程矩 阵系统包含了一个方法，能将带电荷物质20转移到任何一个特异性微位 点12上。当一个微位点12被激活后，便产生自由电场，任意一个带电 荷的功能化的特异性结合物20能通过电泳转移到电极12上。例如，如 果电极12A为正极，电极12D为负极，电泳力线(electrophoretic line of force)22将在电极12A与12D之间。电泳力线22使得带净负电荷的结合 物20向正极12A移动，带净正电荷的带电物质20向负极12D移动。在 电泳力的作用下，带净负电荷的已功能化的特异性结合物20向正极移 动，与附着层16A接触，并共价连接到附着层16A上。
若要保护不参加反应的附着层如16B和16C，只需对应的电极12B 和12C带负电荷即可。这使得电泳力线从附着部位16B发散出来(为简单 起见，只讨论16B，对16C而言，结果类似)。电泳力线24将带负电荷的 结合物20从附着层16B驱赶向附着层16A。以这种方式，在附着层16 周围形成了一个“力场”保护，而此时此刻，该附着层应不与带电荷分 子20发生反应。
该系统的一个非常有利的结果是，在与信号附着层16相邻的部位， 带电结合物20能被高度浓缩。由透视图2B可见，如果一个微位点26A 带正电荷，其它的微位点均带负电荷，则电泳力将使带净负电荷的结合 物20向微位点26A移动。在图2A中，用微位点26A来描述一个由附着 层16、渗透层14及连于其下的电极12构成的组合。以此种方式，待分 析物或反应物能在此装置中的任一个特异性微位点上进行浓缩和反应。 当特异性结合物20结合到附着层16以后，位于其下的微电极12将以直 流(DC)的方式继续行使其功能。这个独特的性质，使得游离在溶液中的 浓度相对稀的带电分析物或反应物分子能在任意一个与其持相反电荷的 特异性微位点上以顺序地或平行的方式被迅速转移、浓缩和反应。这种 在挑选出的微位点26上浓缩稀分析物或反应物分子的能力大大加速了 在这些微位点26上进行的反应的速度。
当目的反应完成以后，电极12可以将其电压逆转，因而在与原先的 吸引力相反的方向上产生一个电泳力，这样，可将非特异性的分析物或 未反应分子从微位点26上除去。特异性的分析物或反应产物可从任意一 微位点26释放出来并转移到其它微位点上进行下一步分析；或在其它可 编址的微位点上贮存起来，或将其从系统中完全除去。通过将电场逆转 来除去或稀释物质加强了该系统的鉴别能力，使其可将非特异性连接的 物质除去。通过控制对非特异性连接在附着层16上的物质的排斥电泳力 的数量，可以完成电子实时控制。提高电极12处的电压，使之能产生一 个足以除去部分杂交的DNA序列的电场，这样一来，单一错配对的杂交 及点突变均可被识别。
在各个不同的附着层16，每步操作可平行进行也可依次进行。例如， 参考图2A，一个反应可首先如所示利用电压在附着层16A上发生。电 极12A处的电压可被逆转，即  变为负极，在相邻电极12B处的电压可 被变为正极。以这种方式，可进行一系列的反应。没有特异性地连接到 附着层16A上的物质将被电泳力转移到附着层16B。以这种方式，利用 浓缩方式使得特异性附着层处具有高浓度，这样会受到正电泳力的作 用。被浓缩了的物质再被转移到相邻的或其它的附着层16。也可采用另 一种方式，在有一个净电泳力场从电极12发散出来，穿过附着层16， 进入样品池18时，可使多重附着层16去除保护。一旦去除了多重附着 层16的保护，便可进行多重反应。每一个单独的位点26实际上就是一 个独立的生物“试管”，在“试管”中，由一已知附着层16编址的特定 的环境不同于其它附着层16周围的环境。
图3为一个有源可编程电子矩阵系统的金属掩膜层的平面图。众多 的单个电极30优选地  按一定形式排列。例如，排成一个8×8的电极 30矩阵。可以选择装上一个额外的控制或转储缓冲器以帮助产生目的电 泳场。电极30和缓冲器32同接触缓冲器34相连。对应于64个电极30 和4个缓冲器32，有68个接触缓冲器34。导线36将电极30和缓冲器 32分别同接触缓冲器34连接起来。如图所示，采用一个成扇形散开的图 形使得电极30和缓冲器32所处的相对密集的部分与金属掩膜的边沿部 分36连接起来。
图4为图3金属掩膜的部件分解平面图。形成的金属化系统大体上 与金属掩膜图形类似。如图所示，电极30基本上为方形结构。导线36 将电极30与接触缓冲器34连接起来(图3)。导线36的宽度优选地为1 到20微米。
图5为一个电极50的透视图，电极50直接与导线52相连。渗透层 54位于导线50之上，而附着层56位于渗透层之上。
在微型平版印刷产生的装置中的渗透层的厚度可从1个纳米到500 个微米不等。优选地是在500纳米到50微米之间。渗透层应该覆盖整个 电极表面。渗透层可由任何适宜的材料如多聚物、陶瓷、溶胶-凝胶、 多层复合材料、粘土、控孔玻璃等构成。
图6为自动样品制备与制备物杂交的完整系统60。将样品62，如 血液或其它生物材料，加入到系统60中。通常需有一个进样口64。当 有一个位于上面的生物容纳结构存在时，通常需利用进样口64，因为若 不通过进样口64，样品62不能够直接加入系统。
在系统60中，经过电子细胞分选器矩阵部件66，DNA选择器部件 64和限制性片段选择器部件70的联合作用，样品得以制备。电子细胞分 选器矩阵部件66由位于下面的电极以及渗透层和附着层构成。它们有效 地形成了一个附着细胞的位点矩阵。通常独立位点的面积与整个矩阵的 面积大于一个分析装置部件上的面积。因此，电子细胞分选器矩阵的大 小应加以调整使其适应于来自不同样品和不同大小样品的细胞数量的变 化。通常，附着层能为细胞所选择，或为不同类型的细胞单独选择。可 任意使一组或一排位点被一种类型的细胞所选择。通过连接特异性抗体 或细胞粘合因子到附着层上，可给予细胞选择性。矩阵66由自由电场电 泳来操作。
粗DNA选择器68和限制性片段选择器70能够结合从电子细胞分选 器矩阵66来的粗DNA产品，并允许对来自结合物的目的DNA片段进行 选择性切割。术语“粗”仅仅用来表示DNA分离或复杂性降低的一个非 最终阶段。DNA连接在选择器上，其连接部位不包括目的DNA片段。 然后用限制性酶类将目的DNA从结合物上切割下来。这个切下的没有连 接的物质被机械地从粗DNA选择器68转移到限制性片段选择器70上。 优选地用电泳转移切下的物质。此过程可以重复，方法是将切下的物质 连到一个选择器上，用一限制性酶切下处于未连接部位的目的DNA片 段。
例如，人DNA含有约100,000个基因。在总DNA中，一个很大的 部分由不含目的DNA信息的重复序列组成。借助这些不含信息的重复序 列，DNA结合到选择器上。这个结合上的DNA可在含有待分析的目的 DNA的未结合部分被切割。然后，将更具特异性的序列再结合到选择器 上，可重复此过程。
接着，将限制性片段选择器70的产物提供给APEX芯片72。矩阵 72的运作按图2A与2B所述进行。
用于降低DNA复杂性的另一种技术是采用基于DNA的亲和层析。 一条单链DNA片段与另一条单链DNA片段的亲和性依赖于它们之间碱 基对互补的程度。当层析系统的固定相含有一段特定序列或许多特定序 列，流动相中的任一单链DNA将附着在固定相上，其附着量的大小主要 依赖于其序列与固定相中的俘获序列配对的程度。这使得层析分离依赖 于DNA与固定相中俘获序列的亲和性。
一种利用微位点矩阵的基于互补DNA的亲和层析方法为用一特定 序列或一组序列做俘获探针去修饰一系列的位点。这构成了固定相。 DNA样品被编址到一个微位点上，然后再依次从一个微位点移到下一个 微位点。用电子实时控制来限制在每一个微位点上与俘获探针紧密配对 的DNA的量。以这种方式，与俘获探针配对的DNA将被迅速从样品中 移去。
在一系列微位点上通过依赖于DNA的亲和层析来连续纯化一种 DNA样品的发明可统一为一种连续的模式。图16为该系统的截面图。 在此，电极210为一长条形式，被一适当的固定相修饰。流动相被限制 在位于固定相上的通道212里。借助于物质对流，流动相通过固定相。 另一种方法是，流动相中的离子可通过电场214的作用在固定相中移动。 将独立的单个电极216放在长条电极的两端可建成电场214。将一转换 或脉冲电流加在长条电极上可进行电子实时控制。这促使DNA进入或离 开固定相。
用于降低DNA复杂性的另一种方法是用一个微孔筛来选择样品的 大小。用树枝晶填充任意几何模槽可形成微孔筛。将一些化学物如金属 盐、陶瓷材料、单体与多聚物以及其它物质进行电化学降解，可得到树 枝晶。通过调节加到电极上的电信号可控制微孔筛的孔径。例如，树枝 晶可形成栅栏形结构或分形结构。
在一个APEX装置上形成微孔筛的方法包括形成一个具有相反金属 电极的长通道。当这个通道充满了适当的化学物，并将适当的电信号加 在电极上，在两电极之间的填隙空间里，将形成树枝晶，由此构成微孔 筛。
再回到图6，电子试剂分配系统74用来给系统60提供试剂。如果这 些试剂带电荷，优选地通过电泳力来运送。可选地在系统60中装入一电 子废弃物处理系统76。该废弃物处理系统76能吸引带电荷的废弃物颗 粒，并将其牢牢吸住，从而处理之。还可选地在系统60中装入一DNA 片段贮存系统78。该片段贮存系统78能够暂时容纳DNA片段，等待进 一步的分析。
系统60可包括上述的部分或全部功能。例如，由DNA选择器68和 限制性片段选择器70完成的复杂性降低形式的样品制备，该组合可以与 分析矩阵72相连。无论如何，任何或全部上述功能可以根据需要进行组 合。
图7为包括控制器在内的整个系统的方框图。通过对电极进行电压 控制，或让控制电流通过电极，可使APEX装置中位于下面的电极有源。 当APEX装置上每一个电极的电压或电流被独立控制时，可实现全部 功能化。这一切由APEX控制系统来完成。
控制器计算机80与用户输入/输出装置相连，如显示器82和输入装 置84。显示器82可以是任何形式的常规显示器，如监视器或计算机屏 幕。输入84可以是任何常规的用户输入装置如键盘，鼠标或触屏装置。 控制器计算机80与电源和波形发生器86相连。控制器80促使电源和波 形发生器86向接口88提供电流或电压输出。在优选的实施方案中，电 源或波形发生器86能提供准确调控的电压和电流。控制器计算机80通 过多功能输入/输出板90给接口88提供控制信号。接口88给APEX系 统92的接触器提供简化了的连接。
接口优选地包括有继电器，这些继电器使得在电源和波形发生器86 与APEX系统92的专一性电极之间存在选择性连接。在一个实施方案 中，接口88由众多的将电源和波形发生器86与APEX系统92的电极连 接起来的继电器构成。电源和波形发生器86与APEX系统92电极间的 连接可以是选择性的也可是非选择性的。另外，还有一种继电器允许对 提供给APEX系统92电极的电压极性进行选择。如果能达到多源水平， 例如来自一个多输出电源86，那么连接到APEX系统92电极上的特异 性电压水平将被单独设置，使其不同于那些与别的电极相连的电压水 平。
因此，如图2A所述，使一些电极(如12B和12C)为负极，但电压低 于电极12D，附着层16B和16C将受到局部力场的保护。
接口88能为APEX系统92的各独立电极选择所需的电压。另外， 如此不同的电压安排也可以通过一个电压分配器来完成。
在一个优选实施方案中，控制器计算机80为Macintosh Quadra 950。 国家仪器公司(National Instruments Corporation)LabVIEW软件被用于为 用户提供软件接口，使之能为与APEX相连的装置编程，并能收集和处 理测定数据。国家仪器公司NuBus主板被用于提供从Quadra 950计算机 到电源装置86的硬件接口，使能提供电压和电流，测定实际电流和电压 及检测结果。
用户通过一个由LabVIEW软件创造的Virtual Instrument控制测定。 这个Virtual Instrument给用户提供一个友好的用户能够控制的图形表 示，及将这些控制应用到APEX装置上进行测定的一些结果的图形表 示。用户通过Quadra 950计算机的键盘和鼠标(统称，输入84)与Virtual Instrument相连。Virtual Instrument为国家仪器公司NB-MIO-16XL 多功能输入/输出90和与Quadra 950的NuBus数据总线相连的国家仪器 公司DMA2800主板提供软件接口。
多功能I/O主板能提供数字和/或模拟信号给外部装置以完成由用户 通过Virtual Instrument指定的编程序列。在Quadra 950中，在Virtual Instrument控制下，MIO主板也能数字化和贮存由连接到APEX上的装 置产生的信号。DMA2800提供迅速贮存由MIO主板绕过Quadra 950 CPU，通过直接存储存取获得的数据的能力。DMA2800也能提供一个 GPIB(IEEE 488)接口用于控制符合于IEEE 488通迅和数据转移标准的外 部装置，其中包括许多最现代化的仪器。
在这种控制器的优选实施方案中，两个外部装置被用于提供电压或 电流给APEX。Keithley 236 Source/Measure Unit电源86作为可精确调 控的电压或电流源提供适当的稳定性和可变性。SMU 236提供电压及测 定所得电流或提供电流及测定所得电压。这个装置在GPIB控制下由 Virtual Instrument编程，通过DMA2800主板控制电流或电压水平和时间 依赖性，测定和贮存提供给APEX的实际电压和电流。
发出的电流或电压通过接口88中的一排继电器提供给APEX。这个 接口88给在无连接，与正极相连和与负极相连之间的每个电极提供单独 的开关。这个优选的实施方案也能提供一个以上的Source/Measure源， 可利用来给不同的电极提供不同水平的正和负电压或电流。由一个具有9 个16-通道，连接在机壳上的Class 3 Relay Modules，提供总共144个 继电器的National Instruments SCXI Chassis提供排列整齐的一组继电 器。每个电极需用两个继电器，将它们提供给不与正极或负极相连的电 极，或与正极或负极相连的电极。在优选的实施方案中，一大束电缆通 过一个Cerprobe探针卡将这些继电器与APEX装置连接起来，这个 探针卡使得探针与APEX装置的连接柄机械接触。
控制器计算机80选择性地控制用于DNA杂交检测的荧光发射的光 源94。在优选的实施方案中，光源94是一束激光，它在一定波长发生 辐射以激发APEX系统92中的荧光标记物。
APEX系统92的输出通过观察途径96到检测器98。这个观察途径 96可以是一个物理结合物例如通过一个光导纤维，或可以构成一个光路 例如通过一个显微镜。在观察途径中可以利用滤光器来减少检测器里与 APEX系统92中荧光标记物的发射光谱不一致的波长下的光照。另外， 在激光光源94的发射波长下，需用凹面滤器来减少检测器98的光照。 检测器98可任意形成一个APEX系统92的图像，如通过一个冷却的CCD 照像机。除此之外，或换一种方式，形成一个光学图像，从APEX系统 92发射的荧光辐射可通过常规方法来检测，例如光电二极管或光电倍增 管。检测器98的输出被提供给数据处理/分析系统100。该系统监测APEX 系统92中被检测的探针的量。可选地将一个专家系统用于分析系统100 中。
在优选的实施方案中，一个Data Translation Frame Grabber主板与 Quadra 950 NuBus相连，使能俘获图像的记录，这些图像由诸如 用于装置中的Optronics冷却的彩色CCD照像机记录。这个CCD照像机 通过一个具有合适滤器的显微镜观察APEX装置，提供APEX上的荧光 图像。
另一种系统能赋予控制器上述所有的功能，但得运用加入印刷电路 板的常规装置和运用常规软件，通过一个类似的用户所需的接口去控制 电路板。这种改变了的系统也能将整齐排列的继电器的开关元件加入一 位于有源可编程矩阵系统中的半导体装置上。图8为有源可编程矩阵系 统的另一种实施方案的截面图。可独立编址的电极102在一支持层104 上形成。这个支持层104优选地是一绝缘体。在电极102上优选地放置 渗透层106和与独立电极102对应的独立附着层108。一个电子连接物 110从电极102的后边穿过支持物104。另外，一个半导体支持物112 包括与导体110相连的电路元件114。这个电路元件能在半导体112上 面或里面形成。这个电路元件能独立控制从导体110到电极102的电压 和/或电流。具体地说，电路元件114能结合在优选的实施方案中整 齐排列的继电器的开关元件上。对应于每个电路元件114的多重电流/电 压源线116能够为不同的电极102提供不同大小的电流/电压。记忆型地 址线118为独立的电路元件114提供方便的激活通路。
波导管用于将发射光导向微位点及将荧光导向检测器。波导管可自 由安装，如可在一光导纤维里，或被整合进一单片半导体装置中。波导 管可由氧化锌，氧化铟锡这类也能导电的物质组成。波导管既能作为电 极，也能作为传送光辐射的工具。波导管可被定位在俘获探针的平面上 或其附近，以减少非特异性背景荧光。波导管能结合全息照像光学元件。 全息照像光学元件的功能包括(不排除有其它功能)：凹面滤光镜，二色性 镜，光谱通带滤光镜，光束分离器，中密度滤光镜，半波片，四分之一 波片，起偏镜和透镜。
图9为有源可编程矩阵系统的另一种层状结构的截面图。在第一层， 独立电极120在一支持物122上形成，支持物122优选地是绝缘的。在 电极120之上优选地形成一渗透层124和对应于独立电极120的独立附 着层126。光路128通过支持物122接近电极120。光路128优选地由 光导纤维或光导管或结构组成。可选地有一电子结合物130穿过支持物 122从后边接近电极120。术语“后边”在此是指与支持物122接触的电极 120的一边。在第二层，一个半导体支持物132包括与导体131相连的电 路元件133。导体130设计为其上表面与位于第一层后边的导体130的 底部紧密配合并形成良好的电接触。电路元件133可在半导体132上面 或里面形成。电路元件133可独立控制从联合导体131和130到电极120 的电压和/或电流。具体地说，这个电路元件133能结合在优选的实 施方案中整齐排列的继电器的开关元件上。这些电路元件可由多重电流/ 电压源线供应，能被记忆型地址线激活。可选地将一检测器元件134， 例如光电二极管，加入到半导体层132上，通过光路135与第一层的光 路128连接，使得该检测器元件可监控在第一层附着点126上进行的DNA 杂交反应。这些光路可以为光导纤维或波导管，能加入上述的各种光 学元件。可选地将一生物密封容器136置于该结构周围用于装正在分析 或测定的生物材料。可选地有一个液体输入口137或光学观察口138。 生物密封容器136和任意的端口137和138可与在此描述的任何一种 有源可编程矩阵系统相连使用。
图10为有源可编程矩阵系统的装配系统的透视图。将如图3和图4 所示结构安装在一片状结构上可形成系统140。片状结构140通过接触 缓冲器(图3)之间的导线146相连，片状结构载体144连接缓冲器142。 片状结构载体144优选地包括独立的插头147，这些插头通过缓冲器142 提供电流到导线146，再到片状结构140上。插头147与插座148相连， 后者再依次与控制系统相连。
有源可编程微位点矩阵也可由毛细管构成。图17为该系统及其产 物。毛细管矩阵可通过将毛细管堆积成任意几何排列220而形成，或通 过加热器222加热熔化，和由拉丝模224拉丝，将这些排列220变成一 粘附的整体单元226而形成。另一种方式，由两种不同材料构成，相互 以同心圆形式排列的固体棒可用来代管毛细管。图8为这种结构的透视 图。在此，构成内核230的物质选择性地从外层物质234蚀刻出来，形 成一个贯穿全部或部分装置的洞232。换一种方式，将内核以一定方式 蚀刻，使形成一个可控制孔径的玻璃。
独立的毛细管通过插入其中的电线被编址，或通过将毛细管矩阵附 加到平版印刷形成的电极的互补矩阵上被编址。另外，固体棒的内核可 由一导体物质形成。通过将固体棒矩阵附加到电极的互补矩阵上，或通 过在固体棒上平版印刷形成的电极，能形成同内核物质的电连接。
毛细管和蚀刻固体棒内充满一种合适的物质，以形成渗透层。渗透 层的表面可通过特定附着化学物而被功能化。
电泳转移的另一种方法是通过物质对流将物质转移到微位点上。能 完成该过程的装置为转盘。在此，物质对流通过存在于转盘和溶液之间 边界处的流体切力而完成。液体直接从本体溶液流到表面上。一个电极 缓冲器矩阵被连到一个转盘上，或矩阵中的每个电极可被连到一独立的 转盘上。在后一种情况，每一个电极可通过物质对流运输被选择性偏址。 在通过物质对流运输将缓冲器编址后，电极可被用于通过电泳除去不需 要的物质。
用于形成有源可编程矩阵系统的一优选方法如图11A-G所述。一 种半导体150，优选地是p-型，实验级硅，其上形成厚(10,000)的氧 化物层152。图11B为在氧化物层152的上面形成一金属层154。所用 金属优选地选自下列金属：铝、金、铂、钯、钛、钛/钨。半导体多晶 硅也可用来代替这类金属。图11C为在氧化层152上形成图形化的铝 156。这种金属可通过任何常规的平版印刷术例如照相平版印刷术形成图 形。
图11D为具有一玻璃外壳(例如TEOS)的图11C的结构。TEOS 优选地由PECVD技术形成。玻璃优选地在相对高的温度下，如475℃下 形成，以提高对金属层156的粘附。然后，在TEOS层158外面包上一 氮化物层160。氮化物层160和TEOS层158优选地在图形化电极区域 156上面的地方被蚀刻。由此形成一个窗口162，使得可与图形化电极 156直接联系。
图11G为将整个结构暴露给氨基丙酸硅宾(APS)的结果。APS 164 附着到图形化金属层156上，与氮化物层160无联系。APS层充当DNA 俘获探针的附着层。
图12为另一种结构，其中用多晶硅代替通常的金属联系物。结构与 图11F的结构类似，但包括一代替铝层156的多晶硅层166。优选步骤 的顺序如下。首先，半导体，优选地是p-型的实验级的硅，用厚(10,000) 的氧化物进行氧化。形成一个导体多晶硅层，优选地是形成厚达5,000 的多晶硅层。然后将多晶硅做出图形，优选地是通过照相平版印刷术用 湿蚀刻来做图形。接下来，形成一个玻璃层，例如通过PECVD沉积的 TEOS。在475℃形成的大约厚3,000的玻璃层用于提高其粘附性。然 后又将玻璃层做出图形，优选地是通过照相平版印刷术用湿蚀刻来做图 形。然后在表面形成一金属层，优选地是通过喷镀铝使其达到3,000A的 厚度。然后将金属层做出图形，优选地是通过照相平版印刷术用湿蚀刻 来做图形。接下来，形成氮化物层，优选地通过PECVD在70℃使其厚 度为3,000。然后，通过照相平版印刷术用湿蚀刻形成一个通道，使其 能与电极接触。
图13为通过应用中间粘附金属如钛钨合金，使得金属导体与位于其 下的绝缘层间的粘附性提高的结构。一种半导体170，优选地是硅，其 上有氧化层172。由导电金属如金或铝形成的中间电极层176被夹在钛 174和钨178之间形成三明治结构。粘附金属层178与外部电极184相 连，该电极优选地由铂构成。玻璃层180，例如由TEOS构成，位于外 部的氮化物外层182之下。
图14为一改进了的电极阵列的截面图。电极190与一绝缘层192相 邻，该绝缘层优选地为氧化物。氮化物层194位于绝缘层192之上。优 选地除去氮化物层194的下部，使得绝缘层192从氮化物层的这一侧198 受到阻碍。因此，贮存池196被限定，其体积比不具切除区域的类似结 构大。
图14所示结构被用于机械握持形成渗透层的材料的接点。这个倒置 层俘获渗透层。该设计能统一为具有任意数目的倒置层，使得能形成一 种排列，例如蜂巢式的渐减的同心圆，或具有不同半径的同心盘孔。
渗透层(如，图2中的层14)可由下列物质构成，但不局限于此：碳 链多聚物，碳硅链多聚物，碳磷链多聚物，碳氮链多聚物，硅链多聚物， 聚合物合金，层状多聚物复合物，互穿聚合物材料，陶瓷，控孔玻璃， 形成溶胶-凝胶的材料，形成气凝胶的材料，形成水凝胶的材料，多孔 石墨，粘土或沸石。
渗透层将结合物与电极表面分开。微位点由微平版印刷术和微机械 加工术产生。对微位点表面和位于微位点上的聚合物层表面进行化学修 饰，为表面功能基团产生特定的附着位点。
网眼型渗透层包括随机排列的多聚物分子，这些多聚物分子形成网 眼状结构，其平均孔径由交联度决定。我们以丙烯酰胺为单体，采用了 几种可聚合制剂，已证明了网眼型渗透层的形成。我们用三甘醇二丙烯 酸酯，四甘醇二丙烯酸酯和N，N′-甲叉双丙烯酰胺为交联剂。将分子量 为330千道尔顿和25千道尔顿的多聚-1-赖氨酸混入丙烯酰胺/共聚物 制剂，由此提供了一个将特异性功能基团连到渗透层表面的方法。将混 合物浇到微位点表面。然后由紫外光照射进行光聚合。在有些情况下， 需加入AuCl4作为光引发剂。聚合物制剂由水和非水溶剂，甲醇，四氢 呋喃，乙腈，丙酮，及这些试剂的混合物来调制。
通过连到DNA俘获探针上的氧化核糖核苷与多聚-1-赖氨酸的伯 胺之间发生的Schiff碱反应，DNA俘获探针被连到渗透层的表面。这提 供了特异性功能基团共价连接到渗透层表面的证据。
通过电泳将氧化了的DNA俘获探针带到表面微位点上。俘获探针由 荧光标记物进行标记。由此证明了通过电泳为微位点编址的能力。
连有荧光标记物的氧化俘获探针通过电泳被送到渗透层表面的微位 点上。用机械手段将渗透层从微位点下移去。没有观察到有荧光标记的 俘获探针存在。这证明了渗透层具有保护DNA不与电极表面接触的能 力。
在发生水解出现气泡之前，在一个不被渗透层修饰的金微位点上达 到的最大直流电流密度为8毫安/cm2。在发生水解出现气泡之前，在 一个被基于丙烯酰胺的渗透层修饰的金微位点上达到的最大直流电流密 度为40毫安/cm2。这证明了渗透层具有在水解发生出现气泡前提高最大 可及电流密度的能力。
离子交换聚合物三明治渗透层可由一层或几层聚电解质形成。这些 聚电解质层可以有相同的电荷，不同的电荷，或可以是带电荷的镶嵌结 构。
一个两层的离子交换聚合物三明治层由全氟化磺酸聚电解质(Nafion) 下层和多聚-1-赖氨酸上层构成。将Nafion下层浇在微位点上面，让 其干燥。然后将下层暴露到1％(重量百分数)的多聚-1-赖氨酸水溶液 中。基于赖氨酸的阳离子聚合物紧紧地吸附到阴离子Nafion下层上。多 聚-1-赖氨酸层通过Schiff碱反应使得氧化的DNA俘获探针连到渗透 层的表面。Nafion下层为阴离子型的，对于带负电荷的离子如DNA具 有选择透性。
图15为图形用户接口的实例。窗口200表示显示器的全貌。识别资 料202被提供。有源可编程矩阵系统的各种缓冲器可在一长方形的坐标 系中被识别。显示物204中的每一个显示出电参数，例如特定缓冲器上 的电流或电压。方框204A为一个缓冲器(3，4)上的作为时间函数的电流， 其中，电流随时间而变化，在施加电流的过程中改变方向。方框204B表 示一个缓冲器(3，5)，在所示的时间段中无电流施加到其上。方框204C 表示加到缓冲器(4，4)上随时间变化的电流，其中，不考虑与方框204A 中报道的缓冲器相关的时间，电流滞后。方框204D表示一缓冲器(4，5)， 没有作为时间函数的电流施加上去。方框204E表示一缓冲器(1，1)，其 上的电压具有恒定的负DC值。方框204F表示缓冲器(3，4)上的作为时间 函数的电压，该电压具有更大的负DC值。在所有的情况下，方框中虚 线表示被编程的电流或电压，实线表示测定的电流或电压。
除了上述的本发明的优选实施方案及其替换方案外，另外几种方案 也是可能的。例如，产生离子迁移的电场可被调节，使时间与同时施加 的直流偏置或电流一样长。将AC信号加在一直流偏置或电流上可完成 三件事：1)减少由于非特异性连接的DNA而产生的背景，2)提供一个 电子实时控制的方法，  其中，控制变量是交流电流或电压，3)提供空 间上的排列DNA分子的方法。
也存在许多其它的荧光检测杂交DNA的方法。大多数转换的技术也 包括用能产生可检测信号的报道基团去修饰俘获或目的或报道DNA探 针。极少数运用纯物理方法进行测定的技术不需要报道基团。这些可选 技术如下所述：(1)线性光学方法，包括荧光、时间调制荧光、荧光猝灭 调制、极化选择荧光、吸收、镜反射、折射率的变化、椭圆光度法、表 面等离子共振测定、化学发光、斑点干涉仪和磁光Kerr效应；(2)非线性 光学方法，包括二次谐波的产生，三次谐波产生、参量混合、光学外差 检测、相共振、孤离子减振和光Kerr效应；(3)基于热效应的方法，包括 差示扫描量热测定法，多频差示扫描量热测定法，和差示量热分析；(4) 基于质量变化的方法，包括晶体微平衡、悬臂微平衡、表面声波和表面 Love波；(5)电化学方法，包括电流分析法、电量测定法、伏安法、电化 学发光、供体-受体复合物中的电荷转移和表面阻抗光谱学；(6)用标记 基团的放射性检测法。
虽然为了清楚和易于理解，已通过说明和实施例对前述发明进行了 一定程度的详细阐述，但显然，本领域普通技术人员依据本发明的技术， 在不背离其精神或范围的前提下，可对其进行某些改动和修饰。
相关申请资料
本申请是1994年7月7日提交的序列号08/271,882申请的部分继续， 而后者又是1993年11月1日提交的序列号07/146,504申请的部分继续， 标题均为“用于分子生物学分析和诊断的能自编址和自装配的微电子系统 和装置”。