微阵列技术是现有的促进包括基因组和蛋白质组在内的诸多领域内的研究发展 的重要工具。该技术被广泛用于生命科学研究、药物和生化研究与发展以及分子和 临床诊断。核酸(或其它生物部分)间的杂交反应是微阵列应用的基础。这些体外反 应通常将在结合到固体支持物的生物探针(寡核苷酸、cDNA、RNA、PNA、肽、蛋白质 等)和溶液中的游离靶(寡核苷酸、cDNA、RNA、PNA、肽、蛋白质等)之间发生。所述 探针和靶无论其性质是互补的，并且相互是特异的。例如，对于寡核苷酸单链探针， 其靶是互补的单链序列。对于蛋白质阵列，靶可以是蛋白质(抗原)及其靶特异性抗 体。基于核酸的微阵列也能够检测互补序列中的特定错误，因为单个碱基错配将显 著降低杂交效率。
微阵列的杂交可在静态条件下进行，无需对杂交靶溶液进行任何额外的搅动。在 这些条件下，扩散仅限于对流并受到靶的动力学特性(大小、迁移率、溶液温度)和 杂交溶液粘度的影响。总之，静态条件下的杂交动力学缓慢，而所得杂交是耗时且 不可预知的。这种情况下的扩散不是完全可靠的过程，它可导致阵列的灵敏度和特 异性降低升高。阵列加热和定向的变化也可进一步导致微阵列杂交过程的不均匀性。
盖玻片法通常在静态条件下使用，这是由于盖玻片产生的毛细管作用阻止了任何 对流性的溶液运动。当靶溶液量有限时该方法是优选的。该方法包括将几微升高度 浓缩的靶溶液放置到微阵列上，并将玻璃或塑料盖玻片直接放置到靶溶液之上。靶 溶液然后通过毛细管作用在盖玻片和载玻片之间展开成薄层。盖玻片和载玻片之间 存在的这种有限的空间能够限制任何如果存在的薄膜层自身之间的液体运动。此外， 已知会发生靶溶液的蒸发，这导致靶干燥并沉淀到载玻片上，且这可能进一步造成 不均匀性甚至扫描假象。对于大多数可靠且均匀的微阵列测量，必需严格控制杂交 期间的环境条件和温度。
当靶体积较大时，杂交可用发送器、染色缸或者甚至尖底离心管进行。通过摇摆、 振动等可实现这些容器中液体体积的有效搅动。适当搅动可造成靶溶液在微阵列上 彻底移动并在载玻片表面产生均匀的杂交。尽管当适当搅动时发送器中的杂交通常 是有效且均匀的，但该方法需要消耗大量(可能是昂贵的)靶溶液。
基于垫片的杂交室实验通常是用相对小的靶溶液体积(50-800μl)进行的。这种类 型杂交室的一个缺点是通过移动载玻片和杂交室(旋转、振动等)造成的靶溶液的搅 动通常不足以抵消这些杂交室内固有的毛细管作用；因此通常无法获得在微阵列各 处产生杂交均匀性的充分混合。一种改进所述室内搅动的方法是在靶溶液中注射气 泡，参见例如美国专利No.6,613,529(2003年9月2日)；杂交期间载玻片和室随 后发生移动使溶液在气泡的运动之下发生位移从而在整个杂交室内更好地混合物。 尽管这种气泡机制提供了内部混合，不幸的是，这种混合通常在载玻片表面不均匀。 当将该器件附加到振荡器(涡漩器)时，气泡可能会截留在所述室的一端。附加到震 动机或轨道式旋转器的器件(其中的载玻片以旋转样的运动移动)也可产生均匀性问 题。在震动机中，气泡在带有微阵列的载玻片表面上升和下降，但通常按照一种特 定的途径；在轨道式旋转器中，气泡沿杂交室的内缘内缘移动，也是按照一种特定 的途径而不会有效混合载玻片中心区域的溶液。克服这种缺点的尝试描述于美国专 利No.6,485,918和专利申请公开号2002/192,701及2003/87,292。
在这种反应中积极搅动杂交溶液的最终方法是使用自动杂交站。各种市售物品的 设计、容量和搅动机制是可变的。然而，这种杂交站的价格通常为30,000-60,000 美元，这在成本上通常是不允许的。
相比二维(2D)微阵列，在三维(3D)微阵列杂交时这些问题似乎更加突出；这种3D 微阵列中的探针被固定在三维水凝胶聚合物滴(90-98％溶剂)中，后者又附加到扶梯 支持物上。典型的支持物是用化学方法功能化的玻璃载玻片，但也可以是任何其它 类型的固体或半透性材料，如塑料、硅、膜片或金属。含有探针的点的数目可以是 1-10,000中的任何数字。然后将构成微阵列的多个探针点暴露于用液体缓冲液稀释 的靶物质以检测杂交。在杂交器件，靶必需扩散到并进入每个点以到达其互补探针。 即便对于2D阵列，都需要将靶输送到表面上探针的部位，并需要从所有非互补探针 中带出未结合的靶。因此，靶溶液的适当搅动对于微阵列杂交反应的效率和均匀性 是非常重要的。包括杂交温度、靶和探针的浓度以及将靶带入和带出固定的探针的 速率在内的实验条件也是重要的。最后一个因素受杂交反应器靶溶液混合程度强烈 影响。良好混合的溶液产生均匀的杂交结果，而较差混合的溶液的结果是不可重现 的且可能会产生假象。
杂交完成之后通常需要对洗涤微进行阵列；然后将它们干燥并用数据收集器进行 扫描。这些器件通常是共焦激光扫描仪、CCD(电荷耦合器件)照相机系统或荧光显微 镜。扫描仪发射单色光束，该光束激发结合到微阵列的荧光团。然后将所得发射光 过滤、通过光电倍增管(PMT)收集并转化成数字强度值。信号强度越大则特定探针/ 靶系统的杂交程度越高。通常，微阵列结果可被微阵列上的划线、污点或高背景负 面影响甚至破坏。这些假象通常是由杂交前不充分的封闭、杂交中不充分的溶液混 合或杂交后的不当洗涤造成的。
为排除上述困难，关于改进的杂交器件的研究已在继续。
发明概述
已经开发了一种在杂交室内充分且均匀混合小体积靶溶液的新方法。不同于传统 的利用一个或一些相对较大气泡的气泡法；这种方法利用了许多非常小的气泡，这 可大大提高混合程度和整个微阵列表面杂交反应的均匀性。其花费与其它基于垫片 的杂交室相同，用于杂交室的靶溶液的体积也是类似的。
在这些改进的器件中，通过使用气泡破裂件产生微小气泡，气泡破裂件的形式可 以是在侧面突出或伸出到杂交室内部体积的齿状凸出。在操作该器件时，当大气泡 在其路径上碰到这种气泡破裂件时便破裂成微小气泡。产生微小气泡的结果是，随 着该器件的运动将有极大数目的可能的气泡途径，这可在微阵列表面形成更好的溶 液混合。据信，众多的微小气泡行进途径能确保在通常含有50-800μl靶溶液的室内 彻底杂交所需的靶溶液的内部搅动量。
在一具体方面，所述微阵列杂交器件包括具有反应性部分微阵列可结合的表面的 平的底层，与所述表面并置以形成其中具有所述微阵列的室的液体屏蔽装置，以及 将所述室封闭从而在操作所述器件时除了其中的气泡填充所述室的液体靶溶液不会 损失的装置，所述屏蔽装置的内表面界定所述室，所述表面是由多个在侧面延伸如 所述室的气泡破裂件形成的，从而当所述器件移动时，所述室内的液体靶溶液将沿 着所述表面从所述室的一个边界移动到另一个边界，最初在所述室内的气泡被破裂 成许多微小气泡，这样便可通过所述微小气泡的移动确保所述液体靶溶液在整个微 阵列的所述室内非常有效的分布。在一优选实施例中，所述屏蔽装置具有一定的高 度以使所述盖片离开所述表面约0.2-2毫米。
在一具体方面，本发明提供一种微阵列杂交器件，所述器件包括：具有上表面的 平的底层；固定于所述上表面的反应性部分微阵列；与所述表面并置以形成其中具 有所述微阵列的室的液体周围屏蔽物；和与所述屏蔽物并置从而在操作所述器件时 除了其中的气泡充满所述室的液体靶溶液不会损失的盖片；所述周围屏蔽物的内壁 界定所述室，所述壁是由多个在侧面延伸如所述室的气泡破裂件形成的，当所述器 件移动时，所述室内的液体靶溶液将沿着所述具有所述微阵列的表面移动，最初在 所述室内的气泡被破裂成许多微小气泡，这样便可通过所述微小气泡的移动确保所 述液体靶溶液在所述室内的整个微阵列中非常有效的分布。在一优选实施例中，所 述盖片是平的，由基本上刚性的透明材料制成，并由所述周围屏蔽物与所述表面均 匀隔开约0.2-2毫米。在另一优选实施例中，所述盖片包括至少一个填充孔，通过 该填充孔可将所述液体靶溶液加入所述室，且其中所述微阵列包括多个附加到所述 上表面并从其向上延伸至少约20μm的3D点，该3D点带有所述反应性部分。
在另一个具体的方面，提供了在探针和靶溶液之间有效杂交的方法，所述方法包 括提供具有反应性探针部分的微阵列可结合的表面的平的底层，将周围的液体屏蔽 物与所述表面并置以形成其中具有所述微阵列的室，封闭所述室从而使在操作所述 底层时液体靶溶液不会损失，在所述室内装入靶溶液和气泡，并移动所述底层以使 所述靶溶液从所述室的一个边界移动到另一个，至少一个所述边界是成形的，因此 这种移动的结果是所述室内的气泡破裂成多个微小气泡，这样便可通过随后所述微 小气泡的移动确保所述液体靶溶液在整个微阵列上非常有效的分布。在一优选实施 例中，所述底层通过绕一基本水平的轴旋转移动，且其中所述室是对齐的，从而所 述短壁通常与从所述旋转轴放射延伸的线垂直。
再在其它具体的方面，提供了用来形成具有底层的微阵列杂交器件的盖片和垫片 组件，所述底层表面具有微阵列，所述组件包括具有上表面和下表面的平的盖片， 附于所述盖片所述下表面的矩形周围屏蔽物，用来将所述盖片连接到所述底层的表 面从而围绕所述微阵列的所述周围屏蔽物底面上的压敏粘合剂，以及覆盖所述粘合 剂的剥离片，所述屏蔽物具有界定所述室的内表面，所述室的表面是由多个在侧面 延伸如所述室的气泡破裂件形成的，从而当所述器件移动时，所述室内的液体靶溶 液将沿着所述表面从所述室的一个边界移动到另一个边界，最初在所述室内的气泡 被破裂成许多微小气泡。
附图简述
图1是设计用来构成具有本发明各种特征的微阵列杂交器件的玻璃载玻片及盖片 和垫片组件的分解透视图。
图2是放大尺寸的侧视图，显示了从图1的组件装配的微阵列杂交器件。
图3是图1所示垫片剖面的放大的局部俯视图。
图4是一器件的示意图，该器件用来在杂交培育期间操纵权利要求2所述的装满 的器件。
优选实施方案详述
图1-3所示是具备本发明各种特征的微阵列杂交器件11的一个例子。显示了结 合到玻璃载玻片15等以形成密封的杂交室的盖片和垫片组件13的组成；该组件包 括平的盖片17和周围垫片19。
玻璃载玻片15提供了其上可附加微阵列的平的底层。尽管所述底层15可以是标 准的玻璃实验室载玻片，但可使用任何其它的适合携带生物样品的提供平的表面的 物体。例如，它们可用聚合材料代替玻璃制成，或任何其它的可在其上施加带有探 针的微粒的合适的不透性物质。标准的实验室载玻片15的形状可以是矩形，其尺寸 为1×3英寸。当然也可使用其它的大小和/或形状，但标准化是微阵列杂交反应所 需要的。通常，底层的厚度并不重要，只要其表面是不透性的。
该组件的盖片17可以是由液体不能透过的材料制成的矩形片，它提供了杂交室 的平的上表面，在杂交室的表面上固定了周界或周围垫片19。垫片可具有与盖片相 同的外部尺寸从而其边缘是基本上共面的。尽管出于制造成本考虑，所述盖片一垫片 组件可以是一片，但宜以单独的片制造，然后再通过任何合适的方法适当地结合在 一起，所述方法例如粘合、溶剂结合、热密封等。例如，盖片17和垫片19都可用 聚合材料制成，并通过高强度粘合剂适当地结合在一起。
例如，可简单地从聚碳酸酯或聚丙烯或聚乙烯或一些其它的聚合材料切下盖片， 所述材料宜为疏水的，从而不会吸收注射到所述室内的水性杂交靶溶液，一旦将所 述组件与玻璃载玻片或其它底层装配在一起就形成了所述室。盖片可以是透明的， 且在一些应用中宜为透光的。然而，对于其它应用，例如对于光敏物质，盖片宜为 不透明的。
垫片19可以简单地从合适的片状材料模切下来或者定量模制，如通过注射成型。 它也可从聚合材料制造，并且可由与盖片相同的聚合物或兼容的聚合物形成，只要 该材料是液体不能透过的，以便提供液体密封型的室，在所述室内可发生杂交培育 反应。也优选由疏水材料形成垫片。例如，垫片19可从闭孔聚合泡沫材料模切下来， 该材料的一个表面具有高强度压敏粘合剂从而可方便地层压或者附加到盖片17的底 面上。
该组件被设计成随后宜通过粘合附加到带有微阵列的平的底层上，为便于实现这 一点，垫片19的底面上优选具有一层压敏粘合剂并覆盖有剥离垫21。剥离垫21可 以仅覆盖垫片19的粘合剂表面，或者可以是与盖片的大小基本相同的矩形，这样它 可密封所述室的整个表面并确保清洁。在以前的方案中，需要同时从原料物质模切 下垫片19。盖片17可以是刚性的或具有柔性，垫片19材料可具有相同的特性。由 于大多数杂交之后将需要除去有垫的盖片以进行洗涤，然后处理或分析微阵列，盖 片17宜为柔性的以便于从底层上将其剥离。
在操作时，一旦已经将微阵列23施加到玻璃载玻片15的上表面，便可准备附加 组件13以形成杂交培育器件。因此，仅需小心地从带有粘合剂的垫片19的底面上 揭去剥离垫21，并将有垫的盖片小心地装配到载玻片上，这通常是通过对准三条边， 以形成图2所示的器件，其中形成了由玻璃载玻片的上表面16、盖片17的底面以及 垫片19的壁的内表面界定的反应室25，现在垫片被密封并面对平的底层16和盖片 17。然后在其中含有微阵列23的密封液体的室25中装满液体靶溶液。
更加仔细地观察垫片19可以发现它是作为周围屏障，具有两个平行的长壁31和 两个与长壁垂直的短壁33，在将组件13层压到玻璃载玻片19上之后便形成了一个 矩形反应室。盖片17具有一对孔或开口35，优选位于所述室相对端附件，这有助于 通过一个孔35来填充所述室以及气体通过相对端的另一个孔35离开。盖片17优选 带有凸舌片(tab)39以便于在培育期结束之后从载玻片上剥离。尽管这种凸舌片可以 是盖片17的一个组成部分，例如使一条边延伸穿过垫片19或者模切出从盖片的边 缘的剩余部分向外延伸的突出物，但宜将这种凸舌片固定到盖片的底面上，如图2 所示，并沿着不具有微阵列的玻璃载玻片的末端延伸。它可由刚性或柔性材料制成 并通过粘合剂、热粘结或溶剂粘结等稳固附加。盖片17和凸舌片39宜都是柔性的 以便于在培育之后剥离。该器件设计成在使用时在所述室内不完全装满杂交靶溶液 以留下空气泡，这样做的目的是促进当杂交反应发生时该器件移动时的混合。一旦 完成填充，用任何合适的方式密封该装置35，例如通过使用塞子或粘合封口37，它 仅适合该装置并防止任何渗漏。
如上所述，反应室内大气泡的运动虽然有时能促进混合，但认为不是真正有效的， 垫片或周围屏蔽物19由多个从一对较短的壁33的表面延伸到反应室25内的气泡破 裂件41构成。这些气泡破裂件41宜为疏水的，并形成在其尖端具有尖锐边缘43的 三角形指，当遇到水溶液中的气泡时，使气泡破裂成两个独立的体积较小的气泡。 其结果是，当连续操作装有靶溶液的器件时，可能需要数小时的事件，最初的气泡 将其产生的小气泡被切割再切割，如上所述，随着它们在该器件两端之间移动，在 水溶液中产生许多在反应室的内部宽度上基本均匀分布的微小气泡。
尖锐边缘43在玻璃载玻片15和盖片17的平的表面之间延伸，且它们是基本上 相互垂直对准的。口袋区域45位于气泡破裂件41之间，它们可容纳并促进微小气 泡的形成。根据如何旋转填充好的器件，可能需要构造或引导气泡破裂件41，以便 当气泡接近短壁33时使它们的尖端指向所述室内气泡将升起的方向。如果操作时气 泡以基本与壁33垂直的方向接近壁33，气泡破裂件41的尖端可能从内壁表面完全 朝外。在例举的这种排列中，它们以与相邻的壁表面呈约45°角定位或排列，尖端 朝向长壁31较低的内壁表面，当在玻璃载玻片自身的平面上旋转该器件时，气泡可 从与长壁31相对的方向升起，这种排列是优选的。采用这种定位时，其中所述气泡 破裂件41的尖端朝向升起的气泡流，气泡在接触尖锐边缘43时破裂的可能性较大。
图4所示是一种类型的装置的例子，该装置可用来在培育期间连续旋转或操作装 有靶溶液的器件，培育时间可以是例如6-18小时。描述了支撑在通常水平的轴53 之上并衍生自支撑底座55的支撑轮51，底座55中含有使轴和轮以所需速度旋转的 电动机，所述速度优选约为2-20rpm，例如约8rpm。所述轮子的一个或两个表面 含有多个设计用来接受含有多个装有靶溶液的杂交器件11的夹座(cartridge)59的 支撑件57，从而有助于同时培育多种测试样品。当然，如果需要的话，同一轮上也 可有其它支撑件以接受美誉夹座59支撑的各个器件。优选的排布是，器件11在其 自身平面上缓慢旋转，从而气泡通常趋于沿所述室较高一侧的长壁31升起。
尽管已经根据某些优选的实施方案描述了本发明，这些实施方案构成了目前已知 的实施本发明的最佳模式，但应该理解，本领域的技术人员显然可做出各种修饰和 改变，但这不脱粒本申请书所附权利要求书所限定的本发明的范围。本发明的特殊 特征在以下权利要求书中着重强调。