将生物分子非共价固定到固体基质上的方法和微阵列

技术领域

本发明涉及将生物分子固定到固体基质上的方法，更特别地涉及将生物 分子非共价地固定到固体基质上的方法。

相关技术的说明

术语“微阵列(microarray)”指一种基质，其将特异的生物分子密集地固定 在预定区域中。微阵列的实例包括，例如，多核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。 术语“多核苷酸微阵列”指将多核苷酸密集地固定在其上的每个预定区域中 的基质。微阵列是本领域众所周知的，例如，美国专利号5,445,934和 5,744,305。

通过在基质上直接合成多核苷酸，或通过将预先合成的多核苷酸固定到 基质上的预定位置(定点法(spotting method))来将多核苷酸固定到固体基质 上。多核苷酸微阵列及其产生方法在美国专利号5,744,305，5,143,854和 5,424,186中有描述，其所公开的内容在此全部引入作为参考。定点法广泛用 于将生物分子共价地固定到固体基质上。例如，通常通过用氨基等亲核官能 团活化固体基质的表面，在所述该官能团上偶联已被优良的离去基团(leaving group)活化的生物分子，例如多核苷酸，然后从所述基质除去未反应的反应 物，从而将生物分子固定到所述基质上。将生物分子非共价地固定到基质上 的方法还不是本领域已知的。

已经将亲水化合物聚乙二醇用于微阵列。聚乙二醇通过共价键附着于 DNA链的两个末端，并且将DNA链固定到基质上以获得微阵列[实验血液 学杂志(Journal of Experimental hematology)2003：11(4)：393-397]。 US-2003-0108917-A1描述了通过将探针多核苷酸固定到水凝胶上来产生微 阵列的方法，所述水凝胶由末端具有环氧基的星状聚乙二醇衍生物组成。

然而，在这些方法中，生物分子被共价固定到基质上。即，基质或生物 分子应具有附着于其上的反应官能团。此外，共价键可在严格的反应条件下 形成。进一步的，很难控制反应条件并且操作很复杂。此外，在反应完成后 必须除去未反应的反应物质。

本发明人进行了研究并且发现了将生物分子非共价地固定到固体基质 上的方法，该方法提供可有效用于靶分子分析的高品质微阵列。

发明概述

本发明提供将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法。

本发明也提供根据上述方法产生的微阵列。

根据本发明的一个方面，提供了将生物分子非共价地固定到固体基质上 的方法，包括：提供附着有第一官能团(first functional group)的固体基质，该 第一官能团具有氢键供给能力；以及使具有氢键接受能力的化合物和用第二 官能团进行功能化(functionalize)的生物分子的混合物，与基质的表面进行反 应，该第二官能团具有氢键供给能力，以便于将生物分子非共价地固定到基 质上。

附图简述

通过详细描述其例证性的实施方案，并参考下列附图，上述的和本发明 的其他特征和优点将更为明显，其中：

图1至3是说明分别利用浓度为0.4mM和0.6mM的聚乙二醇(PEG)所 产生的微阵列的荧光测量结果的图像；以及

图4是说明根据本发明实施方案的方法所产生的在硅晶片(silicon wafer) 上固定有探针多核苷酸的微阵列和对照微阵列的荧光强度的图表。

发明详述

根据本发明的实施方案，提供将生物分子非共价地固定到固体基质上的 方法，包括：提供附着有第一官能团的固体基质，该第一官能团具有氢键供 给能力；以及使具有氢键接受能力的化合物和用第二官能团进行功能化的生 物分子的混合物，与基质的表面进行反应，该第二官能团具有氢键供给能力， 以便于将生物分子非共价地固定到基质上。

具有氢键供给能力的第一官能团与具有氢键供给能力的第二官能团可 以是不同或相同的。具有氢键供给能力的第一官能团和具有氢键供给能力的 第二官能团可分别选自氨基(amino group)、硫醇基(thiol group)和羟基 (hydroxyl group)，但不限于此。具有氨基的化合物的具体实例包括，但不限 于γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane，GAPS)、γ-氨基丙基 二乙氧基硅烷(aminopropyltdiethoxysilane，GAPDES)、以及氨基己基 (aminohexyl group)。可以通过将第一官能团，例如氨基、硫醇基和羟基导入 到例如乙酰氯硅烷(acetylchloride silane)、无水硅烷(anhydrous silane)、磺酰 氯硅烷(sulfonylchloride silane)和异硫氰酸硅烷(isothiocyanate silane)等涂覆 材料中而得到具有第一官能团的化合物。这种导入方法是本领域公知的，并 且本领域的普通技术人员可容易地进行这种方法。

在本发明的实施方案中，具有氢键接受能力的化合物指包含高负电性 (high electronegativity)原子，例如氮原子、氧原子和硫原子的分子，因此其 可供给形成氢键所必需的电子。所述化合物的实例包括聚乙二醇(PEG)或其 衍生物以及聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)或其衍生物。此外，PEG或其衍生 物，或聚乙烯亚胺或其衍生物各自的使用浓度可为0.4至6.0mM，并且分子 量可以是200至1,000,000 Da，优选为200至100,000 Da，更优选为200至 10,000 Da。在本发明例证性的实施方案中，PEG的使用浓度为6.0mM并且 分子量为10,000Da。

在本发明的实施方案中，不特异地限定固体基质，并且其可以是能提供 表面的任何固体基质。固体基质可由塑胶材料形成，例如聚乙烯、聚丙烯、 聚苯乙烯(polystyrene)和聚氨脂(polyurethane)、玻璃、硅晶片，及其修饰物。 固体基质可本身具有或通过化学或物理处理(例如涂覆)而具有第一官能团。

生物分子是来源于生物体的化合物或其合成化合物。生物分子可选自核 酸、蛋白质、多糖，及其组合。优选地，生物分子是核酸。核酸的实例可包 括DNA和RNA。通常，待固定于固体基质上的生物分子特异地与待分析的 靶分子起反应。例如，核酸可通过杂交反应特异地与具有互补核苷酸序列的 靶核酸起反应。蛋白质可通过抗原-抗体反应、配体和受体之间的相互作用 或酶和底物之间的相互作用而特异地与靶分子起反应。多糖可特异地被能够 识别多糖的抗体或蛋白质(例如凝集素)所识别。利用可检测生物分子和靶分 子之间特异的相互作用的检测系统，根据本发明方法产生的微阵列可用于各 种分析。

用于固定作用的生物分子的浓度可根据反应条件和所获得数据的类型 而不同。即，不特别地限定生物分子的浓度。在本发明例证性的实施方案中， DNA的浓度范围为20至100μM，但不限于此。

根据本发明实施方案的固定化方法可用于产生DNA或蛋白质微阵列的 传统方法。一个传统方法是利用光刻法(photolithography)产生微阵列的方法。 这种光刻法包括用以可除去的保护基团保护的单体涂覆基质表面，将该表面 的预定区域暴露于能量源以除去保护基团，以及将用可除去的保护基团保护 的第二单体偶联到第一单体上，并重复上述暴露和偶联，从而产生出多核苷 酸微阵列(光刻法)。在该方法中，通过一个接一个地延伸单体来合成多核苷 酸，从而实现多核苷酸的固定。在通过定点法产生微阵列的方法中，将预先 合成的多核苷酸固定到基质上的预定区域中。这些产生微阵列的方法在例 如，美国专利号5,744,305，5,143,854和5,424,186中有描述。这些专利所公 开的内容在此全部引入作为参考，其中描述了多核苷酸微阵列及其产生方 法。

根据本发明的另一个实施方案，提供根据上述方法产生的微阵列。

通过提供的实施例来更详细地描述本发明。这些实施例只为例证说明的 目的，而不是为了限制本发明的范围。

实施例

实施例1：通过使聚乙二醇和用氨基在其5’端进行功能化的DNA的混 合物与用氨基涂覆的玻璃基质的表面起反应来产生DNA微阵列。

在该实施例中，使PEG和用氨基在其5’端进行功能化的DNA的混合物 与用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷(GAPS)涂覆的玻璃基质的表面起反应，以产生 具有以点(spot)排列的DNAs的DNA微阵列。

首先，使用可购自Dow Coring(www.corning.com)的Cat no.40004作为用 GAPS涂覆的玻璃基质。将用氨基己基在其5’端进行功能化的探针核苷酸 (SEQ ID Nos.1至10)分别以20μM的浓度溶于在含有50％DMSO的0.1M NaHCO3(pH9)中的6mM PEG(购自Aldrich，Mw10,000)溶液中。待固定的探 针多核苷酸由完全匹配的序列(野生型探针)和错配序列(突变型探针)组成， 其中完全匹配的序列与年轻人的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young)基因MODY1的外显子7至10的特定区域互补，而错配序列除了一 个核苷酸之外与野生型探针的序列互补。

表1.探针多核苷酸的名称和序列号(SEQ ID No)

  探针位置   野生型探针序列   突变型探针序列   MO1E07-02rwp1   SEQ ID NO.1   SEQ ID NO.2   MO1E07-03rwp1   SEQ ID NO.3   SEQ ID NO.4   MO1E08-01rwp1   SEQ ID NO.5   SEQ ID NO.6   MO1E09-01rwp1   SEQ ID NO.7   SEQ ID NO.8   MO1E10-01rwp1   SEQ ID NO.9   SEQ ID NO.10

利用Pix5500spotterTM点样仪(购自Cartesian)，将所获得的探针多核苷酸 溶液分别以每点500pl点样(spot)到玻璃基质上。然后，在恒定温度和湿度的 室中，以70℃和30％的湿度，进行固定反应1个小时。反应完成后，用蒸 馏水洗涤玻璃基质，并且用无水丁二酸(封闭剂)保护基质上残留的氨基。然 后用乙醇洗涤玻璃基质，并且旋转干燥以获得具有被固定的探针多核苷酸的 微阵列。所获得的微阵列分别具有相互之间以300μm间隔排列的60个点。

实施例2：利用根据本发明实施方案的方法所产生的微阵列来分析靶核 酸。

在该实施例中，利用在实施例1中所产生的探针多核苷酸微阵列进行探 针多核苷酸和靶核酸之间的杂交反应，然后根据杂交的结果，评估根据本发 明实施方案的方法所产生的微阵列的品质。

首先，扩增靶DNAs。利用分别具有SEQ ID Nos.11至24的14个寡核 苷酸作为引物，并利用分离自人血液的gDNA作为模板进行PCR，以获得 包含MODY1的外显子7至10的多核苷酸。

PCR的条件如下：将0.2μl野生型基因组DNA，各200μM的dATP、dGTP、 dCTP，40μM dTTP，160μM Cy3-标记的dUTP(Amersham Biosciences，Uppsala， 瑞典)，和200nM的相应于外显子和启动子的10个区域的10个多重PCR组 (multiple PCR sets)混合在一起。然后，进行40个循环的PCR，每个循环包 括在95℃变性30秒，在64℃退火10秒，以及在72℃延伸3分钟。利用Qiagen 试剂盒纯化所得到的PCR产物，然后选择A260/A550比率为1.0至3.5的PCR 产物用于后续的步骤。

用0.5U的DNase I(Boehringer Mannheim，曼海姆，德国)在37℃将纯化 的PCR产物切成片段，反应进行10分钟。然后，向产物加入终止混合物 (20mM EDTA，pH8.0-1％SDS-0.2M NaCl)以终止DNase I的消化反应。接着， 调节切成片段的产物至浓度为150至187.5nM，在94℃变性5分钟，并在冰 上放置2分钟进行冷却。将产物分别与相同量的杂交缓冲液(6×SSPE-0.1％ Triton X-100)混合，然后应用于从实施例1获得的微阵列。分别将微阵列在 32℃孵育12至16小时，然后用洗涤缓冲液I(6×SSPE-Triton X-1000.005％) 洗涤5分钟，再用洗涤缓冲液II(3×SSPE-Triton X-1000.005％)洗涤5分钟。 随后，微阵列在室温干燥15分钟，利用GenePix 4000B scannerTM扫描仪(Axon Instruments)在532nm处成像。利用GenePix Pro softwareTM软件(Axon Instruments，Union City，CA)分析所获得的图像。

分析结果如图1和表2所示。对5个微阵列进行实验，每个微阵列上固 定有如表1所列出的野生型和突变型探针(每种探针3个点)。所获得的图像 和荧光强度数据如图1和表2所示。图1表明，固定有探针多核苷酸的5个 微阵列S1到S5(在实施例1中获得)在与靶核酸杂交后，扫描获得的荧光图 像，其中在图1的上部分别指出序列号。在图1中，每个微阵列的上一排点 和下一排点分别相应于PEG浓度0.4mM和6.0mM。表2显示在532nm处测 量的图1中点的荧光强度。利用浓度低至0.4mM的PEG所获得点用作对照， 因为很难获得与利用PEG浓度6.0mM所获得的点具有相似的固定探针多核 苷酸密度的点。

如表2所示，利用PEG浓度6.0mM所获得的微阵列上的点的荧光强度 是6774，而利用PEG浓度0.4mM所获得的微阵列上的点的荧光强度是2683。 此外，利用PEG浓度6.0mM所获得的微阵列上的点的荧光强度与利用PEG 浓度0.4mM所获得的微阵列上的点的荧光强度的比率是2.87。因此，当根 据本发明的实施方案产生微阵列时，荧光强度是与所使用的PEG浓度直接 成比例的。就是说，利用浓度为6.0mM的PEG的情况，可获得比利用浓度 为0.4mM的PEG的情况高大约3倍的荧光强度。因此，证实可通过用PEG 固定探针来增加荧光强度的灵敏性。PEG浓度和荧光强度之间的比例关系可 以维持到PEG浓度8mM，高于此浓度时，在点样期间针孔被堵塞，从而阻 碍了实际应用(数据未显示)。

为了证实在利用根据本发明实施方案的方法所产生的微阵列对靶核酸 进行的分析中，探针可特异地与靶核酸起反应，获得野生型探针(wp)的荧光 强度与突变型探针(mp)的荧光强度的比率。结果显示在表3中。

野生型探针(wp)的荧光强度与突变型探针(mp)的荧光强度的比率，即 wp/mp，对于利用PEG浓度0.4mM的点是8.05，而对于利用PEG浓度6.0mM 的点是11.15，这比前者的比率8.05高出大约1.31倍。这证明当用于固定探 针核苷酸的PEG的浓度变高时，可以以增加的特异性检测靶核酸。

根据实施例1和2中，利用将探针核苷酸以简单的方式非共价地固定到 玻璃基质上的方法所得到的结果，即使不使用将探针核苷酸共价地固定到玻 璃基质上的传统方法，也可以提供具有高分析灵敏性和特异性的微阵列。

实施例3：PEG浓度对微阵列的影响

在该实施例中，以与实施例1和2中相同的方式产生探针核苷酸阵列， 并进行杂交反应，不同的是改变了待固定的探针核苷酸的序列。所述探针核 苷酸具有SEQ ID No.25，靶多核苷酸具有与SEQ ID No.25完全匹配的多核 苷酸序列。

结果是，利用PEG浓度0.4mM所获得的微阵列上的点的荧光强度是 7,700，而利用PEG浓度6.0mM所获得的微阵列上的点的荧光强度是15,000。 图2和3是表明分别利用PEG浓度0.4mM和6.0mM所产生的微阵列的荧光 检测结果的图像。

这证明当用于固定探针核苷酸的PEG的浓度变高时，可检测到的荧光 强度变高。

实施例4：通过使PEG和用氨基在其5’端进行功能化的DNA的混合物 与硅晶片的表面起反应来产生DNA微阵列

在该实施例中，以与实施例1中相同的方式来产生微阵列，不同的是用 涂覆了GAPS的硅晶片(购自LG Siltron：用硼浸润的P型硅晶片)作为固体 基质。然后在每个微阵列上进行与靶核酸的杂交，并且以与实施例2中相同 的方式测量荧光强度。使用与实施例3中相同的探针和靶多核苷酸。

如下进行在硅晶片上涂覆GAPS。利用旋转涂层仪(spincoater)型号CEE 70TM(购自CEE)将GAPS的乙醇溶液(20％(v/v))旋转涂覆(spin-coat)到硅晶片 上。旋转涂覆过程包括以500rpm/10秒起始涂覆，并且主要在2,000rpm/10 秒进行涂覆。完成旋转涂覆后，将基质固定在聚四氟乙烯(Teflon)晶片载体上 以在120℃恢复(cure)40分钟。然后将基质在水中浸泡10分钟，超声波洗涤 15分钟，并且再次在水中浸泡10分钟。再旋转干燥基质。干燥后，将基质 切割成正方形(square)或矩形(rectangular)以用于试验。所有的实验在已经除 去大部分尘埃颗粒的净化室-级别1,000中进行。

荧光强度的结果显示在图4中。图4是表明分别利用浓度为0.4mM和 6.0mM的PEG将探针多核苷酸固定到硅晶片上的微阵列的荧光强度图表。 如图4中所表明的，证实即使利用PEG将探针非共价地固定到基质上也可 获得高的荧光强度，并且荧光强度与所使用的PEG的浓度成比例关系。

实施例5：探针多核苷酸的浓度对荧光强度的影响

在该实施例中，以与实施例1和2中相同的方式产生探针核苷酸阵列， 并进行杂交反应以及检测荧光强度，不同的是改变了待固定的探针多核苷酸 的类型和浓度。在固定化反应中，使用浓度为20μM或100μM并具有SEQ ID No.26的探针多核苷酸。

在分别利用浓度为20μM或100μM的探针多核苷酸的情况中，荧光强 度分别为12,238和8,321。

根据实施例5的结果，证实利用浓度为大约20μM的探针多核苷酸可得 到最佳的荧光强度。通常，当探针多核苷酸是共价固定的时，其所使用的浓 度高于20μM。因此，根据本发明实施方案的方法可减少在固定中使用的探 针多核苷酸的量。

根据本发明实施方案的将生物分子固定到固体基质上的方法，可以在不 使用具有强反应官能团的化学物质的情况下，将探针多核苷酸固定到固体基 质上。因此，本方法可提供简化的工艺和较低的成本。另外，本方法可提供 在反应的灵敏度和特异性方面高品质的微阵列。

虽然，本发明已经参考其例证性的实施方案进行特别地显示和描述，本 领域的普通技术人员将理解可在形式或细节中产生各种变化，而不背离如下 列权利要求所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.Ltd.)

<120>用于将生物分子非共价地固定到固体基质上的方法和根据该方法产生的微阵列

<130>PN052697

<160>26

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>野生型探针核苷酸

<400>1

ctcctggaag ggca                                                14

<210>2

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变型探针核苷酸

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agctcctaga aggg                                                14

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>野生型探针核苷酸

<400>3

aggcatactc attgtca                                            17

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变型探针核苷酸

<400>4

aggcatactg attgtca                                            17

<210>5

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>野生型探针核苷酸

<400>5

ccaaagcggc cac                                                13

<210>6

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变型探针核苷酸

<400>6

ccaaagtggc cac                                                13

<210>7

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>野生型探针核苷酸

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acgatgacgt tggt                                               14

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<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>突变型探针核苷酸

<400>8

acgatgatgt tggt                                               14

<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>野生型探针核苷酸

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tgggggatgg cag                                                    13

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>突变型探针核苷酸

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gggggacggc aga                                                    13

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cagcaacaca acatccccca gagg                                        24

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tacagcaacc accaaggcca aatct                                        25

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<212>DNA

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<223>引物

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gggcctgggc agtccgatga t                                            21

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<212>DNA

<213>人工序列

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aggggagggt tcctgggtct gtgta                                        25

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agaatgtttg cagcgagggg tgtcc                                25

(210>16

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<212>DNA

<213>人工序列

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agcggcccta ggatcatctc aaaag                                25

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<213>人工序列

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atgcccatct ccaacccaca actca                                25

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<213>人工序列

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gcagggaaaa gtgaccaagc caata                                        25

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gcagccatga acggcgagga g                                            21

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aggtaaggcg gccgggtgag aac                                         23

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<212>DNA

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aggtaaggcg gccgggtgag aac                                            23

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tgtggcgacg cgctaaggcc ag                                             22

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ggcagggtgg gaggggagaa c                                              21

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gcgtcagggt gcagtgggat gt                                            22

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<220>

<223>探针核苷酸

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tgttctcttg tcttg                                                    15

<210>26

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针核苷酸

<400>26

cagctggctc agtt                                                     14