리버스-턴 유사체 및 이와 관련된 방법 |
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申请号 | KR1020047005346 | 申请日 | 2002-10-11 | 公开(公告)号 | KR1020040045504A | 公开(公告)日 | 2004-06-01 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
申请人 | 제이더블유중외제약 주식회사; | 发明人 | 칸마이클; 에구치마사카츠; 문성환; 정재욱; 이승찬; 정광원; | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
摘要 | PURPOSE: Reverse-turn mimetics and methods relating thereto are provided, can inhibit the expression of survivin, TCF/B-catenin transcription, and the expression of Wnt signaling, so that it can inhibit the growth of tumor cell in a mammalian subject. CONSTITUTION: The reverse-turn mimetics represented by formula (I) are provided, wherein A is -(CHR3)- or -(C=O); B is -(CHR4)- or -(C=O)-; D is -(CHR5)- or -(C=O)-; E is -(ZR6)- or -(C=O)-; G is -(XR7)n-, -(CHR7)-(NR8)-, -(C=O)-(XR9)- or -(C=O)-; W is -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO2)- or nothing; Y is oxygen or sulfur; X and Z is independently nitrogen or CH; N is 0 or 1; and R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 and R9 are the same or different and independently selected from an amino acid side chain moiety or derivative thereof, the remainder of the molecule, a linker and a solid support, and stereoisomers thereof. The methods for inhibiting the growth of tumor cell in a mammalian subject, for treating cancer in combination with other anti-neoplastic agents, for treating or preventing diseases such as restenosis associated with angioplasty, polycystic kidney disease, aberrant angiogenesis disease, rheumatoid arthritis disease and ulcerative colitis, and for identifying a biologically active component, and a library of compounds using the reverse-turn mimetics of formula (I) are provided . | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
权利要求 | 하기 화학식(Ⅰ)의 화합물. 상기 화학식(Ⅰ)에서 A는 -(CHR 3 )- 또는 -(C=O)- 이며, B는 -(CHR 4 )-, -(C=O)- 이며, D는 -(CHR 5 )- 또는 -(C=0)- 이며, E는 -(ZR 6 )-, -(C=0)- 이며, G는 -(XR 7 ) n -, -(CHR 7 )-(NR 8 )-, -(C=O)-(XR 9 )- 또는 -(C=O)- 이고, W는 -Y(C=O)-, -(C=O)NH- , -(SO 2 )- 또는 없고, Y는 산소 또는 황이며, X와 Z는 독립적으로 질소 또는 CH이며, n은 0 또는 1이며; R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 및 R 9 는 동일하거나 상이하고 아미노산 측쇄 잔기 또는 이의 유도체, 분자의 잔여부분, 링커(linker)및 고체 지지체(solidsupport),및 그들의 입체 이성질체(stereoisomer)로부터 독립적으로 선택된다. 제1항에 있어서, 상기 R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 ,R 6 , R 7 , R 8 , 및 R 9 는 아미노C 2-5 알킬, 구아니디노C 2-5 알킬, C 1-4 알킬구아니디노C 2-5 알킬, 다이C 1-4 알킬구아니디노-C 2-5 알킬, 아미디노C 2-5 알킬, C 1-4 알킬아미디노C 2-5 알킬, 다이C 1-4 알킬아미디노C 2-5 알킬, C 1-3 알콕시, 페닐, 페닐 치환체(치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐(Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, 카복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 벤질, 벤질 치환체(벤질에서의 치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐(Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, � ��복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 나프틸, 나프틸 치환체(치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐 (Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, 카복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 비스-페닐 메틸, 비스-페닐 메틸 치환체(치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐(Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, 카복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 피리딜, 피리딜 치환체(치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조 닐(Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, 카복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 피리딜C 1-4 알킬, 피리딜C 1-4 알킬 치환체(피리딘 치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐 (Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, 카복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 피리미딜C 1-4 알킬, 피리미딜C 1-4 알킬 치환체(피리미딘 치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐(Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시 또는 니트로, 카복시 , 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 트리아진-2-일-C 1-4 알킬, 트리아진-2-일-C 1-4 알킬 치환체(트리아진 치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐(Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, 카복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다.), 이미다조C 1-4 알킬, 이미다졸C 1-4 알킬 치환체(이미다졸 치환기는 각각 아미노, 아미디노, 구아니디노, 히드라지노, 아미드라조닐(Amidrazonyl), C 1-4 알킬아미노, C 1-4 다이알킬아미노, 할로겐, 퍼플루오르 C 1-4 알킬, C 1-4 알킬, C 1-3 알콕시, 니트로, 카복시, 시아노, 설퍼릴 또는 하이드록실 중 하나 이상을 선택할 수 있다), 이미다조리닐C 1-4 알킬, N-아미디노피페라 지닐-NC 0-4 알킬, 하이드록시C 2-5 알킬, C 1-5 알킬아미노 C 2-5 알킬, 하이드록시C 2-5 알킬, C 1-5 알킬아미노C 2-5 알킬, C 1-5 다이알킬아미노C 2-5 알킬, N-아미디노피페리디닐C 1-4 알킬 및 4-아미노사이클로헥실C 0-2 알킬로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 화합물. 제1항에 있어서, 상기 A는 -(CHR 3 )- 이고, B는 -(C=O)- 이고 , D는 -(CHR 5 )- 이고, E는 -(C=O)- 이고 ,G는 -(XR 7 ) n -인 하기 화학식(Ⅱ)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물. 상기 화학식(Ⅱ)에서 R 1 , R 2 , R 3 , R 5 , R 7 , W, X 및 n은 청구항 제1항에서 정의된 바와 같다. 제1항에 있어서, 상기 A는 -(C=O)- 이고, B는 -(CHR 4 )- 이고, D는 -(C=O)- 이고, E는 -(ZR 6 )- 이고, G는 -(C=O)-(XR 9 )- 인 하기 화학식 (Ⅲ)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물. 상기 화학식(Ⅲ)에서 R 1 , R 2 , R 4 , R 6 , R 9 , W 및 X는 청구항 제1항에서 정의된 바와 같고, Z는 질소 또는 CH(Z가 CH일 때, X는 질소)이다. 제1항에 있어서, 상기 A는 -(C=O)- 이고, B는 -(CHR 4 )- 이고, D는 -(C=O)-이고, E는 -(ZR 6 )- 이고, G는 -(XR 7 ) n - 인 하기 화학식 (Ⅳ)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물. 상기 화학식(Ⅳ)에서 R 1 , R 2 , R 4 , R 6 , R 7 , W, X 및 n은 청구항 제1항에서 정의된 바와 같고, Z는 질소 또는 CH(Z가 질소일 때, n은 0이고, Z가 CH일 때, X는 질소이고 n은 0이 아니다)이다. 제2항에 있어서, 상기 R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 ,R 6 , R 7 , R 8 , 또는 R 9 는 고체 지지체 또는 고체 지지체 유도체와 결합한 것을 특징으로 하는 화합물. 제3항에 있어서, 상기 R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 ,R 6 , R 7 , R 8 , 또는 R 9 는 고체 지지체 또는 고체 지지체 유도체와 결합한 것을 특징으로 하는 화합물. 제4항에 있어서, 상기 R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 ,R 6 , R 7 , R 8 , 또는 R 9 는 고체 지지체 또는 고체 지지체 유도체와 결합한 것을 특징으로 하는 화합물. 제5항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식(Ⅵ)의 구조를 갖는 화합물: 상기 화학식(Ⅵ)에서, Ra는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1에서 3까지의 헤테로 원자를 가질 수 있는, 8에서 11까지의 링 구성원을 갖는 두 고리 아릴 그룹(bicyclic aryl group)이고, Rb는 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 1에서 2까지의 헤테로 원자를 가질 수 있는 5에서 7까지의 링 구성원을 갖는 단일 고리 아릴 그룹(monocyclic aryl group)이고, 화합물에서 아릴 링은 할라이드, 하이드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기를 가질 수 있다. 제9항에 있어서, 상기 Ra는 나프틸, 퀴노리닐 또는 아이소퀴노리닐 그룹이고, Rb는 페닐, 피리딜 또는 피페리딜 이고, 이들 모두는 할라이드, 하이드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 치환될 수 있음을 특징으로 하는 화합물. 제9항에 있어서, 상기 Ra는 나프틸이고, Rb는 페닐 - 이것은 할라이드, 하이드록시, 시아노, 저급 알킬, 및 저급 알콕시기로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 치환될 수 있음 - 인 것을 특징으로 하는 화합물. 청구항 제1항 내지 청구항 제9항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물의 라이브러리. 청구항 제1항의 화합물과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. 제13항에 있어서, 청구항 제9항의 화합물의 안전하고 효과적인 양과 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물. 청구항 제1항, 청구항 제3항, 청구항 제4항 및 청구항 제 5항 중 어느 한 항의 조성물의 안전하고 효과적인 양을 종양 세포에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물체에서 종양 세포의 생장을 억제하는 방법. 청구항 제9항의 조성물의 안전하고 효과적인 양을 종양세포에 투여하는 것을 특징으로 하는 포유류 동물체에서 종양 세포의 생장을 억제하는 방법. 제15항 또는 제16항에 있어서, 종양 세포는 결장 직장 세포임을 특징으로 하는 방법. 5-FU, 탁솔, 시스플라틴, 미토마이신 C, 테가푸르, 랠티트렉스드 (raltitrexed), 카페시타빈(capecitabine) 그리고 이리노테칸(irinotecan)과 같은 항암제와 조합해서 청구항 제1항, 청구항 제3항, 청구항 제4항, 청구항 제5항 ,청구항 제9항의 화학식 (Ⅰ)의 구조를 갖는 화합물의 안전하고 효과적인 양을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법. 청구항 제1항, 청구항 제3항, 청구항 제4항, 청구항 제5항 또는 청구항 제 9항 중 어느 한 항의 화합물의 안전하고 효과적인 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 혈관 확장술과 관련된 재흡착의 치료 또는 예방 방법. 청구항 제1항, 청구항 제3항, 청구항 제4항, 청구항 제5항 또는 청구항 제9항 중 어느 한 항의 화합물의 안전하고 효과적인 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 다낭신 질병의 치료 또는 예방 방법. 청구항 제1항, 청구항 제3항, 청구항 제4항, 청구항 제5항 또는 청구항 제9항 중 어느 한 항의 화합물의 안전하고 효과적인 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 혈관생성 변형 질병의 치료 또는 예방 방법. 청구항 제1항, 청구항 제3항, 청구항 제4항, 청구항 제5항 또는 청구항 제9항 중 어느 한 항의 화합물의 안전하고 효과적인 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염의 치료 또는 예방 방법. 청구항 제1항, 청구항 제3항, 청구항 제4항, 청구항 제5항 또는 청구항 제9항 중 어느 한 항의 화합물의 안전하고 효과적인 양을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 궤양성 대장염의 치료 또는 예방 방법. 청구항 제12항의 라이브러리와 생물학적으로 활성이 있는 화합물을 검출하거나 스크린하기 위한 표적과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 생물학적으로 활성이 있는 화합물의 동정 방법. |
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说明书全文 |
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정제 1 | mg/tablet |
화합물 | 100 |
락토오스(Lactose)Ph. Eur. | 179 |
크로스카멜로스소디움(Croscarmellose sodium) | 12.0 |
폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone) | 6 |
마그네슘스테아레이트(Magnesium stearate) | 3.0 |
정제2 | mg/tablet |
화합물 | 50 |
락토오스(Lactose) Ph. Eur. | 229 |
크로스카멜로스 소디움(Croscarmellose sodium) | 12.0 |
폴리비닐 피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone) | 6 |
마그네슘스테아레이트(Magnesium stearate) | 3.0 |
정제 3 | mg/tablet |
화합물 | 1.0 |
락토오스(Lactose) Ph. Eur. | 92 |
크로스카멜로스 소디움(Croscarmellose sodium) | 4.0 |
폴리비닐 피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone) | 2.0 |
마그네슘 스테아레이트(Magnesium stearate) | 1.0 |
캡슐 | mg/capsule |
화합물 | 10 |
락토오스(Lactose) Ph. Eur. | 389 |
크로스카멜로스 소디움(Croscarmellose sodium) | 100 |
마그네슘 스테아레이트(Magnesium stearate) | 1.0 |
주사액 I | (50mg/ml) |
화합물 | 0.5% w/v |
등장 수용액 | 100%까지(to 100%) |
일반적인 화학식(Ⅰ)의 화합물, 특히 화학식(Ⅵ)의 화합물을 포함하는 약학 조성물은 암이나 직장암과 같은 Wnt-신호 경로 변이에 의한 질병의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는, 본 발명의 화합물을 안전하고 효과적인 양으로 암 세포에 투여하는 것을 특징으로 하는 개체 내의 종양 세포의 생장을 억제하기 위한 방법에 대하여 나타나 있다. 이러한 화합물을 포함하는 조성물은 또한 종양 세포의 억제를 위해 사용될 수 있다. 따라서 이러한 방법은 포유류 동물체에서 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 그것은 직장암의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서는 Wnt-신호 경로 변형에 의한 질병을 치료하기 위한 방법, 일반적인 화학식(Ⅰ), 특히 일반적인 화학식(Ⅵ)의 구조를 갖는 화합물을 안전하고 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법에 대해 나타나 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물들은 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
이러한 관계에서 본 발명에서는 일반적인 화학식(Ⅰ), 특히 일반적인 화학식(Ⅵ)의 구조를 갖는 화합물이나 이를 포함하는 조제된 조성물은 Wnt-신호 경로와 와 관련된 암 세포의 과다발현을 일으킨다고 믿고 있는, TCF4- β카테닌 - CBP 복합체 변형에 의한 질병을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서는 일반적인 화학식(Ⅰ), 특히 일반적인 화학식(Ⅵ)의 구조를 갖는 화합물을 사용해서, TCF4- β카테닌- CBP 복합체 변형에 의한 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
더욱이, 암의 치료에서는 또한 환자의 종양 세포에서 세포소멸을 유도하는것과 밀접한 관련이 있기 때문에, 본 발명은 또한 일반적인 화학식(Ⅰ), 특히 일반적인 화학식(Ⅵ)의 구조를 갖는 화합물을 사용해서 암 세포에서의 세포소멸을 유도하는 방법을 나타낸다.
공지된 기술로부터 알려진 바와 같이 5-FU[플루오로우라실 ; 5-플루오로-2,4(1H,3H)-피리미딘디원]은 배양된 구강암 세포에서 세포 소멸을 유도할 수 있다(D. Tong et al., Oral Oncology 36, 2000, 236-241). 더욱이, 결장암(colon cancer)은 5-FU에 민감하다는 것이 알려져 있다(D.Arango et al., Cancer Research 61, 2001, 4910-4915). 따라서 본 발명에서는 항암효과가 있는 5-FU와 본 발명의 화학식(Ⅰ), 특히 일반적인 화학식(Ⅵ)의 구조를 갖는 화합물의 조합물을 제조하고 SW480 세포주(cell line)에 대하여 시험하였다. 그 결과 본 발명의 화합물과 5-FU 조합물, 특히 TCF4 화합물이 SW480 세포와 같은 암 생장을 억제하는 데 놀랄만한 효과가 있다는 것을 알았다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서는 제 1항의 화학식(Ⅰ)과 특히 화학식 (Ⅵ)의 구조를 갖는 화합물에 5-FU와 같은 다른 항암 제제를 혼합한 화합물을 안전하고 효과적인 양으로 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 서바이빈 활성을 억제할 수 있음을 보여준다. 블랑크-브루드 등은 논문에서(Blanc-Brude et al., Nat. Medicine 8 : 987, 2002) 서바이빈은 병리학상의 관-벽 재성형(vessel-wall remodeling)에서 중요한 민무늬근 세포소멸의 중요한 조절인자임을 보였다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서는 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 효과적인 양을 투여하는 것을 특징으로 하는 혈관 확장술과 관련이 있는 재협착을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양태에서는 재협착(restenosis)을 치료한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 재협착이 발생한 환자에게 투여하면 재협착에 의한 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 또한 본 발명은 다른 양태에서는 재협착을 예방한다. 즉, 새로운 또는 추가의 재협착이 발생할 것으로 예상되는 환자에게 본 발명의 리버스-턴 유사체를 투여하면 재협착에 의한 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유류 동물체이다.
본 발명의 화합물은 TCF/β-카테닌의 전사를 억제할 수 있음을 보여준다. 로도바 등은 논문에서(Rodova et al., J. Biol. Chem. 277 : 29577, 2002) PKD-1 촉진자(promoter)는 β-카테닌/TCF 경로의 표적이 됨을 보였다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면에서는 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 효과적인 양을 투여하는 것을 특징으로 하는 다낭신 질병(polycystic kidney disease)을 치료하거나 예방하는 방법을 제공함을 목적으로 한다. 본 발명의 하나의 양태에서는 본 발명은 다낭신 질병을 치료한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 다낭신 질병이 있는 환자에게 투여하여 다낭신 질병의 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 다른 양태에서 본 발명은 다낭신 질병을 예방한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 다낭신 질병의 발생할 것으로 예상되는 환자에게 투여하면 다낭신 질병의 예상되는 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유류 동물체이다.
본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제할 수 있음을 보여준다. 하나이 등은 논문에서(Hanai et al., J. Cell Bio. 158 : 529, 2002) 혈관생성 억제제 (anti-angiogenic factor)로 알려진 엔도스타틴이 Wnt 신호를 억제함을 보였다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에서는 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 효과적인 양을 투여하는 것을 특징으로 하는 혈관생성 변형 질병(aberrant angiogenic)을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 양태에서는 혈관생성 변형 질병을 치료하는 것이다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 혈관생성 변형 질병이 있는 환자에게 투여하여 혈관생성 변형 질병에 의한 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 다른 양태에서 본 발명은 혈관생성 변형 질병을 예방한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 혈관생성 변형 질병이 발생할 것으로 예상되는 환자에게 투여하면 혈관생성 변형 질병의 예상되는 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유류 동물체이다.
본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제할 수 있음을 보여준다. 센 등은 논문에서(Sen et al., PNAS(USA) 97 : 2791, 2000) 류머티스성 관절염이 걸린 포유류에서 RA활액 조직에서 Wnt와 Fz의 Wnt발현이 증가됨을 보였다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에서는 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 효과적인 양을 투여하는 것을 특징으로 하는 류머티스성 관절염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에 있어서 본 발명은 류머티스성 관절염을 치료한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 류머티스성 관절염이 있는 환자에게 투여하여 류머티스성 관절염의 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 다른 양태에서 본 발명은 류머티스성 관절염을 예방한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 류머티스성 관절염이 발생할 것으로 예상되는 환자에게 투여하면 류머티스성 관절염의 예상되는 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유류 동물체이다.
본 발명의 화합물은 Wnt 신호의 발현을 억제할 수 있음을 보여준다. 유쓰오프 등은 논문에서(Uthoff eg al., Int. J. Oncol. 19 : 803, 2001) 흐트러진 특이형태 상향 조절과 fz(Wnt 경로 분자)가 궤양성의 대장염(Chron의 질병환자와 비교하여)을 일으킨다는 것을 보였다. 따라서 본 발명의 다른 측면에서는 환자의 필요에 따라 본 발명의 리버스-턴 유사체의 안전하고 효과적인 양을 투여하는 것을 특징으로 하는 궤양성의 대장염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 필요에 따라 환자에게 투여하고 본 발명의 리버스-턴 유사체의 적절하고 효과적인 양을 그 내용으로 한다. 하나의 양태에서 본 발명은 궤양성의 대장염을 치료한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 궤양성의 대장염이 있는 환자에게 투여함으로써 궤양성 대장염의의 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 다른 양태에서 본 발명은 궤양성 대장염을 예방한다. 즉, 본 발명의 리버스-턴 유사체를 새로운 또는 추가의 궤양성의 대장염의 발병이 예상되는 환자에게 투여하면 예상되는 궤양성 대장염의 고통, 정도를 감소시킬 수 있다. 임의적으로 환자는 포유류 동물체이다.
다음은 본 발명의 화합물, 조성, 사용하는 방법을 예시하기 위해 제시된 것이지만, 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.
[제조예1] : (N-Fmoc-N'-R 3 -히드라지노)-아세트 산의 제조
(1) N-Fmoc-N'- 메틸 히드라진의 제조
2L, 가지가 두개 달린 둥근 바닥 플라스크(two-neck,round-bottomed-flask)에 유리마개와 칼슘 튜브를 끼운다. THF에 메틸히드라진 설페이트(20g,139mmol)를 녹인 용액(300ml)을 넣고, THF에 DiBoc(33g,153mmol)을 녹인 용액을 넣는다. 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate)포화 수용액(500ml)을 깔대기를 통해서 방울방울 떨어뜨리고(dropwise)2시간 동안 격렬하게 교반한다. 6시간후 THF에 Fmoc-Cl(39g, 153mmol)을 녹인 용액을 천천히 가한다. 결과물은 0℃에서 6시간 동안 교반한다. 혼합물은 EA(500ml)로 추출하고 유기층을 남겨둔다. 용액은 황산나트륨과 함께 건조한 후 진공에서 증발시킨다. 다음 단계는 정제 없이 진행된다.
1L, 가지가 두개 달린 둥근 바닥 플라스크(two-necked, round-bottomed-flask)에 유리마개와 칼슘 튜브를 끼운다. 반응물에 MeOH(300ml)를 넣고 진한 염산(30mL, 12N)을 얼음물 조에서 교반하면서 깔대기를 통하여 천천히 넣는다. 그리고 밤새도록 교반한다. 혼합물은 EA(100ml)로 추출하고 유기층을 남겨둔다. 용액은 황산 나트륨으로 건조하고 진공에서 증발시킨다. 잔여물은 n-헥세인(hexane)과 EA로 결정화하여 정제하고 결과물을 얻는다(32.2g, 83%).
1 HNMR (DMSO-D6) δ7.90~7.88 (d, J =6 Hz, 2H,), δ7.73~7.70 (d, J =9 Hz, 2H,), 7.44~7.31 (m, 4H), 4.52~4.50 (d, J =6 Hz, 2H), 4.31~4.26 (t, J =6 Hz, 1H), 2.69 (s, 1H)
(2)(N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트 산 t-부틸 에스테르의 제조
1L, 가지가 두개 달린 둥근 바닥 플라스크(two-necked,round-bottmo-flask)에 유리마개와 칼슘 튜브에 연결된 환류 응축기를 끼운다. 톨루엔(300ml)에 N-Fmoc-N'-메틸-히드라진(20g, 75mmol)을 녹인 용액을 넣는다. 톨루엔(50ml)에 t-부틸 브로모 아세테이트(22g, 111mmol)를 녹인 용액을 천천히 넣는다. Cs 2 CO 3 (49g, 149mmol)을 천천히 넣는다. NaI(11g, 74mmol)를 격렬하게 교반하면서 천천히 넣는다. 반응물은 하루 동안 환류 온도(reflux temperature)에서 교반한다. 혼합물을 여과하고 유기층을 에틸 아세테이트(EA)(500ml)로 추출한다. 용액은 황산나트륨으로 건조하고 진공에서 증발시킨다. 헥세인(haxane) : EA = 2 : 1용액을 사용해서 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 얻는다(19.8g, 70%).
1 H-NMR (CDCl 3 -d) δ7.78~7.75 (d, J =9 Hz, 2H,), δ7.61~7.59 (d, J =6 Hz, 2H,), 7.43~7.26 (m, 4H), 4.42~4.40 (d, J =6 Hz, 2H), 4.23 (b, 1H), 3.57 (s, 2H), 2.78 (s, 3H), 1.50 (s, 9H)
(3) (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트 산의 제조
1L, 가지가 두개 달린 둥근 바닥 플라스크(two-neck, round-bottmoed-flask)에 유리마개와 칼슘 튜브로 연결된 환류 응축기를 연결시킨다. (N-Fmoc-N'-메틸-히드라지노)-아세트산 t-부틸 에스테르(20g, 52mmol)을 넣는다. 염산용액(150ml, 디옥산 4M용액)을 얼음물 조에서 격렬하게 교반하면서 천천히 넣는다. 반응물은 상온에서 하루 동안 교반한다. 용액은 40℃에서 감압 하에서 완전하게 농축시킨다. 포화 NaHCO 3 수용액(100ml)을 넣고 물층은 디에틸 에테르(100ml)로 씻어낸다. 진한염산을 0℃에서 천천히 방울방울로 떨어뜨린다(pH 2-3). 혼합물을 추출하고 유기층은 남겨둔다.(500mL, MC) 용액은 황산나트륨으로 건조하고 진공에서 증발시킨다. 잔여물은 n-헥세인(n-hexane)과 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 재결정하여 정제한다(12g, 72%).
1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ12.38(s, 1H), 8.56(b, 1H), 7.89~7.86(d, J =9 Hz, 2H,), δ7.70~7.67 (d, J =9 Hz, 2H,), 7.43~7.29 (m, 4H), 4.29~4.27 (d, J =6 Hz, 2H), 4.25~4.20 (t, J =6 Hz, 1H), 3.47 (s, 2H), 2.56 (s, 3H)
[제조예2] :(N-Moc-N'-R- 히드라지노)-아세트 산의 제조
(1) (N'- 메톡시카보닐-히드라지노)-아세트산 에틸 에스테르의 제조
메틸 카바제이트(methyl carbazate)(50mg, 0.55mol)을 DMF(300ml)에 녹이고, 에틸 브로모아세테이트(ethyl bromoacetate)(68ml, 0.555mol), 포타슘 카보네이트( potassium carbonate)(77g, 0.555mol)을 반응기에 넣는다. 혼합물은 50℃에서 5시간 동안 유지한다. 반응이 완결되면 혼합물을 여과하고 EtOAc로 희석한다. 그리고 소금물로 세척한다(3번). 정제하지 않은 생성물은 칼럼(column)에 의해 정제한다(용리액(eluent) : Hex/EtOAc=4/1). Pdt : 72g(무색의 오일)
(2)[NR 7 -N' -메톡시카보닐- 히드라지노]- 아세트 산 에틸 에스테르
에틸 에스테르(10g, 0.05mol), 탄산 칼륨(6.9g, 0.05mol), 그리고 R 3 -브롬화물(14.1g, 0.06mol)을 DMF에 녹였다(200ml). 그리고 혼합물을 5시간 동안 50℃에서 따뜻하게 유지한다. 반응이 완결된 후 혼합물을 여과하고, EA로 희석시킨다. 그리고 소금물로 씻는다(3번). 정제되지 않은 생성물은 크로마토그래피로 정제한다(용리액(eluent): Hex/EtOAc=4/1).
(3)[NR 7 -N'-메톡시카보닐-히드라지노]-아세트 산
알킬화된 에틸 에스테르(9.5g, 0.03mol)은 THF/물(1/1,ml)에 녹이고 0℃에서 2N NaOH(28.3ml)용액을 넣는다. 혼합물은 상온에서 2시간 동안 교반한다. 시작 물질인 에스테르가 UV에서 탐지되지 않게 되면, 용액을 EA로 희석한 후 분리한다. 수용액 층은 1N 염산에 의해 pH3~4로 산성화시킨다. 그리고 화합물은 DCM에 의해서 추출한다.(3번). 혼합된 유기 층은 MgSO 4 로 건조하고 증발시켜서 노란색 고체를 얻는다.
[실시예1]
(1) N β -Moc-N α -벤질-히드라지노글리신의 제조
본 화합물은 문헌에 기재된 과정에 따라 제조된다(참조: Cheguillaume et.al., Synlett, 2000, 3, 331).
(2) 1-메톡시카보닐-2,8-다이벤질-6-메틸-4,7-다이옥소-헥사하이드로피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진의 제조
브로모아세탈 수지(60mg, 0.98mmol/g)와 DMSO에 벤질 아민을 녹인 용액(2.5ml, 2M)을 스크류 마개로 덮인 유리병 속에 둔다. 반응물은 12시간 동안 회전식 오븐(rotating oven)을 사용하여 60℃에서 흔든다. 수지는 여과에 의해서 모으고 DMF로 세척한 후 DCM으로 세척한다.
NMP에 Fmoc-알라닌(4당량), HATU(4당량), 그리고 DIEA(4당량)을 녹인 용액을 수지에 첨가한다. 반응물을 상온에서 4시간 동안 흔든 후 수지를 여과에 의해서 모은다. 그리고 DMF, DCM으로 세척한 후 DMF로 세척한다.
수지에 DMF속의 20% 피페리딘을 넣는다. 상온에서 8분 동안 반응물을 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모으고 DMF, DCM로 세척한 후 DMF로 세척한다.
N β -Moc-N α -벤질-히드라지노글리신(4당량), HOBT(4당량) 그리고 DIC(4당량)을 DMF에 녹인 용액을 위에서 준비한 수지에 첨가한다. 반응물을 상온에서 세 시간 동안 흔든 후 수지를 여과액에 의해서 모으고 DMF, DCM으로 세척한 후 MeOH로 세척한다. 수지는 상온에서 진공상태에서 말린다.
수지를 상온에서 18시간 동안 포름산(2.5ml)으로 처리한다. 수지를 여과액에 의해서 제거한 후, 여과액은 오일로 생성물을 얻기 위해 감압 하에서 응축시킨다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ ppm; 1.51 (d, 3H), 2.99 (m, 1H), 3.39 (d, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 4.02 (d, 1H), 4.24 (d, 1H), 4.39 (d, 1H), 4.75 (d, 1H), 5.14 (q, 1H), 5.58 (dd, 1H), 7.10-7.38 (m, 10H).
[실시예2]
(1) N'-Fmoc-N-메틸-히드라지노카보닐 클로라이드의 제조
N-메틸 히드라진 카복실산 9H-플로렌-9-일메틸 에스테르(107mg, 0.4mmol)를 15ml의 CH 2 Cl 2 에 녹인 용액과 NaHCO 3 포화 수용액의 냉각된 이상성의 혼합물을 급속하게 교반한다. 한편 톨루엔(1.03ml, 2mmol)을 단일 부분(single portion)으로 첨가한다.
반응물은 30분동안 교반하고 유기상을 모은다. 그리고 수용액상은 CH 2 Cl 2 로 추출한다. 혼합된 유기층은 MgSO 4 로 건조시키고, 여과한 후 거품의 고체로서 카바모일 클로라이드 128mg을 사용하여 감압 하에서 농축시킨다.(주의: 포스겐 증기는 매우 독성이 강하다. 후드에서 사용하라) 생성물은 정제하지 않고 다음 고체상의 합성에 사용된다.
(2)2,5-다이메틸-7-벤질-3,6-다이옥소-헥사하이드로-[1,2,4]트리아졸[4,5-a]피라진-1-카복실 산 벤질아미드의 제조
브로모아세탈 수지(30mg, 0.98mmol/g)와 DMSO(1.5ml, 2M)에 벤질 아민을 녹인 용액을 스크류 캡이 있는 유리병에 둔다. 반응물은 회전식 오븐(Robbins Scientific)을 사용하여 12시간 동안 60℃에서 흔든다. 수지는 여과에 의해서 모으고, DMF로 세척한 후 DCM으로 세척한다.
NMP에 Fmoc-알라닌(3당량), HATU(3당량), 그리고 DIEA(3당량)을 녹인 용액을 수지에 넣는다. 반응물을 상온에서 약 4시간 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모은다. 그리고 DMF, DCM로 세척한 후 DMF로 세척한다.
수지에 DMF 속의 20%피페리딘을 첨가한다. 반응물을 상온에서 8분 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모으고, DMF, DCM으로 세척한 후 DMF로 세척한다.
DCM에 단계 (1)에서 얻은 N'-Fmoc-N-메틸-히드라지노카보닐 클로라이드(5당량), DIEA(5당량)을 녹인 용액을 위에서 준비한 수지에 넣는다. 반응물을 상온에서 4시간 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모은다. 그리고 DMF, DCM로 세척하고, 그리고 나서 DMF로 세척한다.
수지에 DMF 속의 20% 피페리딘을 넣는다(수지1g당 10ml). 상온에서 반응물을 8분 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모은다. 그리고 DMF,DCM로 세척하고 그리고 나서 DMF로 세척한다.
수지를 DCM에 벤질 이소시아네이트(4당량)와 DIEA(4당량)을 넣은 혼합물로 상온에서 4시간 동안 처리한다. 그리고 나서 수지를 여과에 의해서 모으고 DMF, DCM으로 세척한다. 그리고 나서 MeOH로 세척한다. 수지를 진공 속에서 상온으로 건조한다.
수지는 상온에서 14시간 동안 포름산으로 처리한다. 수지를 여과에 의해서 제거한 후, 여과액은 오일 상태로 생성물을 얻기 위해 감압 하에서 응축한다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δppm ; 1.48 (d, 3H), 2.98 (s, 3H), 3.18 (m,1H), 3.46 (m, 1H), 4.37-4.74 (m, 5H), 5.66 (dd, 1H), 6.18 (m, 1H), 7.10-7.40 (m, 10H).
[실시예3]
2,5,7-트리메틸-3,6-다이옥소-헥사하이드로-[1,2,4]트리아조로[4,5-a]피라진-1-카복실산 벤질아미드의 제조
본 화합물은 실시예2와 같은 과정에 따라 제조된다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δppm ; 1.48 (d, 3H), 2.99 (s, 3H), 3.03 (s, 3H), 3.38 (m, 1H), 3.53 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.52 (q, 1H), 4.59 (dd, 1H), 5.72 (dd, 1H), 6.19 (br.t, 1H), 7.10-7.38 (m, 5H).
[실시예4]
2-메틸-5-(p-하이드록시페닐메틸)-7-나프틸메틸-3,6-다이옥소-헥사하이드로-[1,2,4]트리아조로[4,5-a]피라진-1-카복실산 벤질 아미드의 제조
브로모아세탈 수지(30mg, 0.98mmol/g)과 DMSO에 나프틸메틸 아민을 녹인 용액(1.5ml.2M)을 스크류 캡이 있는 유리병에 넣는다. 반응물은 회전식 오븐(Robbins Scientific)을 사용하여 60℃에서 12시간 동안 흔든다. 수지는 여과에 의해서 모으고, DMF로 세척하고 그리고 나서 DCM으로 세척한다.
NMP에 Fmoc-Tyr(OBut)-OH(3당량), HATU(3당량), 그리고 DIEA(3당량)을 녹인용액을 수지에 넣는다. 반응물을 상온에서 4시간 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모은다. DMF, DCM으로 세척하고 그리고 나서 DMF로 세척한다.
수지에 DMF 속의 20% 피페리딘을 넣는다. 반응물을 상온에서 8분 동안 흔든 후 수지를 여과에 의해서 모은다. DMF, DCM으로 세척하고 그리고 나서 DMF로 세척한다.
DCM에 N'-Fmoc-N-메틸-히드라지노카보닐 클로라이드(5당량), DIEA(5당량)을 녹인 용액을 위에서 준비한 수지에 넣는다. 반응물을 상온에서 4시간 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모은다. DMF, DCM으로 세척하고 그리고 나서 DMF로 세척한다.
수지에 DMF 속의 20% 피페리딘을 넣는다(수지 1g당 10ml). 상온에서 8분동안 흔든 후 수지를 여과에 의해서 모은다. DMF, DCM으로 세척하고 그리고 나서 DMF로 세척한다.
수지를 DCM에 벤질이소시아네이트(4당량)와 DIEA(4당량)을 넣은 혼합물로 상온에서 4시간 동안 처리한다. 그리고 나서, 수지를 여과에 의해서 모으고 DMF, DCM으로 세척한 후 MeOH로 세척한다. 수지를 진공 속에서 상온으로 건조한다.
수지를 상온에서 14시간 동안 포름산으로 처리한다. 수지를 여과에 의해서 제거한 후, 여과액을 오일 상태의 생성물로 얻기 위해 감압 하에서 응축시킨다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δppm ; 2.80-2.98 (m, 5H), 3.21-3.37 (m, 2H), 4.22-4.52 (m, 2H), 4.59 (t, 1H), 4.71 (d, 1H), 5.02 (dd, 1H), 5.35 (d, 1H),5.51 (d, 1H), 6.66 (t, 2H), 6.94 (dd, 2H), 7.21-8.21 (m, 12H).
[실시예5]
2-메틸-6-(p-하이드록시페닐메틸)-8-나프틸-4,7-다이옥소-헥사하이드로피라지노[2,1-c][1,2,4]트리아진-1-카복실산 벤질아미드의 제조
브로모아세탈 수지(60mg, 0.98mmol/g)와 DMSO(2.5ml, 2M)에 나프틸 아민을 녹인 용액을 스크류 캡이 있는 유리병에 둔다. 반응물은 12시간 동안 회전식 오븐(Robbins Scientific)을 사용하여 60℃에서 흔든다. 수지는 여과에 의해서 모으고 DMF로 세척한 후 DCM으로 세척한다.
NMP에 Fmoc-Tyr(OBut)-OH(4당량), HATU(PerSeptive Biosystems)(4당량)을 녹인 용액을 수지에 넣는다. 반응물을 상온에서 4시간 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모으고 DMF, DCM으로 세척한 후 DMF로 세척한다.
수지에 DMF 속의 20% 피페리딘을 넣는다. 반응물을 상온에서 8분 동안 흔든 후 , 수지를 여과에 의해서 모은다. 그리고 DMF, DCM으로 세척한 후 DMF로 세척한다.
DMF에 N β -Fmoc-N α -벤질-히드라지노글리신(4당량), HOBT(Advanced ChemTech) (4당량) 그리고 DIC(4당량)을 녹인 용액을 위에서 준비한 수지에 넣는다. 반응물을 상온에서 3시간 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모은다. DMF로 세척한 후 DCM으로 세척한다. 수지에 DMF속의 20% 피페리딘을 넣는다(수지 1g당 10ml). 반응물을상온에서 8분 동안 흔든 후, 수지를 여과에 의해서 모은다. DMF, DCM으로 세척한 후 DMF로 세척한다.
수지를 DCM에 벤질 이소시아네이트(4당량), DIEA(4당량)을 넣은 혼합물로 상온에서 4시간 동안 처리한다. 그리고 나서 수지를 여과에 의해서 모으고, DMF, DCM으로 세척한 후 MeOH로 세척한다. 수지를 진공 속에서 상온으로 건조시킨 후, 수지를 상온에서 18시간 동안 포름산(2.5ml)으로 처리한다. 수지를 여과에 의해 제거하고, 여과액을 오일 상태의 생성물로 얻기 위해 감압 하에서 응축한다.
1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δppm ; 2.73 (s, 3H), 3.13 (d, 1H), 3.21-3.38 (m, 3H), 3.55 (d, 1H), 3.75 (t, 1H), 4.22 (dd, 1H), 4.36 (dd, 1H), 4.79 (d, 1H), 5.22 (t, 1H), 5.47 (m, 2H), 6.68 (d, 2H), 6.99 (d, 2H), 7.21-8.21 (m, 12H); MS (m/z, ESI) 564.1 (MH + ) 586.3 (MNa + ).
[실시예6]
SW480 세포에 대항하는 IC 50 의 측정을 위한 생물학적 분석(bioassay)과 세포선의 세포독성 시험은 다음과 같은 방법에 따른다. 시험 화합물은 예4에 의해서 준비된다.
정보제공 유전자의 조사
SW480 세포는 감염 시약인 슈퍼펙트(Superfect)를 사용해서 감염시켰다(참조 : Quagen, 301307). 세포는 감염 전에 하루 동안 트립신화 시킨다. 그리고 50~80%정도 융합되기 위해서 6 웰 플레이드에 둔다(5×10 cells/well).
DNA 4 마이크로 그램(TOPFlash)과 1마이크로 그램(pRL-null)을 150㎕의 무혈청 배양기로 희석한다. 그리고 30㎕의 슈퍼펙트(Superfect) 감염 시약을 첨가한다. DNA-슈퍼펙트(Superfect) 혼합물은 15분 동안 상온에서 배양한다. 그리고 나서 10%의 FBS DMEM 1㎖를 이 복합체에 넣고 추가적으로 3시간 동안 배양한다. 복합체가 형성되면 세포는 항생제 없이 PBS로 두 번 세척한다.
DNA-슈퍼펙트 감염 시약(Superfect tansfect reagent) 복합체는 3시간 동안 5% CO 2 에서 37℃에서 배양되기 전의 세포에 적합하다. 배양 후 10% FBS로 회복된 배지를 첨가하면 최종 부피가 1.18ml가 된다. 3시간 동안 배양한 후, 세포는 96 웰 플레이트(3×10000cells/well)에서 수확되고 자생된다. 5% CO2, 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 세포를 24시간 동안 시험 화합물로 처리한다. 마지막으로, 활성도를 발광 효소 조사에 의해서 확인한다.
도 1은 SW480 세포를 위한 위에서 제시된 화합물의 IC 50 측정의 결과를 나타낸 것이다.
SRB(Sulforhodamine B) 법
아래에 제시된 세포에서 위의 화합물의 생장억제 효과는 SRB(sulforhodamine B) 법에 의해서 측정될 수 있다. 100㎕ 배지에 있는 SW480 세포를 96-웰 플레이트에 각각 두고 24시간 동안 부착해 둔다. 화합물을 원하는 마지막 농도를 생산하기 위해서 웰에 첨가하고, 플레이트는 48시간 동안 37℃에서 배양한다. 100㎕의 차가운(4℃) 10% 트리클로로로아세트산을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 고정시킨다. 그리고 1시간 동안 4℃에서 배양하여 세포를 고정시킨다. 플레이트는 탈염수로 5번 씻고, 공기 중에서 말린다. 세포는 15분 동안 웰에 100㎕ SRB 용액(1% 아세트 산(v/v)에 0.4% SRB(w/v)를 넣은)을 첨가하여 염색시킨다 . 염색되지 않고 남은 염료를 제거하기 위하여 염색 후, 플레이트를 1% 아세트산으로 재빠르게 5번 씻고, 공기 중에서 건조한다. 결합된 염료는 플레이트를 읽기 전에 10mmol/L의 트리스 베이스(pH 10.5)로 용해시킨다. 흡광도(OD)는 분자 장치로 515nm의 파장에서 플레이트 리더를 읽는다. 생장의 저해는 상대적인 생활력(%의 조절)으로 표현되고 GI 50 은 로그/프로빗 변환 후에 농도-반응 곡선으로부터 계산할 수 있다.
<표6> [실시예4]에서 얻어진 화합물의 생체 조건 밖에서의 세포독성 조사
본 발명의 특정한 형태가 예시를 목적으로 본 원에서 기술되기는 하였지만, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 각종 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서 본 발명은 첨부된 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
생물학적으로 활성 펩티드와 단백질의 리버스-턴 범위의 2차 구조를 모방한 발명의 화합물은 서바이빈 발현, TCF/β-카테닌 전사, 그리고 Wnt 신호의 발현을 억제할 수 있다. 따라서 , 본 발명은 포유류에서 종양 세포의 생장을 억제하는 방법, 다른 항종양 제제의 조합물로 암을 치료하는 방법, 혈관 확장술(angioplasty)과 관련된 재협착, 다낭신 질병(polycystic kidney disease), 혈관생성 변형 질병( aberrant angiogenesis disease), 류머티스성 관절염 질병(rheumatoid arthritis disease) 그리고 궤양성의 대장염(ulcerative colitis)과 같은 질병을 치료하고 예방하는 방법 뿐만 아니라 생물학적으로 활성이 있는 화합물, 그리고 화합물의 라이브러리를 동정하는 방법을 제공할 수 있다.