천연물 유래 화합물 라이브러리의 제조방법

천연물 유래 화합물 라이브러리의 제조방법{A Chemical Library Preparation Method from Natural Product}

본 발명은 화합물 라이브러리의 제조방법, 그 라이브러리 및 그의 이용 방법에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 생약을 포함하는 천연물의 추출물로부터 유래된 일반 라이브러리 및 최적화용 라이브러리를 제조하는 방법과, 이와 같이 제조된 라이브러리 및 이를 이용하여 항암제 등의 신약 및 기능성 생물 소재를 개발하는 방법에 대한 것이다.

일반적으로 조합화학 또는 신약개발 분야에서 널리 이용되는 펩타이드 라이브러리와 같은 종래의 라이브러리는 대부분 화학적인 구조를 이미 알고 있는 아미노산 등으로 구성되어 있다. 종래의 라이브러리들은 서로 다른 다양한 구조의 화합물들을 반복적으로 결합시켜 다양한 조합의 화합물들을 제조하는 방식으로 제조되어 왔다.

그러나, 종래의 라이브러리를 구성하는 화합물 요소들은 화학적 합성으로부터 유래한 것으로서 그 다양성에 있어서 한계가 있다.

뿐만 아니라, 종래의 라이브러리는 신약개발 분야 등에 종사하는 많은 연구자에 의해 이미 연구가 되어 왔다.

그런데, 생약을 포함하는 천연물에 존재하는 화합물은 그 수가 많을 뿐 아니라 현재까지 알려진 유기합성 기술로는 만들어 내기 어려운 화합물, 예컨대 광학 이성질체 등을 포함하는 경우가 많다. 천연물 내의 화합물은 유기합성에 의하여 합성되는 화합물에 비하여 물성과 화학적 구조가 다양하다.

그리하여 천연물로부터 유용한 물질을 탐색하고 발견해 내는 연구가 수많은 연구자들에 의하여 진행되어 왔다. 그러나, 지금까지의 천연물 연구는 일반적인 분리와 정제 즉, 용해도, 흡착성, 크기 등에 따른 분리 정제를 통하여 유용한 화합물을 얻어내려는 시도가 대부분이었다.

지금까지의 생리활성 물질 탐색에 있어서 일반적인 방법으로서는 일단, 물리적, 화학적 성질을 이용하여 지용성, 수용성 화합물을 분리해 내고, 흡착 크로마토그래피(Adsorption Chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatography), 이온교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography)등의 과정을 거쳐 얻어진 조추출물(crude extract)에 대하여 약리효과를 측정한다. 그 후 일정한 효과를 나타내는 조추출물 분획에 대하여 다시 상기 여러 가지 크로마토그래피 등의 추출과 분리, 정제 과정을 수행하여 우수한 약리효과를 나타내는 화합물을 분리, 정제하게 된다.

그러나, 정제되지 않은 조추출물에서는 약리효과 측정에 있어서 일반적으로 단일 화합물이 나타내는 약리효과보다 뛰어난 가중효과(Additive effect)로 인하여 활성 측정에서 오류가 나타나게 된다.

뿐만 아니라, 상기 종래의 생리활성 물질 탐색 방법에 있어서는 불특정 다수의 화합물에 대하여 여러 번의 추출, 분리, 정제 과정을 수행함으로써 추출물 중 비교적 소량으로 존재하며 뛰어난 기능을 발휘하는 생리활성물질을 효과적으로 찾아낼 수 없다는 단점이 있었다.

따라서, 본 발명은 유기합성에만 의존해 왔던 종래의 라이브러리 제조방법을 벗어나 천연물 유래 화합물들을 이용하여 저렴하고 손쉽게 라이브러리를 제조하는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명은 생약 등의 천연물로부터 유용한 신약성분이나 생물소재를 탐색함에 있어서 무작위적인 분리 정제방법이 아니라 천연물 추출물에 포함된 화합물의 화학적 결합특이성을 이용함으로써 신속하게 유용한 성분을 발견하는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 종래 방법에 의하여 제조된 라이브러리의 수적, 구조적 제한을 극복하고 천연물에 존재하는 다양한 화합물을 이용하여 종래 유기합성방법으로는 생산하기 어려운 무궁무진한 수의 라이브러리를 제조하는 방법을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명은 구조와 기능을 알고 있는 화합물을 앵커화합물로 하여 천연물 유래 최적화용 라이브러리를 제조하는 방법을 제공하려는 것이다.

나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 천연물 추출 화합물 유래 일반 라이브러리 및 최적화용 라이브러리를 이용함으로써 빠르고 손쉽게 신약 및 기능성 생물소재 등을 발굴(Discovery)하는 방법을 제공하려는 것이다.

제 1도는 알코올기를 포함하는 화합물과 고체상 수지와의 화학적 반응예를 도시한 것.

제 2도의 a와 b는 아민기를 포함하는 화합물과 고체상 수지와의 화학적 반응예를 도시한 것.

제 3도는 알데히드기를 가진 화합물과 아민기를 가진 수지와의 이민화 반응예를 도시한 것.

제 4도는 카르복실산을 가진 화합물과 아민기 및 알코올기를 가진 수지 간의 축합반응예를 도시한 것.

제 5도는 본 발명의 천연물 유래 화합물 라이브러리 제조방법 개념도.

제 6a,b,c도는 알코올, 페놀, 아민, 카르복실산 등 할로겐과 반응할 수 있는 작용기를 가진 화합물과 고체상 수지와의 화학적 반응예를 도시한 것.

제7a,b도는 오가피 유래 화합물 라이브러리의 HPLC 분석결과.

본 발명은 유기합성 방법에만 의존해 오던 종래의 조합화학적 라이브러리의 제조 및 신약 개발, 생물소재 개발 방법과 분리 정제에만 의존해 오던 종래의 천연물 연구분야를 결합시킴으로써 지금까지와는 전혀 다른 개념의 천연물 유래 화합물 라이브러리와 그 이용방법을 제공하려는 것이다.

위에서 살펴본 바와 같이 종래 천연물로부터 생리활성물질을 탐색하는 방법에 있어서는 목적 생리활성물질을 물리 화학적인 성질에 따라 분리, 정제하고 이를 구조 분석하여 새로운 생리활성 물질을 찾아내는 방법이 주로 이용되었다. 그러나, 본 발명에 있어서는 천연물 유래 화합물을 손쉽고 빠르게 분리해 내는 방법으로서 고체상 수지 및 유리 등 고상법 합성(solid phase synthesis)의 지지체로 이용 가능한 물질(이하 상세한 설명 및 청구범위에서는 "고체상 수지"로 명명함)을 이용하여 화합물의 화학적 반응성에 따라 천연물의 추출물을 분리하는 방법을 채택하였다. 그리하여 천연물 중의 수많은 화합물 중 특정 작용기를 가진 화합물을 고체상 수지를 이용함으로써 선택적으로 빠른 시간 내에 선별하여 다양한 종류의 탐색용 천연물 유래 화합물 라이브러리(상세한 설명 및 청구범위 중의 "일반 라이브러리"와 동일한 개념으로 사용됨)를 제조하고 이를 신약 및 기능성 생물소재 개발에 이용할 수 있는 것이다.

또한 특정 표적물(target)에 대하여 특이적으로 작용하는 화합물의 구조를 이미 알고 있는 경우에 있어서는 이러한 기지의 화합물(이하에서 "앵커 화합물"로 명명함)을 고체상 수지에 결합시킨 후 천연물의 추출물과 반응시킴으로써 앵커 화합물에 천연물 유래 화합물이 부착된 화합물 라이브러리를 제조할 수 있다. 또는고체상 수지에 앵커 화합물을 결합시킨 후 상기 방법으로 얻어진 일반 라이브러리와 반응시키는 방법으로도 천연물 유래 최적화용 라이브러리를 제조할 수 있다.

본 발명은 천연물의 추출물을 고체상 수지에 부착시키는 단계; 부착되지 않은 화합물 및 반응물을 세척하는 단계;로 구성되는 고상법 합성을 이용한 천연물 유래 화합물 라이브러리의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 있어서, 상기 세척단계 이후 고체상 수지와 화합물의 결합을 절단하는 단계가 부가된 것을 특징으로 하는 고상법 합성을 이용한 천연물 유래 화합물 라이브러리의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 있어서, 천연물의 추출물을 고체상 수지에 부착시키기 전에 특정 작용기를 배제시키기 위하여 블로킹하는 단계가 부가된 것을 특징으로 하는 고상법 합성을 이용한 천연물 유래 화합물 라이브러리의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 기지의 앵커 화합물을 고체상 수지에 부착시키는 단계; 천연물의 추출물에서 특정 작용기를 배제시키기 위하여 블로킹하는 단계; 특정 작용기가 블로킹된 천연물 추출물을 앵커 화합물이 부착된 고체상 수지에 반응시키는 단계; 세척단계;로 구성되는 고상법 합성을 이용한 천연물 유래 화합물 라이브러리의 제조방법 및 세척단계 이후 천연물 유래 화합물이 결합된 앵커 화합물을 고체상 수지로부터 절단하는 단계가 부가된 것을 특징으로 하는 고상법 합성을 이용한 천연물 유래 화합물 라이브러리의 제조방법을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방법들에 의하여 제조된 천연물 유래 화합물라이브러리를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 방법들에 의하여 제조된 천연물 유래 화합물 라이브러리를 이용하여 효소억제제 및 수용체를 포함하는 생리활성 물질을 탐색 또는 최적화하는 방법을 제공한다.

아래에서는 생약 및 천연물 추출 화합물을 이용한 일반 라이브러리의 제조방법을 구체적으로 설명한다.

첫째, 천연물을 물 또는 유기용매를 사용하여 추출하고 필요에 따라서 전처리 또는 특정 작용기를 블로킹시키는 단계이다. 블로킹 반응은 필수적인 단계는 아니고 필요에 따라 부가할 수 있으며, 천연물의 추출물에서 특정 작용기를 배제시키기 위하여 수행한다. 예컨대 천연물 추출물에 포함된 화합물의 알코올기, 페놀기, 카보닐기, 카르복실기, 아민기와 같은 다양한 작용기에 대하여 각각 특이적으로 작용할 수 있는 블로킹제를 사용함으로써 특정 작용기를 블로킹시킨다.

알코올기를 가진 화합물들 또는 하나의 화합물의 여러 작용기 중 알코올기를 블로킹하는 대표적인 화학 반응 및 블로킹기들은 표 2와 같으며, 페놀류의 화합물 또는 화합물 중의 페놀기를 블로킹하는 화학 반응 및 블로킹기들은 표 3 과 같다. 염기 및 친핵체에 의한 화학반응이 일어날 수 있는 카보닐기를 블로킹하는 화학 반응 및 블로킹기들은 표 4와 같으며, 카르복실기를 블로킹하는 화학 반응 및 블로킹기들은 표 5와 같다. 또한 산기 및 친전자체에 의한 화학반응이 일어날 수 있는 아민기를 블로킹하는 화학 반응 및 블로킹기들은 표 6과 같다. 표 2 내지 표 6에 제시된 화학 반응 및 블로킹기들은 예시적인 것이며, 본 발명의 범위가 상기 표에 제시된 반응 또는 블로킹기에만 한정되는 것은 아님을 밝혀둔다.

둘째, 상기 천연물의 추출물을 고체상 수지에 부착시키는 단계이다.

셋째, 고체상 수지와 부착되지 않은 천연물 추출물 및 반응에 참여하고 남은 과량의 반응물 또는 용질을 제거하기 위하여 세척하는 단계이다. 메탄올 및 디클로로메탄(dichloromethane) 등과 같은 용매로 수차례 세척하여 감압 또는 상온하에서 수지를 건조시킨다.

넷째, 고체상 수지와 이에 부착된 화합물 사이의 결합을 절단(cleavage)한다. 이리하여 동일한 화학적 결합성질을 갖는 천연물 유래 일반 라이브러리를 제조할 수 있다. 또는 필요에 따라서 상기 절단 단계를 거치지 않고 고체상 수지와 결합된 상태의 라이브러리를 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 아래에서는 생약 및 천연물 추출을 이용한 최적화용 라이브러리의 제조방법을 구체적으로 설명한다. 천연물 추출물에서 최적화용 라이브러리의 제조 방법은 먼저 고체상 수지에 이미 구조를 알고 있는 화합물을 부착시키는 단계를 수행한 후 상기의 천연물 유래 일반 라이브러리 제조 과정을 수행함으로써 최적화용 라이브러리를 제조할 수 있다.

첫번째, 특정 표적물에 특이적으로 반응하는 기지의 화합물 즉, 앵커 화합물을 고체상 수지에 결합시키고 세척한다.

두번째, 천연물 추출물의 특정 반응기를 블로킹시킨다.

세번째, 상기 특정 작용기가 블로킹된 천연물의 추출 화합물을 고체상 수지에 부착된 앵커 화합물과 반응시키는 단계이다.

네번째, 앵커 화합물과 반응하지 않은 천연물 추출물 및 반응에 참여하고 남은 과량의 반응물 또는 용질을 제거하기 위하여 세척하는 단계이다. 세척 후 감압 또는 상온 하에서 수지를 건조시킨다.

다섯번째, 고체상 수지와 이에 부착된 앵커 화합물 사이의 결합을 절단한다. 이리하여 특정 표적물에 특이적으로 반응하는 기지의 앵커 화합물이 결합된 천연물 유래 최적화된 라이브러리를 제조할 수 있다. 또는 필요에 따라서 상기 절단 단계를 거치지 않고 고체상 수지와 결합된 상태의 최적화된 라이브러리를 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 방법에 의하여 제조된 천연물 유래 화합물 라이브러리 즉, 일반 라이브러리와 최적화된 라이브러리는 종래 알려진 조합화학적 방법에 의하여 효소억제제 및 수용체를 포함하는 생리활성 물질을 탐색 또는 최적화하는 데 이용될 수 있다.

아래에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 좀더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 아래의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아님을 분명히 밝혀 둔다.

실시예 1

일명 유백피라 불리는 유근피 500g에서 아민과 결합이 가능한 카르복실기를 가진 천연 화합물을 얻기 위하여 유근피 조각을 가루형태로 만든 다음 500g의 유근피 가루를 80% 메탄올 용액 2ℓ에 하루 방치하였다. 추출 여액을 초고속 원심 분리기(880rpm으로 20분 동안)를 이용하여 추출 여액을 침전물과 분리하고 얻어진 상층액을 진공, 감압 하에서 농축, 건조시켰다.

분말상태로 건조된 추출물 중에서 아민기를 블로킹하기 위해 건조 추출물 5g을 N,N-디메틸포름아마이드(N,N-dimethylformamide) 10ml에 완전히 용해한 후 아세틸안하이드라드(acethyl anhydride) 1ml을 가하여 3시간 정도 반응시켰다. 반응 후 반응 혼합물을 증류수 50ml로 희석시키고, 에틸 아세테이드(ethyl acetate) 100ml로 추출하였다. 유기층을 10% 염산 수용액 100ml, 포화 탄산수소나트륨 수용액 100ml, 포화 염화나트륨 수용액의 순서로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하여 아민기가 블로킹된 건조 추출 혼합물(I) 5.1g을 얻었다.

상기 추출 혼합물(I) 5.1g을 아세톤 30ml에 용해 시키고 추출 혼합물(I) 내의 알코올기를 블로킹하기 위해 파라 톨루엔술폰산(p-toluenesulfonic acid) 0.5g, 3mmol을 넣어 상온에서 2시간동안 교반하였다. 혼합물을 증류수 50ml로 희석시키고, 에틸 아세테이드(ethyl acetate) 100ml로 추출하였다. 유기층을 10% 염산 수용액 100ml, 포화 탄산수소나트륨 수용액 100ml, 포화 염화나트륨 수용액의 순서로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후, 감압 하에서 용매를 제거하여 알코올기와 아민기가 블로킹된 고체 혼합물(II) 5.2g을 얻었다.

상기 고체 혼합물(II)에 포함된 산기와 수지 상의 아민기를 연결하기 위하여 고체 혼합물(II) 5.2g을 N-메틸피롤리돈(N-methyl pyrrolidone) 10ml에 녹이고 시스테인이 치환된 왕 레진(Wang resin) 500mg (0.4mmol/g)을 넣고 디사이클로헥실카보이미드(dicyclohexylcarboimide) 2mmol과 N-히드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole) 2mmol을 첨가하여 상온에서 12시간동안 반응시켰다.

반응 후 수지 일부를 취하여 아민 정색 반응(Kaiser test; E. Kaiser, et al. Anal. Biochem., 1970,34, 595)을 통하여 수지 상의 아민이 모두 없어진 것을 확인하였다. 미반응 고체 혼합물(II)을 필터에 넣고 디사이클로헥실카로디미드(dicyclohexyl urea) 와 N-히드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole) 등을 수지와 분리 여과시켰다. 수지를 98% 메탄올 50ml, 디클로로메탄(dichloromathane) 50ml로 3차례 세척하고 상온에서 완전히 건조하여 수지 549mg을 얻었다.

반응 후 얻은 수지 549mg을 삼플로로아세트산(trifluoro acetic acid) 5ml 과 삼이소프로필실란(triisopropyl silane) 0.01ml에 넣고 30분간 수지에서 화합물을 분리하고 감압 하에서 건조시켜 시스테인-카르복실기를 가진 천연물 결합 구조의 최적화된 라이브러리를 얻었다.

실시예 2

실시예 1 에서 준비한 유근피 추출물인 고체 혼합물(I)에서 알코올기를 가진 라이브러리를 얻기 위하여 고체 혼합물(I) 5g을 건조된 테트라히드로퓨란(tetrahydrofurane) 30ml에 녹이고 왕 레진 1g(0.88mmole/g)을 가하여 미쯔노브(Mitsunobu) 반응조건(Porco, JA,; Deegan, T.; Devonport et alMolecular Diversity .,1996, 2, 197-206) 하에서 4시간동안 교반했다.

반응 후 수지를 98% 메탄올 100ml, 디클로로메탄 100ml로 세척하고 상온에서 완전히 건조시켜 알코올기를 포함하는 화합물이 부착된 수지 1.02g을 얻었다.

건조된 수지를 95% 삼플로로아세트산으로 1시간동안 반응시켜 수지와 알코올기를 포함하는 화합물 일반 라이브러리를 분리하고 감압 하에서 용매를 완전히 제거, 건조하여 알코올기를 포함하는 일반 라이브러리를 얻었다.

실시예 3

500g의 유근피 가루를 80% 메탄올 용액 2ℓ에 하루 방치하였다. 초고속 원심분리기(880rpm으로 20분 동안)를 이용하여 추출 여액을 침전물과 분리하고 얻어진 상층액을 진공, 감압 하에서 농축, 건조시켰다.

아민기를 포함한 라이브러리를 얻기 위하여 유근피 추출물 5g을 건조된 디클로로메탄 30ml에 녹이고 2-염화트리틸수지(2-chloro trityl resin) 1g(0.85mmol/g)을 용해된 용액에 넣고 N,N-디이소프로필아민(N,N-diisopropyl amine) 0.5ml 을 천천히 첨가하였다.

상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 여과장치에서 수지를 여과하고 디클로로메탄 50ml로 수차례 세척했다.

아민기를 포함하는 화합물이 부착된 건조상태의 수지 1.04g을 2% 삼플로로아세트산(trifluoro acetic acid) 디클로로메탄 용액에 넣고 수지와 화합물을 분리시켰다. 분리된 아민기를 포함하는 라이브러리를 감압하에서 건조하여 아민기를 포함하는 일반 라이브러리를 얻었다.

실시예 4

가루 형태의 오가피 500g을 메탄올 2ℓ에 넣고 하루동안 방치하였다. 이 용액을 필터하여 추출액과 침전물을 분리하고 용액을 감압하에서 농축하여 28.9g의 오가피 추출물을 얻었다.

친수성이 큰 물질과 소수성 성질이 매우 큰 물질을 제거하기 위해 오가피 추출물을 1ℓ의 물에 현탁시키고 노말 헥산(nomal hexane) 400ml를 넣고 추출하였다. 헥산 층을 분리하여 소수성 물질을 제거한 후 물층을 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 600ml로 추출하여 친수성 물질을 제거했다. 유기층에 무수 황산 마그네슘(anhydrous magnesium sulfate)을 넣고 필터했다. 용액을 감압 건조하여 에칠 아세테이트 추출물 4.8g을 얻었다.

오가피 추출물 1g을 염화 메틸렌 5ml에 완전히 용해시킨 후 2-클로로 트리틸클로라이드 수지(2-chlorotrityl chloride resin) 24mg(0.85mmol/g)을 넣고 트리에틸아민(triethylamine) 0.5ml을 첨가하였다. 상온에서 2시간 동안 반응한 후 여과장치에서 수지를 여과하고 염화 메틸렌, 물, 메탄올, 헥산 용액의 순서로 씻어주고 다시 염화 메틸렌 용액으로 씻어준 후 건조시켰다.

반응 후 얻은 수지를 염화 메틸렌으로 묽힌 5% 삼플로로아세트산 (trifluoroacetic acid) 0.7ml에 넣고 40분간 반응시켜 수지에서 화합물을 분리하고 필터를 통해 수지를 제거한 후 이 용액을 물과 염화 메틸렌 용액으로 추출하였다. 유기층에 무수 황산 마그네슘을 넣어 건조시키고 필터한 후 감압 농축하여 5.6mg의 화합물 라이브러리를 얻었다.

이렇게 얻은 오가피 유래 화합물 라이브러리를 HPLC로 분석한 결과를 도7에 나타내었다. HPLC 조건은 다음과 같다.

완충용액 A: 0.1% TFA, in water; 완충용액 B: 0.1% TFA in Acetonitrile

농도구배(Gredient): 0%B 5min, 0%-100%B 20 min

흐름속도(Flow rate): 1ml/min; monitor at 214nm

컬럼: Waters reverse-phase C18 column (3.9x150mm)

도7a는 고체상 수지와 반응시키기 전의 오가피의 에칠 아세테이트 추출물이며, 도7b는 오가피 유래 화합물 라이브러리이다. HPLC 분석결과 이 라이브러리의 주성분은 4종의 화합물임을 알 수 있었다(도7b, 피크(peak) 1, 2, 3, 4). 각 화합물의 질량을 알아보기 위하여 LC-MASS를 이용하여 분석한 결과, 피크 1, 2, 3, 4의 분자량은 각각 532, 441, 495, 988로 나타났다.

실시예 5

실시예 1에 의해서 제조된 최적화된 라이브러리를 이용하여 C형 간염바이러스(Hepatitis C Virus) 프로테아제 효소에 대하여 활성을 측정하기 위하여 pH8.3의 20mM 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate) 수용액에 1mg/ml의 농도로 녹인 다음 다이메칠 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 1mg/ml로 녹인 플루오르세인 이소치오시아네이트(fluorescein isothiocyanate) 50ul를 천천히 1ml의 효소용액에 넣었다.섭씨 4도에서 8시간 반응시킨 후 흡착버퍼수용액(50mM Tris, pH 7.6, 2% CHAPS, 10mM DTT, 30% Glycerol)에 투석하였다.

라이브러리를 부착한 수지를 96-웰 플레이트에 웰당 10mg씩 넣고 흡착버퍼 수용액으로 200ul로 세번 세척한 후 흡착버퍼 수용액에 10ug/ml로 희석한 형광체로 표식된 C형 간염바이러스(Hepatitis C Virus) 프로테아제 효소를 100ul 가하고 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 흡착버퍼수용액으로 200ul씩 세번 고정체를 세척한 후 세척버퍼 수용액(50mM Tris, pH 7.6, 0.15M NaCl, 2% CHAPS, 10mM DTT, 30% Glycerol)으로 200ul씩 세번 세척하였다. 96-웰 플레이트를 스톰(STORM)으로 측정한 결과 형광값으로 효소와 화합물 간의 결합도를 측정하였다.

본 발명의 방법에 의한 라이브러리 구축("라이브러리 제조"와 동일한 의미로 사용됨)에 있어서 종래의 라이브러리 구축과 비교하여 몇 가지 장점을 파악해 보면 다음과 같다.

첫째, 다양한 라이브러리를 구축할 때 종래의 기술에서는 여러 가지 구성 조합을 통하여 서로 다른 다양한 구조의 구성 화합물을 조직적, 반복적으로 결합시켜 다양한 분자들을 제조함으로써 수많은 구성 화합물의 구입이 필수 불가결한 경비로 소모되어질 뿐 아니라, 기존의 알려진 구성 화합물을 이용할 경우 중복적으로 이미 타 연구자에 의해서 합성되었을 가능성이 많아 중복 연구에 의한 크나큰 낭비를 초래할 가능성이 높아진다.

반면 천연물 유래 화합물을 이용할 경우 하나의 천연물에 포함되어 있는 수많은 화합물이 고체상의 특정기와 공유결합하는 방법으로 라이브러리에 필요한 구성 화합물이 될 수 있으므로 구성 화합물 구입에 따른 비용을 절감할 수 있다. 표 1은 혼합물에서 화학적 특성에 따라 화합물들을 포획할 수 있는 대표적인 고체상 수지를 화학적 성질별로 분류한 것이다.

둘째, 본 발명의 방법에 의한 라이브러리의 제조방법에 의하면 하나의 천연물로부터 화학 선택성 반응을 통하여 일반적으로 유기 화합물이 반응에 참여할 수 있는 특성기들인 아민기, 이민기, 카보닐기, 알데히드기, 올레핀기, 알코올기 등으로 분류되는 수많은 라이브러리를 경제적으로 얻을 수 있다.

셋째, 종래의 라이브러리 제조방법에 있어서 기존의 상용화되어 있는 화합물 구성요소를 구입하여 사용할 경우 이미 수많은 조합화학자들에 의해 구축된 라이브러리 형태를 벗어난 라이브러리을 제조하기가 쉽지 않은 반면, 본 발명의 방법에 의한 라이브러리의 제조는 현재의 기술로는 인위적으로 합성하기가 곤란한 여러 화합물을 포함할 수 있다.