生物素化合物与支持物可逆结合的方法

申请号 CN200780047089.5 申请日 2007-11-15 公开(公告)号 CN101622340A 公开(公告)日 2010-01-06
申请人 茵维特罗根戴纳股份公司; 发明人 O·布雷克; L·诺德伯格; A·纽劳特; P·索格;
摘要 公开在 生物 素化合物和生物素结合化合物之间的结合的反转的方法。从链霉抗生物素(或抗生物素蛋白)包被的支持物可逆释放生物素化部分的方法作为实例示出。通过使用修饰的链霉抗生物素或抗生物素蛋白和修饰的生物素如 脱硫 生物素或其衍生物如DSB-X生物素的组合,使链霉抗生物素或抗生物素蛋白-生物素之间的强相互作用变弱很多。 蛋白质 ,例如 抗体 ,可以用修饰的生物素生物素化。当通过将修饰的生物素结合到修饰的链霉抗生物素或抗生物素蛋白——其结合到固体表面——从而分离该蛋白时,可通过加入游离生物素,将其在非常温和和快速的条件下释放。与通过 现有技术 释放方法获得的蛋白质——使用以前可用的释放方法获得的蛋白质——相反,使用本文公开的方法获得的蛋白质将保持它们的天然构象。也描述在多种过程中应用本方法,所述过程包括细胞分离方法和检测、识别、测定、纯化、分离和/或分开靶蛋白质或核酸分子的技术。
权利要求

1.将修饰的生物素化合物可逆地固定到支持物的方法,所述方法 包括:
提供第一化合物,其包含修饰的生物素化合物;
提供固体支持物,其包含修饰的生物素结合化合物;和
将所述第一化合物和所述固体支持物接触以形成固定的物质;
其中:所述修饰的生物素化合物对链霉抗生物素的亲和小于生 物素对链霉抗生物素的亲和力;且生物素对所述修饰的生物素结合化 合物的亲和力小于生物素对链霉抗生物素的亲和力。
2.权利要求1所述的方法,其进一步包括将所述固定的物质与置 换分子接触,以释放所述第一化合物。
3.权利要求1所述的方法,其进一步包括将所述固定的物质与游 离生物素或其衍生物接触,以释放所述第一化合物。
4.权利要求1所述的方法,其中所述修饰的生物素结合化合物包 括硝基-链霉抗生物素或其衍生物。
5.权利要求1所述的方法,其中所述修饰的生物素化合物包括脱 硫生物素、DSB-X生物素或其衍生物。
6.权利要求1所述的方法,其中所述固体支持物选自塑料、玻璃、 陶瓷、烷、金属、纤维素和凝胶的表面。
7.权利要求1所述的方法,其中所述固体支持物是颗粒或磁性颗 粒。
8.权利要求1所述的方法,其中所述修饰的生物素化合物结合或 连接到下列物质:蛋白质、肽、核酸、寡糖、糖蛋白、脂质、化 合物、激素、毒素、其衍生物或其组合。
9.将修饰的生物素结合化合物可逆地固定到支持物的方法,所述 方法包括:
提供第一化合物,其包含修饰的生物素结合化合物;
提供固体支持物,其包含修饰的生物素化合物;和
将所述第一化合物和所述固体支持物接触以形成固定的物质;
其中:所述修饰的生物素化合物对链霉抗生物素的亲和力小于生 物素对链霉抗生物素的亲和力;且生物素对所述修饰的生物素结合化 合物的亲和力小于生物素对链霉抗生物素的亲和力。
10.权利要求9所述的方法,其进一步包括将所述固定的物质与 置换分子接触,以释放所述第一化合物。
11.权利要求9所述的方法,其进一步包括将所述固定的物质与 游离生物素或其衍生物接触,以释放所述第一化合物。
12.权利要求9所述的方法,其中所述修饰的生物素结合化合物 包括硝基-链霉抗生物素或其衍生物。
13.权利要求9所述的方法,其中所述修饰的生物素化合物包括 脱硫生物素、DSB-X生物素或其衍生物。
14.权利要求9所述的方法,其中所述固体支持物选自塑料、玻 璃、陶瓷、硅氧烷、金属、纤维素和凝胶的表面。
15.权利要求9所述的方法,其中所述固体支持物是颗粒或磁性 颗粒。
16.权利要求9所述的方法,其中所述修饰的生物素化合物结合 或连接到下列物质:蛋白质、肽、核酸、寡糖、糖蛋白、脂质、碳水 化合物、激素、毒素、其衍生物或其组合。
17.试剂盒,其包括:
(1)连接到固体支持物的生物素结合化合物;
(2)修饰的生物素化合物,其结合或连接到至少一种生物实体, 或试剂,所述试剂用于用修饰的生物素生物素化生物实体;和
(3)游离生物素或其衍生物,
其中所述修饰的生物素化合物对链霉抗生物素的亲和力小于生物 素对链霉抗生物素的亲和力;且生物素对所述修饰的生物素结合化合 物的亲和力小于生物素对链霉抗生物素的亲和力。
18.权利要求17所述的试剂盒,其中所述生物素结合化合物是硝 基-链霉抗生物素。
19.权利要求17所述的试剂盒,其中所述修饰的生物素包括脱硫 生物素、DSB-X生物素或其衍生物。
20.权利要求17所述的试剂盒,其中所述固体支持物包括磁性颗 粒。
21.试剂盒,其包括:
(1)连接到固体支持物的修饰的生物素化合物;
(2)修饰的生物素结合化合物,其结合或连接到至少一种生物实 体,或试剂,所述试剂用于用修饰的生物素生物素化生物实体;和
(3)游离生物素或其衍生物,
其中所述修饰的生物素化合物对链霉抗生物素的亲和力小于生物 素对链霉抗生物素的亲和力;且生物素对所述修饰的生物素结合化合 物的亲和力小于生物素对链霉抗生物素的亲和力。
22.权利要求21所述的试剂盒,其中所述生物素结合化合物是硝 基-链霉抗生物素。
23.权利要求21所述的试剂盒,其中所述修饰的生物素包括脱硫 生物素、DSB-X生物素或其衍生物。
24.权利要求21所述的试剂盒,其中所述固体支持物包括磁性颗 粒。

说明书全文

相关申请的交叉参考

[0001]本申请要求2006年11月15日提交的美国临时专利申请 系列号60/866021的优先权。

技术领域

[0002]本发明提供生物素化合物和生物素结合化合物之间的结 合的反转的温和方法。特别地,本发明涉及从硝基-链霉抗生物素(或 抗生物素蛋白)包被的支持物可逆释放修饰的生物素化部分的方法。相关领域描述
[0003]在医疗实践、研究和诊断过程中,对于从各种生物学液体 快速、准确地分离或定量测定不同类型的细胞存在持续的需要。
[0004]实现这类分离或测定所一般使用的方法是通过在两个实 体——分离或检测实体和靶——之间形成连接。这类连接通常使用亲 和结合,即依靠一对结合配偶体(partner)来完成。该对的一个成员 连接至检测或分离实体,或者是检测或分离实体的一部分,第二个成 员连接至靶或是靶的一部分。当该两部分接触时,发生连接。很多结 合配偶体系统是已知的,例如抗原-抗体、酶-底物、细胞上的配体- 受体相互作用和生物素-链霉抗生物素或抗生物素蛋白结合。虽然在实 体之间这类连接的形成允许用于这类分离、纯化或固定,但是如果希 望通过打断或反转该连接进一步操作分离的或纯化的细胞群,那么经 常出现问题。
[0005]抗生物素蛋白-生物素系统——特别是链霉抗生物素-生 物素系统——是分子、免疫学和细胞分析中最广泛使用的亲和结合之 一(Wilchek,M.and Bayer,E.A.,Methods Enzymol.184:5-13 and 14-45,1990)。一般而言,待纯化或检测的靶分子被直接结合于生物 素,或者结合于生物素化中间物。这样的中间物几乎可以是与靶分子 复合或缀合的任何分子或大分子。例如,如果特定抗原或表位是靶, 那么其结合剂(binder)将是抗体或其含互补位的片段。生物素化靶与 链霉抗生物素结合;为了易于检测,所述链霉抗生物素可以与固相结 合。
[0006]链霉抗生物素还可以容易地固定在表面上,以从原始的复 杂混合物中俘获、分离或检测生物素化部分,例如生物素化分子或生 物素标记的细胞。该基础性链霉抗生物素-生物素相互作用技术可用于 亲和层析、细胞化学、组织化学、病理探测(pathological probing)、 免疫测定、原位杂交、生物亲和传感器和交联剂中,以及用于更具体 的技术例如寻靶、药物递送、流式细胞术和细胞学探测中。
[0007]生物素对于链霉抗生物素或抗生物素蛋白的高亲和性,为 检测和分离生物素相关的靶的许多已经建立的方法提供基础。抗生物 素蛋白和生物素之间的结合(亲和常数,k大约10-15M)被认为是已知 的最强的非共价的生物学相互作用之一。(N.M.Green,Methods Enzymol.184:51-67,1990)。甚至当结合配偶体的一个或两个与其他 物质共价结合时,这种强结合作用被保持。结合形成非常迅速,并且 被认为在宽范围的pH、温度及其他变性条件下是稳定的。(Savage et al.,Avidin-Biotin Chemistry:A Handbook,1992:1-23,Rockford, Pierce Chemical Company)。该特别出众的亲和,以及生物素和它 的衍生物易于掺入各种生物物质的能力,赋予链霉抗生物素-生物素系 统极大的通用性。
[0008]生物素与链霉抗生物素的解离据报道比生物素与抗生物 素蛋白的解离快大约30倍。(Piran & Riordan.J.Immunol.Methods 133,141-143,1990)。在非特异性结合方面,这两个分子也不同。抗 生物素蛋白是糖基化的,并且糖部分的存在使其与生物物质非特异性 结合。对于许多应用,这些非特异性的相互作用使抗生物素蛋白不如 链霉抗生物素适合。去糖基化的抗生物素蛋白是从Southern Biotechnology Assoc.Inc.,Birmingham,AL,USA和从Accurate Chemical & Scientific Co.,Westbury,NY,USA商业可获得的,其 商标名为NEUTRALITE AVIDINTM。
[0009]使用生物素-链霉抗生物素(或抗生物素蛋白)连接的大多 数应用依靠两个结合配偶体的基本上不可逆的结合。然而,有许多这 样的情况,其中释放结合的生物素是希望的,例如在使用生物素化抗 体回收细胞期间。
[0010]破坏或反转生物素-链霉抗生物素连接的许多策略已被报 道。(Lee & Vacquier,Anal Biochem.206:206-207,1992,Elgar & Schofield,DNA Sequence 2:219-226,1992,和Conrad & Krupp, Nucleic Acids Res.20:6423-6424,1992)。
[0011]高亲和力迫使使用苛刻的(harsh)化学试剂和复杂的程 序,例如在高盐条件下煮或者使用加热到94℃的甲酰胺和EDTA数分 钟(Tong & Smith,Anal.Chem.64:2672-2677,1992),或者使用 6M pH 1.5的盐酸胍,以达到部分的或完全的结合破坏。美国专利号 5,387,505描述分开包含生物素化靶核酸和抗生物素蛋白-包被的聚 合颗粒的复合物的方法。该方法包括在包含氯化钠、SDS和EDTA的盐 洗涤溶液存在下,加热复合物至至少65℃的温度。在WO 02/061428 中,发明人描述破坏生物素-链霉抗生物素或生物素-抗生物素蛋白连 接的方法,其通过在大约80℃的温度下,在不存在额外加工步骤的 情况下,将缀合物与有效量的纯化或蒸馏温育。这类条件通常对任 何结合部分是有损害性的,但是它们对核酸起作用,因为核酸受到损 害的上限温度在大约300℃。因此,使用这类条件反转生物素-链霉抗 生物素连接通常是不希望的,特别是在纯化蛋白质或分离细胞、细菌 和病毒等时,此时保持细胞完整性和保持存活力或感染性是重要的。
[0012]在产生可释放的链霉抗生物素-生物素或抗生物素蛋白- 生物素缀合物的尝试中,已经开发了大量方法。
[0013]一些科学家已经引入化学可切割的连接体来将生物素连 接到一个结合配偶体。Shimkus等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82, pp.2593-2597,1985)描述使用连接体中的二硫键——其将生物素连 接到嘧啶环的C-5——作为将核苷酸可逆结合到抗生物素蛋白-琼脂 糖柱的手段。该原理也在美国专利号4,772,691中描述。
[0014]美国专利号5,215,927建议在生物素分子和特异性结合 试剂之间插入键,该键可被酶试剂或化学试剂特异性切割,例如各种 肽酶可切割的肽键、二糖酶可切割的二糖键、或在温和还原、化、 酸性或性条件下可以选择性断裂的化学键。
[0015]一个这类的连接体,硫代-NHS-SS-生物素,是商业可获得 的(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL.USA)。它是胺反应 性生物素化试剂,其包含延伸的间隔臂,以减少与抗生物素蛋白结合 相关的位阻。使用该基团,将硫代-NHS-SS-生物素与靶分子连接,并 且生物素部分使用50mM DTT通过硫醇切割被除去。该复杂的方法是缓 慢的并且使用受限,这是因为硫醇通常破坏天然蛋白质的二硫键。
[0016]用来解离链霉抗生物素-生物素结合的一种方法包括蛋白 酶K消化链霉抗生物素(Wilchek & Bayer,Anal.Biochem.171:1-32, 1988)。仅仅当生物素化产物不包括蛋白质时,蛋白酶K是可用的。
[0017]商业可获得的CELLectionTM生物素结合剂(Dynal Biotech AS,Prod.No.115.33)包含经由DNA连接体用链霉抗生物素包被的磁 珠,以提供靶释放的可切割位点。通过在室温下与DNAse温育15分钟 发生释放,然后进行强力吹吸(pipetting)以最大化细胞释放。
[0018]使用酶或化学可切割的连接体,对于从生物环境分离真正 地天然细胞,是次-最佳的(sub-optimal)。
[0019]其他方法包括使用单体抗生物素蛋白(Pierce Biotechnology Inc,Rockford,IL.USA.),切割生物素或链霉抗生 物素,和使用生物素类似物如N-羟基琥珀酰亚胺-亚基生物素 (iminobiotin)和酰胺生物素(amidobiotin)。
[0020]N-羟基琥珀酰亚胺-亚氨基生物素(NHS-亚氨基生物素)是 NHS-生物素的胍基类似物,其对于链霉抗生物素具有pH敏感的结合亲 和力。该系统的缺点是结合要求pH为9.5或以上,而NHS-亚氨基生 物素与链霉抗生物素的完全解离需要4以下的pH。因此,使用NHS- 亚氨基生物素不适于分离天然细胞。
[0021]其它人已经报道了在更温和条件下破坏生物素-链霉抗生 物素复合物的多种方法,例如引入可光切割的生物素亚磷酰胺 (Olejnik et al,Nucleic Acids Res.24:361-366,1996),或者 使用聚合物缀合物连同链霉抗生物素突变体,这产生温度或pH依赖性 的释放。例如,Ding等(Bioconjugate Chem.10:395-400,1999)已 经将温度敏感性聚合物——聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NI PAAm)缀合到遗 传工程改造的链霉抗生物素(SAv),以产生能在室温或更低温度下结合 生物素并且在37℃下释放所结合的生物素的缀合物。更近来,同一基 团将pH敏感性聚合物(NIPAAm和丙烯酸的共聚物)缀合到遗传工程改 造的SAy分子上同一特异性位置(Bioconjugate Chem.11:78-83, 2000)。发现降低pH引起聚合物折拢(collapse),这导致生物素结合 阻断,反之,升高pH引起聚合物完全水合,从而使生物素结合。
[0022]美国专利号5,332,679描述免疫测定或DNA探针测定, 其利用基于生物素和链霉抗生物素的可逆的结合置换系统(binding displacement system)。在该测定中,可释放的配体、可释放的配体 的结合配偶体、目的分析物、分析上可检测的(报道分子)基团和分析 物的至少一个结合配偶体被首先连接至不溶相,以便形成与不溶相结 合的报道分子-标记的复合物,然后,加入置换剂配体,其置换可释放 的配体连同一部分的报道分子-标记的复合物,以便释放的报道分子在 游离液体介质中是分析上可检测的,并且可与样品中分析物的浓度相 关。例如,当可释放的配体是脱硫生物素并且结合配偶体是链霉抗生 物素时,对链霉抗生物素具有比脱硫生物素更高的亲和常数的生物素, 可被用作置换剂配体。适当的置换剂配体的实例包括生物素、脱硫生 物素、链霉抗生物素或抗生物素蛋白。生物素是优选的置换剂配体。 适当的可释放的配体的实例包括脱硫生物素、亚氨基生物素、和功能 化的偶氮染料、链霉抗生物素、琥珀酰化的抗生物素蛋白、和抗生物 素蛋白。脱硫生物素是优选的。
[0023]专利族,美国专利号4,656,252;4,478,914;和 4,282,287,描述制备多层系统的方法,包括连续地、重复地连接蛋 白质物质和配体物质的特定分子或颗粒层,以形成多层系统。该蛋白 质物质包括蛋白质例如抗生物素蛋白,配体物质包括蛋白质例如生物 素和这些的衍生物、类似物或取代物。典型的生物素类似物是脱硫生 物素和生物素砜,典型的生物素衍生物包括己酰胺生物素和生物胞素。
[0024]在其形成期间,将多层系统连接(共价或非共价地)到固体 表面。该系统和方法可用来改变或修饰固体表面的性质——包括分子 连接到表面的程度——用于增加免疫测定和亲和层析。
[0025]所述的酰胺生物素化合物包括生物素、生物素衍生物、生 物素类似物、和生物素取代物,其具有通过酰胺基共价结合到氨基羧 酸的反应性羧基,并且氨基酸的羧基与环状化合物例如N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)的羟基共价反应,或者与大分子例如酶的反应性氨基发生共 价反应。本发明的酰胺生物素化合物的通式包括:生物素- C(=O)NHRC(=O)(O)mN(H)nY,其中R是将生物素与大分子和潜在位阻分 开的间隔基团。典型地,R可以是芳基例如亚苯基或烷基取代的亚苯 基、脂环基例如C5或C6基团、或优选地烷基例如C1-C12或更大例 如C3-C10聚亚甲基。Y是反应性氨基或羟氨基化合物,例如包含反应 性氨基的蛋白质物质,例如酶。整数n或m可以是0或1,这取决于 氨基反应物Y是否是伯胺或仲胺或羟基胺。典型的新的化合物包括苯 甲酰基酰胺生物素-N-羟基琥珀酰亚胺;C1-C12烷酰基酰胺生物素-N- 羟基琥珀酰亚胺;例如,己酰胺生物素-NHS;和其酶缀合物。美国专 利号4,656,252描述三种不同的酰胺生物素。
[0026]这种修饰的生物素衍生物是商业可获得的,其名称为 DSB-XTM生物素(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)。DSB-XTM生物 素是脱硫生物素的衍生物,一种稳定的生物素前体。DSB-XTM生物素使 用7原子间隔子,以增加DSB-XTM生物素缀合物在链霉抗生物素或抗生 物素蛋白的深藏生物素-结合袋中结合的能力。该衍生物对抗生物素蛋 白和链霉抗生物素具有中等亲和力。通过低浓度的游离生物素或脱硫 生物素在中性pH和室温下,它们的相互作用被快速反转。与DSB-X 生物素-标记的分子复合的靶可用抗生物素蛋白或链霉抗生物素缀合 物选择性的检测,或者在亲和基质上分离,然后在温和条件下释放 DSB-X生物素-标记的生物分子(Hirsch et al.Anal.Biochem.308, 343-357,2002)。在他们的出版物中,Hirsch等描述数种可逆系统。 在多孔板测定中,使用5mM游离生物素并且在室温下温育2小时或在 4℃下温育过夜,进行置换。对于柱,他们推荐以10个到20个柱体积 用>25mM的置换配体洗脱,并且对于点渍法,他们谈到与置换配体 温育2-16小时。DES-XTM生物素可以与多种分子缀合,并且使用链霉 抗生物素或抗生物素蛋白包被的固相固定靶,或者可以使用DES-XTM- 包被的固相和链霉抗生物素或抗生物素蛋白标记的分子。Molecular Probes提供DSB-XTM生物素的多种抗体缀合物,以及DSB-XTM生物素琼 脂糖。
[0027]降低生物素与链霉抗生物素或抗生物素蛋白的亲和力的 另一种方法是使用重组或化学修饰的链霉抗生物素或抗生物素蛋白。 Kulomaa等的WO 01/05977包括抗生物素蛋白和链霉抗生物素的突变, 该突变通过用赖氨酸置换特定的色氨酸残基进行。这两种突变体蛋白 都产生稳定的二聚体。当用缓冲液(PBS中0.5%BSA;0.5%吐温20和 1M NaCl)中的0.5mM生物素在37℃下检测1小时时,这些稳定的 二聚体表现出可逆的生物素-结合特性。
[0028]美国专利号6,022,951也描述对生物素具有减少的亲和 力的突变重组链霉抗生物素。发明人建议以一种或多种缺失、插入、 点突变或这些遗传改变的组合的形式修饰链霉抗生物素,这些修饰改 变但保持生物素结合位点。为了破坏他们突变的链霉抗生物素的链霉 抗生物素-生物素结合,他们可以使用在0.1mM到10mM之间的生物 素。另外,可以在高或低的pH下、在高盐中或在存在离子洗涤剂、解 离剂、离液剂、有机溶剂、蛋白酶(蛋白酶K)或水的情况下,进行洗 脱。在他们的实施例11中,他们使用他们的减少亲和力的链霉抗生物 素包被在玻璃珠上,用于分离和分开B细胞和T细胞。他们使用包含 包被有抗人IgG的2ml的玻璃珠的3ml柱。在500μl/分钟的流速 下,将1ml的淋巴细胞加入到该柱,并且收集包含T细胞的流过组分。 用另外15ml的PBS在500μl/分钟下洗涤该柱,以回收另外的T细 胞。使用15ml的PBS中的2mM生物素从该柱洗脱结合的B细胞。该过 程的总时间为至少1小时。
[0029]美国专利号6,391,571;6,312,916;和6,417,331描述 使用多种氨基酸取代和缺失制造的抗生物素蛋白和链霉抗生物素的突 变蛋白,其对生物素具有减少的结合亲和力。发明人表明他们可以使 用50mM、pH 3.0的乙酸铵或/和9到10mM亚氨基生物素或生物素的 梯度,从他们的Spherosil-NH2链霉抗生物素突变蛋白吸附柱洗脱他 们的生物素化血清白蛋白。使用pH 7.2的PBS缓冲液和0到10mM 生物素的梯度,洗脱他们的生物素化Fab抗体片段。
[0030]美国专利号6,165,750和6,156,493描述嵌合的链霉抗 生物素四聚体,其具有至少一个包含氨基酸修饰的单体,该修饰产生 对生物素减少的结合亲和力、改变的解离率、改变的结合率(on-rate) 或改变的结合。他们使用生物素柱,并且通过将2mM生物素加入到 流动缓冲液来洗脱他们的突变链霉抗生物素。
[0031]美国专利号5,168,049描述了在免疫学上基本与天然链 霉抗生物素等同并且能与生物素或生物素衍生物或类似物结合的多 肽。
[0032]其他的专利报告了对链霉抗生物素具有结合活性的肽的 产生。美国专利号5,506,121描述产生这类肽(Strep-标签),其可以 使用1mM亚氨基生物素或5mM硫辛酸的溶液从链霉抗生物素琼脂糖 柱洗脱。与生物素相比,这类肽配体的优点本质上是它们的编码序列 在DNA水平与期望蛋白质的基因连接,并且随后可与该蛋白质的基因 一起共表达,通过该方法,形成标记有肽配体的重组蛋白质。美国专 利号6,103,493提供链霉抗生物素突变蛋白,其对于肽配体的结合亲 和力是这样的,以致可以通过其他的链霉抗生物素配体例如生物素、 亚氨基生物素、硫辛酸、脱硫生物素、二氨基生物素、 HABA(hydroxyazobenzene-benzoic acid,羟基偶氮苯-苯甲酸)或/和 二甲基-HABA竞争性洗脱它们。可以通过运用10ml、2.5mM的浓度 的二氨基生物素、脱硫生物素和生物素的每一个,逐步洗脱结合的蛋 白质。
[0033]美国专利号5,973,124描述修饰抗生物素蛋白-型分子的 方法。生物素结合位点中的必需酪氨酸残基以如此方式修饰:与相应 的未修饰的抗生物素蛋白-型分子中的未修饰的酪氨酸残基相比,它的 pKa减少。通过用基团例如硝基、卤素、偶氮和氨基,在酪氨酸残基 的羟基的一个或两个邻位取代,完成该修饰。他们表明这类修饰可在 不同的抗生物素蛋白-型分子上进行,所述分子包括:(i)天然卵清抗 生物素蛋白;(ii)重组抗生物素蛋白;(iii)去糖基化形式的抗生物素 蛋白;(iv)细菌链霉抗生物素;(v)重组链霉抗生物素;(vi)截短的 链霉抗生物素;和它们的衍生物。发明人示出他们能通过加入碱性溶 液(例如pH 10)或加入过量的生物素(例如在任何pH下,0.6mM),从 含有修饰的抗生物素蛋白-型分子的柱释放生物素化的化合物。根据他 们的图,他们需要大约5个柱体积的含生物素缓冲液,以实现释放 (Morag et al.Anal.Biochem.243,257-263,1996)。
[0034]这些硝化的抗生物素蛋白衍生物是从Molecular Probes, Eugene,OR,USA商业可获得的,其名称为
[0035]尽管迄今为止做出了进步,但是对于选择性分离和释放细 胞及其它生物分子仍需要新的和提高的方法;对于在生物素和链霉抗 生物素之间的可逆结合,先前报道的方法对于构象敏感的靶或天然细 胞的分离均不是最适宜的。因此,在本领域对于可逆和可靠破坏生物 素和链霉抗生物素(或抗生物素蛋白)之间的结合的可选方法,存在持 续的需要。发明概述
[0036]本发明的方面提供在生物素化部分和生物素结合化合物 如链霉抗生物素(或抗生物素蛋白)之间的结合的反转的简单方法,该 方法没有破坏靶的天然构象或分离的细胞的天然状态。可以通过使用 硝基-链霉抗生物素或抗生物素蛋白和修饰的生物素如脱硫生物素或 其衍生物如DSB-X生物素的组合,使链霉抗生物素或抗生物素蛋白- 生物素之间的强相互作用变弱很多。蛋白质,例如针对细胞表面抗原 的抗体,可以用修饰的生物素进行生物素化。该抗体被俘获或结合至 硝基-链霉抗生物素或抗生物素蛋白(其又被固定在固体表面上)。该 固相/抗体复合物用于从复杂混合物中俘获特定的细胞。然后,通过将 复合物与有效量的游离生物素接触,在非常温和和快速的条件下,释 放具有结合抗体的细胞。释放出的具有生物素化抗体的细胞可以因此 被分离和纯化。
[0037]本方法优于现有技术的一个新的方面是,生物素-链霉抗 生物素结合对的两部分都被修饰为对彼此具有基本上减少的亲和力, 结果释放速度变得比在现有技术中报道的快很多。该方法避免先前使 用的苛刻的化学变性条件。它也避免与置换配体的任何冗长的温育, 或避免从亲和柱洗脱分离的靶时发生的稀释效应。分离的细胞比使用 以前可用的方法分离的细胞更接近它们的天然状态。
[0038]本方法已经表明非常适用于细胞分离和分开过程。本方法 可用于多种其他的过程,例如检测、识别、测定、纯化、分开和/或分 离靶蛋白或核酸分子。也提供进行本发明方法的试剂盒附图描述
[0039]下列附图形成本说明书的一部分,并且被包括以进一步说 明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个,连同本文 提供的具体实施方案的详细说明,可更好地理解本发明。
[0040]图1是标记和分离特定细胞的五种不同原理的示意图。两 种原理——其中一抗用于标记和细胞分离,显示在图A和B中;而二 重标记原理在图C、D和E中示出,其中使用一抗和二抗。
[0041]图1A显示直接单层标记技术,其中特定抗体用修饰的生 物素进行标记,并且在与靶细胞温育以前,与修饰的链霉抗生物素包 被的固体支持物结合。
[0042]图1B显示间接单层标记技术,其中特定抗体标记有修饰 的生物素,并且在与修饰的链霉抗生物素包被的固体支持物温育以前, 与靶细胞温育。
[0043]图1C显示直接双层标记技术,其中针对抗-靶抗体的抗体 标记有修饰的生物素,并且在与抗-靶抗体温育之前,与修饰的链霉抗 生物素包被的固体支持物结合。然后,这些复合物与靶细胞温育。
[0044]图1D显示间接双层标记技术,其中在与修饰的链霉抗生 物素包被的固体支持物温育之前,生物素-标记的抗-抗体和抗-靶抗体 的复合物与靶细胞温育。
[0045]图1E显示组合型双层标记技术,其中在和已经与靶细胞 结合的抗-靶抗体温育之前,修饰的生物素-标记的抗-抗体与修饰的链 霉抗生物素结合。
[0046]图2是本发明应用方法的示意图,其示出修饰的生物素化 细胞结合抗体如何可用于与荧光染料标记的链霉抗生物素结合,以在 荧光显微术或流式细胞术中进行检测。
[0047]图3是用于经过抗原呈递细胞(APC)特异性刺激T细胞的 本发明的应用方法的示意图。显示的是在结构中具有遗传学或化学插 入的抗原肽(显示为正方形)的DSB-标记的修饰的抗体。在APC分离之 后,保留下来的修饰的抗体被内化并且加工(负载/加工)。APC的抗原 肽的随后呈递可被用于刺激特定的T细胞。该T细胞通过它们的T细 胞受体(TcR),在主要组织相容性复合物II类((Major Histo-compatibility Complex)(MHC)class II)的背景中,识别肽。
[0048]图4是本发明的应用方法的示意图,其示出分离的细胞如 何可以由用于细胞分离的抗体进行刺激。分离的细胞在细胞表面上保 留用于分离的DSB-连接的-抗体。引入另外的生物素化共刺激分子和 链霉抗生物素包被的Dynabeads将产生细胞-珠复合物,从而推动细胞 活化、增殖和/或分化。
[0049]图5是示出在用Dynabeads M-280链霉抗生物素、生物 素-抗-CD28和DSB-连接的-抗-CD3刺激后CD3+T细胞的增殖的图。使 用DSB-连接的-抗-CD3和硝基-链霉抗生物素-珠分离CD3+T细胞。在 释放后,细胞在细胞表面上保留DSB-连接的-抗-CD3,并且引入生物 素-抗-CD28和Dynabeads M-280链霉抗生物素以产生细胞进入细胞周 期所需要的刺激信号(通过TCR/CD3复合物和共刺激分子)。48小时的 刺激后,用3H-胸苷(thymidin)脉冲细胞,并在72小时后收获细胞, 如在实施例4中所描述的。发明详述
[0050]尽管用“包括”多种成分或步骤(解释为指“包括但不限 于”)的方式描述组合物和方法,但是组合物和方法也可“基本上由多 种成分或步骤构成”或者“由多种成分或步骤构成”,此类术语应解 释为定义基本上封闭的成员组。
[0051]方法
[0052]本发明的一个实施方案提供在使用抗生物素蛋白-生物素 技术的方法中,回收生物素化配体的方法(如在图1A中所示),其包括 下列步骤:
[0053](a)将修饰的生物素化配体固定化到连接至固体支持物的 修饰的链霉抗生物素-型分子上;
[0054](b)在如此固定化的修饰的生物素化配体和它的靶之间进 行期望的反应或分离过程;
[0055](c)通过加入低浓度的游离生物素,从固定化的修饰的链 霉抗生物素移出修饰的生物素化配体/靶复合物;和
[0056](d)回收修饰的生物素化配体/靶复合物。
[0057]本发明的可选的实施方案涉及包括下列步骤的方法(如在 图1B中图解的):
[0058](a)温育修饰的生物素化配体和它的靶;
[0059](b)将修饰的生物素化配体/靶复合物固定化到连接至固 体支持物的修饰的链霉抗生物素-型分子上;
[0060](c)通过加入低浓度的游离生物素,从固定化的修饰的链 霉抗生物素移出修饰的生物素化配体/靶复合物;和
[0061](d)回收修饰的生物素化配体/靶复合物。
[0062]本发明的第三个实施方案涉及包括下列步骤的方法(如在 图1C中图解的):
[0063](a)将修饰的生物素化抗-配体固定到连接至固体支持物 的修饰的链霉抗生物素-型分子上;
[0064](b)将步骤a的复合物与配体一起温育;
[0065](c)在如此固定的步骤b的复合物与它的靶之间进行期望 的反应或分离过程;
[0066](d)通过加入低浓度的游离生物素,从固定的修饰的链霉 抗生物素移出修饰的生物素化抗-配体/配体/靶复合物;和
[0067](e)回收修饰的生物素化抗-配体/配体/靶复合物。
[0068]本发明的第四个实施方案涉及包括下列步骤的方法(如在 图1D中图解的):
[0069](a)温育修饰的生物素化抗-配体和配体;
[0070](b)将步骤a的复合物与靶一起温育;
[0071](c)将步骤b的复合物固定到连接至固体支持物的修饰的 链霉抗生物素-型分子上;
[0072](d)通过加入低浓度的游离生物素,从固定的修饰的链霉 抗生物素移出修饰的生物素化抗-配体/配体/靶复合物;和
[0073](e)回收修饰的生物素化抗-配体/配体/靶复合物。
[0074]本发明的第五个实施方案涉及包括下列步骤的方法(如在 图1E中图解的):
[0075](a)将修饰的生物素化抗-配体固定到连接至固体支持物 的修饰的链霉抗生物素-型分子上;
[0076](b)将步骤a的复合物与配体一起温育;
[0077](c)在如此固定的步骤b的复合物与它的靶之间进行期望 的反应或分离过程;
[0078](d)通过加入低浓度的游离生物素,从固定的修饰的链霉 抗生物素移出修饰的生物素化抗-配体/配体/靶复合物;和
[0079](e)回收修饰的生物素化抗-配体/配体/靶复合物。
[0080]所描述的方法优于现有技术的优点是释放结合的细胞更 快得多,并且在非常温和的条件下进行,所述条件例如在生理pH下的 PBS缓冲液或细胞培养基中的大约50μM到大约500μM生物素。
[0081]如本文使用的,术语“生物素”意图指生物素(顺式-六氢 -2-氧代-1H-噻吩并[3,4]咪唑-4-戊酸)和任何生物素衍生物以及类似 物。此类衍生物和类似物是与天然或修饰的链霉抗生物素或抗生物素 蛋白的生物素结合袋形成复合物的物质。这样的化合物包括,例如, 亚氨基生物素、脱硫生物素和链霉抗生物素亲和肽,并且也包括生物 素-ε-N-赖氨酸、生物胞素酰肼、2-亚氨基生物素和生物素基-ε- 氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的氨基或巯基衍生物、硫代-琥珀酰亚 胺-亚氨基生物素、生物素溴代乙酰基肼 (biotinbromoacetylhydrazide)、对-重氮苯甲酰基生物胞素、3-(N- 来酰亚胺丙酰)生物胞素。用于本发明的优选的生物素衍生物是脱硫 生物素或它的衍生物DSB-X生物素,其从Molecular Probes,Eugene, OR,USA商业可获得;产品号D20658)。
[0082]术语“生物素化物质”或“部分”应被理解为修饰的生物 素或生物素类似物与其他部分的缀合物,所述其他部分例如生物分子, 如核酸分子(包括单链或双链DNA、RNA、DNA/RNA嵌合分子、核酸类似 物和包含或并入核苷酸序列的任何分子例如肽核酸(PNA)或其任何修 饰物)、蛋白质(包括糖蛋白、酶、肽文库或展示产品和抗体或其衍生 物)、肽、水化合物或多糖、脂质等等,其中所述其他部分被共价连 接到修饰的生物素或生物素类似物。许多生物素化配体是商业可获得 的,或可以通过标准方法制备。将生物分子例如核酸分子或蛋白质分 子偶联到生物素的方法是本领域熟知的(Bayer and Wilchek,Methods in Molec.Biology 10,143.1992)。
[0083]术语“结合配偶体”被定义为能够与另一个生物分子特异 性或非特异性结合或相互作用的任何生物或其他的有机分子,该结合 或相互作用可被称为“配体”结合或相互作用,并且由下列物质所例 证,但不限于这些物质:抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑 制剂、酶/辅因子、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、凝集素/碳水化 合物、受体/激素、受体/效应物或阻抑物/诱导物结合或相互作用。适 当的配体依赖本发明的方法的期望应用而选择。
[0084]其他的特异性亲和吸附部分,例如小麦胚粘合剂(wheat germ agglutinant)、抗-独特型抗体和染料配体,也可与修饰的生物 素偶联,以便分离糖基化的蛋白质例如SP1转录因子、染料结合蛋白 质例如丙酸激酶和肝脏乙醇脱氢酶及其他抗体。
[0085]在一些情况下,配体是针对药物、激素、抗生素或具有抗 原性质的其他化合物的抗体。抗体也可以针对另一个抗体(也就是说抗 -抗体)。单克隆和多克隆抗体都可被使用,并且他们可以是完整的分 子或其各个片段。对特定配体特异性的抗体可通过本领域公知的和记 录在文件中的方法来生产。
[0086]用于本发明的方法中的抗体可以是任何种、类别或亚类, 只要这样的抗体能够与特定的靶配体形成连接,并且可以用修饰的生 物素进行生物素化。如此,用于本发明的抗体包括:
[0087]任何种类或亚类的免疫球蛋白,例如源于任何动物的IgG、 IgA、IgM、IgD或者IgE,所述动物例如通常使用的任何动物,例如 绵羊、兔、山羊或小鼠。
[0088]单克隆抗体
[0089]完整的抗体或抗体的“片段”,单克隆或多克隆的,包含 抗体的结合区域的那些片段,例如缺少Fc部分的片段(例如Fab、Fab′、 F(ab′)2、Fv),通过还原切割完整抗体中连接重链部分的二硫键而获 得的所谓的“半分子”片段。
[0090]通过重组DNA或其他合成技术生产或修饰的抗体,包括单 克隆抗体、抗体的片段、“人源化抗体”、嵌合的抗体或合成制造的 或改变的抗体样结构。也包括的是抗体的功能衍生物或“等同物”, 例如单链抗体。
[0091]可选地,配体可以是抗原性物质(包括一价的或多价的或 多决定簇(multideterminant)抗原)。
[0092]如本文使用的,术语“缀合物”和“复合物”指包含生物 素化合物和生物素结合化合物的任何缀合物或复合物,其中生物素化 合物和生物素结合化合物通过非共价结合连接。典型地,生物素与一 种或多种——优选一种——生物或化学实体例如生物分子结合或连 接。如上面解释的,这类包含与其他实体连接的生物素的生物素化合 物,在本文也称为“生物素化部分”。
[0093]如本文使用的,术语“生物素结合”化合物意图包括:能 够与生物素或任何生物素化合物紧紧地但非共价结合的任何化合物。 优选的生物素结合化合物包括修饰的链霉抗生物素和抗生物素蛋白, 以及其衍生物和类似物,例如硝基-链霉抗生物素。
[0094]如本文使用的,术语“抗生物素蛋白”指天然的卵清糖蛋 白抗生物素蛋白,以及其衍生物或等同物,例如去糖基化或重组形式 的抗生物素蛋白,例如,N-酰基抗生物素蛋白如N-乙酰基、N-邻苯二 甲酰和N-琥珀酰抗生物素蛋白;和商品ExtrAvidin、Neutralite Avidin和CaptAvidin。
[0095]如本文使用的术语“链霉抗生物素”指通过链霉菌属选择 的菌株产生的细菌链霉抗生物素,例如,阿维丁链霉菌(Streptomyces avidini),以及其衍生物或等同物,例如重组和截短的链霉抗生物素, 例如“核心”链霉抗生物素。
[0096]某些抗生物素蛋白/链霉抗生物素物质是商业可获得的, 例如天然的抗生物素蛋白和链霉抗生物素、非糖基化的抗生物素蛋白、 N-酰基抗生物素蛋白和截短的链霉抗生物素;或者可以通过公知的方 法制备(参见Avidin-biotin technology,Methods of Enzymology, Vol.184:1-671,1990。在该参考文献中,Green描述抗生物素蛋 白和链霉抗生物素的制备;Hiller等,制备非糖基化抗生物素蛋白; Bayer等,制备链霉抗生物素和截短的链霉抗生物素;Chandra & Gray 描述重组抗生物素蛋白)。天然和重组形式的链霉抗生物素和抗生物素 蛋白都可用于本文描述的方法,只要他们可以被修饰,如 US-A-5,973,124中描述的。用于本发明的优选的链霉抗生物素的衍生 物是硝基-链霉抗生物素,其如在实施例2中描述的那样进行制备。用 作起始材料的优选的衍生物是重组核心-链霉抗生物素。
[0097]在本发明的优选实施方案中,生物素类似物或者修饰的生 物素结合化合物,被固定化在固定化部分,例如固体支持物上。优选 地,修饰的生物素结合化合物例如硝基-链霉抗生物素(或抗生物素蛋 白),将被固定化。连接作用的任何一种成分连接到固相,使该连接的 成分容易操作。因此,连接到某种固相可以使得能够从混合物中的剩 余成分中分离出连接的成分。例如,这可通过进行洗涤步骤实现,或 者如果该成分连接到磁珠,那么使用磁场实现从混合物中的剩余成分 中物理分离出连接的成分。
[0098]固体支持物可能是任何公知的支持物或基体,其当前被广 泛用于化学或生物化学过程中的固定、分离等,或者被提议用于化学 或生物化学过程中的固定、分离等。这些支持物可以采取颗粒、片、 试条(dip-sticks)、凝胶、过滤器、膜、微纤维条、管、孔或板、纤 维或毛细管、梳、移液管尖、微阵列或芯片或它们的组合的形式,并 且方便地可以由聚合材料例如琼脂糖、琼脂糖凝胶(Sepharose)、纤 维素、硝化纤维、藻酸盐、特氟纶(Teflon)、胶乳、丙烯酰胺、尼 龙膜、塑料、聚苯乙烯、玻璃或二氧化或金属制成。生物芯片可被 用作固体支持物,以提供微型实验系统——如在Nilsson等中描述的 (Anal.Biochem.224:400-408,1995);或者作为诊断工具。许多 适当的固体支持物是商业可获得的。
[0099]优选的固体支持物是为结合修饰的生物素或修饰的生物 素结合化合物提供大的表面面积的物质。此类支持物通常具有不规则 表面,并且例如可以是多孔的或微粒状的,例如颗粒、纤维、织物、 熔渣或筛。微粒物质例如珠通常是优选的,这是由于它们更大的结合 能力,特别是聚合珠/颗粒。
[0100]方便地,根据本发明使用的微粒固体支持物包括球形珠。 珠的大小不是关键的,但是它们可以为,例如至少0.01μm直径的量 级,并且具有优选地不超过10和更优选地不超过6μm的最大直径。 例如,直径1.0μm、2.8μm和4.5μm的珠已经示出工作良好。
[0101]单分散颗粒,即基本上大小一致的那些颗粒(例如大小具 有小于5%的直径标准差),具有下列优点:它们提供非常均一的反应 重复性。通过在美国专利号4,336,173中描述的技术生产的单分散聚 合物颗粒是特别适当的。
[0102]颗粒可以完全由相同的聚合物组成,或者它们可以是核- 壳(core-shell)聚合物,如在美国专利号4,703,018和EP-A-0280556 中描述的,其中壳聚合物具有必需的反应基团。
[0103]在本发明方法中适用的非磁性聚合物珠可从Dynal Biotech AS(Oslo,Norway)获得,其商标DYNOSPHERES,以及可从 Qiagen、GE Healthcare Life Sciences、Serotec、Seradyne、Merck、 Nippon Paint、Chemagen、Promega、Prolabo、Polysciences、Agowa 和Bangs Laboratories获得。
[0104]然而,为了帮助操作和分离固定的物质,并且如果需要的 话也为了促进自动化,可磁化的(“磁性的”)珠是优选的。如本文使 用的,术语“磁性的”指当支持物被放入磁场中时,支持物能够具有 给予其的磁矩,因此支持物在该场的作用下可被移置。换言之,在结 合任何修饰的生物素或修饰的生物素化部分后,包括磁性颗粒的支持 物通过磁性聚集(magnetic aggregation),可容易地从样品的其他成 分中移出,这提供快捷、简单的和有效的分离颗粒的方法。另外,这 样的磁性聚集是远不及传统的技术例如离心作用——其产生可以破裂 细胞或降解连接至修饰的生物素分子的任何其他部分,例如蛋白质或 核酸的剪切力——严酷的分离方法。
[0105]因此,通过应用磁场,例如使用永久磁体,具有修饰的生 物素或修饰的生物素化部分的磁性颗粒——所述修饰的生物素或修饰 的生物素化部分经过缀合连接到修饰的生物素结合化合物例如硝基- 链霉抗生物素(抗生物素蛋白)上——可以在适当的表面上移动。应用 磁体到包含样品混合物的容器的侧面,以聚集颗粒到容器壁并移出其 余的样品以便剩余样品和/或颗粒可用于任何期望的进一步的步骤,这 通常是足够的。
[0106]可选地,本方法可使用处理这类磁性颗粒的自动化系统进 行。可将包含靶细胞的样品转移到这样的仪器,并且可以加入携带针 对靶的抗体的磁性颗粒——所述抗体通过修饰的生物素/硝基链霉抗 生物素复合物连接。如果希望,可以洗涤分离的支持物结合的细胞, 并将其转移到包含置换生物素的其他小瓶中,然后移出释放的颗粒。 在这点上,特别提到Bead Retriever,其可从Dynal Biotech AS, Norway获得。该仪器具有将支持物(携带细胞)从一个孔简便、有效地 转移到另一个孔的系统。
[0107]优选地,这样的磁性颗粒是超顺磁的 (superparamagnetic)以避免顽磁并因此聚集,并且有利地,这样的磁 性颗粒是单分散的(即在大小上基本一致,例如大小具有小于5%的直 径标准差),以提供均一的动力学和分离。超顺磁单分散颗粒的制备由 Sintef在BP-A-106873中描述。
[0108]由Dynal Biotech AS(Oslo,Norway)以商标DYNABEADS 出售的公知的单分散聚合超顺磁珠,是示例性的商业可获得的磁性颗 粒,其可根据本发明的应用而进行使用或修饰。
[0109]如果希望,修饰的生物素结合化合物(例如硝基-链霉抗生 物素或抗生物素蛋白)或修饰的生物素,可经由基底(substrate)表面 上的反应基团、通过本领域公知的方法,共价连接到适当的支持物上。 这些包括例如,通过羟基、羧基、或氨基——其可通过处理固定支 持物以提供适当的表面涂层而被提供——的连接。
[0110]可选地,具有功能化表面的支持物是从许多制造商商业可 获得的,例如上面所述的那些颗粒制造商。
[0111]具有下列功能化表面的磁性颗粒可从Dynal Biotech AS, Oslo,Norway获得:
[0112]疏水珠
[0113]M-450 Epoxy(具有环氧基团)
[0114]M-450 Tosylactivated(具有甲苯磺酰基)
[0115]M-280 Tosylactivated(具有甲苯磺酰基)
[0116]MyOneTM Tosylactivated(具有甲苯磺酰基)
[0117]M-500 Subcellular(具有甲苯磺酰基)
[0118]亲水珠
[0119]M-270 Epoxy(具有环氧基团)
[0120]M-270 Carboxylic acid(具有羧酸基团)
[0121]MyOne Carboxylic acid(具有羧酸基团)
[0122]Dynabeads M-270 Amine(具有氨基)。
[0123]在关心的具体方法中,表面的适当选择可依赖于连接到修 饰的生物素或修饰的生物素结合化合物的部分的类型。通过可直接与 颗粒的外表面上的反应基团反应的生物素结合化合物的氨基或巯基可 实现该连接。
[0124]存在许多有用的反应基团,其与修饰的生物素结合分子的 游离胺基反应。这样的基团包括但不限于:羧基、活性卤素、活化的 2-取代的乙磺酰基、活化的2-取代的乙基羰基、活性酯、乙烯基磺酰 基、乙烯基羰基、醛、环氧、氨基和巯基,所有这些在本领域是已知 的。这些基团中的一些与修饰的生物素结合分子直接反应,而其他的, 例如羧基,需要使用化合物来产生中间物,该中间物与修饰的生物素 结合化合物分子反应。适于交联固体表面和生物素结合化合物的试剂 包括溴化氰、羰二咪唑、戊二醛、羟基琥珀酰亚胺和甲苯磺酰氯。已 经发现甲苯磺酰基-和环氧表面都适用于本发明。
[0125]制备本发明试剂的一般方法包括使用通常已知的反应,将 修饰的链霉抗生物素或抗生物素蛋白或它们的衍生物共价连接到颗 粒。代表性的制备方法在下面实施例2中举例说明。
[0126]本文描述的本发明的修饰的生物素-结合分子可用于使用 抗生物素蛋白-生物素技术的任何方法,特别是其中希望破坏结合或反 转结合复合物的那些方法。
[0127]术语“反转”、“切割”、“释放”或“破坏”在本文可 互相交换使用,并且意图指物理分离或分开或解离结合复合物的配偶 体。所需要的是破坏或打破在修饰的生物素和修饰的生物素结合化合 物之间的连接以使各个实体分离。
[0128]“置换分子(displacement molecule)”(例如,游离生 物素)可在物理上以充分的方式打破连接或使连接不稳定,以使其被切 割或反转,如此使两个连接的实体被分离。而且,在连接群中,可能 不需要破坏每个连接,只要充分的或显著的比例被“反转”,例如, 基本上所有的连接被“反转”。在本文中,“基本上”可用于指至少 70%(或更优选地,至少75、80、85、90或95%)的连接被反转。理想 地,100%的连接被反转。在本发明的连接反转系统中,即使反转不能 100%完成,应用性也可得到保持。
[0129]例如,本发明可用于从异质混合物中检测、识别、测定、 纯化、分离和/或分开生物学目的化合物、靶的方法。这样的化合物可 以被定义为任何生物学或化学化合物,其具有一个或多个与相应的特 定配体复合的位点,并且其中配体可以用修饰的生物素进行生物素化。
[0130]本发明的方法可用于从任何生物样品或人工培养基纯化 或分离任何类型的细胞或细胞组分。源自人或动物来源的代表性生物 样品,包括:全血;和血液衍生产物,例如血浆、血沉棕黄层或白细 胞分离(leukophoresis)产物;血清、唾液、淋巴液、胆汁、尿、乳、 粪便脑脊液或任何其他的体液,如脊髓液、精液、泪液、阴道分泌 物等等,以及粪便标本。也可以分析人或动物组织例如骨骼肌、心脏、 肾、、脑、骨髓、皮肤等等的液体制备物,或通过密度梯度离心获 得的细胞提取物或分泌物和细胞悬液等等,和环境样品例如土壤、水 或食物样品。这样的样品可以以原样使用,或者它们可以接受多种纯 化、净化、过滤或浓缩方法。样品也可包括相对纯的或部分纯化的起 始材料,例如通过其他的细胞或生物分子分离过程如免疫磁分离而获 得的半-纯制品。
[0131]而且,应该注意到,可应用根据本发明的方法分离和随后 释放亚细胞组分,例如线粒体和细胞核,以及大分子例如蛋白质和核 酸。待被分离的实体可以天然具有抗原性或可以是人工使之如此。
[0132]选择的靶可能是与更大的生物实体例如细胞的表面相结 合的特定结构的分子,例如肽、蛋白质、糖蛋白、脂质或碳水化合物 等等。其他的靶可能是生物物质,其包括肽、多肽、蛋白质、脂蛋白、 糖蛋白、核酸(DNA、RNA、PNA、适体)和核酸前体(核苷和核苷酸)、多 糖、脂质例如脂囊泡。在传统的链霉抗生物素/生物素系统中可检测的、 并且在本文中可用的典型的蛋白质,包括:细胞因子、激素、维生素 表面受体、半抗原、抗原、抗体、酶、生长因子、重组蛋白质、毒素 以及其片段和组合。
[0133]术语“细胞”在本文用来包括所有的原核(包括古细菌和 支原体)和真核细胞及其他实体,例如病毒和亚细胞组分,例如细胞器 (例如线粒体和细胞核)。因此,代表性的“细胞”包括所有类型的哺 乳动物和非哺乳动物的动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、 酵母细胞、原生动物、细菌、原生质体和病毒。
[0134]本发明的方法特别适合于细胞分离,特别是使用针对待被 分离的细胞的抗体正选择期望的细胞的过程中(与负选择方法相反,其 中负选择方法使用对不需要的细胞具有特异性的抗体,从而从细胞制 备物中除去不需要的细胞)。
[0135]在这样的正分离的方法中,使用包被有针对细胞表面配体 /抗原的抗体的固相,将期望的靶细胞类型从混合的细胞群中分离。抗 体携带修饰的生物素如DSB-X-生物素,并且通过与修饰的链霉抗生物 素如硝基链霉抗生物素的相互作用,连接到固相上。连接到固相可以 在与靶细胞结合之前或之后进行,借此固相和附着的细胞从存在的其 它细胞中分离。根据本发明的方法,通过温和地加入置换配体(例如, 游离生物素),固相结合的靶细胞从颗粒迅速地释放,从而留下携带修 饰的生物素化抗体的未受影响的、活细胞的正选择群。
[0136]本发明的一个吸引人的方面是:它开启了细胞连接的抗体 /配体的许多不同的后分离应用。释放的细胞继续携带它们的生物素化 抗体。修饰的生物素基团的存在,在多种研究或诊断过程中,进一步 促进链霉抗生物素或抗生物素蛋白相互作用。
[0137]通过加入例如用酶或荧光、化学发光放射性试剂标记的 链霉抗生物素,可以以高度灵敏性检测和量化分离的靶。缀合的链霉 抗生物素或抗生物素蛋白产物(具有荧光素、若丹明、蛋白或辣根过 氧化物酶)是商业可获得的。这样的标记将帮助在流式细胞术中检测分 离的细胞。细胞必须在释放溶液中洗涤一次,以除去游离生物素,然 后可以加入荧光染料缀合的链霉抗生物素,从而所有分离的细胞被标 记,并易于在荧光显微术或流式细胞术中检测(图2)。
[0138]连接到释放出来的细胞的生物素化抗体也可用于将蛋白 质递送入细胞,以进行下列的体外研究:A,吞噬作用;B,递送毒性 或代谢物质;或C,递送通过抗原呈递细胞(APC)上的MHC II/HLA复 合物降解和呈递的蛋白质/肽。
[0139](a)绿色荧光蛋白-标记的抗体可以在胞吞区室中示踪,或 可以使用FITC缀合的链霉抗生物素,其与DSB-X-标记的抗体结合。
[0140](b)DSB-X-标记的抗体可以与毒素缀合,以研究药物递送 入细胞中。
[0141](c)DSB-X-标记的抗体/DSB-X-蛋白可涉及细胞内化和降 解/加工,以及随后呈递用于特异性T细胞刺激的抗原肽。对于体内治 疗应用,通过递送T细胞表位的抗体靶向APC的概念已在Bogen等的 美国专利号6,294,654和Br ekke O.H.&Sandlie I.European BioPharmaceutical Review,Spring 2002中描述。典型的APC是B 细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。用于这样的APC的任何细胞 表面标记可用于靶向抗体。
[0142]在本发明的多个方面中所描述的概念的新颖性在于将体 外细胞分离和体外特定的T细胞刺激组合。当与用于T细胞扩增 (expansion)的CD3/CD28产品(Dynal Biotech AS Oslo Norway)结合使用时,特定的T细胞可以甚至进一步扩增。可以运用本 观念筛选和发现新的T细胞表位,以用于疫苗开发。
[0143]可以想象将抗原蛋白直接缀合到抗体,而不是如在上述两 个参考文献中描述的将它们遗传并入抗体。如果抗原蛋白本身是细胞 受体的配体,那么它可以在DSB-X-缀合之后,直接用于细胞分离(参 见图3)。
[0144]本发明的方面也可与细胞刺激和扩增一起应用(参见图 4)。
[0145]细胞结合的抗体展示DSB-部分,即在选择和释放后,它 们可以在溶液中或固体表面(例如磁珠)上结合链霉抗生物素。这可用 于帮助将两个或多个信号递送到细胞。例如应用抗-CD3分离,随后与 共刺激抗体/配体例如抗-CD28、抗-CD137或抗-NKG2D交联。这将使 能够控制和改变所涉及的分子的比率(例如抗-CD3-抗-CD28比率)的 非常具有灵活性的系统成为可能。
[0146]如果希望使分离的细胞不含任何抗体,则本发明的方法可 以与其他的释放原理——如在美国专利号5,429,927中描述的——相 结合。在那个文件中,发明人描述了通过使连接与二抗反应、从而切 割抗原/抗体连接的方法,其中所述二抗结合并破坏抗原和抗体之间的 结合,因此释放抗原(参见实施例5)。
[0147]在释放结合对之后,即在释放修饰的生物素化抗体之后, 可以重复使用硝基-链霉抗生物素支持物。
[0148]在本发明优选的实施方案中,固相包括磁性颗粒,并且通 过磁性聚集从混合的细胞群中分离磁性颗粒和附着的细胞。
[0149]在使用磁性颗粒进行正分离细胞的许多现有技术方法中, 为了从颗粒释放细胞,将细胞/颗粒“莲座(rosettes)”在37℃下温 育过夜,以实现从颗粒分离细胞。在一些情况下,细胞与颗粒分开; 但是在很多情况下,它们没有分开,此类差的回收使分离低表现细胞 亚群变得困难。
[0150]本发明的方面涉及分离恶性细胞或对不同疾病特异的细 胞群的方法,并在不受其他污染细胞的干扰的情况下,进一步表征这 些细胞。同时,本方法可用于从一个个体或从一群个体分离防卫细胞 群;然后,在被返回给处于治疗中的患者之前,分离的群可进行扩增 和/或加强。这样的防卫细胞群可以是,例如单核细胞/巨噬细胞、淋 巴细胞或骨髓干细胞。
[0151]方法也可用于从患者分离和培养传染物例如细菌或病毒, 以便量化它们或表征它们的传染性、毒性或对药物治疗的敏感性。体 液,例如患者的血,可以与具有对病毒表面抗原特异的抗体的支持物 接触。如果通过修饰的链霉抗生物素将抗体与固体支持物交联,那么 使用温和的洗脱技术可释放结合的传染物,而对其没有损害。分离的 传染物最后通过活培养而鉴定。可以通过该技术分离的传染物包括慢 病毒、疟疾和传染性酵母。
[0152]在噬菌体文库技术中,结合配体(例如抗体、受体)被连接 到固体支持物例如微量滴定板。这通常通过生物素化配体和随后通过 链霉抗生物素桥固定到板来完成。因此,通过使用本发明的修饰的链 霉抗生物素,可以通过温和的加入生物素从微量滴定板释放高亲和力 噬菌体,连同修饰的生物素化配体。然后,回收的与噬菌体结合的高 亲和力的肽,可通过随后感染细菌和通过建立的噬菌体文库方法来富 集。
[0153]本方法可用于其中的纯化方法包括传统用于分离细胞、核 酸、蛋白质及其他生物物质、有机化合物等等的那些方法。本发明的 方法也可用于除去固定化酶,因此产生可逆的酶反应剂;和用于将细 胞固定到柱材料,因此产生基于细胞的反应系统。本方法也可用于分 离,然后洗脱抗原/抗体-复合物,以用于进一步的下游分析,如质谱 法。在高通量筛选中的应用也是适当的。
[0154]本发明的另一个实施方案关注于涉及核酸的方法。这样的 方法包括纯化、基于DNA的分析、测序、体外扩增等。通过应用修饰 的生物素/修饰的链霉抗生物素复合物,核酸可以可逆地固定到固相。 这与涉及生物素/链霉抗生物素结合的传统方法——其中生物素化链 保持固定在固相上——相反。本方法一个优选的应用是在再生用于 DNA分析的探针的方法中。固定的核酸可以是单链的或双链的,并且 其可包括克隆序列或随机序列。使用本领域已知的方法,容易地制备 生物素化核酸。
[0155]本文描述的连接和释放系统中涉及的所有参数可根据待 被分离的靶/细胞类型、使用的配体系统或抗原/抗体、使用的修饰的 生物素和链霉抗生物素以及使用的固相的类型如磁珠的大小而改变。 对于任何给定的靶和使用的结合对,本领域技术人员可容易地确定所 有使用条件。
[0156]用于置换的条件可适当改变。使连接与置换配体例如游离 生物素(或其片段)“反应”的步骤,可以以任何方便的或期望的方式 进行。包含连接的“反应混合物”或样品——方便地在水性介质中— —可以简单地接触置换配体,例如可简单地将置换配体加入到样品中, 并在适当条件下,使反应混合物停留一段时间间隔,以使置换配体结 合,然后可以分离连接的一种或两种组分。
[0157]当然,最佳切割所需要的置换配体的数量根据结合的实 体、它们的比率和实体例如需要分离的细胞的数或量而变化,并且可 以根据需要容易地确定。
[0158]例如,在上述的正细胞分离的情况中,磁性颗粒与靶细胞 的比率在不同的系统中和根据不同的应用而改变,因此,需要不同的 数量的置换配体以从颗粒分开细胞。实例浓度可以是1mM、5mM或10 mM。在大约0.1到10mM、优选2到5mM范围内的游离生物素的浓度 已被发现是有效的。
[0159]用于分开的条件也可适当改变。典型地,对于非吞噬细胞, 与游离生物素的温育在大约0℃(上)到37℃的范围内、优选室温下 的温度下是有效的。吞噬细胞必须在0℃(冰上)到2-8℃(冷室)温育。
[0160]温育时间根据使用的温度、材料和浓度而改变,并且对于 任何给定组的条件,其可由本领域技术人员容易地确定。对于用户而 言,短的温育时间是吸引人的。典型地,温育时间的范围为大约2到 大约30分钟,优选地大约5到10分钟。
[0161]因此,对于具有仍旧附着的生物素化配体的细胞,可将悬 浮在适当的培养基中的莲座细胞简单地与2到5mM的游离生物素在周 围温度下温育5到10分钟,以从生物素结合固体支持物释放。
[0162]在一些情况中,可能希望例如通过温和的搅拌或混合例如 吹吸,以帮助破坏通过置换配体结合而变得不稳定的连接,从而帮助 反转连接。通过在提供温和倾斜和旋转的仪器上温育,获得最好的结 果。
[0163]该反转抗体-靶配体连接的更广泛方法的优点是明显的, 并且包括更方便、耗费较少时间和努力来开发并因此更具有成本效益 的益处。同样,本发明的方法在既不导致连接中涉及的抗体或靶配体 组分的活性的破坏或损失、又不影响涉及的任何细胞的生命或天然状 态的非常温和的/柔和的条件下进行。本发明方法的另一个优点是留在 细胞表面上的生物素化配体可以立即用于下游的应用。
[0164]试剂盒
[0165]本发明可选的实施方案涉及试剂盒。试剂盒可以包含固体 支持物、配体和置换试剂。固体支持物通常可以是任何固体支持物。 例如,固体支持物可以是微粒或磁性颗粒。固体支持物可以进一步包 括至少一种修饰的链霉抗生物素例如硝基链霉抗生物素。配体可以针 对携带修饰的生物素优选脱硫生物素或甚至更优选DSB-X-生物素的 特定靶。配体可以与固体支持物上的修饰的链霉抗生物素结合。置换 试剂通常可以是足以从固体支持物置换配体的任何材料。例如,置换 试剂可以是生物素。
[0166]试剂盒可选地包括用于用修饰的生物素标记配体的试剂。
[0167]包括下列实施例来说明本发明的优选的实施方案。本领域 技术人员应理解,在随后的实施例中公开的技术代表本发明人(一个或 多个)发现的、在本发明实践中良好发挥功能的技术,因此其可以被认 为构成其实践的优选的模式。然而,根据本公开内容,本领域技术人 员理解,在公开的具体实施方案中可以进行许多变化,并仍然获得类 似或相似的结果,而没有背离本发明的范围。实施例
[0168]缩写
[0169]在实验中使用下列缩写:
[0170]BSA=牛血清白蛋白[017I]DSB=脱硫生物素
[0172]DMSO=二甲基亚砜
[0173]DPBS=Dulbecco′s PBS
[0174]Dynabeads-NSA=硝基-链霉抗生物素包被的Dynabeads
[0175]Dynabeads-SA=链霉抗生物素包被的Dynabeads
[0176]FCS=胎牛血清
[0177]EDC/NHS=1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺氢氯 化物/N-羟基琥珀酰亚胺
[0178]PBS=磷酸盐缓冲盐溶液
[0179]RT=室温
[0180]RU=相对单位(RU)
[0181]实施例1:脱硫生物素-X/链霉抗生物素(DSB-X/SA)相互 作用的BiaCore数据
[0182]材料和方法
[0183]1.固定化方法:
[0184]通过使用BiaCore的Amine Coupling Kit,激活CM5芯 片(BiaCore AB,Uppsa la,Sweden),以结合配体例如链 霉抗生物素或CaptAvidin。该方法遵循制造商所提供的方法。简言之, 将EDC/NHS暴露于CM5芯片,以5μl/分钟流动7分钟。然后,将配 体暴露于激活的CM5表面,以5μl/分钟流动7分钟。用乙醇胺灭活 过量的反应基团,以5μl/分钟流动7分钟。配体的RU的量级介于4000 -19000RU之间。
[0185]2.分析物的结合:
[0186]将具有共价结合的配体(重组核心链霉抗生物素或 CaptAvidin(硝基抗生物素蛋白))的CM5芯片暴露于分析物(生物素化 或DSB-XTM生物素化的抗体),所述分析物在50-400μg/ml的浓度下, 以5μl/分钟流动,直到达到分析物的饱和结合。分析物的RU的量级 介于1000-6000RU之间。
[0187]3.分析物的释放:
[0188]将具有共价结合的配体(链霉抗生物素或CaptAvidin)和 亲和结合的分析物(生物素化或DSB-X生物素化抗体)的CM5芯片暴露 于游离D-生物素,所述生物素在50μM-10mM的浓度下,以5μl/ 分钟流动。
[0189]4.分析:
[0190]在生物评估(Bioevaluation)程序中处理所有监控的数 据,以显现游离D-生物素与不同复合物链霉抗生物素-DSB-XTM生物素 化抗体、-DSB-XTM生物素化抗体和-生物素 化抗体的相互作用。
[0191]结果
[0192]表1示出观察的DSB-XTM生物素化抗体(DSB-XTM Ab)和生物 素化抗体对和链霉抗生物素的结合特性的比较。通过加 入10mM游离生物素当一半的结合分子释放时,测量出解离时间。
*根据文献
[0193]实施例2:硝化链霉抗生物素和偶联到Dynabeads的方法。
[0194]材料和方法
[0195]1.制备硝基-链霉抗生物素
[0196]25℃下,用60mM四硝基甲烷处理链霉抗生物素(50mg, 在5ml的50mM Tris缓冲液中,pH 8.5)2小时。由NAPTM-25柱(GE Healthcare Life Sciences)纯化硝基-链霉抗生物素。
[0197]2.制备硝基-链霉抗生物素珠
[0198]用0.1M磷酸盐缓冲液,pH 7.4(3X3ml)洗涤100mg M-280 Tosylactivated,并将其重悬于1.8ml 0.1M、 pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。加入200μl硝基-链霉抗生物素(PBS中, 10mg/ml),然后将0.1M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液中的1ml 3M(NH4)2SO4 加入到珠中。37℃下,在滚筒上16小时后,用pH4.0的3ml 50mM 柠檬酸/磷酸盐缓冲液洗涤珠,并将其重悬于3ml中。加入100μl 生物素(DMSO中10mg/ml)以封闭未修饰的生物素结合位点。30分钟 后,用pH 10的3ml 50mM碳酸盐缓冲液洗涤珠以释放与修饰的结合 位点结合的任何生物素。将珠储存在PBS、0.1%BSA缓冲液中。
[0199]处理和/或细胞的一般程序
[0200]1.洗涤Dynabeads:
[0201]1.将期望数量的珠转移到适当的管
[0202]2.用洗涤缓冲液填充3/4管,混合至均匀(例如旋转-混 合/涡旋)
[0203]3.将管置入磁体
[0204]4.除去上清液
[0205]5.在洗涤-缓冲液中重悬至初始体积(10mg珠/ml)
[0206]2.细胞牵引(cell pulling)和释放
[0207]1.将107细胞/ml的1ml细胞加入到适当的管内
[0208]2.加入0.75mg的Dynabeads
[0209]3.混合至均匀(例如旋转-混合/涡旋)
[0210]4.在具有倾斜和旋转运动的仪器上在2-8℃下,温育15 分钟
[0211]5.温和混合
[0212]6.将管置入磁体(Dynal MPC)
[0213]7.收集上清液(将来自每一洗涤周期的组合)
[0214]8.从磁体移出管
[0215]9.加1ml洗涤缓冲液,并混合至均匀(例如旋转-混合/ 涡旋)
[0216]10.重复步骤6-9一次
[0217]11.重复步骤6-8一次
[0218]12.加入0.5m l释放缓冲液(PBS中的5mM d-生物素)
[0219]13.混合至均匀(例如旋转-混合/涡旋)
[0220]14.在具有倾斜和旋转运动的仪器上在室温下,温育10 分钟
[0221]15.混合至均匀(例如旋转-混合/涡旋)
[0222]16.将管置入磁体
[0223]17.收集上清液(将来自每一释放周期的组合)
[0224]18.从磁体移出管
[0225]19.加入0.5ml释放缓冲液,并混合至均匀(例如吹吸)
[0226]20.重复步骤16-17一次
[0227]实施例3:用于不同细胞分离过程中的方法,如在图1中 所示。
[0228]材料和方法
[0229]使用的抗体是小鼠抗-CD45抗体——克隆EOl、DSB-标记 或没有标记,和人抗-小鼠IgG抗体——克隆HAM6、DSB-标记的。
[0230]I)培养和洗涤细胞:
[0231]1.在含10%FCS和1%丙酮酸钠的RPMI 1640中以 0.3-0.5x106细胞/ml培养Daudi细胞。使用前24小时分开。
[0232]2.在洗涤缓冲液(DPBS,0.1%BSA和2mM EDTA)中洗 涤细胞。在2-8℃、300xg下离心8分钟。以107-108细胞/ml重 悬于洗涤缓冲液中。
[0233]II)用抗体敏化细胞:
[0234]1.将每106个细胞0.5μg抗体(抗-CD45抗体,DSB-标 记或没有标记)加入到107-108细胞/ml的洗涤细胞中
[0235]2.在2-8℃下温育10-15分钟(或在冰上温育30-45分钟)
[0236]通过加入10x过量体积的洗涤缓冲液洗涤细胞1次,在 2-8℃、300xg下离心8分钟。在洗涤缓冲液中以107-108细胞/ml 重悬细胞。
[0237]3.可选的:通过以2∶1的比率同时加入DSB-标记的人抗 小鼠IgG和抗-CD45,用“双层抗体复合物”敏化细胞。
[0238]III)洗涤Dynabeads:
[0239]根据一般程序进行该洗涤。
[0240]IV)偶联Dynabeads和抗体:
[0241]1.将每毫克偶联有硝基-链霉抗生物素的Dynabeads 3 μg DSB-标记的抗体(人抗-小鼠IgG抗体或抗-CD45抗体)加入到10mg 珠/ml的经洗涤的珠中。
[0242]2.室温下温育10-20分钟。
[0243]3.用洗涤缓冲液填充3/4管,混合至均匀(例如旋转-混 合/涡旋)
[0244]4.将管置入磁体
[0245]5.除去上清液
[0246]6.重复步骤3-5两次
[0247]7.在洗涤-缓冲液中重悬至初始体积
[0248]可选的:通过以1∶2的比率同时加入DSB-标记的人抗小 鼠IgG抗体和抗-CD45抗体,将珠与“双层抗体复合物”偶联。
[0249]V)细胞牵引和释放:
[0250]根据一般程序进行该步骤。
[0251]全部的方案
[0252]方法A:组合洗涤的细胞(I)和与DSB-抗-CD45抗体偶联 的Dynabeads-NSA(IV)。
[0253]方法B:组合用DSB-抗-CD45抗体敏化的细胞(II)和洗涤 的Dynabeads-NSA(III)。
[0254]方法C:组合洗涤的细胞(I)和与“双层抗体复合物”偶 联的Dynabeads-NSA(IV)(DSB-标记的人抗-小鼠IgG抗体和抗-CD45 抗体)。
[0255]方法D:组合用“双层抗体复合物”敏化的细胞(II)(DSB- 标记的人抗-小鼠IgG和抗CD45)和洗涤的Dynabeads-NSA(III)。
[0256]方法E:组合用抗-CD45-抗体敏化的细胞和偶联有DSB- 人抗-小鼠IgG抗体的Dynabeads
[0257]通过下列方程计算分离的细胞的百分比:
[0258]100%*(加入用于牵引的细胞数量-在组合洗涤溶液中的 细胞数量)/加入用于牵引的细胞数量
[0259]通过下列方程计算释放的细胞的百分比:
[0260]100%*在组合释放溶液中的细胞数量/(加入用于牵引的细 胞数量-在组合洗涤溶液中的细胞数量)
[0261]通过下列方程计算细胞得率百分比:
[0262]100%*在组合释放溶液中的细胞数量/加入用于牵引的细 胞数量
[0263]其中:
[0264]加入用于牵引的细胞数量来自一般程序第2部分细胞牵 引和释放的步骤1
[0265]在组合洗涤溶液中的细胞数量来自一般程序第2部分细 胞牵引和释放的步骤7
[0266]在组合释放溶液中的细胞数量来自一般程序第2部分细 胞牵引和释放的步骤17。
[0267]结果在表2中示出
[0268]实施例4:细胞刺激和扩增的方法
[0269]材料和方法
[0270]I)分离外周血单核细胞(PBMC):
[0271]1.按照密度梯度培养基制造商的说明书。
[0272]2.在洗涤缓冲液(DPBS 0.1%BSA和2mM EDTA)中洗涤 细胞。在2-8℃、300xg下离心8分钟。在洗涤缓冲液中以107-108 细胞/ml重悬细胞。
[0273]II)用抗体敏化细胞:
[0274]1.将每106个靶细胞0.5μg DSB-标记的抗体(抗-CD3 抗体,克隆SpvT3b)加入到107-108个细胞/ml的洗涤的PBMC中
[0275]2.在2-8℃下温育10-15分钟(或在冰上温育30-45分钟)
[0276]3.通过加入10x过量体积的洗涤缓冲液洗涤细胞一次, 在2-8℃、300xg下离心8分钟。在洗涤缓冲液中以107-108个细 胞/ml重悬细胞。
[0277]III)洗涤Dynabeads:
[0278]根据一般程序进行该步骤。
[0279]IV)细胞牵引和释放:
[0280]根据一般程序进行该步骤。
[0281]V)细胞刺激
[0282]1.将10x过量的X-Vivo 15加入到释放的细胞(在IV 中步骤17)。在2-8℃、300xg下离心8分钟。以106个细胞/ml在 X-Vivo 15中重悬细胞。
[0283]2.将105个细胞(100μl悬浮液)加入到96-孔U-底板
[0284]3.在X-Vivo 15中稀释生物素-抗-CD28抗体(克隆L2/93) 至0.0013mg/ml
[0285]4.将稀释的抗体加入到96-孔板的细胞中:0-0.026μ g/孔(0-20μl悬浮液)
[0286]5.在X-Vivo 15中,稀释洗涤的(III)Dynabeads M-280 链霉抗生物素至4x106珠/ml(10mg/ml=6.8x108珠/ml)
[0287]6.将稀释的珠加入到96-孔板的细胞中:2x105-2x106珠/ 孔(5-50μl悬浮液)。
[0288]7.加入X-Vivo 15至200μl/孔的总体积
[0289]8.37℃下,在CO2-培养箱中温育48小时
[0290]9.用20μl的3H-胸苷(5μCi/ml终浓度)脉冲24小时。
[0291]10.收获并计数。
[0292]结果在图5中示出。该图示出在用DSB-连接的-抗-CD3 和NSA-珠分离CD3+T细胞、用M-280SA和生物素-抗-CD28 刺激后,CD3+T细胞的增殖。在刺激3天后脉冲,在4天后收获,如 在实施例4中所述。
[0293]实施例5:双分离的方法
[0294]材料和方法
[0295]使用Dynabeads-NSA牵引用抗-CD8-X-DSB(脱硫生物素-X 偶联的抗-CD8mAb,IgM)染色的细胞。
[0296]在2-8℃下,牵引细胞20分钟,5x107珠/ml和5x106细 胞/ml
[0297]3x洗涤
[0298]室温下,用1单位或0.5mM生物素或两者 的组合释放15分钟。
[0299]释放后,洗涤细胞一次,以除去
[0300]然后,在分离之前、耗尽之后和释放之后,用异硫氰酸荧 光素标记的抗-CD3(抗-CD3-FITC)和藻红蛋白标记的抗-CD8(抗 -CD8-PE)对细胞染色。
[0301]结果在图6中示出。该图示出分离之前(左上直方图)和用 Dynabeads-NSA+抗-CD8-X-DSB耗尽CD8+细胞之后(右上直方图)人单 核细胞的流动染色(抗-CD3-FITC对抗-CD8-PE)。使用 (左中直方图)、d-生物素(右中直方图)或 +d-生物素的组合(下面的直方图)从珠释放分离的细 胞。
[0302]讨论
[0303]在(最佳,室温下45分钟)和生物素(最佳 1mM以上)的次最佳条件下,进行释放,这给出次最佳的释放结果。 然而,两个不同释放机制间的协同作用(对同一结合实体)被观察到。 这表明″双分离″方法可能是吸引人的。
[0304]本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以根据本 公开内容通过有限次试验进行和实行。尽管本发明的组合物和方法已 经根据优选实施方案进行了描述,但是对本领域普通技术人员显而易 见的是可以对组合物和/或方法,以及本文描述的方法的步骤和步骤顺 序进行变化,而没有背离本发明的原理和范围。更具体地说,显然地, 化学和生理学都相关的某些试剂可以替换本文描述的试剂,但是仍达 到相同或相似的结果。对本领域普通技术人员显而易见的所有这些相 似的替代和修改被认为在本发明的范围和原理内。
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