대체 결합 표면을 가진 피브로넥틴 유형 III 반복체 기반의 단백질 스캐폴드

대체 결합 표면을 가진 피브로넥틴 유형 III 반복체 기반의 단백질 스캐폴드 {FIBRONECTIN TYPE III REPEAT BASED PROTEIN SCAFFOLDS WITH ALTERNATIVE BINDING SURFACES}

본 발명은 대체 결합 표면 설계를 가진 피브로넥틴 유형 III(FN3) 반복체를 기반으로 하는 단백질 스캐폴드 및 스캐폴드 라이브러리에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 선택된 베타-스트랜드 및 루프에 의해 형성된 요면(concave) 결합 부위를 갖는 FN3 스캐폴드 및 라이브러리에 관한 것이다.

단클론 항체는 표적 분자에 대한 높은 친화성 및 특이성이 요망될 때 가장 널리 사용되는 치료 단백질 부류이다. 그러나, 단백질 스캐폴드라고 통상적으로 지칭되는, 목적하는 표적 분자에 결합하도록 조작될 수 있는 상대적으로 정의된 3-차원 구조를 갖는 비-항체 단백질은, 그들의 작은 크기, 다이설파이드 결합의 결여, 높은 안정성, 및 원핵 숙주에서 발현되는 능력으로 인해, 전통적인 항체에 비해 이점을 가질 수 있다. 이들 스캐폴드는 전형적으로 특이적 또는 무작위 서열 변이가 일어나기 쉬운 하나 이상의 영역을 함유하는데, 종종 이러한 서열 무작위화를 실행하여 단백질의 라이브러리를 제조하며, 이로부터 목적 산물을 선택할 수 있다. 신규의 정제 방법이 용이하게 적용되며; 스캐폴드는 약물/독물에 용이하게 접합되고, 조직 내에 효율적으로 침투하며 다중 특이적 바인더(binder)로 체제화될 수 있다(문헌[Binz and Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-469, 2005, Skerra, J Mol Recognit, 13, 167-187, 2000]).

이러한 하나의 단백질 스캐폴드는, 7개의 베타 스트랜드에 의해 연결된 6개의 루프를 가진 특징적인 3차 구조를 갖는, 다량의 단백질에서 동정된 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인이다. 특히 3개의 루프, FG, BC, 및 DE 루프는 항체의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)와 구조적으로 유사하다. 이들 루프를 무작위화하여 FN3 도메인 스캐폴드의 라이브러리를 생성시킴으로써, 중요한 생물물리학적 특성을 유지하면서 다수의 상이한 표적에 대한 특이적 바인더를 성공적으로 선택하였다(문헌[Getmanova et al., Chem Biol, 13, 549-556, 2006], 문헌[Hackel et al., J Mol Biol, 381, 1238-1252, 2008], 문헌[Karatan et al., Chem Biol, 11, 835-844, 2004]; 문헌[Koide et al., J Mol Biol, 284, 1141-1151, 1998]; 문헌[Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007]; 문헌[Parker et al., Protein Eng Des Sel, -18, 435-444, 2005]; 문헌[Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933-942, 2002]). AB, EF, 및 CD 루프 또한 무작위화함으로써 FN3 도메인의 라이브러리를 생성시켰다(미국 특허 공개 제2011/0038866호; 국제 특허 공개 제WO2011/05133호; 미국 특허 공개 제 2011/0124527호). FN3 라이브러리에 대한 다른 참고문헌은 국제 특허 공개 제WO2002/32925호, 제WO2003/104418호, 제WO2009/023184호, 및 제WO2010/060095호를 포함한다. 국제 특허 공개 제WO2012/016245호에는 베타-시트의 표면 노출된 잔기와 함께 CD 및 FG 루프를 사용하는 FN3 도메인 라이브러리가 기재되어 있다.

치료적 목적 및 진단적 목적 양자 모두를 위한 개선된 피브로넥틴 도메인 스캐폴드 단백질을 얻는 것이 유리할 것이다. 본 개시는 이러한 개선된 단백질을 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태는, 서열 번호 27의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 기준(reference) 피브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인 폴리펩티드를 제공하는 단계; 하나 이상의 C 베타-스트랜드 잔기 및 하나 이상의 F 베타-스트랜드 잔기를 돌연변이화함으로써 기준 FN3 도메인 폴리펩티드 내로 다양성을 도입하여 다양화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 갖는 FN3 도메인 라이브러리를 형성시키는 단계를 포함하는, C 베타-스트랜드, CD 루프, F 베타-스트랜드, 및 FG 루프에 의해 형성된 다양화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 갖는 FN3 도메인의 라이브러리의 제조 방법이다.

본 발명의 다른 태양은, 본 명세서에 기재된 발명의 방법에 의해 제조된 라이브러리이다.

본 발명의 또 다른 태양은, 제11항의 라이브러리를 표적 분자와 접촉시키거나 선별하는 단계, 및 사전 정의된 친화성으로 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 스캐폴드를 단리하는 단계를 포함하는, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 다양화된 C-CD-F-FG 대체물을 갖는 피브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 얻는 방법이다.

<도 1>
도 1은 FN3 도메인 및 항체 VH 도메인 구조의 리본 다이어그램을 나타낸다. CDR과 구조적으로 유사한 FN3 도메인의 루프는 표지되어 있다.
<도 2>
도 2는 A) 무작위화된 루프를 가진 관용적인 FN3 라이브러리(도 2a); B) 무작위화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 가진 FN3 라이브러리(TCL14 라이브러리)(도 2b); C) 무작위화된 A-AB-B-BC-E 표면을 가진 FN3 라이브러리(TCL15 라이브러리)(도 2c) 사이의 비교를 가능하게 하는 구조적 다이어그램을 나타낸다. 이들 라이브러리 설계에서 무작위화된 위치는 리본 다이어그램 내의 흑색으로 채워진 부분(solid black)으로서 도시되어 있다.
<도 3>
도 3은 텐콘(Tencon)27 스캐폴드(서열 번호 27) 및 무작위화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 갖는 TCL14 라이브러리(서열 번호 28)의 서열 정렬을 나타낸다. 루프 잔기는 박스로 표시되어 있다. 특정 루프 및 베타-스트랜드 영역은 서열 위에 표시되어 있다.
<도 4>
도 4는 텐콘27 스캐폴드(서열 번호 27) 및 무작위화된 A-AB-B-BC-E 대체 표면을 갖는 TCL15 라이브러리(서열 번호 61)의 서열 정렬을 나타낸다. 루프 잔기는 박스로 표시되어 있다. 특정 루프 및 베타-스트랜드 영역은 서열 위에 표시되어 있다.
<도 5>
도 5는 무작위화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 가진 텐콘27(서열 번호 27)에 대한 라이브러리 설계의 토폴로지(topology) 다이어그램을 나타낸다(TCN14 라이브러리). 베타-스트랜드는 화살표로 도시되어 있으며, 텐콘27 구조 내에서 서로에 수소결합되는 스트랜드의 잔기는 플롯 내에서 인접하여 위치한다. 무작위화된 잔기의 위치는 회색으로 음영 처리된 타원으로 도시되어 있다.
<도 6>
도 6은 무작위화된 A-AB-B-BC-E 대체 표면을 가진 텐콘27(서열 번호 27)에 대한 라이브러리 설계의 토폴로지 다이어그램을 나타낸다(TCL15 라이브러리). 베타-스트랜드는 화살표로 도시되어 있으며, 텐콘 구조 내에서 서로에 수소결합되는 스트랜드의 잔기는 플롯 내에서 인접하여 위치한다. 무작위화된 잔기의 위치는 회색으로 음영 처리된 타원으로 도시되어 있다.
<도 7>
도 7은 TCL14 라이브러리 내의 무작위화된 위치에서의 예상 아미노산 분포 및 관찰 아미노산 분포를 나타낸다.
<도 8>
도 8은 무작위화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 가진 텐콘27, TCL14, 및 FN10, TN3, 및 피브콘(Fibcon)에 대해 설계된 라이브러리의 서열 정렬을 나타낸다. 잔기 번호화는 텐콘27 서열을 기반으로 한다. 라이브러리의 아미노산 서열은 각각 서열 번호 28, 98, 99, 및 62에 나타낸다. 루프 잔기는 박스로 표시되어 있다. 특정 루프 및 베타-스트랜드 영역은 서열 위에 표시되어 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "피브로넥틴 유형 III 모듈(FN3) 도메인" 또는 "FN3 도메인"은, 피브로넥틴, 테나신, 세포내 세포골격 단백질, 사이토카인 수용체, 및 원핵생물 효소를 포함하는 단백질에서 자주 나타나는 도메인을 지칭한다(문헌[Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89, 8990-8994, 1992]; 문헌[Meinke et al., J Bacteriol 175, 1910-1918, 1993]; 문헌[Watanabe et al., J Biol Chem 265, 15659-15665, 1990]). 예시적인 FN3 도메인(또는 모듈)은 인간 테나신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인 및 인간 피브로넥틴(FN)에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인이다. 개별적인 FN3 도메인은 도메인 번호 및 단백질 명칭(예를 들어, 테나신의 제3 FN3 도메인(TN3), 또는 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인(FN10))에 의해 지칭된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "기준 FN3 도메인"은, 주형으로 사용되는 야생형 또는 비-천연 발생적 FN3 도메인을 지칭하며, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 스캐폴드를 생성시키기 위해 그 안에 치환을 실행한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대체 표면"은, 2개 이상의 베타 스트랜드, 및 하나 이상의 루프를 포함하는 FN3 도메인의 측면 상의 표면을 지칭한다. 예시적인 대체 표면은, C 및 F 베타-스트랜드 및 CD 및 FG 루프 내의 아미노산에 의해 형성되는 C-CD-F-FG 표면, 및 A, B, 및 E 베타-스트랜드 및 BC 루프 내의 아미노산에 의해 형성되는 A-AB-B-BC-E 표면이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치환하는" 또는 "치환된" 또는 '돌연변이화하는" 또는 "돌연변이화된"은, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 그 서열의 변종을 생성시키기 위해 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 변경, 결실, 또는 삽입하는 단계를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "무작위화하는" 또는 "무작위화된" 또는 "다양화된" 또는 "다양화하는"은, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내에 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실을 실행하는 단계를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변종"은, 하나 이상의 개질, 예를 들어, 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 기준 폴리펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적 결합"은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정할 때, 본 발명의 FN3 도메인이 1x10 ^-6 M 이상의 친화성(Kd)으로 표적 분자에 결합하고/하거나, 비특이적 항원(예를 들어, BSA 또는 카세인)에 대한 그의 친화성보다 10배 이상 더 큰 친화성으로 표적 분자에 결합하는 능력을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 분자"는, 본 발명의 FN3 도메인에 의해 인식되는 항원 또는 에피토프를 갖는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 등을 지칭한다. 표적 분자는 천연 발생적 또는 비-천연 발생적일 수 있다.

용어 "라이브러리"는 변종의 수집을 지칭한다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 변종으로 구성될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "테나신 C"는, 젠뱅크(GenBank) 등록 번호 NP_002151 및 서열 번호 57에 나타낸 서열을 갖는 인간 테나신 C를 지칭한다. 테나신 C는 각각 서열 번호 1 내지 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 15개의 탠덤 FN3 도메인을 갖는다. 테나신 C의 제3 FN3 도메인(TN3)의 아미노산 서열은 서열 번호 3에 나타낸다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성"은, 분자가 그의 정상적 작용 활성(예를 들어, 표적 분자에 대한 결합) 중 하나 이상을 유지하도록, 생리학적 조건 하에서 접힌 상태를 유지하는 분자의 능력을 지칭한다.

본 발명은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 제공하며, 따라서 치료적 응용 및 진단적 응용에 널리 사용될 수 있다. 본 발명은, 2개 이상의 베타-스트랜드 및 하나 이상의 루프를 포함하는 FN3 도메인의 측면 상의 대체 표면을 무작위화하여 고친화성으로 표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 스캐폴드를 생성시키고 선택할 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 공개된 FN3-기반의 도메인 라이브러리는, 항체 가변 사슬 내의 CDR을 구조적으로 닮은 영역인 상부 또는 하부 루프를 다양화하여 곡면화된 결합 표면을 제공함으로써 생성되었다. 본 발명에서는, 대체 표면을 무작위화함으로써 생성된 요면 상호작용 표면을 나타내는 FN3 도메인 라이브러리로부터 고친화성 결합 분자를 선택하며; 따라서 고친화성 결합 단백질 스캐폴드를 선택할 수 있는 에피토프 및 표적의 수를 증가시킬 가능성이 있다. 본 발명은 단백질 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 그들의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 FN3 도메인의 라이브러리의 제조 방법, 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 라이브러리를 제공한다.

피브로넥틴 유형 III 도메인

피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인(또는 모듈)은, 피브로넥틴에서 처음 동정되었고 지금은 세포 표면 수용체, 세포외 매트릭스 단백질, 효소, 및 근육 단백질을 포함하는 다양한 동물 단백질 패밀리에 존재하는 것으로 알려진 원형 반복체 도메인(prototypic repeat domain)이다. 구조적으로 FN3 도메인은, 다이설파이드 결합의 결여를 제외하고는, 면역글로불린-유사 도메인의 것과 매우 유사한 토폴로지를 갖는다. 당업계에 공지된 바와 같이, 천연 발생적 FN3 도메인은 6개의 루프(AB, BC, CD, DE, EF, 및 FG 루프라고 지칭됨)에 의해 연결된 7개의 베타-스트랜드(A, B, C, D, E, F, 및 G라고 지칭됨)를 갖는 베타-샌드위치(beta-sandwich) 구조를 갖는다(문헌[Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89, 8990-8992, 1992]; 미국 특허 제6,673,901호). 3개 루프(BC, DE, 및 FG 루프)는 FN3 도메인의 상부에 있고, 3개(AB, CD, 및 EF 루프)는 도메인의 하부에 있다(도 1). 표 1은 몇몇 FN3 도메인 함유 단백질, 및 각각의 단백질과 연계된 상이한 FN3 도메인의 수를 나타낸다. FN3 도메인 입체 형태는 고도로 보존되어 있지만, 아미노산 수준에서 상이한 도메인들 사이의 유사성은 상당히 낮다.

FN3 도메인은 천연 발생적이거나 비-천연 발생적일 수 있다. 예시적인 비-천연 발생적 FN3 도메인은 소정 단백질 내에 존재하는 선택된 FN3 도메인의 정렬을 기반으로 하여 설계된 컨센서스(consensus) FN3 도메인이며, 각각의 위치에 가장 많이 보존된(빈도가 높은) 아미노산을 혼입시켜 비-천연 발생적 FN3 도메인을 생성시킨다. 예를 들어, 인간 테나신 C로부터의 15개 FN3 도메인의 컨센서스 서열을 기반으로 하거나, 인간 피브로넥틴으로부터의 15개 FN3 도메인의 컨센서스 서열을 기반으로 하여 비-천연 발생적 FN3 도메인을 설계한다. 이들 비-천연 발생적 FN3 도메인은 FN3 도메인의 전형적인 토폴로지를 유지하며, 야생형 FN3 도메인에 비교할 때 개선된 안정성과 같은 개선된 특성을 나타낼 수 있다. 예시적인 비-천연 발생적 FN3 도메인은 각각 서열 번호 16 및 58에 나타낸 텐콘 및 피브콘 도메인이며, 미국 특허 공개 제2010/0216708호 및 미국 특허 공개 제2010/0255056호에 기재되어 있다.

FN3 스캐폴드 텐콘27(서열 번호 27)의 경우에 각각의 루프 및 각각의 베타-스트랜드를 정의하는 아미노산 잔기를 표 2에 나타낸다. 테나신 C 제3 FN3 도메인(TN3)(서열 번호 3) 및 피브콘(서열 번호 58) 내의 각각의 루프 및 베타-스트랜드의 위치는 텐콘27의 것과 동일하다. 주지의 방법을 사용하여, 예를 들어, x-선 회절, 핵자기 공명, 또는 분자 모델링에 의해 생성되는 3-차원 구조의 분석에 의해, 베타-스트랜드 잔기를 동정할 수 있다. 모델이 이용가능하지 않은 경우, 다른 공지의 FN3 분자와의 서열 정렬의 분석을 사용하여 스트랜드 및 루프 영역의 경계를 예측할 수 있다. 최종적으로, 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 단백질 1차 서열로부터 베타 스트랜드의 존재를 예측할 수 있다.

FN3 도메인 상의 대체 표면

상부(BC, DE, 및 FG) 및 하부(AB, CD, 및 EF) 루프, 예를 들어, FN3 도메인 내의 보고된 결합 표면은 FN3 구조의 중심을 형성하는 베타-스트랜드에 의해 분리된다(도 1, 2a). 루프 단독에 의해 형성된 표면과는 상이한 형상을 갖는 FN3 도메인의 2개의 "측면" 상에 있는 대체 표면은 FN3 도메인 구조를 90 도 만큼 회전시킴으로써 가시화할 수 있다(도 2b, 2c). 2개의 역평행 베타-스트랜드, C 및 F 베타-스트랜드, 및 CD 및 FG 루프에 의해 FN3 도메인의 한쪽 측면에 약간의 요면 표면이 형성되며, 본 명세서에서는 이를 C-CD-F-FG 표면이라고 칭한다. A, B, 및 E 베타-스트랜드 및 AB 및 BC 루프에 의해 C-CD-F-FG 표면의 대향 측면에도 대체 표면이 형성되며, 본 명세서에서는 이를 A-AB-B-BC-E 표면이라고 칭한다.

FN3 도메인 내의 대체 표면은 각각의 FN3 도메인 내의 아미노산의 불연속 스트레치(non-contiguous stretch)에 의해 암호화된다. 예를 들어, 표 2에 나타낸 바와 같이, 텐콘27 C-CD-F-FG 표면은 서열 번호 27의 아미노산 잔기 29 내지 43 및 65 내지 81에 의해 형성되고, 텐콘27 A-AB-B-BC-E 표면은 서열 번호 27의 아미노산 잔기 1 내지 28 및 55 내지 59에 의해 형성된다.

대체 표면의 무작위화를 기반으로 하는 단백질 스캐폴드

본 발명의 일 실시 형태는, 대체 표면을 포함하는 FN3 도메인을 포함하는 단리된 단백질 스캐폴드이며, 여기서 대체 표면은 기준 FN3 도메인에 비교할 때 대체 표면을 형성하는 각각의 베타-스트랜드 및 각각의 루프 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 기준 FN3 도메인에 의해서는 특이적으로 결합되지 않는 표적 분자에 특이적으로 결합한다.

다른 실시 형태에서, 기준 FN3 도메인은 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 C 베타-스트랜드, CD 루프, F 베타-스트랜드, 및 FG 루프에 의해 형성된 C-CD-F-FG 대체 표면을 포함한다.

다른 실시 형태에서, C-CD-F-FG 대체 표면을 형성하는 C 베타-스트랜드, CD 루프, F 베타-스트랜드, 또는 FG 루프는 표 4 및 5 및 서열 번호 45 내지 48에 나타낸 바와 같은 소정 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시 형태에서는, C 베타-스트랜드가 1, 2, 3, 또는 4개 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 DSFLIQYQE(서열 번호 33)를 포함하거나, F 베타-스트랜드가 1, 2, 3, 4, 또는 5개 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 TEYTVSIYGV(서열 번호 39)를 포함하거나, C 베타-스트랜드 및 CD 루프가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 DSFLIQYQESEKVGE(서열 번호 42)를 포함하거나, F 베타-스트랜드 및 FG 루프가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 잔기에 치환을 갖는 아미노산 서열 TEYTVSIYGVKGGHRSN(서열 번호 43)을 포함한다.

다른 실시 형태에서는, C 베타-스트랜드 및 F 베타-스트랜드가 각각 서열 번호 33과 67% 이상 동일하고 서열 번호 39와 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, C 베타-스트랜드 및 CD 루프가 서열 번호 42와 53% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, F 베타-스트랜드 및 FG 루프가 서열 번호 43과 65% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 서열 번호 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 FN3 도메인을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는,

각각 잔기 1 내지 12, 13 내지 16, 17 내지 21, 22 내지 28, 44 내지 50, 51 내지 54, 55 내지 59, 60 내지 64, 및 82 내지 89에서 서열 번호 27과 동일한 아미노산 서열을 갖는 A 베타-스트랜드, AB 루프, B 베타-스트랜드, BC 루프, D 베타-스트랜드, DE 루프, E 베타-스트랜드, EF 루프, 및 G 베타-스트랜드;

서열 번호 42와 53% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 C 베타-스트랜드 및 CD 루프; 및

서열 번호 43과 65% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 F 베타-스트랜드 및 FG 루프를 포함하고, 서열 번호 27의 아미노산 잔기 11, 14, 17, 37, 46, 73, 또는 86에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 치환을 임의로 갖는 유형 III의 피브로넥틴 모듈(FN3) 도메인을 포함하며, 여기서 단백질 스캐폴드는 기준 FN3 도메인에 의해서는 특이적으로 결합되지 않는 표적 분자에 특이적으로 결합한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는, 서열 번호 27에 나타낸 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 FN3 도메인을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 A 베타-스트랜드, AB 루프, B 베타-스트랜드, BC 루프, 및 E 베타-스트랜드에 의해 형성된 A-AB-B-BC-E 대체 표면을 포함한다.

다른 실시 형태에서, A-AB-B-BC-E 대체 표면을 형성하는 A 베타-스트랜드, AB 루프, B 베타-스트랜드, 및 BC 루프는 표 4 및 5 및 서열 번호 49 및 50에 나타낸 바와 같은 소정 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시 형태에서, A 베타-스트랜드, AB 루프, B 베타-스트랜드, 및 BC 루프는 서열 번호 44와 59% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, E 베타-스트랜드는 서열 번호 37과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 서열 번호 61에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 FN3 도메인을 포함한다.

다른 실시 형태에서, 본 발명의 단리된 단백질 스캐폴드는,

각각 잔기 29 내지 37, 38 내지 43, 44 내지 50, 51 내지 54, 60 내지 64, 65 내지 74, 75 내지 81, 및 82 내지 89에서 서열 번호 27과 동일한 아미노산 서열을 갖는 C 베타-스트랜드, CD 루프, D 베타-스트랜드, DE 루프, EF 루프, F 베타-스트랜드, FG 루프, 및 G 베타-스트랜드;

서열 번호 44와 59% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 A 베타-스트랜드, AB 루프, B 베타-스트랜드, 및 BC 루프; 및

서열 번호 37과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 E 베타-스트랜드를 포함하고; 서열 번호 27의 아미노산 잔기 11, 14, 17, 37, 46, 73, 또는 86에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 치환을 임의로 갖는 FN3 도메인을 포함하며,

여기서 단백질 스캐폴드는 기준 FN3 도메인에 의해서는 특이적으로 결합되지 않는 표적 분자에 특이적으로 결합한다.

표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 대체 표면을 형성하는 잔기의 서브세트를 무작위화함으로써 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 대체 표면에 기여하는 각각의 베타-스트랜드 및 각각의 루프 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 잔기를 무작위화할 수 있다. 부가적인 잔기를 무작위화하여 라이브러리의 다양성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 대체 표면을 형성하는 각각의 베타-스트랜드 및 각각의 루프 내의 잔기의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 무작위화할 수 있다. 대안적으로, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 루프의 어느 잔기도 무작위화하지 않으면서 대체 표면에 기여하는 베타-스트랜드 내의 잔기의 서브세트를 무작위화함으로써 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 대체 표면에 기여하는 각각의 스트랜드 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 잔기를 무작위화할 수 있다. 베타-스트랜드 내에 있는 부가적인 잔기를 무작위화함으로써 라이브러리 다양성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 대체 표면을 형성하는 각각의 베타-스트랜드 내의 잔기의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 무작위화할 수 있다.

베타-스트랜드는, 하나 걸러서 잔기의 측쇄가 단백질의 표면에 노출된 반복 구조를 갖는다. 표면 노출된 측쇄는 3 차원 구조의 시험에 의해, 또는 다중 서열 정렬에 의해 공지 구조를 가진 FN3 도메인의 서열에 비교함으로써 결정된다. 대체 표면에 기여하는 베타-스트랜드 내의 표면 노출된 잔기의 서브세트 또는 전부를 선택하여 무작위화할 수 있다. 예를 들어, 텐콘27(서열 번호 27) C-CD-F-FG 대체 표면은 C 베타-스트랜드 내의 4개 표면 노출된 잔기(S30, L32, Q34, 및 Q36) 및 F 베타-스트랜드 내의 5개 표면 노출된 잔기(E66, T68, S70, Y72, 및 V74)를 갖는다(잔기 번호화는 서열 번호 27을 기반으로 함). 이들 잔기 중 하나 이상을 무작위화하여 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 대체 표면의 접합부에 있는 잔기, 예를 들어, S30, E66, 및 V74는 무작위화되거나 무작위화되지 않을 수 있다. 베타-스트랜드의 매몰 잔기의 무작위화는, 구조의 코어 내의 소수성 접촉의 상실로 인하여 스캐폴드의 불안정화를 유발할 수 있다. 아미노산의 서브세트만을 사용하도록, 예를 들어, 소수성 아미노산만을 사용하도록, 매몰 잔기를 무작위화할 수 있다.

대체 표면에 기여하는 루프 영역 내의 모든 잔기 또는 서브세트를 무작위화할 수 있다. 예를 들어, 대체 표면에 기여하는 CD 및/또는 FG 루프 내에서 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개 위치를 치환할 수 있다. 루프 내의 글리신 잔기, 예를 들어, 텐콘27 내의 G42, G76, 및/또는 G77은 유연성을 제공할 수 있으며, 무작위화되거나 무작위화되지 않을 수 있다. 베타-스트랜드/루프 경계에 있는 잔기, 예를 들어, 텐콘27 내의 E43은 무작위화되거나 무작위화되지 않을 수 있다. 베타-스트랜드 또는 루프 영역 내의 부가적인 잔기를 무작위화에 포함시키거나 무작위화로부터 배제할 수 있다. 예를 들어, 안정화에 필요한 것으로 보이는 잔기(예를 들어, FN3 도메인의 결정 구조의 분석을 기반으로 동정함)를 무작위화하거나 무작위화하지 않을 수 있다. 예를 들어, 텐콘27 내의 S80은 FN3 도메인 코어와 접촉을 이루어 FG 루프를 잠재적으로 안정화시키며, K75는 부분적으로 대체 표면으로부터 다른 쪽을 향한다. 따라서, 이들 잔기 양자 모두는 초기 라이브러리 설계로부터 배제될 수 있다. 무작위화된 C-CD-F-FG 표면을 갖는 예시적인 FN3 도메인 라이브러리에서, 무작위화될 수 있는 잔기는 서열 번호 27의 위치 30, 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 66, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 또는 81에 있는 잔기를 포함한다. 무작위화된 A-AB-B-BC-E 표면을 갖는 예시적인 FN3 도메인 라이브러리에서, 무작위화될 수 있는 잔기는 위치 6, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 55, 및 57에 있는 잔기를 포함한다.

루프에 있는 잔기의 삽입 및/또는 결실에 의해, 대체 표면에 기여하는 루프에서의 다양성을 달성할 수 있다. 예를 들어, FG 및/또는 CD 루프는 1 내지 22개 아미노산만큼 연장되거나, 1 내지 3개 아미노산만큼 감소될 수 있다. 텐콘27 내의 FG 루프의 길이는 7개 아미노산인 반면에, 항체 중쇄 내의 상응하는 루프는 4 내지 28개 잔기의 범위이다. 최대 다양성을 제공하기 위하여, 대체 표면에 기여하는 루프, 예를 들어, FG 루프를, 4 내지 28개 잔기의 항체 CDR3 길이 범위에 상응하도록 길이에 있어서 뿐 아니라 서열에 있어서도 다양화할 수 있다.

예를 들어, 안정성 개선, 면역원성 감소, 결합 친화성 증진, 결합 속도(on-rate), 해리 속도(off-rate), 반감기, 용해도, 또는 임의의 다른 적합한 특징을 목적으로, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 생성되는 FN3 도메인을 대체 표면 내부 또는 외부에 있는 잔기에서 추가로 개질할 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위한 한가지 방법에서는, 모 서열 및 조작 서열의 3-차원 모델을 사용하는 모 서열 및 다양한 개념 조작 산물(conceptual engineered product)의 분석 과정에 의해 스캐폴드 단백질을 임의로 제조할 수 있다. 3차원 모델이 통상 이용가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 묘사하고 디스플레이하여 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, 미국 캘리포니아주 몬로비아 소재의 젠코, 인크.(Xencor, Inc.)의 이뮤노필터(Immunofilter) 프로그램)이 입수가능하다. 이들 디스플레이의 조사는, 후보 서열의 작용에 있어서 잔기의 개연성 있는 역할의 분석을 가능하게 한다(예를 들어, 스캐폴드 단백질의 안정성 또는 후보 스캐폴드 단백질이 그의 표적 분자에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기). 이러한 방식으로, 목적하는 특징, 예를 들어, 개선된 스캐폴드 안정성이 달성되도록 모 서열 및 기준 서열로부터 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 대안적으로, 또는 상기 절차에 부가하여, 당업계에 공지된 바와 같은 다른 적합한 조작 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 FN3 도메인의 바람직한 물리적 특성은 높은 열 안정성 및 열 접힘(folding) 및 풀림(unfolding)의 가역성을 포함한다. 단백질 및 효소의 겉보기 열 안정성을 증가시키기 위하여 몇몇 방법이 적용되었으며, 이는 고도로 유사한 열안정성 서열들에 대한 비교를 기반으로 하는 합리적인 설계, 다이설파이드 가교체를 안정화하는 설계, 알파-나선 성향을 증가시키는 돌연변이, 염 가교체의 조작, 단백질의 표면 전하의 변경, 지향 진화, 및 컨센서스 서열들의 조합을 포함한다(문헌[Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001]). 높은 열 안정성은 발현 단백질의 수율을 증가시키고, 용해도 또는 활성을 개선하고, 면역원성을 감소시키고, 제조 중에 콜드 체인(cold chain)의 필요성을 최소화할 수 있다.

본 발명의 FN3 도메인의 임의의 특징을 개선하기 위해 치환될 수 있는 잔기는, 치환을 실행하고 스캐폴드의 목적하는 특징에 대해 분석함으로써 결정할 수 있다. 개선된 특징을 가진 예시적인 FN3 도메인-기반의 스캐폴드는 텐콘 스캐폴드(서열 번호 16) 또는 하나 이상의 아미노산 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 또는 86에서 개질된 텐콘27 스캐폴드(서열 번호 27)이다.

안정성 상실의 관점에서, 즉, 단백질의 "변성됨" 또는 "변성"은, 활성 및/또는 용해도의 상실을 수반하여, 단백질의 작용 특성을 부여하는 3-차원 입체 형태의 일부 또는 전부가 상실되는 과정을 의미한다. 변성 중에 붕괴되는 힘은 분자내 결합, 예를 들어, 정전기적, 소수성, 반 데르 발스 힘, 수소 결합, 및 다이설파이드를 포함한다. 단백질 변성은 단백질 또는 단백질을 포함하는 용액에 적용되는 힘, 예를 들어, 기계적 힘(예를 들어, 압축력 또는 전단력), 열적 응력, 삼투성 응력, pH의 변화, 전기장 또는 자기장, 이온화 방사, 자외선 방사, 및 탈수에 의해, 그리고 화학적 변성제에 의해 의해 야기될 수 있다.

단백질 안정성 및 단백질 불안정성의 측정은 단백질 완전성(integrity)의 동일하거나 상이한 양상이라고 볼 수 있다. 단백질은 열에 의해, 자외선 또는 이온화 방사, 액체 용액 내의 경우에는 주위 삼투압 및 pH의 변화, 작은 기공-크기 여과에 의해 부과되는 기계적 전단력, 자외선 방사, 이온화 방사, 예를 들어 감마 조사에 의해, 화학적 탈수 또는 열 탈수, 또는 단백질 구조 붕괴를 야기할 수 있는 임의의 다른 작용 또는 힘에 의해 야기되는 변성에 민감하거나 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 표준 방법을 사용하여, 분자의 ½ 이 풀리게 되는 섭씨 °(℃) 단위의 온도인 열적 융해("TM": thermal melting) 온도를 측정함으로써 분자의 안정성을 결정할 수 있다. 전형적으로, TM이 높을수록 분자가 더 안정하다. 열에 부가하여, 화학적 환경 또한 단백질이 특정 3 차원 구조를 유지하는 능력을 변화시킨다.

일 실시 형태에서 본 발명의 FN3 도메인은, TM의 증가에 의해 측정할 때, 조작 전의 동일한 도메인에 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 만큼 증가된 안정성을 나타낸다.

화학적 변성을 다양한 방법에 의해 마찬가지로 측정할 수 있다. 화학적 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 우레아, 아세톤, 유기 용매(DMF, 벤젠, 아세토니트릴), 염(암모늄 설페이트 리튬 브로마이드, 리튬 클로라이드, 소듐 브로마이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드); 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨, 베타-메르캅토에탄올, 다이니트로티오벤젠, 및 하이드라이드, 예를 들어, 소듐 보로하이드라이드), 비-이온성 및 이온성 세제, 산(예를 들어, 염산(HCl), 아세트산(CH ₃ COOH), 할로겐화 아세트산), 소수성 분자(예를 들어, 인지질), 및 표적화 변성제를 포함한다. 변성 정도의 정량화는 작용 특성, 예를 들어, 표적 분자에 결합하는 능력의 손실에 의존할 수 있거나, 물리화학적 특성, 예를 들어, 응집하는 경향, 이전에는 용매 접근불가능했던 잔기의 노출, 또는 다이설파이드 결합의 붕괴 또는 형성에 의한다.

일 실시 형태에서 본 발명의 스캐폴드는, 구아니디늄 하이드로클로라이드를 화학적 변성제로 사용함으로써 측정할 때, 조작 전의 동일한 스캐폴드에 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 만큼 증가된 안정성을 나타낸다. 증가된 안정성은, 주지의 방법을 사용하여 증가하는 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드로 처리시에 감소되는 트립토판 형광의 함수로서 측정할 수 있다.

본 명세서에 제공된 방법에 따라 임의의 FN3 도메인을 치환을 위한 주형으로 사용하여 본 발명의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 생성시킬 수 있다. 무작위화된 대체 표면을 갖는 예시적인 FN3 도메인은 테나신 C의 제3 FN3 도메인(TN3)(서열 번호 3), 텐콘(서열 번호 16), 텐콘27(서열 번호 27), 피브콘(서열 번호 58), 및 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인(FN10)(서열 번호 97)이다. 텐콘27 내의 대체 표면을 기술하는 아미노산 위치를 표 2 및 도 8에 나타내며, 이들은 텐콘, TN3, 및 피브콘 선형 서열에 있어서 동일하다. FN10 내의 대체 표면을 기술하는 아미노산 위치는 도 8에 나타낸다. 다른 FN3 도메인 내의 대체 표면을 형성하는 잔기는, 이용가능한 경우에 3 차원 구조의 시험에 의해, 또는 주지의 방법에 의한 FN3 도메인의 서열 정렬의 분석에 의해 동정할 수 있다.

예를 들어, 결합가(valency)를 증가시킴으로써 표적 분자 결합의 결합활성(avidity)을 증가시키기 위한 수단으로서, 또는 2개 이상의 상이한 표적 분자에 동시에 결합하는 이중 특이적 또는 다중 특이적 스캐폴드를 생성시키기 위하여, 본 발명의 FN3 도메인을 단량체, 이량체, 또는 다량체로서 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 아미노산 링커, 예를 들어, 폴리-글리신, 글리신 및 세린, 또는 알라닌 및 프롤린을 함유하는 링커의 포함에 의해 단일 특이적, 이중 특이적, 또는 다중 특이적 단백질 스캐폴드를 연결함으로써 이량체 및 다량체를 생성시킬 수 있다. 폴리펩티드를 신규의 연결된 융합 폴리펩티드로 연결하기 위한, 천연 발생적 펩티드 링커와 더불어 인공 펩티드 링커의 사용은 문헌에 주지되어 있다(문헌[Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989]; 문헌[Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995]; 문헌[Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996]; 미국 특허 제5,856,456호).

본 발명의 FN3 도메인을 이중 특이적 분자로 사용할 수 있으며, 여기서 도메인 내의 제1 대체 표면은 제1 표적 분자에 대한 특이성을 갖고 동일한 도메인 내의 제2 대체 표면은 제2 표적 분자에 대한 특이성을 갖는다. 예시적인 이중 특이적 단백질 도메인은, C-CD-F-FG 표면에서 제1 표적 분자에 결합하고 A-AB-B-BC-E 표면에서 제2 표적 분자에 결합하는 텐콘27의 변종이다.

본 발명의 FN3 도메인은, 예를 들어, 공유적 상호작용을 통해 다른 서브유닛을 포함할 수 있다. 항체 불변 부위의 전부 또는 일부를 FN3 도메인에 부착하여 항체-유사 특성, 특히 Fc 영역과 연계된 특성, 예를 들어, 보체 활성, 반감기 등을 부여할 수 있다. 예를 들어, Fc 효과기 작용, 예를 들어, C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 식작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포수용체; BCR)의 하향 조절 등을, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 개질함으로써 제공하고/하거나 제어할 수 있다(검토를 위해서는; 문헌[Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691, 2009]을 참조한다).

목적하는 특성을 위해 부가적인 부분, 예를 들어, 독소 접합체, 알부민 또는 알부민 바인더, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예를 들어, PEG5000 또는 PEG20,000, 상이한 사슬 길이의 지방산 및 지방산 에스테르, 예를 들어, 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레에이트, 아라키도네이트, 옥탄다이오산, 테트라데칸다이오산, 옥타데칸다이오산, 도코산다이오산 등, 폴리라이신, 옥탄, 탄수화물(덱스트란, 셀룰로오스, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드)을 본 발명의 FN3 도메인 내로 포함시킬 수 있다. 이들 부분은 단백질 스캐폴드 코딩 서열과의 직접 융합일 수 있으며, 표준 클로닝 및 발현 기술에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 주지의 화학적 커플링 방법을 사용하여 본 발명의 재조합적으로 제조된 FN3 도메인에 그 부분을 부착할 수 있다.

부가적인 부분을 포함하는 FN3 도메인을 몇몇 주지의 분석에 의해 작용성에 대해 비교할 수 있다. 가용성 형태의 수용체, 예를 들어, Fc

FN3 도메인 단백질의 생성 및 제조

본 발명의 일 실시 형태는, 기준 FN3 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 대체 표면을 무작위화함으로써 기준 FN3 도메인의 폴리뉴클레오티드 서열의 라이브러리를 생성시키는 단계; 라이브러리를 시험관내 번역하는 단계 또는 라이브러리를 숙주 내에서 발현시키는 단계를 포함하는, 대체 표면을 포함하는 FN3 도메인의 라이브러리의 제조 방법이며, 여기서 대체 표면은 기준 FN3 도메인에 비교할 때 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는다.

본 발명의 다른 실시 형태는, 서열 번호 27의 아미노산 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 기준 FN3 도메인 폴리펩티드를 제공하는 단계; 하나 이상의 C 베타-스트랜드 잔기 및 하나 이상의 F 베타-스트랜드 잔기를 돌연변이화함으로써 기준 FN3 도메인 폴리펩티드 내로 다양성을 도입하여 다양화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 갖는 FN3 도메인 라이브러리를 형성시키는 단계를 포함하는, C 베타-스트랜드, CD 루프, F 베타-스트랜드, 및 FG 루프에 의해 형성된 다양화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 갖는 FN3 도메인의 라이브러리의 제조 방법이다.

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, C 베타-스트랜드 내의 1, 2, 3, 또는 4개 잔기를 돌연변이화할 수 있으며, 다만, S30은 돌연변이화되지 않는다(서열 번호 27에 따른 잔기 번호화).

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, C 베타-스트랜드 잔기 L32, Q34, 및 Q36을 돌연변이화할 수 있다(서열 번호 27에 따른 잔기 번호화).

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, F 베타-스트랜드 내의 1, 2, 3, 또는 4개 잔기를 돌연변이화할 수 있으며, 다만, E66은 돌연변이화되지 않는다(서열 번호 27에 따른 잔기 번호화).

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, F-베타 스트랜드 잔기 T68, S70, 및 Y72를 돌연변이화할 수 있다(서열 번호 27에 따른 잔기 번호화).

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, CD 루프 잔기 내의 1, 2, 3, 또는 4개 잔기를 돌연변이화할 수 있으며, 다만, G42 및 E43은 돌연변이화되지 않는다(서열 번호 27에 따른 잔기 번호화).

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, CD 루프 내의 잔기 S38, E39, K40, 및 V41을 돌연변이화할 수 있다.

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, FG 루프 내의 1, 2, 3, 또는 4개 잔기를 돌연변이화할 수 있으며, 다만, 잔기 K75, G76, G77, 및 S80은 돌연변이화되지 않는다(서열 번호 27에 따른 잔기 번호화).

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서는, FG 루프 내의 잔기 H78, R79, 및 N81을 돌연변이화할 수 있다(서열 번호 27에 따른 잔기 번호화).

본 발명의 라이브러리의 제조 방법에서, 기준 FN3 도메인은 아미노산 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 또는 86에서 하나 이상의 치환을 임의로 포함하는, 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함한다.

서열 번호 17 내지 26 및 표 3에 나타낸 바와 같은 텐콘(서열 번호 16) 또는 그의 변종과 같은 다른 기준 FN3 도메인을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 라이브러리이다.

본 발명의 스캐폴드 단백질, FN3 도메인(또는 모듈)의 생성은 전형적으로 핵산 수준에서 달성된다. 하나 이상의 특이적 잔기에서 치환된 코돈을 갖는 본 발명의 FN3 도메인의 라이브러리는, 예를 들어, 표준 PCR 클로닝 방법, 또는 미국 특허 제6,521,427호 및 미국 특허 제6,670,127호에 기재된 방법에 따른 화학적 유전자 합성을 사용하여 합성될 수 있다. 주지의 방법, 예를 들어, 설계된 다양성에 부합하는 축퇴성 올리고뉴클레오티드(degenerate oligonucleotide)를 사용하거나, 쿤켈 돌연변이유발(Kunkel mutagenesis)(문헌[Kunkel mutagenesis Kunkel et al., Methods Enzymol . 154, 367-382, 1987])을 사용하여 코돈을 무작위화할 수 있다.

아미노산의 무작위 또는 정의된 세트를 사용하여 선택된 코돈에서 라이브러리를 무작위화할 수 있다. 예를 들어, 20개 천연 발생적 아미노산 모두를 암호화하는 NNK 코돈을 사용하여 무작위 치환을 갖는 라이브러리 내의 변종을 생성시킬 수 있다. 다른 다양화 스킴에서는, DVK 코돈을 사용하여 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 암호화할 수 있다. 대안적으로, NNS 코돈을 사용하여 20개 아미노산 잔기 모두를 발생시킴과 동시에 정지 코돈의 빈도를 감소시킬 수 있다. 코돈 표기는 주지의 IUB 코드에 따른다.

본 발명의 FN3 도메인은 임의의 다른 단백질과 같이, 다운스트림 가공에 악영향을 유발하는 다양한 물리적 및/또는 화학적 불안정성을 갖기 쉽다. 예를 들어, 물리적 및 화학적 불안정성은 응집, 분해, 감소된 산물 수율, 효능의 상실, 증가된 면역원성 잠재력, 분자적 이질성, 및 활성의 상실을 야기할 수 있다. 따라서, 라이브러리의 설계 중에 가능한 불안정성-유도성 잔기 및 인식 서열의 존재를 최소화할 수 있다. 예를 들어, 표면 노출된 메티오닌 및 트립토판은 저장 조건에서 산화될 수 있으므로, 단백질 스캐폴드 효능의 상실을 야기할 가능성이 있다. 아스파라긴의 존재는, 주지의 N-글리코실화 인식 부위(NXS/T)에 기여할 뿐 아니라, 글리신이 뒤에 올 경우에 탈아미드화될 수 있으므로, 이질성을 발생시킬 가능성이 있다(문헌[Robinson, Proc Natl Acad Sci USA , 99, 5283-5288, 2002]). 따라서 이들 아미노산의 일부 또는 전부를 선택된 위치를 무작위화하기 위해 사용되는 혼합물로부터 제외하거나 제외하지 않을 수 있다. 추가로, 시스테인 및 프롤린을 제외하여 다이설파이드 가교체 형성 및 베타 시트의 붕괴를 최소화할 수 있다.

예를 들어, 슬로노믹스(등록상표) 기술(http:_//www_sloning_com)을 사용하여, 다양화할 위치에 편향된 아미노산 분포를 가진 FN3 도메인의 라이브러리를 합성할 수 있다. 이 기술은, 수천개 유전자 합성 과정에 충분한 보편적 구성 요소(building block)로서 작용하는 사전-제조된 이중 스트랜드 트리플렛의 라이브러리를 사용한다. 트리플렛 라이브러리는 임의의 목적하는 DNA 분자를 구성하기 위해 필요한 모든 가능한 서열 조합을 대표한다.

소정 위치에 선택된 뉴클레오티드 "축퇴"를 가진 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, TRIM 접근법(문헌[Knappek et al., J Mol Biol 296, 57-86, 1999]; 문헌[Garrard & Henner, Gene 128,103-109, 1993]). 구매가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 시약 및 장치를 사용하여, 소정 코돈 세트를 갖는 이러한 뉴클레오티드의 세트를 합성할 수 있다.

예시적인 다양화 스킴에서는, 텐콘27 FN3 도메인(서열 번호 27) 잔기 C 베타-스트랜드 내의 L32, Q34, 및 Q36, CD 루프 내의 S38, E39, K40, 및 V41, F 베타-스트랜드 내의 T68, S70, 및 Y72, 및 FG 루프 내의 H78, R79, 및 N81을 NNS 코돈으로 무작위화한다.

표준 클로닝 및 발현 기술을 사용하여 라이브러리를 벡터 내로 클로닝하거나 라이브러리의 이중 스트랜드 cDNA 카세트를 합성하거나, 라이브러리를 시험관내 번역하거나, 발현시킨다. 예를 들어, 시스-디스플레이를 사용하여 스캐폴드 단백질을 암호화하는 DNA 단편을 RepA를 암호화하는 DNA 단편에 결찰하여 시험관내 번역 후에 형성되는 단백질-DNA 복합체의 풀(pool)을 생성시킬 수 있으며, 여기서 각각의 단백질은 그것을 암호화하는 DNA와 안정하게 연계된다(미국 특허 제7,842,476호; 문헌[Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004]). 다른 방법, 예를 들어, 리보좀 디스플레이(문헌[Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997]), mRNA 디스플레이(문헌[Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA , 94, 12297-12302, 1997]), 또는 다른 무세포 시스템(미국 특허 제5,643,768호)을 사용할 수 있다. 단백질 스캐폴드의 라이브러리는, 예를 들어, 임의의 적합한 박테리오파아지의 표면 상에 디스플레이되는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 박테리오파아지의 표면 상에 융합 폴리펩티드를 디스플레이하는 방법은 주지되어 있다(미국 특허 공개 제2011/0118144호; 국제 특허 공개 제WO2009/085462호; 미국 특허 제6,969,108호; 미국 특허 제6,172,197호; 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제6,582,915호; 미국 특허 제6,472,147호).

스크리닝

조작된 단백질 FN3 도메인 또는 FN3 도메인 변종의 라이브러리를 표적 분자에 대한 특이적 결합에 대해 스크리닝하는 단계는, 예를 들어, 실시예 및 문헌[Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004]에 기재된 바와 같은 시스 디스플레이를 사용하여 라이브러리를 제조하고, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 표적 분자에 대한 특이적 결합에 대해 라이브러리를 분석함으로써 달성할 수 있다. 사용할 수 있는 예시적인 주지의 방법은 ELISA, 샌드위치 면역분석, 및 경쟁 및 비-경쟁 분석이다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조).

본 발명의 FN3 도메인은 광범위한 친화성(K _D )으로 인간 또는 다른 포유류 단백질에 결합할 수 있다. 전형적으로 본 발명의 FN3 도메인은, 당업자에 의해 실시되는 바와 같이 표면 플라스몬 공명 또는 키넥사 방법(Kinexa method)에 의해 결정할 때, 약 10 ^-7 M, 10 ^-8 M, 10 ^-9 M, 10 ^-10 M, 10 ^-11 M, 10 ^-12 M, 10 ^-13 M, 10 ^-14 M, 또는 10 ^-15 M 이하의 K _D 으로 표적 단백질에 결합할 수 있다. 항원에 대한 FN3 도메인의 친화성은 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정할 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al. , "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology , Paul, WE, Ed., Raven Press: New York, NY (1984)]; 문헌[Kuby, Janis Immunology , WH Freeman and Company: New York, NY (1992)]; 및 본 명세서에 기재된 방법 참조). 특정 FN3 도메인-항원 상호작용의 측정된 친화성은, 상이한 조건(예를 들어, 삼투성, pH) 하에 측정할 경우에 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터(예를 들어, K _D , K _on , K _off )의 측정은 바람직하게는 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충제로 행해진다.

핵산 분자 및 벡터

본 발명은, 시험관내 전사/번역에 사용되는 선형 DNA 서열, 그의 조합 또는 지정 돌연변이원(directed mutagen)의 원핵생물, 진핵생물, 또는 사상 파아지 발현, 분비, 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 발현 벡터의 일부로서, 또는 선형 DNA 서열의 일부로서, 본 발명의 FN3 도메인을 암호화하는 핵산을 제공한다. 예시적인 소정 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되나, 주어진 발현 시스템에서 유전자 코드의 축퇴 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 단백질 스캐폴드 및 단백질 스캐폴드의 라이브러리를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자동화 폴리뉴클레오티드 합성기 상에서 고체상 폴리뉴클레오티드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 제조되고 완전한 단일 또는 이중 스트랜드 분자로 조립될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR 후의 일상적인 클로닝과 같은 다른 기술에 의해 제조될 수 있다. 주어진 공지된 서열의 폴리뉴클레오티드를 제조하거나 얻는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 비-코딩 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 시스 서열 촉진 RepA 결합(cis sequence facilitating RepA binding) 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한, 예를 들어, 단백질의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위한 히스티딘 태그 또는 HA 태그와 같은 마커 또는 태그 서열, 신호 서열, RepA와 같은 융합 단백질 파트너, pIX 또는 pIII와 같은 Fc 또는 박테리오파아지 코트 단백질을 암호화하는, 부가적인 아미노산을 암호화하는 부가적인 서열을 포함할 수 있다.

예시적인 폴리뉴클레오티드는 Tac 프로모터를 위한 서열, FN3 도메인 라이브러리 및 repA, 시스 요소, 및 박테리아 복제 개시점(ori)을 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 예시적인 폴리뉴클레오티드는 pelB 또는 ompA 신호 서열, pIII 또는 pIX 박테리오파아지 코트 단백질, FN3 도메인, 및 폴리A 부위를 포함한다. TCL14 라이브러리 및 텐콘27을 암호화하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 100 및 101에 각각 나타낸다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 이들 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스(baculovirus) 발현용 벡터, 트랜스포존(transposon) 기반의 벡터, 또는 임의의 수단에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 주어진 유기체 또는 유전자 백그라운드(genetic background)로의 도입에 적절한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 이러한 벡터에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현을 제어하거나, 조절하거나, 야기하거나, 허용할 수 있는 핵산 서열 요소를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 그러한 요소는 전사 인핸서(enhancer) 결합 부위, RNA 폴리머라아제 개시 부위, 리보좀 결합 부위, 및 주어진 발현 시스템에서 코딩된 폴리펩티드의 발현을 돕는 다른 부위를 포함할 수 있다. 그러한 발현 시스템은 당업계에 잘 알려진 세포 기반 시스템 또는 무세포 시스템일 수 있다.

숙주 세포 선택 또는 숙주 세포 조작

본 발명의 FN3 도메인은, 당업계에 주지된 바와 같이, 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포, 또는 불멸화 세포의 클론 집단(clonal population)에 의해 임의로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[ Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[ Colligan, et al ., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[ Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조한다.

발현용으로 선택된 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 있거나 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 그의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는, 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어, 원핵 세포 또는 유기체, 예를 들어, BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), 및 천연 또는 조작된 E. 콜라이 종(E. coli spp), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp) 균주 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다 .

본 발명의 FN3 도메인의 용도

본 명세서에 기재되고 상기 방법 중 임의의 것에 의해 생성된 FN3 도메인(모듈)-기반의 분자의 조합을 사용하여, 인간 질환 또는 세포, 조직, 기관, 유체, 또는 일반적으로 숙주 내의 특이적 병리 현상을 진단하거나, 모니터링하거나, 조정하거나, 치료하거나, 완화시키거나, 그의 발생의 예방을 돕거나, 그의 증상을 감소시킬 수 있다. 특이적 목적을 위해 조작된 FN3 도메인을 사용하여 면역-매개 또는 면역-결핍 질환, 대사성 질환, 심혈관계 장애 또는 질환; 악성 질환; 신경계 장애 또는 질환; 감염, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 또는 기생충 감염; 또는 부종, 통증, 및 조직 괴사 또는 섬유증을 포함하는 다른 공지되거나 명시된 관련 병태를 치료할 수 있다.

이러한 방법은, 이러한 조정, 치료, 완화, 예방, 또는 증상의 감소, 효과 또는 기전을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에게 표적 분자에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 FN3 도메인을 포함하는 유효량의 조성물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유효량은, 본 명세서에 기재되거나 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 공지 방법을 사용하여 실행하고 결정할 때, 단일(예를 들어, 볼루스), 다중, 또는 연속 투여 당 약 0.001 내지 500 mg/kg의 양, 또는 단일, 다중, 또는 연속 투여 당 0.01 내지 5000 μg/ml 혈청 농도의 혈청 농도를 달성하기 위한 양, 또는 임의의 유효 범위 또는 그 안의 값을 포함할 수 있다.

FN3 도메인-기반의 단백질을 포함하는 약제학적 조성물

개질되거나 개질되지 않은, 단일 특이적, 이중 특이적, 또는 다중 특이적, 단량체, 이량체, 또는 다량체인, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은, 포획, 고정화, 분배(partitioning), 또는 침강에 관해 당업계에 주지된 분리 절차를 사용하여 단리되고 상업적 응용가능성에 필요한 정도까지 정제될 수 있다.

치료적 용도를 위해, 약제학적으로 허용가능한 담체 내에 활성 성분으로서 유효량의 FN3 도메인을 함유하는 약제학적 조성물로서, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 제조할 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어, 낙화생유, 대두유, 광물유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신을 사용할 수 있다. 이들 용액을 멸균이고 일반적으로 입자상 물질이 없다. 이들은 관용적인 주지의 멸균 기술( 예를 들어 , 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 완충제, 안정화제, 농후제, 윤활제, 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위해 필요한, 약제학적으로 허용가능한 보조 물질을 함유할 수 있다. 이러한 약제학적 제형에서 본 발명의 약제의 농도는 광범위하게, 즉 , 약 0.5 중량% 미만으로부터, 통상적으로는 약 1 중량% 이상 내지 15 또는 20 중량% 만큼까지로 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요한 투여량, 유체 부피, 점도 등을 기반으로 하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21 ^st Edition, Troy, DB ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092(특히 pp. 958-989 참조)]에 기재되어 있다.

표적 분자에 특이적으로 결합하는 FN3 도메인의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 약제를 숙주에 전달하는 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 비경구 투여, 예를 들어, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 또는 피하, 폐; 경점막(경구, 비강내, 질내, 직장); 정제, 캡슐, 액제, 분제, 겔, 입자 중의 제형; 및 주사기, 이식 디바이스, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 포함되는 제형의 사용; 또는 당업계에 주지된 바와 같이, 당업자에 의해 인식되는 다른 수단일 수 있다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.

본 발명을 일반적인 개념으로 개시하였지만, 본 발명의 실시 형태는 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.

실시예 1. 텐콘 스캐폴드

텐콘 설계

인간 테나신 C로부터의 유형 III의 제3 피브로넥틴 모듈(Fn3) 도메인(서열 번호 3)을, 특이적 표적 분자에 결합하도록 조작할 수 있는 단백질 스캐폴드로 사용할 수 있다. 이 도메인의 용융 온도는 그 천연 형태에서 PBS에서 54℃이다.

유사한 구조 및 개선된 물리적 특성, 예를 들어, 개선된 열 안정성을 가진 단백질 스캐폴드를 제조하기 위하여, 인간 테나신 C로부터의 15개 FN3 도메인의 정렬을 기반으로 하여 컨센서스 서열을 설계하였다(서열 번호 1 내지 15에 나타냄). 선택된 15개 FN3 도메인은 13 내지 80% 범위의 서로에 대한 서열 동일성을 가지며, 쌍들 중의 평균 서열 동일성은 29%이다. 가장 보존된(빈도가 높은) 아미노산을 각각의 위치에 혼입시킴으로써 텐콘(서열 번호 16)으로 표기되는 컨센서스 서열을 설계하였다(미국 특허 공개 제2010/0216708호 참조). 쌍 정렬에서, 텐콘은 34 내지 59%의 위치에서 테나신 C로부터의 FN3 도메인과 동일하며, 평균 서열 동일성은 43%이다.

텐콘 발현 및 정제

텐콘의 아미노산 서열을 역번역하여, 서열 번호 59에 나타낸 cDNA 서열을 생성시켰다. 일상적 방법을 사용하여 cDNA를 증폭하고 개질된 pET15 벡터 내로 클로닝하였다. 단백질은 E. 콜라이로부터 가용성 형태의 C-말단 His ₆ -융합 단백질로서 발현되었으며, 500 mM 이미다졸 중의 용출을 사용하는 표준 Ni-NTA 아가로스를 사용하여 정제하였다. 원하는 분획을 모아서 PBS(pH 7.4) 내로 투석시켰다. 두번째 정제 단계로서 단백질을 PBS 에서 평형화된 수퍼덱스(Superdex)-75 하이로드(HiLoad) 16/60 컬럼(GE 헬스케어(GE Healthcare))상에 로딩하였다. 텐콘을 함유하는 분획을 모아서 센트리프렙 울트라셀(Centriprep UltraCel) YM-3 농축기(아미콘(Amicon))를 사용하여 농축하였다. SDS-PAGE 분석은 텐콘이 6 내지 14 kDa 사이에서 이동함을 나타냈으며, 단량체 단백질에 대한 10.7 kDa의 예상 질량과 일치한다. 배양물 1리터 당 >50 mg의 순수한 텐콘 단백질의 수율이 얻어졌다.

텐콘 생물물리학적 특성화

텐콘의 구조 및 안정성을 원편광 이색성 분광법(CD) 및 시차 주사 열량법(DSC)에 의해 특성화하였다. CD 측정은 PBS에서 20℃에서 그리고 0.2 mg/mL의 농도에서 AVIV 분광계에서 이루어졌다. 스펙트럼은 218 nm에서 최소를 나타냈으며, 이는 FN3 패밀리에 속하는 단백질에 대해 예상되는 베타-시트 구조를 시사한다. PBS중의 테나신 C로부터의 제3 FN3 도메인(TN3) 또는 텐콘의 0.5 mg/mL 용액을 N-DSCII 칼로리미터(어플라이드 써모다이나믹스(Applied Thermodynamics))에서 1℃/분의 속도로 35℃로부터 95℃까지 가열함으로써 DSC 데이터를 얻었다. 이 데이터로부터, CpCalc(어플라이드 써모다이나믹스) 소프트웨어를 사용하여, TN3 및 텐콘에 대해 각각 54℃ 및 78℃의 용융 온도를 계산하였다. 두 도메인의 접힘과 풀림은 이들 온도에서 가역적이다. 따라서, 생성된 텐콘 스캐폴드는 TN3의 열 안정성에 비교할 때 개선된 열 안정성을 나타낸다. 이러한 안정성 증가를 기반으로 하여, 텐콘 스캐폴드는 아미노산 치환이 더 쉽고 제조가 더 용이할 가능성이 있다. 단백질 안정성을 감소시키는 돌연변이는 더욱 안정한 스캐폴드의 맥락에서 더욱 우수하게 견딜 가능성이 있으며, 따라서 안정성이 향상된 스캐폴드는 스캐폴드 변이체의 라이브러리 유래의, 더욱 기능적이고 잘 접힌 바인더를 생성할 가능성이 있다.

M13 파아지 상의 텐콘 디스플레이

텐콘 아미노산 서열을 암호화하는 cDNA(서열 번호 59)를 표준 PCR 및 제한 분해 클로닝에 의해 파아지미드 발현 벡터 pPep9(국제 특허 공개 제WO2008/079973호) 내로 서브클로닝하여 벡터 p텐콘-pIX를 생성시켰다. 이러한 벡터는, OmpA 신호 서열을 이용하여 Lac 프로모터(IPTG가 없을 때의 낮은 수준의 발현 및 IPTG의 첨가 후의 증가된 발현을 가능하게 함) 하에 박테리오파아지 M13 pIX 단백질의 N-말단에 대한 C-말단 융합으로서 N-말단에 Myc-태깅된 텐콘을 발현시킨다. 짧은 TSGGGGS 링커(서열 번호 60)를 텐콘과 pIX 사이에 삽입하여 이들 단백질 사이의 입체 상호작용을 방지하였다.

M13 파아지 입자의 표면 상의 디스플레이의 확인을 위하여, XL1-Blue E. 콜라이 내의 p텐콘-pIX의 단일 콜로니 형질전환체를 37℃에서 중간 대수기에 도달할 때까지 성장시키고 6 ¹⁰ pfu의 VCSM13 헬퍼 파아지로 레스큐하였다. 암피실린으로 보충된 2YT 배지 내에서 16 시간 증식시킨 후에 1 mM IPTG로 유도하고, 4000 X g에서 20 분 동안 원심분리한 후, 레스큐된 배양물로부터 상청액을 수집하고, 분석을 위해 4℃에서 저장하였다.

항-Myc 항체(캘리포니아주 칼스배드 소재의 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 대한 파아지 입자의 결합을 사용하여 M13 파아지 표면 상에서 Myc-텐콘 구조체의 디스플레이를 확인하였다. 맥시소프(Maxisorp) 플레이트를 항-Myc 또는 항-αv 항체(음성 대조군)로 2.5 μg/mL의 농도에서 밤새 코팅하고 수퍼블록(SuperBlock) T20(일리노이주 록포드 소재의 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))으로 블로킹하였다. 상기한 파지미드 배양 상청액의 2배 연속 희석물을 PBS에서 제조하고 코팅된 플레이트의 웰(well)에 첨가하였다. 1시간 후에, 플레이트를 TBST로 세척하고, 각각의 웰에 항-M13 HRP 항체를 첨가하고, TBST로 세척한 후에 1 시간 인큐베이션하였다. 로쉐(Roche) BD ELISA POD 기질을 첨가하고 테칸(Tecan) 플레이트 판독기 상에서 발광을 검출하였다.

실시예 2: 텐콘 내의 안정화 돌연변이

FG 및 FG 및 BC 루프 내로 동시에 다양성을 도입하도록 설계된 텐콘 라이브러리, FG7 및 BC6/FG7이 기재되어 있다(미국 특허 공개 제2010/0255056호; 미국 특허 공개 제2010/0216708호).

변종의 설계

텐콘(서열 번호 16)의 접힘 안정성을 개선하도록 돌연변이체를 설계하였다. 몇몇 점 돌연변이를 실행하여 서열 번호 16의 개별적인 잔기의 치환, 예를 들어, N46V(텐콘17; 서열 번호 17), E14P(텐콘18; 서열 번호 18), E11N(텐콘19; 서열 번호 19), E37P(텐콘20; 서열 번호 20), 및 G73Y(텐콘21; 서열 번호 21)를 생성시켰으며, 이는 프로그램 PoPMuSiC v2.0(문헌[Dehouck et al., Bioinformatics, 25, 2537-2543, 2009])에 의해 스캐폴드 안정성을 개선할 것으로 예측되었다. 돌연변이체 E86I(텐콘22; 서열 번호 22)는 동종 단백질, 인간 테나신 C로부터의 제3 FN3 도메인을 안정화시키는 것으로 이전에 확인된 바 있다(제WO2009/086116호). L17A 돌연변이(텐콘26; 서열 번호 26)는, 텐콘의 모든 루프 잔기가 독립적으로 알라닌으로 대체된 알라닌 스캐닝 실험 중에 텐콘을 현저하게 안정화시키는 것으로 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 안정성 분석의 초기 라운드 후에, 조합 돌연변이체 N46V/E86I(텐콘23; 서열 번호 23), E14P/N46V/E86I(텐콘24; 서열 번호 24), 및 L17A/N46V/E86I(텐콘25; 서열 번호 25)를 제조하여 안정성을 추가로 증가시켰다.

발현 및 정제

퀵체인지(QuikChange) 돌연변이유발 키트(스트라타진(Stratagene))를 사용하여 텐콘 코딩 서열 내의 돌연변이를 실행하고, 표준 프로토콜을 사용하여 돌연변이체 단백질을 HIS ₆ 융합 단백질로서 발현시키고 정제하였다. Ni-NTA(노바젠(Novagen)) 컬럼으로부터 50 mM 소듐 포스페이트(pH 7.4), 500 mM NaCl, 및 250 mM 이미다졸 중에 단백질을 용출시켰다. 용출 후에, 단백질을 PBS(pH 7.4) 내로 투석하였다.

열 안정성의 특성화

pBS(pH 7.4) 내의 텐콘 및 각각의 돌연변이체 단백질(2 내지 3 mg/mL)의 열 안정성을 모세관 시차 주사 열량법(DSC)에 의해 측정하였다. 오토샘플러가 장착된 VP-DSC 기기(마이크로칼, LLC(MicroCal, LLC))를 사용하여 이들 샘플에 대하여 용융 온도를 측정하였다. 샘플을 10℃로부터 95℃ 또는 100℃까지 1℃/분의 속도로 가열하였다. 적분용 기준선을 계산하기 위하여 각각의 샘플 스캔 사이에 완충제 단독 스캔을 완료하였다. 데이터를 2 상태 풀림 모델에 적합시킨 후에 완충제 단독 신호를 감산하였다. 각각의 샘플을 셀로부터 제거하지 않으면서 그에 대한 스캔을 반복함으로써 열 변성의 가역성을 결정하였다. 제1 스캔으로부터의 곡선하 면적을 제2 스캔과 비교함으로써 가역성을 계산하였다. DSC 실험의 결과는 표 3에 완전 용융 곡선으로부터 유도된 값(Tm(Kcal))으로서 제공되어 있다. 단일 돌연변이체 텐콘17, 텐콘18, 텐콘19, 및 텐콘22는 모 텐콘 서열에 비교하여 개선된 열 안정성을 가졌다. 단지 텐콘21만 현저하게 불안정화되었다. 조합 돌연변이체 텐콘23, 텐콘24, 및 텐콘25 및 모두는 현저하게 더 큰 안정성 향상을 가졌으며, 이는 설계된 돌연변이가 열 안정성의 개선에 대해 상가적임을 나타낸다.

구아니딘 하이드로클로라이드에 의한 변성

트립토판 형광에 의해 측정된, 증가하는 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드(GdmCl)로 처리시에 텐콘 및 각각의 돌연변이체가 접힘을 유지하는 능력을 사용하여 안정성을 산정하였다. 텐콘은 단 하나의 트립토판 잔기를 함유한다. 트립토판 잔기는 소수성 코어 내부에 매몰되어 있으므로, 360 nm에서의 형광 방출은 이러한 단백질의 접힘 상태의 민감한 측정값이다. 50 mM 소듐 포스페이트(pH 7.0), 150 mM NaCl, 및 0.48 내지 6.63 M의 가변 농도의 GdmCl을 함유하는 200 μL의 용액을 흑색의 비-결합 96-웰 플레이트(그라이너(Greiner)) 내로 피펫팅하여 17 점 적정을 생성시켰다. 텐콘 돌연변이체를 함유하는 10 μL의 용액을 플레이트에 걸쳐 각각의 웰에 첨가하여 23 μM의 최종 단백질 농도가 되게 하고 온화하게 상하로 피펫팅함으로써 혼합하였다. 실온에서 24 시간 동안 인큐베이션한 후에, 280 nm에서의 여기 및 360 nm에서의 방출을 동반하는 스펙트라맥스(Spectramax) M5 플레이트 판독기(캘리포니아주 서니베일 소재의 몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 형광을 판독하였다. 하기 수학식(문헌[Pace, Methods Enzymol 131:,266-280, 1986])을 사용하여 형광 신호를 풀림 분율로 변환하였다:

여기서 y _F 는 접힌 샘플의 형광 신호이고 y _u 는 풀린 샘플의 형광 신호이다.

하기 수학식(문헌[Clarke et al., 1997])에 적합시킴으로써 풀림 전이의 중간점 및 전이의 경사를 결정하였다:

여기서 F는 주어진 변성제 농도에서의 형광이고, α _N 및 α _D 는 천연 상태 및 변성 상태의 y-절편이며, β _N 및 β _D 는 천연 상태 및 변성 상태에 대한 기준선의 경사이고, [D]는 GdmCl의 농도이며, [D] _50% 는 샘플의 50%가 변성되는 지점에서의 GdmCl 농도이고, m은 전이의 경사이며, R은 기체 상수이고, T는 온도이다. 하기 수학식(문헌[Pace 1986 supra ]; 문헌[Clarke et al., J Mol Biol 270, 771-778, 1997])을 사용하여 각각의 샘플에 대한 접힘의 자유 에너지를 추산하였다:

이러한 곡선에 대해 전이의 경사, m을 정확하게 측정하는 것은 종종 어렵다. 부가적으로, 본 명세서에 기재된 돌연변이는 텐콘의 접힘 기전을 변경하는 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 각각의 돌연변이체에 대한 m 값을 측정하고 그 값을 평균하여(문헌[Pace 1986 supra ]), 모든 자유 에너지 계산에 사용되는 m = 3544 cal/mol/M을 산출하였다. 이들 계산의 결과는 표 3에 제공되어 있다. GdmCl 풀림 실험에 대한 결과는 열 안정성에 대해 텐콘을 안정화시키는 동일한 돌연변이체가 GdmCl에 의해 유도된 변성에 대해서도 단백질을 안정화시킨다는 것을 나타낸다.

크기 배제 크로마토그래피

크기 배제 크로마토그래피(SEC: Size exclusion chromatography)를 사용하여 텐콘 및 각각의 텐콘 변종의 응집 상태를 산정하였다. 5 μL의 각각의 샘플을 PBS 이동상으로 0.3 mL/min의 유속에서 수퍼덱스 75 5/150 컬럼(GE 헬스케어) 상에 주입하였다. 컬럼으로부터의 용출을 280 nm에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. 응집 상태를 산정하기 위하여, 구상 분자량 표준품(시그마(Sigma))으로 컬럼을 사전에 보정하였다. 텐콘21을 제외하고는, 모든 시험 샘플이 단량체성 샘플의 용출 부피와 일치하는 용출 부피에서 하나의 피크로 용출되었다. 텐콘21은 2개의 피크로 용출되었으며, 이는 응집체의 존재를 나타낸다.

실시예 3: 대체 결합 표면을 갖는 텐콘 라이브러리의 생성

TCL14 라이브러리의 설계

특정 라이브러리 설계에서 무작위화될 잔기의 선택은 생성되는 상호작용 표면의 전반적인 형상을 지배한다. BC, DE, 및 FG 루프가 무작위화된 라이브러리로부터 말토오스 결합 단백질(MBP: maltose binding protein)에 결합하도록 선택된 스캐폴드 단백질을 함유하는 FN3 도메인의 X-선 결정학적 분석은 MBP의 활성 부위 내로 적합되는 크게 곡면인 계면을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007]). 반면에, MBP에 결합하도록 선택된 안키린 반복체 스캐폴드 단백질은 훨씬 더 평면인 상호작용 표면을 가지며 활성 부위로부터 멀리 떨어진 MBP의 외측 표면에 결합하는 것으로 확인되었다(문헌[Binz et al., Nat Biotechnol, 22, 575-58, 2004]). 이들 결과는, 어느 표적 단백질 또는 그들 표적 단백질 상의 특이적 에피토프가 스캐폴드에 의해 효과적으로 결합될 수 있는지를 스캐폴드 분자의 결합 표면의 형상(곡면 대 평면)이 좌우할 수 있다는 것을 시사한다. 단백질 결합을 위한 FN3 도메인을 함유하는 단백질 스캐폴드의 조작을 둘러싼 공개된 노력은 표적 결합을 위해 인접한 루프(도 1)를 조작함으로써 곡면인 결합 표면을 생성시키는 것에 의존해 왔다. 이러한 접근법은 이러한 스캐폴드에 의해 접근가능한 표적 및 에피토프의 수를 제한할 수 있다.

텐콘 및 다른 FN3 도메인은 분자의 대향면 상에 있는 2개 세트의 CDR-유사 루프를 함유하며, 제1 세트는 BC, DE, 및 FG 루프에 의해 형성되고, 제2 세트는 AB, CD, 및 EF 루프에 의해 형성된다. 2개 세트의 루프는 FN3 구조의 중심을 형성하는 베타-스트랜드에 의해 분리된다(도 1, 2a). 도 1에 제공된 텐콘 구조의 영상을 90 도 만큼 회전시킬 경우, 대체 표면이 가시화될 수 있다(도 2b). CD 및 FG 루프 및 2개의 역평행 베타- 스트랜드, C 및 F 베타-스트랜드에 의해 이러한 약간의 요면 표면이 형성되며, 본 명세서에서는 이를 C-CD-F-FG 표면이라고 칭한다(도 2b). C-CD-F-FG 표면을 주형으로 사용하여, 표면을 형성하는 잔기의 서브세트를 무작위화함으로써 단백질 스캐폴드 상호작용 표면의 라이브러리를 설계할 수 있다. 베타-스트랜드는, 하나 걸러서 잔기의 측쇄가 단백질의 표면에 노출된 반복 구조를 갖는다. 따라서, 베타 스트랜드 내의 표면 노출된 잔기의 일부 또는 전부를 무작위화함으로써 라이브러리를 제조할 수 있다. 베타-스트랜드 내의 적절한 잔기를 선택함으로써, 다른 단백질과 상호작용하기 위한 독특한 스캐폴드 표면을 제공하면서도 텐콘 스캐폴드의 내재적 안정성의 훼손을 최소화해야 한다.

본 명세서에서 TCL14(서열 번호 28)라고 칭하는 새로운 라이브러리를, 부가적인 E11R 치환을 갖는(텐콘27, 서열 번호 27) 텐콘25 스캐폴드(서열 번호 25)로 설계하였다(도 2b, 3). 각각 텐콘27(서열 번호 27) 및 TCL14 (서열 번호 28)에 대해, 루프 및 스트랜드의 위치 및 그들의 서열을 표 4 및 표 5에 나타낸다. 표 5에서, "X"는 임의의 아미노산을 나타낸다.

텐콘27(서열 번호 27):

TCL14 라이브러리(서열 번호 28):

여기서 "X"는 임의의 아미노산이다.

텐콘27 내의 C-CD-F-FG 표면을 형성하는 2개의 베타 스트랜드는 무작위화될 수 있는 총 9개의 표면 노출된 잔기를 가지며(C-스트랜드: S30, L32, Q34, Q36; F-스트랜드: E66, T68, S70, Y72, 및 V74), 반면에 CD 루프는 6개의 잠재적 잔기를 갖고(S38, E39, K40, V41, G42, 및 E43) FG 루프는 7개의 잠재적 잔기를 갖는다(K75, G76, G77, H78, R79, S80, 및 N81)(도 5). 선택된 잔기는, 22개 잔기 전부가 무작위화되었을 경우에 라이브러리의 이론적 크기가 더 크기 때문에 TCL14 설계 내에 포함되도록 선택되었다.

무작위화를 위해 텐콘27(서열 번호 27) 내의 하기 13개 위치를 선택하였다: C-스트랜드 내의 L32, Q34, 및 Q36, CD-루프 내의 S38, E39, K40, 및 V41, F-스트랜드 내의 T68, S70, 및 Y72, FG-루프 내의 H78, R79, 및 N81. C 및 F 스트랜드 내에서 S30 및 E66은 무작위화하지 않았으며, 이는 그들이 CD 및 FG 루프 바로 너머에 있고, 외견상 C-CD-F-FG 표면의 일부인 것으로 보이지 않기 때문이다. CD 루프의 경우, G42 및 E43은 무작위화되지 않았으며, 이는 유연성을 제공하는 글리신이 루프 영역 내에서 유익할 수 있고, E43이 표면의 접합부에 있기 때문이다. FG 루프에서 K75, G76, G77, 및 S80은 배제되었다. 글리신은 상기 이유로 배제된 반면에, 결정 구조의 신중한 조사에 의해 S80이 코어와 중요한 접촉을 이루어 안정한 FG 루프의 형성을 돕는 것이 밝혀졌다. K75는 C-CD-F-FG 표면의 표면으로부터 다른 쪽을 향하며, 무작위화를 위해 덜 흥미로운 후보였다. 원래의 TCL14 설계에서 상기 잔기는 무작위화되지 않았지만, 그들은 후속의 라이브러리 설계에 포함되어 드노보 선택을 위해, 또는 예를 들어, 선택된 TCL14 표적 특이적 적중(target specific hit)에 대한 친화성 성숙 라이브러리(affinity maturation library)를 위해, 부가적인 다양성을 제공할 수 있을 것이다.

기존의 FN3-스캐폴드 기반의 라이브러리 설계 (문헌[Koide, et al. J Mol Biol, 284, 1141-1151, 1998]; 문헌[Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA 104, 6632-6637, 2007];문헌[Dineen et al., BMC Cancer, 8, 352-361, 2008]; 문헌[Olson and Roberts, Protein Sci, 16, 476-484, 2007]; 문헌[Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933-942, 2002]; 문헌[Karatan et al., Chem Biol, 11, 835-844, 2004]; 문헌[Hackel et al., J Mol Biol, 401, 84-96, 2010]; 문헌[Hackel et al., J Mol Biol 381, 1238-1252, 2008]; 문헌[Koide et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007]; 문헌[Lipovsek et al., J Mol Biol, 368, 1024-1041, 2007]; 국제 특허 공개 제WO2009/133208호; 국제 특허 공개 제WO2009/058379호; 미국 특허 제7,115,396호)와는 대조적으로, 설계된 TCL14 라이브러리 표면은 항체 가변 도메인 또는 CDR, 또는 이전에 기재된 FN3 라이브러리의 표면과 구조상의 유사성을 갖지 않는다. 이러한 설계에 의해 생성된 큰 상호작용 표면으로 인하여, 아마도 친화성 성숙 단계를 필요로 하지 않으면서, 고친화성 분자를 신속하게 단리할 수 있다.

이러한 설계는 연속하는 아미노산의 긴 스트레치를 무작위화하지 않으므로, 이는 이전에 기재된 라이브러리보다 더 가용성이고 안정한 FN3 결합 분자를 제조할 수 있다. 기재된 TCL14 라이브러리는 이전의 라이브러리의 곡면 표면에 비교하여 평면 또는 요면 상호작용 표면을 생성시킨다. 따라서, TCL14로부터 선택된 FN3 분자는 이전의 FN3 라이브러리 설계로부터 발견되는 것들과 같은 별개의 항원 및 에피토프에 결합할 가능성이 있다. TCL14 라이브러리 설계는 또한, 동일한 분자 상에 별개의 2개 결합 표면의 생성을 가능하게 하여 이중 특이성을 달성할 수 있다.

TCL14 라이브러리의 생성

시스 -디스플레이 시스템(문헌[Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-2810, 2004])을 사용하여 상기 TCL14 라이브러리를 발현시켰다. 이러한 시스템에서는, RepA 코딩 서열, 시스 및 ori 요소, 및 Tac 프로모터를 암호화하는 DNA 단편에 라이브러리를 결찰하고, 생성된 결찰 산물을 시험관내 전사/번역한다. 제조된 TCL14-RepA 융합 단백질은 그 융합 단백질을 암호화하는 DNA에 시스 로 결합된다. 관심의 대상인 단백질에 특이적으로 결합하는 스캐폴드 분자에 대해 라이브러리를 스크리닝하고, 분자를 단리하고, 결합된 DNA를 증폭하여 결합된 스캐폴드 분자의 코딩 서열을 동정한다.

축퇴성 프라이머를 가진 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)을 사용하여 텐콘 27(서열 번호 27) 내의 위치 L32, Q34, Q36(C-스트랜드), S38, E39, K40, V41(CD-루프), T68, S70, Y72(F-스트랜드), H78, R79, 및 N81(FG-루프)을 무작위화함으로써 TCL14 라이브러리를 생성시키고, 표준 프로토콜을 사용하여 시스 -디스플레이를 위해 5'을 RepA 유전자에 클로닝하였다. 프라이머 C-CD N46V(서열 번호 51)를 사용하여 C 스트랜드 및 C:D 루프를 무작위화하고, 프라이머 F-FG-Sf E86I-R(서열 번호 52)을 사용하여 F 스트랜드 및 F:G 루프를 무작위화하였다. 프라이머 R1RecFor(서열 번호 53) 및 DigLigRev(서열 번호 54)로 최종 결찰물을 증폭하여 시험관내 전사/번역을 위한 TCL14 라이브러리를 생성시켰다. 표 6은 이용된 프라이머의 서열을 나타낸다. 다양화를 위해 코돈 NNS를 사용하였다(IUB 코드; N은 A, C, G, 또는 T를 나타내고; S는 C 또는 G를 나타냄).

TCL14 라이브러리의 특성화

TCON6(서열 번호 55) 및 TCON5 E86I 쇼트(서열 번호 56) 프라이머를 사용하여 리가아제 비의존성 클로닝 부위(pET154-LIC)를 함유하는 개질된 pET15 벡터(EMD 바이오사이언시즈(EMD Biosciences)) 내로 생성된 TCL14 라이브러리를 PCR 클로닝하고, 표준 프로토콜을 사용하는 형질전환 및 IPTG 유도(최종 1 mM, 16 시간 동안 30℃) 후에 C-말단 His6-태깅된 단백질로서 단백질을 발현시켰다. 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 이어서 0.2 mg/mL 계난백 라이소자임(미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))으로 보충된 버그버스터(Bugbuster) HT(뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD 케미칼스(EMD Chemicals))로 용해시켰다. 박테리아 용해물을 원심분리에 의해 청징화하고 상청액을 새로운 96 딥웰 플레이트에 이전하였다. 96 웰 Ni-NTA 멀티트랩 플레이트(Multitrap Plate)(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 GE 라이프사이언시즈(GE Lifesciences))를 사용하여 단백질을 정제하였다.

클론의 무작위 선택을 취하고 서열분석하여 라이브러리 내에서 얻어진 분포를 평가하였다. 라이브러리 내에서 관찰된 다양성은 예상된 것과 잘 일치하였다(도 7). 전체 길이 라이브러리 클론에서 관찰된 다양성을 계산하기 위하여, 다양화된 라이브러리 영역 내에서 주어진 아미노산이 나타나는 총 횟수를 모든 클론에서 계수하여 무작위 위치의 총 수(13개 무작위 라이브러리 위치 * 69개 전체 길이 클론)로 나누고 100을 곱하여 % 빈도를 산출하였다. 예상된 다양성은 하기의 아미노산 분포를 가진 NNS 축퇴성 코돈을 기반으로 한다: Phe=1, Leu=3, Ile=1, Met=1, Val=2, Ser=3, Pro=2, Thr=2, Ala=2, Cys=1, Arg=3, Gly=2, Tyr=1, His=1, Gln=1, Asn=1, Lys=1, Asp=1, Glu=1, Trp=1 코돈(들)을 코돈의 총 수(32)로 나누고 100을 곱하여 % 빈도를 산출한다.

정제된 단백질에 크기 배제 크로마토그래피를 적용하여 개별적인 라이브러리 구성원의 응집 성향을 결정하였다. 280 nm에서의 흡광도 판독을 동반하는 애질런트(Agilent) 1200 HPLC를 사용하여, 10 μL의 정제된 단백질을 수퍼덱스 75 5/150 컬럼 상에 주입함으로써 선택된 클론의 용출 프로파일을 결정하였다. 시스테인을 함유하지 않는 클론의 약 80%가 단량체성 단일 피크로서 용출됨으로써, 대부분의 개별적인 라이브러리 구성원이 모 분자의 고유한 용해도 및 구조를 유지했음을 의미했다. 자유 시스테인을 함유하는 일부 분자는 정제 후에 산화됨으로써 이량체성 분자로서 용출되는 것으로 확인되었다.

시차 주사 열량법(DSC)을 사용하여, SEC 분석에 의해 결정할 때 단분산 프로파일을 가진 클론을 추가로 특성화하였다. VP-DSC 모세관 셀 마이크로칼로리미터(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 마이크로칼, LLC) 내에서 PBS 중의 각각의 클론에 대해 0.5 mg/mL 용액을 35℃로부터 95℃까지 1℃/min의 속도로 가열함으로써 DSC 데이터를 얻었다. CpCalc(뉴저지주 피스카타웨이 소재의 마이크로칼, LLC) 소프트웨어를 사용하여 각각의 클론에 대해 용융 온도를 계산하였으며, 데이터의 요약은 표 7에 나타냈다. 시험 분자의 평균 용융 온도는 70 ± 9℃였다. 얻어진 데이터는 TCL14 라이브러리 설계가 모 분자 텐콘25의 현저한 양의 열 안정성(93℃)을 유지했으며 그 자체가 내재적으로 열에 안정하고 잘 접힌 스캐폴드 분자를 제조한다는 것을 나타낸다.

관심의 대상인 표적 분자에 특이적으로 결합하는 TCL14 라이브러리 분자의 선택

세포 표면 수용체 세포외 도메인, 사이토카인, 키나아제, 포스파타아제, 열 충격 단백질 및 면역글로불린, 및 그들의 단편으로 구성된 상이한 단백질 부류의 다양한 표적 단백질에 대해 TCL14 라이브러리를 스크리닝하여, 이들 단백질 및/또는 단백질 도메인에 특이적으로 결합하는 스캐폴드 분자를 동정하였다. HEK293 또는 E. 콜라이 세포에서 발현된 정제된 가용성 단백질을, EZ-링크 노-웨이트 설포-NHS-LC-바이오틴 마이크로튜브(EZ-Link No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotin Microtube)(일리노이주 록포드 소재의 써모 피셔(Thermo Fisher))를 사용하여 바이오틴화한 후, PBS 내로 완전히 투석하였다. 선택을 위하여, E. 콜라이 S30 리니어 익스트랙트(Linear Extract)(위스콘신주 메디슨 소재의 프로메가(Promega)) 내에서 3 μg의 TCL14 라이브러리를 시험관내 전사 및 번역(IVTT)하고, 발현된 라이브러리를 시스 블록(Cis Block)(2% BSA(미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치), 100 μg/ml 청어 정자 DNA(위스콘신주 메디슨 소재의 프로메가), 1 mg/mL 헤파린(미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치))으로 블로킹하였다. 선택을 위하여, 각각의 바이오틴화 표적 단백질을 400 nM(라운드 1), 200 nM(라운드 2 및 3), 및 100 nM(라운드 4 및 5)의 농도로 첨가하였다. 뉴트라비딘 자성 비드(일리노이주 록포드 소재의 써모 피셔)(라운드 1, 3, 및 5) 또는 스트렙타비딘 자성 비드(위스콘신주 메디슨 소재의 프로메가)(라운드 2 및 4)를 사용하여 결합된 라이브러리 구성원을 회수하고, 비드를 500 μL PBST로 5 내지 14회 세척한 후 500 μL PBS로 2회 세척함으로써 결합되지 않은 라이브러리 구성원을 제거하였다.

5 라운드의 선택 후에, DNA 산출물을 PCR에 의해 증폭하고 표준 프로토콜을 사용하여 pET154-LIC 내로 서브클로닝하였다.

2개의 표적 단백질에 대한 개선된 친화성을 가진 스캐폴드 분자를 동정하기 위하여 부가적인 선택 라운드를 수행하였다. 약술하면, 라운드 5로부터의 산출물을 상기와 같이 제조하고 하기의 변화를 동반하여 부가적인 반복 선택 라운드를 적용하였다: 바이오틴화 표적 단백질과의 인큐베이션을 1 시간에서 15 분으로 감소시켰고 비드 포획을 20 분에서 15 분으로 감소시켰으며, 바이오틴화 표적 단백질을 25 nM(라운드 6 및 7) 또는 2.5 nM(라운드 8 및 9)로 감소시켰고, 과량의 바이오틴화되지 않은 표적 단백질의 존재 하에 부가적인 1 시간 세척을 수행하였다. 이들 변화의 목적은, 잠재적으로 더 빠른 결합 속도 및 더 느린 해리 속도를 가지며 실질적으로 더 낮은 K _D 를 산출하는 바인더에 대해 동시에 선택하기 위한 것이었다. 제9 라운드 산출물을 상기와 같이 PCR 증폭하고, 클로닝하고, 발현시켰다.

관심의 대상인 단백질 및/또는 단백질 도메인에 결합하는 스캐폴드 분자의 시험관내 특성화

결합

라운드 5 선별 산출물로부터의 188개 개별적인 클론에 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA: enzyme linked immunosorbant assay)을 수행하였다. 맥시소프 플레이트(뉴욕주 로체스터 소재의 넌크(Nunc))를 0.1 μg 항-His 항체(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))로 밤새 코팅하고, 0.05% 트윈(Tween)-20을 가진 트리스-완충 식염수(pH 7.4)(TBST)로 세척하고, 스타팅 블록(Starting Block) T20(일리노이주 록포드 소재의 써모 피셔)을 사용하여 블로킹하였다. 1 μg/ml His ₆ -태그된 TCL14-RepA 융합체 또는 대조군 단백질(인간 혈청 알부민)을 함유하는 청징화된 박테리아 용해물을 코팅된 플레이트의 웰 상에 적용하였다. 플레이트를 1 시간 동안 인큐베이션하고, TBST로 세척하고, 몰리큘라 디바이시즈 M5 플레이트 판독기를 사용하여 스트렙타비딘-HRP(펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)) 및 POD 화학발광 기질(인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로쉐)로 바이오틴화 단백질을 검출하였다. 라이브러리의 성능을 적중률(hit rate)에 의해 산정하였다. 적중률은 대조군 신호보다 10-배 큰 발광 신호를 갖는 스캐폴드 분자를 스크리닝한 클론의 총 수(188)로 나눈 퍼센트(%)로서 정의된다. 표 8에 나타낸 바와 같이, TLC14 라이브러리는 8개 별개의 단백질에 대해 8% 내지 45% 범위의 적중률을 가진 스캐폴드 분자를 산출하였다. 사이토카인 2는 마우스 IL-17A이다.

마우스 IL-17A 바인더의 특성화

IL-17A 수용체 저해

마우스 IL-17A(mIL-17A)에 대한 라운드 5 및 9 선별 산출물이 mIL-17A 수용체에 대한 mIL-17A의 결합을 저해했는지를 결정하기 위하여 저해 분석을 수행하였다. 맥시소프 플레이트를 0.2 μg/ml mIL-17A 수용체 Fc 융합체(미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D 시스템즈(R&D Systems))로 밤새 코팅하고, 0.05% 트윈-20을 가진 포스페이트-완충 식염수(PBS)(pH 7.4)(TBST)로 세척하고, PBS 중의 2% BSA, 5% 수크로스로 블로킹하였다. PBS 중의 1% BSA에 1:50 희석한 청징화된 박테리아 용해물 내로 10 ng/ml 바이오틴화-mIL17A(b-mIL-17A)를 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 인큐베이션하였다. 블로킹된 플레이트를 세척하고 박테리아 용해물/b-mIL-17A 인큐베이션을 플레이트 상에 이전하였다. 플레이트를 부가적인 1 시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 세척하고, 스트렙타비딘-HRP(펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리서치) 및 OPD 비색성 기질(colorimetric substrate)(미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치)로 바이오틴화 단백질을 검출하였다. M5 플레이트 판독기(캘리포니아주 서니베일 소재의 몰리큘라 디바이시즈)를 사용하여 490 nm에서의 흡광도를 판독하고 데이터를 % 저해로 변환하였다. mIL-17A:mIL-17 수용체 결합에 대한 퍼센트 저해는 100-(샘플/음성 대조군 × 100)으로서 정의되었다.

100 μl의 정제된 TCL14-His(Ni-NTA) 융합 단백질을 10 μM 내지 56 pM의 농도로 분석에 사용한 점을 제외하고는, 상기 프로토콜을 사용하여, mIL-17A:mIL-17 수용체 상호작용을 저해하는 스캐폴드 분자를 함유하는 선택된 박테리아 용해물을 투여량 반응 저해 분석(dose response inhibition assay)에서 추가로 특성화하였다. S형 투여량 반응 적합(sigmoidal dose response fit)을 사용하여 투여량 반응 곡선으로부터 IC50 값을 계산하였다. 표 9에 요약된 바와 같이, mIL-17A 특이적 저해제의 IC50은 약 9 내지 약 428 pM의 범위이다.

친화성 측정

프로테온(ProteOn) XPR-36 기기(바이오-라드(Bio-Rad))를 사용하는 표면 플라스몬 공명을 사용하여, mIL-17A에 결합하는 선택된 분자의 친화성을 측정하였다. pH 5.0 및 30 μL/min의 유속에서 5 분 동안 변동 밀도(100 내지 300 Rus)로 아민 커플링을 통해, 정제된 분자를 칩 상에 직접 고정하였다. 100 nM에서 3-배 농도 시리즈로 희석된 mIL-17A를, 칩 표면 상의 상이한 분자에 대한 그들의 결합에 대해 시험하였다. 모든 샘플의 모든 농도에 대한 해리 단계(dissociation phase)를, 그들의 해리 속도에 따라 100 μL/min의 유속에서 1 내지 2 시간 동안 모니터링하였다. 완충제 샘플을 주입하여 기준선 안정성을 모니터링하였으며, 표면은 추가 사용을 위해 재생하지 않았다. TLC14 라이브러리로부터 선택된 스캐폴드 분자의 각각의 상이한 표면에 대한 모든 농도 시리즈의 반응 데이터를 1:1 단순 랑뮤어 결합 모델(simple langmuir binding model)에 전체적으로 적합시켜 동역학적 상수(k _on , k _off ) 및 친화성 상수( K _D )의 추산값을 얻었다. 표 9에 요약된 바와 같이, mIL-17A에 특이적으로 결합하는 스캐폴드 분자의 친화성은 서브나노몰 범위에 있었다.

선택된 mIL-17A 바인더의 서열은 서열 번호 85 내지 96에 나타내며, C 및 F 베타-스트랜드 및 CD 및 FG 루프의 서열은 표 10에 나타낸다.

실시예 4: 제2 대체 표면에서 무작위화된 텐콘27 라이브러리

도 2c에 가시화된 바와 같이, 텐콘27 상의 제2 대체 표면은, A 베타-스트랜드, AB 루프, B 베타-스트랜드, BC 루프, 및 E 베타-스트랜드에 의해 형성된, 본 명세서에서 A-AB-B-BC-E 표면이라고 칭하는, C-CD-F-FG 표면의 대향 측면 상에 있다. A-AB-B-BC-E 표면 또한 약간 요면이며, 표면을 형성하는 잔기의 서브세트를 무작위화함으로써 단백질 스캐폴드 상호작용 표면의 라이브러리를 설계하기 위한 주형으로 사용할 수 있다. 베타-스트랜드는, 하나 걸러서 잔기의 측쇄가 단백질의 표면에 노출된 반복 구조를 갖는다. 따라서, 베타-스트랜드 내의 표면 노출된 잔기의 일부 또는 전부를 무작위화함으로써 라이브러리를 제조할 수 있다. 베타-스트랜드 내의 적절한 잔기를 선택함으로써, 다른 단백질과 상호작용하기 위한 독특한 스캐폴드 표면을 제공하면서도 텐콘27 스캐폴드의 내재적 안정성의 훼손을 최소화해야 한다. A-AB-B-BC-E 표면의 무작위화는 TCL14 라이브러리 설계에 비교할 때 텐콘27 구조의 대향 측면 상에 결합 표면을 생성시킬 것이다. 무작위화된 A-AB-B-BC-E 표면을 가진 텐콘27 상의 라이브러리 설계는 서열 번호 61(TCL15 라이브러리) 및 도 6에 나타낸다.

TCL15 라이브러리(서열 번호 61):

여기서 X는 임의의 아미노산이다.

TCL14 라이브러리에 대해 상기한 바와 같이 표적 분자에 특이적으로 결합하는 스캐폴드에 대해 TCL15 라이브러리를 생성시키고 선택한다.

실시예 5: 다른 FN3 도메인: 대체 표면의 무작위화에 의한 라이브러리의 생성

FN3 도메인 사이의 구조적 유사성으로 인하여, 텐콘27 스캐폴드에 대한 실시예에 기재된 대체 표면을 이용하는 라이브러리 설계를 다양한 단백질의 다른 FN3 도메인에 적용할 수 있다. 이러한 FN3 도메인은 천연 발생적이거나 합성될 수 있으며, 예를 들어, 피브로넥틴 도메인의 컨센서스 서열(미국 특허 공개 제2010/0255056호)을 기반으로 하는 피브콘 컨센서스 스캐폴드(서열 번호 58), 인간 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인(FN10)(서열 번호 97), 또는 인간 테나신으로부터의 제3 FN3 도메인(TN3)(서열 번호 3), 또는 표 1에 열거된 단백질 내에 존재하는 임의의 FN3 도메인이다.

무작위화된 C-CD-F-FG 대체 표면을 가진 피브콘, FN10, 및 TN3 라이브러리에 대한 라이브러리 설계는 도 8 및 서열 번호 62, 98, 및 99에 각각 나타낸다. 본 명세서에 기재된 프로토콜을 사용하여, 설계된 라이브러리를 합성하고, 발현시키고, 특이적 바인더에 대해 선택한다.

무작위화된 C-CD-F-FG 표면을 가진 피브콘-기반의 단백질 스캐폴드 라이브러리(서열 번호 62):

여기서 X는 임의의 아미노산이다.

무작위화된 C-CD-F-FG 표면을 가진 FN10-기반의 단백질 스캐폴드 라이브러리(서열 번호 98):

여기서 X는 임의의 아미노산이다.

무작위화된 C-CD-F-FG 표면을 가진 TN3-기반의 단백질 스캐폴드 라이브러리(서열 번호 99):

여기서 X는 임의의 아미노산이다.

텐콘27 스캐폴드에 대해 기재된 바와 유사하게, 다른 FN3 도메인의 CD 및/또는 FG 루프를 구성하는 잔기의 일부 또는 전부를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개 무작위화된 위치로 대체하여 상이한 길이의 라이브러리를 생성시킬 수 있다.

본 발명은 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에서 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시할 수 있음이 명백할 것이다. 상기 교시 내용에 비추어 본 발명의 많은 변형 및 변경이 가능하며, 따라서 이들은 첨부된 특허청구범위의 범주 내이다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. <120> Fibronectin Type III Repeat Based Protein Scaffolds With Alternative Binding Surfaces <130> CEN5315WOPCT <140> To Be Assigned <141> 2012-09-27 <150> 61/539670 <151> 2011-09-27 <160> 101 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 87 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Ser Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val 1 5 10 15 Asn Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val 20 25 30 Tyr Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro 35 40 45 Gly Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu 50 55 60 Tyr Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro 65 70 75 80 Val Ser Ala Arg Val Ala Thr 85 <210> 2 <211> 95 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe Lys Ser Ile Lys Glu 1 5 10 15 Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp Ile Ala Phe Glu Thr 20 25 30 Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu Asp Glu Gly Glu Ile 35 40 45 Thr Lys 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improving stability <400> 22 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Se r Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 23 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus FN3 sequence based on tenascin C FN3 domains with additional mutations improving stability <400> 23 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 24 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial s equence <220> <223> Consensus FN3 sequence based on tenascin C FN3 domains with additional mutations improving stability <400> 24 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Pro Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 25 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus FN3 sequence based on tenascin C FN3 domains with additional mutations improving stability <400> 25 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 26 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus FN3 sequence based on tenascin C FN3 domains with additional mutations improving stability <400> 26 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 27 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus FN3 sequence based on tenascin C FN3 domains with additional mutations improving stability <400> 27 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 28 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TCL14 library based on tencon27 scaffold with randomized C-CD-F-FG surface <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (38)..(41) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (70)..(70) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (78)..(79) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 28 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold A strand sequence <400> 29 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val 1 5 10 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold AB loop <400> 30 Thr Glu Asp Ser 1 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold B strand <400> 31 Ala Arg Leu Ser Trp 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold BC loop <400> 32 Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold C strand <400> 33 Asp Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold CD loop <400> 34 Ser Glu Lys Val Gly Glu 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold D strand <400> 35 Ala Ile Val Leu Thr Val Pro 1 5 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold DE loop <400> 36 Gly Ser Glu Arg 1 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold E strand <400> 37 Ser Tyr Asp Leu Thr 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold EF loop <400> 38 Gly Leu Lys Pro Gly 1 5 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold F strand <400> 39 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val 1 5 10 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold FG loop <400> 40 Lys Gly Gly His Arg Ser Asn 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold G strand <400> 41 Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 1 5 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold C strand and CD loop <400> 42 Asp Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold F strand and FG loop <400> 43 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 1 5 10 15 Asn <210> 44 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Tencon27 scaffold A strand, AB loop, B strand and BC loop <400> 44 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 1 0 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe 20 25 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TCL14 library C strand <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 45 Asp Ser Phe Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Glu 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TCL14 library F strand <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 46 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val 1 5 10 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TCL14 library C strand and CD loop <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 47 Asp Ser Phe Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu 1 5 10 15 <210> 48 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TCL14 library F strand and FG loop <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be any naturally occurring ami no acid <400> 48 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa <210> 49 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TCL15 library A strand, AB loop, B strand and BC loop <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(16) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 49 Leu Pro Ala Pro Lys Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Ala Xaa Leu Xaa Trp Xaa Ala Pro Asp Ala Ala Phe 20 25 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TCL15 library E strand <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 50 Xaa Tyr Xaa Leu Thr 1 5 <210> 51 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> s is g or c <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> s is g or c <220> <221> misc_feature <222> (31)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> s is g or c <220> <221> misc_feature <222> (37)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> s is g or c <220> <221> misc_feature <222> (40)..(41) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42 ) <223> s is g or c <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> s is g or c <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> s is g or c <400> 51 gcggcgttcg actctttcnn satcnnstac nnsgaannsn nsnnsnnsgg tgaagcgatc 60 ggtctgaccg ttccgggttc tgaacgttct tacgacctga ccggtctgaa accgggtacc 120 gaatac 126 <210> 52 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> s is c or g <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> s is c or g <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> s is c or g <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> s is c or g <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> s is c or g <220> <221> misc_feature <222> (59)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> s is c or g <220> <221> misc_feature <222> (65)..(66) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 ggtggtgaag atcgcagaca gcggsnnaga snnsnnacca cctttaacac csnngatsnn 60 aacsnngtat tcggtacccg gtttcagacc ggtcaggtcg ta 102 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 53 gaacgcggct acaattaata cataacc 27 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 54 catgattacg ccaagctcag aa 22 <210> 55 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 55 aagaaggaga accggtatgc tgccggcgcc gaaaaac 37 <210> 56 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 56 gagccgccgc caccggttta atggtgatgg tgatggtgac caccggtggt gaagatcgca 60 gacag 65 <210> 57 <211> 2201 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 57 Met Gly Ala Met Thr Gln Leu Leu A la Gly Val Phe Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys Val Ile Arg His Lys 20 25 30 Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val 35 40 45 Val Phe Asn His Val Tyr Asn Ile Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys 50 55 60 Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro 65 70 75 80 Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn 85 90 95 Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly 100 105 110 Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu 115 120 125 Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Cys Thr Ala Gly Ala 130 135 140 Gly Cys Cys Leu Gln Pro Ala Thr Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe 145 150 155 160 Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Ser Thr Glu Gly Cys Gly Cys Val Cys 165 170 175 Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu Pro Glu Cys Pro Gly 180 185 190 Asn Cys His Leu Arg Gly Arg Cys Ile Asp 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<220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (78)..(79) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 62 Leu Asp Ala Pro Thr Asp Leu Gln Val Thr Asn Val Thr Asp Thr Ser 1 5 10 15 Ile Thr Val Ser Trp Thr Pro Pro Ser Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Pro Lys Glu Leu Thr 35 40 45 Val Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Thr Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly 50 55 60 Val Glu Tyr Xaa Val Xaa Leu Xaa Ala Leu Lys Asp Asn Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Val Gly Thr Gln Thr Thr 85 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C strand sequence of scaffold TP1KR9P61-A2 <400> 63 Asp Ser Phe Ala Ile Glu Tyr Phe Glu 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> C strand sequence of clone TP1KR9P62-A2 <400> 64 Asp Ser Phe Ala Ile Glu Tyr 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can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> Xaa can be any naturally occurring am ino acid <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (73)..(73) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (83)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 98 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro 50 55 60 Gly Val Asp Tyr Xaa Ile Xaa Val Xaa Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp 65 70 75 80 Ser Pro Xaa Xaa Ser Xaa Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 <210> 99 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TN3 based scaffodl library with randomized C-CD-F-FG surface <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (37)..(40) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (67)..(67) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (71)..(71) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (80)..(80) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 99 Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala 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