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항체 특이성을 재지시하기 위한 고 친화성 어댑터 분자{HIGH AFFINITY ADAPTOR MOLECULES FOR REDIRECTING ANTIBODY SPECIFITY}
관련 출원 본 출원은 2009년 10월 5일자로 출원된 미국 가특허원 제61/248,778호, 및 2009년 11월 2일자로 출원된 미국 가특허원 제61/257,351호에 대한 우선권을 주장한다. 위에서 언급한 출원들의 전체 내용은 본 출원에서 참조로 인용된다.
면역계를 재지시(redirecting)하여 새로운 표적을 공격하는 개념은 표적화된 면역치료요법을 위한 매력적인 전략으로서 과학자에게 장기간 흥미를 끌어왔다. 천연적으로 순환하는 사람 항체를 재지시하여 암, 자가면역병 및 감염성 질병과 같은 질병 부위에서 바람직한 표적을 공격함으로써, 구체적인 면역화에 대한 요구를 피할 수 있다. 비록 당해 전략이 성공의 조기 징후를 나타내어 왔지만, 대부분은 연구는 시험관내 입증사실을 능가하여 진행되지 않아 왔다. 예를 들어, 당해 전략은 일반적인 집단에서 이미 존재하는 항체를 사용하고 경구 투여에 적합하도록 제조할 수 있는 경우에 특히 가치가 있을 수 있었다. 따라서, 항체 특이성을 재지시하는 개선된 방법에 대해 당해 분야의 요구가 존재한다.
본 발명은 고 결합 특이성 및 선택성으로 항체 및 목적한 표적 분자(target molecule) 둘 다에 결합하는 분리된 어댑터 분자(adaptor molecule), 특히 이중특이적인 어댑터 펩타이드를 제공한다. 이들의 고 결합 친화성 및 선택성으로 인하여, 본 발명의 어댑터 분자는 항체 분자에 의해 일반적으로 결합되지 않는 표적 분자에 대한 순환 항체를 효율적으로 재지시킬 수 있다. 또한, 본 출원에 기술된 어댑터 분자는 전통적인 항체-매개된 치료제보다 하나 이상의 다음과 같은 이점을 제공한다: 1) 다중 항체-부류 효과기 기능의 동시적인 재보충 능력; 2) 본 발명의 방법을 사용하여 신속하게 개발할 수 있는 가능성; 3) 제품의 낮은 비용; 및 4) 대상체에게 투여시 IgE-매개된 고민감성 반응(hypersensitivity reaction)의 비유발. 어댑터 분자는 일반적으로 하나 이상의 리간드 잔기에 연결된 하나 이상의 표적화 잔기(targeting moiety)를 포함한다. 특정의 양태에서, 리간드 잔기는 하나 이상의 Gal 항원(예를 들면, Gal-α-1-3-Gal) 또는 이의 모사체(mimetic)를 포함한다. 하나의 양태에서, 표적화 잔기는 펩타이드, 예를 들면, VEGF 또는 TNFα-결합 펩타이드를 포함한다. 예시적인 VEGF-결합 펩타이드는 서열 번호: 1, 2, 3, 및/또는 4에 설정된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 바람직한 양태에서, 펩타이드(예를 들면, 서열 번호 1, 2, 3, 및/또는 4에 설정된 펩타이드 서열)은 하나 이상의 Gal 항원을 포함하는 리간드 잔기(예를 들면, Gal-α-1-3-Gal 이당류)를 포함하는 리간드 잔기에 연결되어 있다. 다른 양태에서, 표적화 잔기는 하나 이상의 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 적합한 항체는 아브킥시마브(Abciximab), 아달리무마브, 알렘투주마브, 바실릭시마브, 베바키주마브, 세툭시마브, 세르톨리주마브 페골, 다클리주마브, 에쿨리주마브, 에팔리주마브, 겜투주마브, 이브리투모마브 티욱세탄, 인플릭시마브, 무로모나브-CD3, 나탈리주마브, 오말리주마브, 팔리비주마브, 파니투무마브, 라니비주마브, 리툭시마브, 토시투모마브, 트라스투주마브, 및/또는 골리무마브, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 양태에서, 항체(예를 들면, 하나 이상의 상기 기재된 항체) 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 Gal 항원(예를 들면, Gal-α-1-3-Gal)을 포함하는 리간드 잔기에 연결된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체(예를 들면, 하나 이상의 상기 기재된 항체) 또는 이의 항원 결합 단편은 하나의 Gal-α-1-3-Gal 이당류를 포함하는 리간드 잔기에 연결된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 하나 이상의 Gal 항원을 포함하는 리간드 잔기(예를 들면, Gal-α-1-3-Gal)는 항체의 하나 이상의 가변 영역에 연결된다. 다른 양태에서, 표적화 잔기는 항체-유사 분자를 포함한다. 적합한 항체-유사 분자는 아드넥틴(Adnectins), 아피보디(Affibodies), DARPins, 안티칼린, 아비머(Avimers), 및 베르사보디(Versabodies), 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 양태에서, 항체-유사 분자는 하나 이상의 Gal 항원을 포함하는 리간드 잔기(예를 들면, Gal-α-1-3-Gal)에 연결된다. 다른 양태에서, 본 발명의 표적화 잔기는 세포 표면 수용체의 세포외 부위, 또는 이의 단편을 포함한다. 적합한 세포 표면 수용체는 TNF 계열 수용체(예를 들면, TNFα 수용체, 예를 들면, 사람 TNFα 수용체) 및, 타이로신 키나제 계열의 성장 인자 수용체(예를 들면, p185HER2)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 양태에서, 세포 표면 수용체 분자의 세포외 부위는 하나 이상의 Gal 항원을 포함하는 리간드 잔기(예를 들면, Gal-α-1-3-Gal)에 연결된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 세포 표면 수용체 분자의 세포외 부위는 하나의 Gal-α-1-3-Gal 이당류를 포함하는 리간드 잔기에 연결된다. 다른 양태에서, 표적화 잔기는 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 포함한다. 바람직한 양태에서, 리간드는 하나 이상의 Gal 항원을 포함하는 리간드 잔기(예를 들면, Gal-α-1-3-Gal)에 연결된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 리간드는 하나의 Gal-α-1-3-Gal 이당류를 포함하는 리간드 잔기에 연결된다. 또 다른 국면에서, 본 발명은 또한 후보 표적화 분자의 집단을 암호화하는 무작위화 라이브러리(randomized library)를 제공하는 단계; 표적 분자에 고 친화성 및/또는 선택성으로 결합하는 디스플레이 라이브러리로부터 표적화 잔기를 선택하는 단계; 상기 표적화 잔기를 연결 잔기를 통해 리간드 잔기에 연결시켜 후보 어댑터 분자를 형성시키는 단계; 및 상기 표적 분자에 대한 순환 항체의 특이성을 재지시하는 후보 어댑터 분자의 능력을 평가하는 단계를 포함하는, 분리된 어댑터 분자의 확인 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 스크리닝 방법은 합성 펩타이드 라이브러리의 mRNA 디스플레이, 리보소옴 디스플레이, 효모 디스플레이, 파아지 디스플레이 또는 스크리닝을 포함한다. 하나의 바람직한 양태에서, mRNA 디스플레이 라이브러리는 표적화 펩타이드를 선택하는데 사용된다. 다른 바람직한 양태에서, 파아지 디스플레이 라이브러리는 표적화 펩타이드를 선택하는데 사용된다.
본 명세서는 특히 항체 및 표적 분자 둘다에 고 결합 친화성 및 선택성으로 결합하는 신규한, 어댑터 분자의 확인 및 생산을 기술한다. 본 출원에 사용된 것으로서, 용어 "어댑터(adaptor)"는, 항체가 일반적으로 결합하지 않는 표적 분자와 항체 사이의 기능적 상호작용을 촉진시키는 펩타이드의 능력을 말한다. 예를 들면, 본 발명의 어댑터 분자는 항체 및 표적 분자 둘다에 결합함으로써 항체 및 표적이 서로 밀접하게 근접하도록 한다. 특정의 양태에서, 항체는 표적 분자에 대한 항체 반응을 촉진할 수 있다. 예시적인 항체 반응은 표적 분자(예를 들면, 사이토킨 또는 성장 인자와 같은 가용성 인자)의 중화 또는 옵소닌화(opsonization)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 표적 분자가 바이러스의 표면에 존재하는 경우, 항체는 바이러스의 중화 또는 옵소닌화를 촉진할 수 있다. 다른 양태에서, 표적 분자는 세포(예를 들면, 감염된 세포 또는 종양 세포)의 표면에 존재할 수 있으며 어댑터 펩타이드에 의한 세포에 대한 항체의 보충은 항체-매개된 효과기 반응[예를 들면, 보체 카스카제(complement cascase) 또는 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)의 유도]을 촉진한다. 본 출원에 기재된 어댑터 분자들은, 이들이 호염기구를 인식할 정도로 활성화시키지 않고, 이에 따라 대상체에게 투여되는 경우 IgE 고민감성 반응을 유발시키지 않는다는 점에서 특히 유리하다. 본 발명의 어댑터 분자는 적어도 3개의 잔기: (a) 표적화 잔기, (b) 리간드 잔기 및 (c) 링커 잔기를 포함한다. 표적화 잔기 (a)는 표적 분자에 고 친화성 및/또는 선택성으로 결합하는 잔기이다. 리간드 잔기 (b)는, 순환 항체가 고 친화성 및/또는 선택성으로 결합하는 잔기이다. 표적화 잔기 및 리간드 잔기는 개재하는(intervening) 링커 잔기 (c)를 통해 작동적으로 연결된다. 상기 링커 잔기는 공유결합, 화학적 링커, 또는 펩타이드 아미노산 서열, 또는 어댑터 펩타이드의 표적화 및 리간드 잔기를 연결시킬 수 있는 임의의 다른 잔기일 수 있다. (a) 표적화 잔기 본 발명의 표적화 잔기는 표적 분자에 대한 고 친화성 및/또는 선택성으로 결합하는 이의 능력에 대해 선택되어 진다. 특정의 양태에서, 표적화 잔기는 100 나노몰 이하(예를 들면, 10 nM 이하, 1nM 이하, 100pM 이하, 10pM 이하, 또는 1pM 이하)의 해리상수(KD)로 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 다른 양태에서, 표적화 잔기는 고 선택성을 나타낸다. "특이적으로 결합한다"라는 표현은, 잔기가 시료, 예를 들면, 생물학적 시료 속에서 표적 분자를 인식하여 이와 상호작용하지만 다른 분자는 실질적으로 인식하여 상호작용하지 않음을 의미한다. 특정의 양태에서, 표적 분자에 대한 표적화 잔기의 결합 친화성은 비-표적 분자에 대한 이의 결합 친화성보다 적어도 1000 배 더 높다(예를 들면, 10 3 배, 10 4 배, 10 5 배, 10 6 배, 또는 10 7 배 더 높다). 표적화 잔기는 사실상 임의의 표적 분자에 대해 고 선택성 및/또는 친화성으로 결합하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 특정의 양태에서, 표적화 잔기는 바이러스(예를 들면, HAV, HBV, 또는 HCV, HIV, 인플루엔자 바이러스), 세균, 효모, 기생충, 또는 진균으로부터의 표면 단백질 또는 항원을 포함하나, 이에 한정되지 않는 병원체-관련 표적 분자에 결합한다. 다른 양태에서, 표적 분자는 감염된 숙주 세포 또는 종양 세포로부터의 세포 표면 항원 또는 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포 표면 단백질이다. 예시적인 종양 -관련 항원은 타이로신 키나제 계열의 성장 인자 수용체, p185HER2를 포함한다. 다른 양태에서, 표적 분자는 호르몬 또는 성장 인자이다. 예시적인 호르몬 또는 성장 인자는 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함한다. 다른 양태에서, 표적 분자는 항체(예를 들면, 자가-항체)이다. 하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 표적화 잔기는 펩타이드 잔기를 포함한다. 펩타이드 표적화 잔기의 길이는 바람직하게는 적어도 3 내지 200개 아미노산, 바람직하게는 적어도 3 내지 100개 아미노산, 보다 바람직하게는 3 내지 50개 아미노산, 및 여전히 보다 바람직하게는 3 내지 30개 아미노산(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 아미노산)이다. 표적화 잔기로서 사용하기 위한 예시적인 펩타이드는, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 제WO/2010/014830호에 기술되어 있다. 바람직한 양태에서, 펩타이드는 임의의 하나 이상의 다음 아미노산 서열, 또는 이의 VEGF-결합 부위를 포함하거나 이로 이루어진 VEGF-결합 펩타이드이다: 서열 번호 1 H-Gly-Val-Gln-Glu-Asp-Val-Ser-Ser-Thr-Leu-Gly-Ser-Trp-Val-Leu-Leu-Pro-Phe-His-Arg-Gly-Thr-Arg-Leu-Ser-Val-Trp-Val-Thr 서열 번호 2 H-Gly-Gly-Phe-Glu-Gly-Leu-Ser-Gln-Ala-Arg-Lys-Asp-Gln-Leu-Trp-Leu-Phe-Leu-Met-Gln-His-Ile-Arg-Ser-Tyr-Arg-Thr-Ile-Thr 서열 번호 3 H-Gly-Val-Gly-Gly-Ser-Arg-Leu-Glu-Ala-Tyr-Lys-Lys-Asp-His-Arg-Val-Phe-Gln-Met-Ala-Trp-Leu-Gln-Tyr-Tyr-Trp-Ser-Thr-Thr; 및/또는 서열 번호 4 H-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Asn-Ala-Leu-His-Trp-Val-Cys-Ala-Ser-Asn-Ile-Cys-Trp-Arg-Thr-Pro-Trp-Ala-Gly-Gln-Leu-Trp-Gly-Leu-Val-Arg-Leu-Thr. 다른 양태에서, 본 발명의 표적화 잔기는 항체, 또는 이의 결합 단편(예를 들면, CDR (예를 들면, CDRH3), 가변 도메인(VH 또는 VL), 또는 Fab 단편)을 포함한다. 동물 종으로부터의 임의의 항체, 또는 이의 단편은 본 출원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용하기 위해 고려된다. 적합한 항체 및 항체 단편은 단일쇄 항체[참조: 예를 들면, 이의 각각의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 Bird et al . (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al . (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883], 도메인 항체(참조: 예를 들면, 이들 각각의 전문이 본 출원에 참조로 인용된, 미국 특허 제6,291,158호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,172,197호; 제6,696,245호), 나노보디(nanobody)(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,765,087호), 및 유니보디(UniBody)(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 제W02007/059782호)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 양태에서, 항체는 아브킥시마브, 아달리무마브, 알렘투주마브, 바실릭시마브, 베카키주마브, 세툭시마브, 세르톨리주마브 페골, 다클리주마브, 에쿨리주마브, 에팔리주마브, 겜투주마브, 이브리투모마브 티욱세탄, 인플릭시마브, 무로모나브-CD3, 나탈리주바브, 오말리주마브, 팔리비주마브, 파니투무마브, 라니비주마브, 리툭시마브, 토시투모마브, 트라스투주마브 및/또는 골리무마브, 또는 이의 항원 결합 단편이다. 다른 양태에서, 본 발명의 표적화 잔기는 항체-유사 분자를 포함한다. 적합한 항체-유사 분자는 아드넥틴(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 제WO 2009/083804호), 아피보디(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,831,012호), DARPin(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허원 공보 제2004/0132028호), 안티칼린(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허 제7,250,297호), 아비머(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허원 공보 제200610286603호), 및 베르사보디(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허원 공보 제2007/0191272호)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 양태에서, 본 발명의 표적화 잔기는 세포 표면 수용체에 대한 리간드를 포함하며, 여기서, 리간드는 상기 세포 표면 수용체를 발현하는 세포에 어댑터 분자를 보충할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 표적화 잔기는 세포 표면 수용체, 또는 이의 단편의 세포외 부위를 포함하며, 여기서, 세포 표면 수용체, 또는 이의 단편은 어댑터 분자를 상기 세포 표면 수용체의 인지체 리간드(cognate ligand)에 보충할 수 있다. 적합한 세포 표면 수용체는 TNF 계열 수용체(예를 들면, TNFα 수용체, 예를 들면, 사람 TNFα 수용체) 및, 타이로신 카나제 계열의 성장 인자 수용체(예를 들면, p185HER2)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정의 예시적인 양태에서, 본 발명의 표적화 잔기는 Fc 융합 단백질 또는 면역부착소(immunoadhesin)(예를 들면, 에타네라셉트(Etaneracept)와 같은 TNF 수용체-Fc 융합체)를 포함한다.
(b) 리간드 잔기 본 발명의 리간드 잔기는 대상체내에 존재하는 면역부착소(Fc 융합체 단백질)에 의해 결합된 항원성 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 리간드 잔기는 순환 항체에 의해 결합된다. 순환 항체는 천연적으로 획득된 면역성으로 인해 대상체내에 존재할 수 있다. 대안적으로, 순환 항체는 대상체의 사전 예방접종의 결과로 존재한다. 예를 들면, 순환 항체는 천연두, 홍역, 볼거리, 풍진, 헤르페스, 간염 및 소아마비에 대한 유아 예방접종의 결과로서 존재할 수 있다. 따라서, 리간드 잔기는 이들 순환 항체에 의해 인식되는 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 양태에서, 리간드 잔기는 대상체에게 투여된 항체와 상호작용한다. 예를 들면, 본 발명의 어댑터 분자의 리간드 잔기와 상호작용하는 항체는 어댑터 분자와 함께 동시-투여될 수 있다. 또한, 리간드 잔기와 상호작용하는 항체는 대상체내에 정상적으로 존재할 수 없지만, 대상체는 생물학적 물질 또는 항원(예를 들면, 혈청, 혈액, 또는 조직)의 도입에 의해 항체를 획득함으로써 대상체내에서 고 역가(high titer)의 항체를 생성한다. 예를 들면, 수혈받은 대상체는 다수의 항체를 획득하며, 이들 중 일부는 어댑터 펩타이드의 리간드 잔기와 상호작용할 수 있다. 리간드 잔기는 펩타이드, 탄수화물, 지질, 항체 또는 항체-유사 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체에 결합할 수 있는 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 리간드 잔기(예를 들면, 펩타이드, 항체 또는 항체-유사 분자)는 하나 이상의 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 리간드 잔기는 "고-역가 항체"에 결합하는 에피토프를 포함한다. 본 출원에 사용된 것으로서 용어 "고-역가 항체"는 항원(예를 들면, 항원성 도메인상의 에피토프)에 대해 고 친화성을 갖는 항체를 말한다. 예를 들면, 고체-상 효소 결합된 면역흡착성 검정(ELISA)에서, 고 역가 항체는 혈청을 적절한 희석 완충액 속에서 대략 1:100 내지 1:1000의 범위로 희석한 후 검정물 속에 양성으로 잔류하는 혈청 시료 중에 존재하는 항체에 상응한다. 다른 희석 범위는 1:200 내지 1:1000, 1:200 내지 1:900, 1:300 내지 1:900, 1:300 내지 1:800, 1:400 내지 1:800, 1:400 내지 1:700, 1:400 내지 1:600, 등을 포함한다. 특정의 양태에서, 혈청과 희석 완충액 사이의 비는 대략 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 1:500, 1:550, 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950, 1:1000이다. 특정의 양태에서, 리간드 잔기는 항체의 공지된 표적 분자(예를 들면, 병원체, 종양 세포 또는 감염된 숙주 세포로부터의 표면 단백질)로부터 수득된 항원성 펩타이드이다. 펩타이드 리간드 잔기의 길이는 바람직하게는 적어도 3 내지 200개 아미노산, 바람직하게는 적어도 3 내지 100개 아미노산, 보다 바람직하게는 3 내지 50개 아미노산, 및 여전히 보다 바람직하게는 10 내지 25개 아미노산(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 아미노산)이다. 일부 양태에서, 펩타이드는 천연 아미노산으로 구성된다. 다른 양태에서, 펩타이드는 하나 이상의 비-천연 아미노산(예를 들면, D-아미노산)을 포함한다. 특정의 양태에서, 리간드 잔기는 글리코실화된 리간드 잔기이다. 글리코실화된 리간드 잔기는 대상체내에서 항체에 의해 인식된 항원성 당류 또는 글리칸 잔기를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 글리코실화된 리간드 잔기는 어댑터 분자의 표적화 잔기에 적접 또는 간접적으로(즉, 링커 잔기를 통해) 연결된다. 이러한 리간드 잔기는 항원성 펩타이드 잔기를 결여한다. 다른 양태에서, 글리코실화된 리간드 잔기는 추가의 항원성 펩타이드 성분(예를 들면, 병원체의 펩타이드 또는 에피토프를 포함하는 항원성 도메인)을 포함하는 당펩타이드이다. 예시적인 글리코실화된 리간드 잔기는 혈액 그룹 항원으로부터 기원한다. 이들 항원은 일반적으로 적혈구 세포막의 외부에 위치하는 표면 마커이다. 이들 표면 마커 중 대부분은 단백질이나, 일부는 지질 또는 단백질에 부착된 탄수화물이다. 구조적으로, 본 출원에 기술된 양태들과 함께 사용될 수 있는 혈액 그룹 결정인자는 제I 형 및 제II 형으로 공지된 2개의 기본 범주에 속한다. 제I 형은 N-아세틸 글루코사민에 연결된 갈락토즈 1-3 β으로 구성된 반면, 제II 형은, 대신에, 동일한 구조 블록 사이에 1-4β연결을 포함한다. 이들 골격 구조의 푸코실화의 위치 및 정도는 루이스-유형 및 H-유형 특이성을 생성한다. 예를 들면, 골격내 갈락토즈 잔기내 C2-하이드록실에서 단독으로, α-모노푸코실 측쇄의 존재는 H-유형 특이성(제I 형 및 제II 형)을 구성하는 반면, α-연결된 갈락토즈 또는 α-연결된 N-아세틸갈락토사민의 치환에 의한 추가의 순열(permutation)은 친숙한 혈청학적 혈액 그룹 분류, A, B 및 O의 분자 기준을 제공한다. 혈액 그룹 항원의 환자의 특수 세트를 우선 결정함으로써, 환자의 레퍼토리에서 제외된 하나 이상의 혈액 그룹 항원을 포함하는 리간드 잔기를 선택하여 당해 리간드 잔기를 포함하는 어댑터 분자에 대한 강력한 반응을 생성시킴으로써 상기 어댑터 분자의 표적화 잔기에 의해 결합된 표적 분자에 대해 환자에 존재하는 항체를 재지시할 수 있다. 예시적인 혈액 그룹 항원은 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허 제7,318,926호의 표 2에 상세히 나타나 있다. 특정의 바람직한 양태에서, 글리코실화된 리간드 잔기는 gal 항원의 하나 이상의 gal-α-1-3 gal 이당류 당 단위를 포함한다. gal 항원은 돼지, 마우스 및 뉴 월드 원숭이(New World monkey)의 세포에서 글리코실화 효소 갈락토실트랜스퍼라제(α(1,3)GT)에 의해 다량으로 생산된다. 사람 및 올드 월드 영장류(Old World primate)는 gal 항원을 결여하고 있으므로, 이들은 이에 대해 면역내성이 아니며 위장 세균에 의한 항원성 자극에 반응하여 생애 전체에서 항-gal 항원 항체(항-Gal)를 생산한다. 항-gal 항체는 사람에서 순환 IgG의 2% 이상 및 순환 IgM의 1 내지 8%를 나타내는 것으로 추정하였다. 공여체 기관내 내피 세포의 표면의 당지질 및 당단백질에서 발현된 gal 항원에 대한 항-Gal의 결합은 보체 캐스케이드의 활성화 및 초급성 거부를 초래하며 또한 보체-의존성 지연된 이종이식체 거부의 발생시 중요한 역활을 담당한다. 따라서, gal 항원은 강력한 면역 반응을 생성하는 능력을 가진다. 특정의 바람직한 양태에서, 어댑터 분자내로 합쳐지거나 결합될 글리코실화된 리간드 잔기는 필수적으로 하나 이상의 Gal-α(1-3)-Gal 이당류 당 단위로 이루어지며 Gal 항원의 나머지 부위(예를 들면, GlcNac 또는 Glc)의 어느 것도 결여한다. 예를 들면, 하나 이상의 Gal-α(1-3)-Gal 이당류는 이당류 단위의 환원 말단에서 유리된 하이드록실 그룹(예를 들면, 글리코시드 결합에 포함되지 않은 C1 탄소에서 하이드록실 그룹)을 통해 어댑터 분자의 표적화 잔기에 연결될 수 있다. 특정의 양태에서, Gal 이당류는 유리된 하이드록실 그룹에서 스페이서 잔기(예를 들면, C 1 -C 6 알킬 스페이서)를 통해 표적화 잔기에 연결된다. 특정의 특수 이론에 제한되지 않고, Gal 항원의 Gal-α(1-3)-Gal 이당류 부위는 항-Gal 항체에 우선적으로 결합하지만 렉틴(예를 들면, Galectin-3) 또는, Gal 항원의 다른 부위에 결합하는 다른 분자(예를 들면, Gal-β(1-4)-GlcNAc 잔기)에 대해 제한된 결합을 나타낸다. 다른 양태에서, 어댑터 분자내로 합해지거나 결합될 글리코실화된 리간드 잔기는 Gal 항원의 추가의 당 잔기를 포함한다. 예를 들면, gal 항원의 하나 이상의 삼당류(Gal-α(1-3)-Gal-β-1-4)-GlcNAc 또는 Gal-α(1-3)-Gal-β-1-4)-Glc), 사당류(Gal-α(1-3)-Gal-β(1-4)-GlcNAc-β(1-3)-Gal) 또는 오당류(Gal-α(1-3)-Gal-β(1-4)-GlcNAc-β(1-3)-Gal-β(1-4)-Glc) 단위가 결합될 수 있다. 특정의 양태에서 어댑터 분자내로 합해지거나 결합될 gal 항원은 gal-α-(1,3) gal 계열의 신생 당단백질 중에서 선택되며 Galα1-3Gal-BSA (3-원자 공간), Galα1-3Gal-BSA(14-원자 공간), Galα1-3Gal-HSA (3-원자 공간), Galα1-3Gal-HSA (14-원자 공간), Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA(3-원자 공간), Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-BSA (14-원자 공간), Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA (3-원자 공간), Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-HSA (14-원자 공간), Galα1-3Gal-오당류-BSA (3-원자 공간) 등을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, gal 항원은 Galα1-3Galβ1-4Glc-BSA (3-원자 공간), Galα1-3Galβ1-4Glc-HSA (3-원자 공간), Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-BSA (3-원자 공간), Galα1-3Galβ1-3GlcNAc-HSA (3-원자 공간), Galα1-3Galβ1-4(3-데옥시GlcNAc)-HSA (3-원자 공간), Galα1-3Galβ1-4(6-데옥시GlcNAc)-HSA, 등을 포함하는 galα(1,3) gal 유사체 신생당단백질 중에서 선택될 수 있다. 여전히 다른 양태에서, Gal 항원의 펩티드모사체를 본 발명의 어댑터 분자내로 결합시킬 수 있다. 예시적인 펩티드모사체는 αGal-연결된 당펩타이드 Gal-αYWRY, Gal-αTWRY 및 Gal-αRWRY를 포함한다. 다른 펩티드모사체는 지앙(Xian) 등의 방법[참조: J. Comb. Chem., 6:126-134 (2004)]을 사용하여 항-GaL 항체 결합 활성에 대해 αGal 당펩타이드의 무작위화 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. Gal 항원, 또는 이의 펩티드모사체는 임의의 당해 분야에 인식된 수단을 사용하여 표적화 잔기에 연결(공유결합 및/또는 비공유결합적으로) 연결시킬 수 있다. 당해 분야에 인식된 비-공유결합 연결은 바이오틴-아비딘 또는 바이오틴-스트렙타비딘 연결 및 다른 고 친화성 결합 파트너(예를 들면, 루이신 지퍼(leucine zippers) 등)를 포함한다. 공유결합 부착에 적합한 수단은 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허원 제20100183635호 및 도 4에 나타낸 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, gal 항원(또는 펩티드모사체)는 합성의 화학적 링커를 통해 폴리펩타이드 표적화 잔기의 폴리펩타이드 골격에 직접 연결시킬 수 있다. 예시적인 합성 화학적 링커는 이중기능성 링커 잔기, 예를 들면, 말레이미드 기능성을 지닌 링커를 포함한다. 예를 들면, 이중기능성 링커 잔기는 표적화 잔기 및 리간드 잔기를 표적화 잔기내 아미드 그룹 및 리간드 잔기내 티올 잔기 또는 이의 반대의 그룹을 통해 연결할 수 있다. 하나의 예시적인 양태에서, 말레이미드 링커(예를 들면, 설포-SMCC)를 사용하여 아미노 변형된 Gal 항원(예를 들면, 도 5의 B di -(CH 2 ) 3 -NH 2 )의 아미노 그룹에 폴리펩타이드 표적화 잔기의 시스테인 잔기를 연결시킨다. 추가로 또는 대안적으로, gal 항원을 당단백질 표적화 잔기의 N-연결된 올리고당류에 연결시킬 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 Gal 항원(예를 들면, gal-α-(1,3) gal), 또는 이의 펩티드모사체는 표적 잔기에서 단일 부위에 연결된다. 다른 양태에서, 하나 이상의 Gal 항원(예를 들면, gal-α-(1,3) gal), 또는 이의 펩티드모사체는 표적 잔기에서 다중 부위에 연결된다. 특정의 양태에서, 링커 잔기는 화학적으로 변형되어 효소적 또는 화학적 분해를 감소시킨다. 본 출원에 기재된 것으로서 Gal 항원을 포함하는 어댑터 분자는, 호염기구를 인지할 만하게 활성화시키지 않으므로 따라서 대상체에게 투여시 IgE-매개된 고민감성 반응을 유발하지 않는다는 점에서 특히 유리하다. 그럼에도 불구하고, 일부 양태에서, 본 발명의 어댑터 분자를 호염기구를 활성화시키는 이의 능력에 대해 검정할 것이다. 호염기구 활성화를 측정하는데 적합한 검정은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용된 J. Allergy Clin Immunol (2002) 110102-9]. 특정의 양태에서, 리간드 잔기는 중합체성 결합 분자를 포함하며, 여기서 단량체는 아미노산이 아니다. 특정의 예시적인 양태에서, 고 친화성 어댑터 분자는 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. (a) H-Gly-D-Val-D-Gln-D-Glu-D-Asp-D-Val-D-Ser-D-Ser-D-Thr-D-Leu-Gly-D-Ser-D-Trp-D-Val-D-Leu-D-Leu-D-Pro-D-Phe-D-His-D-Arg-Gly-D-Thr-D-Arg-D-Leu-D-Ser-D-Val-D-Trp-D-Val-D-Thr-PEG 2 -Cys-XY; (b) H-Gly-Gly-D-Phe-D-Glu-Gly-D-Leu-D-Ser-D-Gln-D-Ala-D-Arg-D-Lys-D-Asp-D-Gln-D-Leu-D-Trp-D-Leu-D-Phe-D-Leu-D-Met-D-Gln-D-His-D-Ile-D-Arg-D-Ser-D-Tyr-D-Arg-D-Thr-D-Ile-D-Thr-PEG 2 -Cys-XY; (c) H-Gly-D-Val-Gly-Gly-D-Ser-D-Arg-D-Leu-D-Glu-D-Ala-D-Tyr-D-Lys-D-Lys-D-Asp-D-His-D-Arg-D-Val-D-Phe-D-Gln-D-Met-D-Ala-D-Trp-D-Leu-D-Gln-D-Tyr-D-Tyr-D-Trp-D-Ser-D-Thr-D-Thr-PEG2-Cys-XY; 및 (d) H-Gly-D-Ser-Gly-D-Ser-Gly-D-Asn-D-Ala-D-Leu-D-His-D-Trp-D-Val-D-Cys-D-Ala-D-Ser-D-Asn-D-Ile-D-Cys-D-Trp-D-Arg-D-Thr-D-Pro-D-Trp-D-Ala-Gly-D-Gln-D-Leu-D-Trp-Gly-D-Leu-D-Val-D-Arg-D-Leu-D-Thr-PEG2-Cys-XY; 여기서, X는 말레이미드 기능성을 가진 이중기능성 화학적 링커이고; Y는 아미노 변형된 Gal-1-3-Gal 이당류이다]로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
(c) 변형된 어댑터 분자 본 발명의 어댑터 분자들 중의 하나 이상의 잔기를 또한 변형시킬 수 있다. 특정의 양태에서, 어댑터 분자의 펩타이드 잔기는 변형된다. 예를 들면, 어댑터 분자의 펩타이드 잔기는 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,559,126호에 기술된 것과 같은 비-천연 아미노산 잔기를 포함하도록 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩타이드는 하나 이상의, 또는 가장 바람직하게는 D-유형 광학 이성체인 모든 아미노산으로 구성될 수 있다. 이들 D-펩타이드는 항체 및 다른 단백질 치료제와 관련하여 몇가지 장점을 갖는다. D-펩타이드의 보다 작은 크기 및 보다 큰 안전성은 이들을 폐, 국소 및 경구 전달용으로 제형화하기에 보다 간단하도록 한다. D-펩타이드는 또한 불량한 면역원으로 공지되어 있다[참조: Dintzis et al . (1993) PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 16, 306-308]. 또한, 효소 분해에 대한 이들의 내성, 및 중합체와 조합되는 이들의 능력은 다른 펩타이드 약물과 비교하여 향상된 약력학을 생성한다. 더욱이, D-펩타이드는 소비자에게 전달될 수 있는 감소된 제조 비용을 갖는다. 어댑터 분자의 펩타이드 성분은 또한 어떠한 다양한 표준 화학적 방법에 이해서도 변형시킬 수 있다(예를 들면, 아미노산은 보호 그룹을 사용하여 변형시킬 수 있으며; 카복시-말단 아미노산은 말단 아미드 그룹으로 제조될 수 있고; 아미노-말단 잔기는 그룹으로 변형시켜 예를 들면, 친지질성을 향상시키거나; 폴리펩타이드는 화학적으로 글리코실화되거나 기타 경우에 안전성 또는 생체내 반감기가 증가되도록 변형시킬 수 있다). 본 발명의 어댑터 분자는 가용성을 증진시키는 화학적 변형 또는 특수 아미노산 잔기를 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서 펩타이드 잔기는 N-말단 또는 C-말단 영역내 아미노산 DDD 또는 KKK를 포함하도록 합성할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 펩타이드 및 다른 표적화 잔기는 예를 들면, N-말단 및/또는 -C 말단 영역에서 PEG화 잔기를 포함하도록 합성할 수 있다. 예시적인 PEG화 잔기는 PEG 2 -NH 2 및 PEG 2 -Cys-NH 2 잔기를 포함한다. 본 발명은 또한 본 출원에 기술된 서열의 "보존적 서열 변형" 또는 "보존적 아미노산 변형", 즉, 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나 아미노산 서열을 함유하는 펩타이드의 결합 특성에 유의적으로 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 서열 변형을 포함한다. 이러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오타이드 및 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지시된 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같은, 당해 분야에 공지된 표준 기술에 의해 서열내로 도입시킬 수 있다. 일부 양태에서, 변형은, 합리적인 설계에 의해 선택되며, 설계된 펩타이드는 본 출원에 기술된 바와 같은 화학적 합성에 의해 생성된다. "보존적 아미노산 변형"은, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄(예를 들면, 유사한 크기, 모양, 전하공유결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 포함하는 화학적 특성, 등)를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 치환인 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들면, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분기된 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 본 발명의 펩타이드 또는 이의 모사체는 특히 표적 단백질과 상호작용하는 것으로 예측되지 않는 단백질의 부위에서, 하나 이상의 치환에 의해 변형될 수 있다. 펩타이드내 아미노산의 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 심지어 50% 이상의 많은 아미노산이 표적용 단백질의 친화성을 실질적으로 변경시키지 않으면서 보존적 치환에 의해 변경될 수 있는 것으로 예측된다. 이러한 변화는 생체내에서 폴리펩타이드의 면역원성을 변경시킬 것이며, 면역원성이 감소되는 경우, 이러한 변화가 바람직할 것이다. 본 발명의 펩타이드 분자의 구조내에서 이루어질 수 있는 동종 치환의 추가의 비-제한적 예는 D-페닐알라닌의 D-타이로신, D-피리딜알라닌 또는 D-호모페닐알라닌으로의 치환, D-루이신의 D-발린 또는 지방족 측쇄를 갖는 다른 천연의 또는 비-천연의 아미노산으로의 치환 및/또는 D-발린의 D-루이신 또는 지방촉 측쇄를 갖는 다른 천연의 또는 비-천연의 아미노산으로의 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 보존적 아미노산 치환 단독, 즉, 아미노산 결실 또는 첨가가 없는 보존적 아미노산 치환 단독이 아미노산 변형의 바람직한 유형이다. 당해 분야의 숙련가는, 이러한 변형 또는 치환이 DNA 수준에서 이루어져서, 변경되거나 치환된 펩타이드를 암호화할 수 있거나, 또는 이들이 예를 들면, 직접적인 화학적 합성에 의해 단백질 수준에서 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 양태에서, 어댑터 분자의 펩타이드 또는 펩타이드 잔기는 사이클릭으로 제조될 수 있다. 이러한 "사이클릭 펩타이드"는 2개의 아미노산을 연결하는 분자내 연결부를 갖는다. 사이클릭 펩타이드는 종종 단백질분해성 분해에 대해 내성이므로 경구 투여용으로 우수한 후보물질이다. 분자내 연결은 중간 연결 그룹을 포함할 수 있거나 아미노산 잔기들 사이에 직접적인 공유 결합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, N-말단 및 C-말단 아미노산이 연결된다. 다른 양태에서, 하나 이상의 내부 아미노산은 폐환에 관여한다. 당해 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 본 발명의 펩타이드를 폐환시킬 수 있다. 예를 들면, 사이클릭 펩타이드는 측쇄 아지드-알킨 1,3-이극성 폐환 부가반응을 통해 형성될 수 있다(참조:본 출원에 참조로 인용된 문헌, Cantel et al. J. Org . Chem ., 73 (15), 5663-5674, 2008). 펩타이드의 폐환반응은 또한 예를 들면, 모두 본 출원에 참조로 인용된, 미국 특허 제5596078호; 제4033940호; 제4216141호; 제4271068호; 제5726287호; 제5922680호; 제5990273호; 제6242565호; 및 문헌(참조: Scott et al . PNAS. 1999. vol.96 no.24 P.13638-13643)에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 분자내 연결은 이황화물 결합 모사체 또는, 기타의 경우 이황화물 결합에 의해 생성될 수 있는 구조를 보존하는 이황화물 결합 모사체이다. 일부의 특히 바람직한 양태에서, 펩타이드의 폐환반응은 분자내 이황화물 결합을 통해 발생한다. 일부 바람직한 양태에서, 분자내 이황화물 결합의 형성은 펩타이드의 친화성을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 또는 이의 모사체를 선택하고/하거나 친화성 성숙시키는데 사용된 방법을 선택 전 및 동안에 이황화물 결합 형성을 허용하는 조건(예를 들면, 산화 조건)하에서 수행할 수 있다. 일부 특히 바람직한 양태에서, 이황화물 결합은 라이브러리 또는 펩타이드내에 천연적으로 존재하거나, 또는 하나 이상의 선택 라운드 동안에 돌연변이 공정에 의해 도입되는 시스테인 잔기들 사이에 형성될 수 있다. 다른 양태에서, 펩타이드는 특수 위치에서 시스테인 잔기를 함유하도록 설계됨으로써 어느 잔기가 이황화물 결합에 관여한는지가 공지되도록 할 수 있다. 시스테인 잔기들 사이의 분자내 이황화물 결합은 당해 분야에 공지된 방법(예를 들면, 본 출원에 참조로 인용된 미국 특허 제4572798호; 제6083715호; 제6027888호, 및 WIPO 공보 제WO/2002/103024호)에 의해 도입시킬 수 있다. 일부 양태에서, 이황화물 결합의 형성(또는 일반적으로 폐환되거나 분자내 연결된 구조의 형성)은 표적 결합에 중요한 펩타이드 상의 특수 구조에 영향을 미친다. 따라서, 이황화물 결합 및/또는 폐환이 바람직하게는 펩타이드 선택 전에 형성됨으로써 결합 형성에 의해 생성된 잠재적으로 양호한 구조를 이를 위해 선택할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 펩타이드 또는 이의 모사체는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 이황화물 결합을 가질 수 있다. 분자내 이황화물 결합, 분자내 이황화물 결합 치환체, 및 다른 분자내 연결을 갖는 펩타이드를 생성하고 선택하기 위한 당해 분야에 공지된 추가의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 출원에 참고로 인용된 제WO03040168호에 기술된 방법은 펩타이드 아파타머(apatamer), 코노타이드(conotide), 및 일부 양태에서 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있는 다른 사이클릭 펩타이드를 생성하고 선택하는 방법을 기술한다. 관련 양태에서, 결합에 유리한(예를 들면, 이는 결합 친화성을 증가시킨다) 펩타이드 형태 또는 구조는 화학적 가교결합 또는 펩타이드 안정화의 다른 방법에 의해 보존하거나 모사할 수 있다. 예를 들면, 이황화물 결합에 의해 형성된 유리한 펩타이드 형태 또는 구조는 화학적 치료 또는 반응에 의해 안정화시킴으로써 이황화물 결합없이 구조를 보존할 수 있다. 실제로, 펩타이드 안정화 기술을 사용하여 이황화물 결합이 원래 존재하였는지 여부에 상관없이 본 발명의 펩타이드를 안정화시킬 수 있다. 예를 들면, 본 출원에 참조로 인용된 문헌(참조: Jackson, et al. J. Am . Chem . Soc . 1991, 113 , 9391-9392; Phelan, et al. J. Am . Chem . Soc . 1997, 119 , 455-460; Bracken, et al. J. Am . Chem . Soc . 1994, 116 , 6431-6432)에 기술된 기술을 사용하여 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 잔기를 안정화시킬 수 있다. 펩타이드 및 펩타이드 구조를 안정화시키기 위한 다른 방법, 예를 들면, O-알릴 세린 잔기를 통한 나선의 올레핀계 교차-결합(참조: 본 출원에 참조로 인용된, Blackwell, HE; Grubbs, RH Angew . Chem ., Int . Ed . 1998, 37 , 3281-3284), 모든-탄화수소 교차-결합[본 출원에 참조로 인용된, Schafmeister and Verdine J. Am . Chem . Soc . 2000, 122 (24), 5891-5892] 및 미국 특허 제7183059호(본 출원에 참조로 인용됨)에 기술된 방법을 사용할 수 있다. 블랙웰(Blackwell) 등 및 사프마이스터(Schafmeister) 등의 문헌에 기술된 방법은 "스테이플화된(stapled)" 펩타이드, 즉, 특수한 형태학적 상태 또는 제2 구조로 공유결합적으로 고정된 펩타이드, 또는 이들을 특수한 형태 또는 구조를 형성하도록 만드는 특수한 분자간 공유결합성 연결을 갖는 펩타이드를 생산하는 것으로 기술될 수 있다. 이렇게 처리된 펩타이드는 예를 들면, 표적 결합에 중요한 알파-나선을 형성하는 경우, 이후 결합에 대한 에너지성 한계(energetic threshold)가 저하될 것이다. 이러한 "스테이플화된" 펩타이드는 프로테아제에 대해 내성인 것으로 나타났으며 또한 세포 막을 보다 효과적으로 횡단하도록 설계될 수 있다(참조: 또한 본 출원에 참조로 인용된 Walensky et al . Science 2004:Vol. 305. no. 5689, pp. 1466 - 1470; Bernal et al . J Am Chem Soc. 2007, 129(9):2456-7). 따라서, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 잔기는 스테이플화되거나 기타의 경우 변형됨으로써 이들을 특수한 형태학적 모양으로 고정시킬 수 있거나 이들은 변형되어 결합에 유리한 특수 형태 또는 제2 구조로 될 수 있다. 이러한 펩타이드 변형은 펩타이드 선택 전에 일어남으로써 어떠한 형태학적 구속의 잇점도 또한 선택될 수 있도록 함이 고려된다. 대안적으로, 일부 양태에서, 변형은 펩타이드 후보물을 추가로 향상시키거나 결합에 대해 유리한 것으로 공지된 형태를 보존하기 위해서 선택 후 이루어질 수 있다. 다른 양태에서, 어댑터 분자의 리간드 잔기는 변형될 수 있다. 상기 변형은 예를 들면, 분자를 방해함으로써 경쟁적 결합을 최소화시키거나 리간드 잔기의 효소적 또는 화학적 분해(예를 들면, 생리학적 조건하에서)를 감소시키도록 이루어질 수 있다. 본 출원에 사용된 것으로서, 용어 "방해하는 분자"는 어댑터 분자에 결합시키기 위해 순환 항체와 경쟁하고 이를 이의 의도된 치료학적 효과(예를 들면, 순환으로부터 어댑터 분자를 신속하게 제거함으로써)를 발휘하는 것으로부터 방지하는 결합 분자(예를 들면, 순환하는 또는 세포 표면 수용체)를 말한다. 예를 들면, 글리코실화된 리간드 잔기는 화학적으로-변형됨으로써 항-Gal 항체에 의한 우선적 결합이 향상되는 반면 렉틴(예를 들면, 갈렉틴-3) 또는 다른 방해 분자에 의한 바람직하지 않은 결합을 최소화시키는 gal 항원 또는 모사체를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 글리코실화된 리간드 잔기는 예를 들면, 효소적 또는 화학적 분해를 감소시키거나 공유 연결을 촉진시키기 위해, 화학적으로-변형된 gal 항원 또는 모사체를 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 예를 들면 탈수성 커플링, 환원성 아민화 또는 예를 들면, 갈락토즈 옥시다제를 사용한 효소적 산화를 통해 gal 항원의 당 잔기 상의 반응성 하이드록실 그룹에 대한 생물학적으로 불활성인 보호 그룹의 첨가를 포함한다. 보호 그룹은 Gal 에피토프의 말단 Gal 잔기 상의 C-6' OH에 첨가될 수 있다[참조: 예를 들면, Andreana et al., Glycoconjugate J., 20: 107-118 (2004)]. 예시적인 보호 그룹은 아민(예를 들면, 아미노피리딘) 및 옥심 치환체(예를 들면, O-Me-옥심, O-Et-옥심, O-tBu-옥심, O-Bn-옥심 및 O-알릴-옥심)을 포함한다. 대안적으로, 극성 C-6' OH 그룹은 비극성 수소로 교체되어 6-데옥시-α-Gal 유도체를 형성할 수 있다[참조: 본 출원에 참조로 인용된, Janczuk et al., Carbohydrate Research, 337: 1247-1259 (2002)]. 특정의 예시적인 양태에서, Gal 에피토프는 아미노 개질제(예를 들면, 알킬-NH2 치환체)로 변형(예를 들면, C-1 OH에서)되어 표적 잔기에 대한 연결을 촉진시킬 수 있다. 이후에, 변형된 gal 항원에 대한 항-Gal 항체의 결합은 당해 분야에 공지된 방법론(예를 들면, ELISA)을 사용하여 평가할 수 있다. (d) 다가의 어댑터 분자 본 출원에 기재된 종류의 펩타이드 또는 펩타이드 잔기의 다수를 연결시켜 항원항체결합력 또는 원자가가 증가된 조합 어댑터 분자를 생성할 수 있다. 유사하게, 어댑터 분자의 펩타이드 또는 펩타이드 잔기를 형광성 폴리펩타이드, 표적화 폴리펩타이드 및 명확한 치료학적 효과를 갖는 폴리펩타이드와 같은 임의의 수의 다른 폴리펩타이드에 부착시킬 수 있다.
II. 고 친화성 어댑터 분자의 확인 방법 특정의 국면에서, 본 발명은 고 결합 친화성 또는 선택성을 갖는 어댑터 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 (i) 고 친화성 표적화 잔기(예를 들면, 표적화 펩타이드 잔기 및/또는 리간드 펩타이드 잔기)를 확인하기 위한 적어도 하나의 선택 단계, 및 (ii) 어댑터 분자의 표적화 및 리간드 잔기가 연결되어 어댑터 분자를 형성하는 연결 단계를 포함한다. 특정의 양태에서, 본 발명의 방법은 선택 단계로서 리보소옴 또는 mRNA 디스플레이를 사용하여 어댑터 분자의 하나 이상의 표적화 잔기를 확인한다. 리보소옴 및 mRNA 디스플레이 방법의 일반적인 개관은 본 출원에 참조로 인용된 문헌[참조: Lipovsek and Pluckthun, J. Immunological Methods, 290: 51-67 (2004)]에서 제공된다. 바람직한 양태에서, 어댑터 분자의 표적화 잔기(예를 들면, 펩타이드 표적화 잔기)는 mRNA 디스플레이를 사용하여 확인한다. 예시적인 mRNA 디스플레이 방법론은 도 2에 도시되어 있다. 요약하면, 출발하는 라이브러리를 예를 들면, 직접적인 DNA 합성에 의해 또는 시험관내 또는 생체내 돌연변이유발을 통해 수득한다. 이후에, 이중가닥 DNA 라이브러리를 시험관내(예를 들면, T7 폴리머라제 사용)에서 전사시키고 푸로마이신-유사 링커에 부착시킨다. 시험관내 해독을 수행하며, 여기서 푸로마이신-유사 링커는 초기의 해독 생성물과 반응한다. 그 결과는, 정제 후, 펩타이드-RNA 융합 분자의 고도로 다양한(~10 13 ) 라이브러리이다. 역 전사는 전사된 펩타이드에 공유결합으로 연결된 cDNA/RNA 하이브리드를 생성한다. 당해 복합체는 이후에 표적 분자(표적화 펩타이드 잔기의 경우에) 또는 항체(리간드 펩타이드 잔기의 경우에)를 사용함으로써 선택된다. 표적 또는 항체 분자에 결합하는 펩타이드(예를 들면, 엄중한(stringent) 세척 조건하에서)에 결합하는 펩타이드가 선택될 것이며, cDNA는 용이하게 용출됨으로서 선택된 펩타이드가 확인된다. 선택을 다수회 수행하여 고 친화성 결합제를 확인할 수 있다. 선택 방법은, 분자간 이항화물 결합이 선택 동안 펩타이드내에 존재하도록 하는 조건하에서 수행될 수 있음에 주목하여야 한다. 다른 양태에서, 이황화물 결합의 형성은, 바람직한 경우, 방지될 수 있다. 추가의 또는 대안의 양태에서, 본 발명의 방법은 선택 단계로서 파아지 디스플레이 및/또는 효모 디스플레이 기술을 사용함으로써 어댑터 분자의 하나 이상의 표적화(예를 들면, 펩타이드) 잔기를 확인한다. 이러한 라이브러리 스크리닝 방법의 비-제한적 예는 예를 들면, 미국 특허 제7,195,880호; 제6,951,725호; 제7,078,197호; 제7,022,479호; 제5,922,545호; 제5,830,721호; 제5,605,793호; 제5,830,650호; 제6,194,550호; 제6,699,658호에 기술되어 있으며, 이들 각각은, 이의 전문이 본 출원에 참조로 인용되어 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 합성 펩타이드의 라이브러리를 사용한다. 이러한 합성 펩타이드는 화학적으로 합성되거나 효소적으로 생산(예를 들면, RNA로부터 시험관내 해독에 의해 또는 기존의 단백질의 효소적 분해에 의해)될 수 있다. 일부 양태에서, 합성 펩타이드의 라이브러리는 고체 기질(예를 들면, 유리 슬라이드) 상에서 배열된다. 특정의 양태에서, 본 발명의 방법은 특수한 표적 또는 항체 분자와 상호작용하는 것으로 공지된 보다 큰 폴리펩타이드의 부위에 상응하는 무작위화 펩타이드를 암호화하는 mRNA 라이브러리(예를 들면, mRNA 디스플레이 라이브러리)를 사용한다. 예시적인 mRNA 디스플레이 라이브러리는 도 3에 도시되어 있다. 예를 들면, 펩타이드 라이브러리는, 펩타이드의 아미노산 서열이 분자내 하나 이상의 아미노산 위치(바람직하게는 적어도 10개 이상의 아미노산 위치)에서 무작위화 선형 펩타이드 분자의 집단을 포함할 수 있다. 펩타이드 서열의 이러한 무작위화 부위는 모 폴리펩타이드로부터 하나 이상의 고정 영역에 의해 플랭킹(flanking)될 수 있다. 특정의 양태에서, 본 발명의 방법은 후보 표적화 잔기의 무작위화 집단을 암호화하는 mRNA 디스플레이 라이브러리(예를 들면, 또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드)를 제공함을 포함한다. 예로서, 표적화 펩타이드는 가용성 리간드, 예를 들면, VEGF로부터 기원한 무작위화 펩타이드일 수 있다. 고 친화성 표적화 펩타이드는 라이브러리로부터 펩타이드-RNA-cDNA 융합체를 스크리닝함으로써 선택된다. 다수의 선택 주기를 바람직하게 수행하여 표적 분자(예를 들면, VEGF 수용체)에 결합하는 것들에 대한 분자의 집단을 크게 만든다. 각각의 선택 단계에서 표적 분자의 농도를 감소시킴으로써, 표적 분자에 고 친화성으로 결합하는 펩타이드는 집단내에서 더 커질 수 있다. 각각의 선택 단계에서 사용될 수 있는 추가의 선택 과정은 (1) 비-특이적인 펩타이드를 제거하기 위한 반대(contra)-선택; (2) 부위-특이적인 펩타이드를 확인하기 위한 경쟁적 용출; 및 (3) 안정한 펩타이드를 확인하기 위한 특이적인 용액 조건(예를 들면, 고 엄중 세척 조건)하에서의 선택을 포함한다. 특정의 양태에서, 라이브러리의 구성원들은 선택 전에 변형되어, 링커(예를 들면, 이중기능성 링커)와 반응하여 연결 잔기를 형성할 수 있는 커플링 잔기를 포함한다. 다른 양태에서, 라이브러리의 구성원은 선택 단계 후에 커플링 잔기로 변형시켜 연결 잔기에 대한 연결을 촉진시킨다. 예시적인 커플링 잔기는 말레이미드 기능성의 이중기능성 링커와 반응할 수 있는 말단 아미노산(예를 들면, C- 또는 N-말단 시스테인 또는 시스테인 유사체) 또는 아미노산산 측쇄(예를 들면, 시스테인 또는 시스테인 유사체 측쇄)를 포함한다. 고-친화성 표적화 잔기가 확인되면, 이후에 펩타이드를 결합 잔기를 통해 미리-선택된 리간드 잔기에 연결시킴으로써 어댑터 분자를 생성할 수 있다. 특정 양태에서, 리간드 잔기는 mRNA 디스플레이 방법을 사용하여 미리-선택된다. 대안적으로, 표적화 잔기는 후보 리간드의 무작위화 집단을 암호화하는 제2의 mRNA 디스플레이 라이브러리내에 고정 영역으로서 삽입될 수 있다. 이후에, 이러한 제2의 mRNA 디스플레이 라이브러리는 추가의 선택 단계에 적용될 수 있으며, 여기서 라이브러리 구성원을 항체에 대해 스크리닝하여 어댑터 분자를 확인한다. 따라서, 후보 리간드는 바람직하게는 항체 리간드의 부위(예를 들면, 에피토프)에 상응한다. 하나의 양태에서, 항체 리간드 부위는, 항체가 결합하는 항원의 에피토프일 수 있다. 또 다른 양태에서, 항체 리간드 부위는, 제2의 항-이디오타입(anti-idiotypic), 항체가 결합하는 제1의 항체의 이디오토프(idiotope)일 수 있다. 여전히 또 다른 양태에서, 항체 리간드 부위는 Fc 결합 단백질(예를 들면, Fc 수용체)의 Fc 결합 부위일 수 있다. 표적 분자 및 항체 분자 둘다에 고 친화성 및/또는 선택성으로 결합하는 어댑터 분자가 선택되면, 어댑터 분자를 표적 분자에 대한 항체 특이성을 재지시하는 능력에 대해 평가할 수 있다. 예를 들면, 표적 분자가 세포 표면 분자인 경우, 효과기 기능[예를 들면, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(CDC) 및 세포 사멸]을 유도하는 어댑터 분자의 능력을 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 여전히 다른 양태에서, 라이브러리의 구성원을 선택 단계 전에 리간드 잔기에 연결시킨다. 예를 들면, 스크리닝될 라이브러리의 각각의 구성원을 Gal 항원으로 유도체화한 후 스크리닝 단계에 적용시켜 고 친화성 어댑터 분자를 확인할 수 있다. 상기 Gal 항원은 각각의 펩타이드의 말단 아미노산 또는 아미노산 측쇄에 연결시킬 수 있다. 여전히 다른 양태에서, 반복된 선택 공정을 사용할 수 있으며, 여기서 표적화 잔기는 제1 선택 단계(또는 선택 단계의 제1 시리즈)에서 선택되며, 표적화 잔기의 서열은 mRNA-펩타이드 융합체의 고정 영역내로 도입되어 제2 선택 단계(또는 선택 단계의 제2 시리즈)에서 리간드 잔기의 선택을 촉진시킬 수 있다. 예를 들면, 제1 및 제2 선택 단계(또는 일련의 선택 단계들)는 선택의 연속 라운드에서 번갈아 사용하여 고 친화성 어댑터 분자를 확인할 수 있다.
III. 고 친화성 어댑터 분자의 합성 방법 고 친화성 어댑터 분자가 본 출원에 기술된 방법을 사용하여 확인되면, 이들을 당해 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(예를 들면, cDNA)을 재조합체 발현 벡터내로 삽입시키고 발현을 촉진하는 조건하에 DNA 서열을 발현시키는 재조합체 DNA 방법에 의해 생산될 수 있다. 핵산 조작을 위한 일반적인 기술은 예를 들면 문헌[참조: 본 출원에 참조로 인용된, Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed. , 1989, or F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987) 및 주기적 업데이트]에 기술되어 있다. 세균, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[참조: 이의 관련 기재내용이 본 출원에 참조로 인용된, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985]에서 찾을 수 있다. 다른 재조합체 DNA 방법은, 모두 본 출원에 참조로 인용된, 미국 특허 제4356270호, 제4399216호, 제4506013호, 제4503142호, 제4952682호, 제5618676호, 제5854018호, 제5856123호, 제5919651호, 및 제6455275호에 기술되어 있다. 어댑터 분자 및 이들의 성분은 또한 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여, 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, D-펩타이드를 적절한 보호 그룹의 사용을 포함하는 고체-상 합성 방법에서 D-아미노산의 단계별 첨가를 사용하여 합성할 수 있다. L-펩타이드에 대해 일반적으로 사용된 고체 상 펩타이드 합성 기술은 문헌[참조: Meinhofer, Hormonal Proteins and Peptides, vol. 2, (New York 1983); Kent, et al . , Ann. Rev. Biochem. , 57:957 (1988); Bodanszky et al . , Peptide Synthesis, (2d ed. 1976); Atherton et al .(1989) Oxford , England: IRL Press . ISBN 0199630674; Stewart et al .(1984). 2 nd edition , Rockford: Pierce Chemical Company , 91. ISBN 0935940030; and Merrifield (1963) J. Am . Chem. Soc . 85: 2149-2154 ]에 기술되어 있으며, 이들 참조 문헌 모두는 본 출원에 참조로 인용된다. D-펩타이드의 고체-상 합성시 사용하기 위한 D-아미노산은 다수의 시판 공급원으로부터 수득할 수 있다. 혼합된 L- 및 D-아미노산을 포함하는 펩타이드 및 D-펩타이드가 당해 분야에 공지되어 있다. 또한 D-아미노산(D-펩타이드)를 독점적으로 함유하는 펩타이드가 합성되어 있다[참조: Zawadzke et al . , J. Am. Chem. Soc., 114:4002-4003 (1992); Milton et al., Science 256: 1445-1448 (1992)]. D-펩타이드를 제조하는 추가의 방법은 당해 분야에 기술되어 있으며 적어도 WIPO 공보 제WO/1997/013522호, 및 미국 특허원 제60/005,508호에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌은 둘다 참조로 본 출원에 인용되어 있다. 본 발명의 펩타이드는 단백질 화학 분야에 일반적으로 공지된 단백질에 대한 분리/정제 방법에 의해 정제할 수 있다. 비-제한적 예는 추출, 재결정화, 탈염(예를 들면, 황산암모늄 또는 황산나트륨 사용), 원심분리, 투석, 초미세여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상 상 크로마토그래피, 역-상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 침투 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 역류분배(countercurrent distribution) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 정제 후, 펩타이드는 상이한 완충액으로 교환하고/하거나 여과 및 투석을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당해 분야에 공지된 임의의 각종 방법에 의해서 농축시킬 수 있다. 정제된 폴리펩타이드는, 바람직하게는 순도가 적어도 85% 또는 90%, 보다 바람직하게는 적어도 93% 또는 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 97%, 98%, 또는 99%이다. 순도의 정확한 수치 값과 상관없이, 펩타이드는 약제학적 제품으로서 사용하기에 충분히 순수하다.
본 발명의 추가의 국면은 유효량의 본 발명의 분리된 어댑터 분자를 대상체에게 투여함으로써 질병을 치료함을 포함하여, 대상체에서 질병(예를 들면, 암, 감염성 질병 또는 자가면역병)을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적인 양태에서, 질병은 적어도 하나의 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 건선, 당뇨병, 심혈관성 허혈, 류마티스 관절염, 및 골관절염이다.
도 1은 본 발명의 예시적인 어댑터 분자의 개략도이다. 어댑터 분자는 목적한 표적에 대해 지시된 고-친화성 펩타이드 표적화 잔기 및, 항-gal 항체의 당펩타이드 에피토프(epitope)를 포함하는 리간드 잔기를 포함하는 이중특이적 펩타이드이다. 표적 분자 및 천연적으로-존재하는 항-gal 항체 둘다에 결합함으로써, 어댑터 분자는 항체의 효과기 기능을 재지시하여 표적 분자상에서 작용할 수 있다.
도 2는 mRNA 디스플레이 동안 수행된 각종 방법 단계들의 개략도이다.
도 3은 고 친화성 어댑터 펩타이드의 선택을 위해 mRNA 디스플레이에 사용될 수 있는 예시적인 펩타이드 라이브러리를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 4개의 예시적인 고 친화성 VEGF 표적화 펩타이드를 나타낸다.
도 5는 표적 잔기(예를 들면, 본 발명의 VEGF 표적화 잔기)를 리간드 잔기에 커플링시키기 위한 링커 및 예시적인 방법을 나타낸다.
도 6은 표적 잔기/리간드 잔기 커플링 반응의 HPLC 및 질량 분광법 분석을 나타낸다.
도 7은 최적화된 표적 잔기/리간드 잔기 커플링 반응의 HPLC 및 질량 분광법 분석을 나타낸다.
도 8은 VEGF를 결합시키기 위한 천연적으로 존재하는 항-gal 항체를 재지시하는데 있어서 본 발명의 VEGF-결합 어댑터의 효능을 입증하는 시험관내 검정의 결과를 나타낸다.
예시 본 기재내용을 추가의 제한으로 고려되어서는 안되는, 도면 및 다음 실시예에 의해 추가로 설명한다. 모든 도면 및 본 출원전체에서 인용된 모든 참조 문헌, 특허 및 공개된 특허원의 내용은, 이들의 전문이 본 출원에 참조로 명확하게 인용되어 있다. 실시예 1. 표적화 잔기로서 고 친화성 항- VEGF 펩타이드의 선택 및 α Gal 리간드 잔기에 대한 접합 도 2에 도시된 mRNA 디스플레이 방법을 사용하여, 무작위배치된 펩타이드 서열의 라이브러리를 VEGF에 대한 고 친화성 결합에 대해 스크리닝하였다. 4개의 고 친화성 항-VEGF 펩타이드 서열(서열 번호: 1 내지 4)을 선택하였다. 각각의 펩타이드를 C-말단에서 PEG 2 -NH 2 또는 PEG 2 -Cys-NH 2 잔기를 사용하여 PEG화하여(참조: 도 4) Gal 항원(Bdi-(CH 2 )-NH 2 , 이당류)에 대한 화학적 커플링을 촉진하였다. 각각의 펩타이드의 Gal 이당류에 대한 화학적 접합을 촉진시키기 위해, 말레이미드 및 설포-NHS 기능성을 지닌 이중기능성 링커(Sulfo-SMCC, PIERCE)를 사용하였다. 링커를 이당류내에 존재하는 아미노 그룹 및 펩타이드의 C-말단 시스테인 잔기의 설프하이드록실 그룹내 말레이미드 작용기와 반응시켰다. 목적한 화합물을 수득하여 임의의 추가의 반응 및 부산물의 형성을 피하기 위해, 반응물을 항온처리 직후 RP-HPLC 정제에 적용시켰다. 반응물 양에 대한 비를 최적화하여 부산물의 형성을 피하였다. 예시적인 합성시, 6 mg의 이당류 화합물 B di -(CH 2 )-NH 2 (~ 15μmol)을 20% MeCN, pH 6.0을 함유하는 100 μl의 0.1 M Hepes 완충액 속에 용해하고; 1.3 mg의 설포-SMCC 링커(~ 3 μmol)를 20% MeCN, pH 6.0을 함유하는 100 μl의 0.1 M Hepes 완충액 속에 용해하고; 용액 둘다를 혼합하고 실온에서 30분 동안 반응물 튜브의 연속 회전하에 항온처리하였다. 1 mg의 펩타이드 07-090(07-090; 동결건조물, TFA 첨가물, MW 3474 g/mol; ~ 320 nmol)를 1 ml의 H 2 O/MeCN 80:20% 속에 용해하였다. 제조 직후, 투명한 펩타이드 용액을 링커-이당류 용액에 가하고 실온에서 추가로 90분 동안 반응 튜브의 연속 회전하에 항온처리하였다. 반응 혼합물을 얼음 위에 두고, 분취량을 RP-HPLC-C18 컬럼에서 분석하였다. 목적한 화합물(B di -(CH 2 )-NH-링커-S-07-090-펩타이드)을 0 내지 50%; 완충액 A: H 2 O/5% MeCN, 0.1% TFA, 완충액 B: H 2 O/5% MeCN, 0.1% TFA로부터 HPLC 구배를 이동시켜 정제하였다. HPLC 분획을 65% 메탄올, 0.5% 포름산을 사용하여 희석한 후 ESI-TOF-MS 분석에 의해 분석하고 생성물 분획을 확인하였다. 관련 생성물 피크 분획을 -80℃에서 냉동시킨 후 동결건조시켜 완전 건조시킴으로써 목적한 화합물을 제공하였다.
실시예 2 VEGF 에 대한 천연의 항-α Gal 항체를 재지시할 수 있는 항- VEGF -특이적인 어댑터 분자 검정을 설계하여 αGal에 대해 특이적인, 천연의 항체를 재지시하여 VEGF에 결합하도록 하는, αGal-연결된 항-VEGF 펩타이드의 능력을 시험하였다. 당해 검정은 고체 상에서 재조합체 VEGF를 사용하여 설계하였다. 이후에, αGal-연결된 항-VEGF 펩타이드의 일련의 희석물을 rVEGF와 함께 항온처리한 후 고 수준의 항-αGal을 함유하는 마우스로부터의 혈청과 함께 항온처리하였다. 이후에, 결합된 항-αGal의 양을 효소 접합된 항-마우스 항체로 나타내었다. 효소의 존재는 비색 기질을 첨가하여 나타내고 색상에 있어서의 증가를 490 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 측정하였다. 도 8 에 나타낸 데이타는, 펩타이드 또는 항혈청의 양에 있어서의 감소가 광학 밀도에 있어서의 감소를 초래하므로, αGal-연결된 항-VEGF 펩타이드가 VEGF에 대한 천연의 항-αGal 항체를 재지시할 수 있음을 분명하게 나타낸다. |
