具有自身抗体或类似抗自身抗体的抗体的化合物及其制备方法 |
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| 申请号 | CN201610192471.6 | 申请日 | 2016-03-30 | 公开(公告)号 | CN107286239A | 公开(公告)日 | 2017-10-24 |
| 申请人 | 复旦大学; | 发明人 | 陈思锋; 薛蓉; 应天雷; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 生物 医学技术领域，涉及自身 抗原 及自身 抗体 的特异性结合物制备的新方法。具体涉及自身抗体及其类似物的制备、用自身抗体或者其类似物作为抗原制备获得抗自身抗体的抗体及其类似物方法以及抗人胰岛素自身抗体和抗胰岛素自身抗体的抗体及其类似物的制备方法。本发明提供了一类制备克隆化自身抗体或者抗自身抗体的抗体的肽类化合物的制备方法及所制备的自身抗体的特异性结合物与自身抗体结合能 力 的效果评定。免疫试验证明本发明制备的自身抗体或者抗自身抗体的抗体的特异性结合物具有单克隆抗体的理化特征，并且抗自身抗体的抗体的特异性结合物可以有效地结合自身抗体。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种制备具有天然自身抗体特征的化合物的方法，其特征在于，应用噬菌体抗体库技术，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 具有自身抗体或类似抗自身抗体的抗体的化合物及其制备方法 技术领域[0001] 本发明属于生物医学技术领域，涉及自身抗原及自身抗体的特异性结合物及其制备方法。具体涉及一种制备自身抗原特异性结合物的方法及其用制得的特异性结合物作为抗原筛选获得具有抗自身抗体的抗体特性的化合物或抗体类似物及其方法备。 背景技术[0002] 现有技术公开了有关自身免疫性疾病现状，1904年，Donatht和Landsteiner首次在患者尿液中检测到寒冷环境导致红细胞破坏的抗体，并提出“自身抗体”这一概念，从此拉开了自身免疫性疾病(AID)研究的序幕。自身免疫性疾病是由于机体对自身抗原的免疫耐受被打破从而导致自我反应的免疫细胞被激活以及自身抗体的产生。通常正常人具有自身免疫调节功能，其免疫反应有保护性防御作用，即对自身组织、成分不发生反应，—旦自身耐受的完整性遭到破坏，机体对自身细胞抗原(自身组织、器官、细胞等)发生反应，产生自身抗体，导致机体损伤，诱发疾病。 [0003] 近年来，随着自身抗体诊断技术的不断发展，其在AID的诊断和预后的评估逐步得到重视。自身抗体作为AID的风险预测指标，对具有家族史的高危人群进行风险评估的功能也在不断的优化中。2011年，Towns发现抗GAD65抗体有助于诊断早期1型糖尿病。随后Sui提出联合应用抗核抗体、抗sDNA抗体及抗组蛋白抗体有助于早期诊断狼疮性肾病；由于系统性自身免疫性疾病早期临床表现并不典型，因此，利用检测自身抗体对自身免疫性疾病进行早期诊断及预测，对于疾病的临床治疗非常有利。 [0004] 目前，自身免疫性疾病的治疗原则包括去除病因防止自身抗体形成以及抑制免疫反应。传统的治疗主要包括糖皮质激素和免疫抑制剂。然而长期使用激素和免疫抑制剂可能伴有严重的不良反应，如增加心血管疾病、白内障、骨折及感染的风险。因此，临床治疗中需要有效且副作用更小的手段；近年来，新的治疗方法包括基因治疗、小分子TLR抑制剂、干细胞自体移植以及单克隆抗体治疗等不断被提出。 [0005] 统计显示，全球已有超过25种单克隆抗体应用于临床，目前针对AID的单克隆抗体均为嵌合抗体或者利用转基因动物制备的人源化IgG，可以通过抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)发挥作用。已知自身免疫性疾病是由于自体免疫系统失衡造成，自体免疫细胞主要包括B细胞以及T细胞。B细胞的主要功能是介导体液免疫，由于B细胞在自身免疫性疾病发病机制中发挥重要的作用，因此，清除B细胞，对于AID的治疗会产生有利的影响；CD20是B细胞的特异性标记，抗B细胞单克隆抗体(抗CD20)，是由鼠抗人CD20B细胞杂交瘤的可变区融合与人的IgG和κ-恒定区所构成；抗CD20单抗可以通过激活内源性和外源性凋亡途径触发B细胞凋亡达到治疗目的。此外，还有研究者针对T细胞的清除展开研究，显示了CD3特异性抗体，与TCR-CD3复合物相结合，阻断T细胞的功能，起到免疫抑制的作用；但是，上述单抗是对整体B细胞和T细胞的清除，同接受免疫抑制剂一样，容易引发重症感染。 [0006] 1型糖尿病(T1DM)又称胰岛素依赖型糖尿病，是由于机体产生异常自身免疫应答引起胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少的一类疾病。由于多数患者都在儿童或青少年期发病，一旦发病就意味着患者终身需要胰岛素治疗，其疾病防控的意义毋庸置疑。 [0007] 研究显示，糖尿病自身抗体是1型糖尿病人在发病的过程中出现的一类抗自身抗原的免疫球蛋白，主要包括胰岛细胞胞浆自身抗体(ICA)，谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)，胰岛素瘤相关抗原2自身抗体(IA-2A)，胰岛素自身抗体(IAA)。Wenzlau等通过对223例新发T1DM患者的研究发现，IA-2A、GADA、IAA和ZnT8A四抗联合检测的阳性率为98.2％。这些抗体的出现为诊断1型糖尿病提供依据，同时也使得产生胰岛素的β细胞被破坏，使胰岛素产生减少，胰岛素绝对量的降低，使患者不得不用外源性胰岛素维持体内血糖的稳定；胰岛素是β细胞特异性的抗原，所以IAA被认为是针对β细胞的特异性的抗体。 [0008] 目前该类免疫介导型糖尿病尚无很好的预防措施，较为广泛的治疗方法是使用免疫抑制性药物，包括抗CD3抗体、抗CD20抗体以及两者的共同应用，这是针对整个免疫系统的免疫抑制，会使得全部的T细胞或者B细胞减少，这势必会影响机体正常的免疫保护功能。近年来，关于抗抗体治疗的方法逐渐得到重视。Wang X研究发现，特异性识别GAD65Ab的b96.11表位的人单克隆抗体的应用可明显推迟NOD小鼠自身免疫型糖尿病的发生。这类采用抗GADA独特型的单克隆抗体，抑制自身抗原GAD65与自身抗体的结合，从而对糖尿病的发病能够起到预防。Preety等在2014年的美国糖尿病科学年会上表示，针对NOD小鼠注射多克隆的正常小鼠IgM能够阻断胰岛素自身抗体的产生，从而达到预防疾病的目的。 [0009] 此外，已有文献报道，对NOD小鼠给予抗自身抗体的抗血清，可以明显降低该小鼠糖尿病的发病率，延缓发病进程，减轻发病的程度。但是以上血清成分并不单一，且Fc段具有免疫原性。基于上述原因，为了更好地获得治疗性的单一的抗抗体，本申请的发明人拟构建抗自身抗体Fab抗体库，为进一步获得治疗性抗体打下基础。 [0010] 关于噬菌体抗体库技术：1985年，Smith等首次报道了将EcoR I核酸内切酶基因克隆到丝状噬菌体fd外壳蛋白基因III中，与外壳蛋白融合表达并呈现在噬菌体表面上，宣告了噬菌体展示技术的诞生。噬菌体抗体库技术是在噬菌体展示技术的基础上发展起来的。将抗体的轻链和重链可变区基因通过PCR扩增后，克隆到载体pComb3，与噬菌体外壳蛋白III相连接形成的融合蛋白，然后通过特定的步骤在膜上组装成有活性的Fab抗体。噬菌体抗体库技术是将噬菌体展示技术应用于抗体库技术所取得的一大进展。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，而且可以感染宿主菌进行再扩增，经过多步“吸附-洗脱-扩增”过程可富集出特异性的抗体。相对于单克隆抗体而言，它用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不需要经过细胞融合，可制备出针对任何抗原的抗体分子。而且利用该技术制备的多数为抗体片段，缺乏Fc段，穿透性强，体内循环半衰期短及免疫原性低，易于携带放射性核素或细胞毒性药物进行导向诊断和治疗。目前，治疗性抗体已在肿瘤、器官移植排斥反应、病毒感染、血液性疾病等的临床诊断和治疗中，显示出了广阔的应用前景。 发明内容[0011] 本发明的目的是针对现有技术的在现状，拟提供获得人工自身抗体或者其类似物及其方法，用于自身免疫性疾病的筛查、诊断和预后判断；获得抗自身抗体的抗体或者其类似物及其方法，用于与自身抗体特异性结合，中和自身抗体并诱导机体防御系统杀灭能产生和携带自身抗体的细胞。具体的，本发明提供一种制备克隆化自身抗体及其类似物的新方法和一种制备特异性的抗自身抗体的抗体及其类似物的方法，利用这些方法得到的抗自身抗体的抗体可以应用于1型糖尿病等的自身免疫性疾病的治疗以及其他临床和实验室的研究。 [0012] 本发明提供了一种制备自身抗原特异性结合物的方法； [0013] 进一步提供用制得的特异性结合物作为抗原筛选获得具有抗自身抗体的抗体特性的化合物或抗体类似物及其制备方法。 [0014] 具体的，本发明提供了一种应用噬菌体抗体库技术制备具有天然自身抗体特征的化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤： [0015] (1)应用自身抗原在天然噬菌体抗体库中进行筛选； [0016] (2)获取表达具有天然自身抗体特征的化合物的噬菌体单个克隆； [0017] (3)通过扩增分离纯化得到具有天然自身抗体特征的化合物。 [0018] 本发明中，制备的自身抗体或者具有天然自身抗体特征的化合物，包括抗胰岛素自身抗体化合物且不限于此类自身免疫疾病自身抗体及其类似物。 [0019] 本发明中，进一步提供了一种构建抗自身抗体的抗体及其类似物的方法，其特征在于，包括以下步骤： [0020] (1)用天然自身抗体或制得的自身抗体及其类似物作为抗原； [0021] (2)构建抗自身抗体的抗体及其类似物的噬菌体抗体库； [0022] (3)用上述自身抗体或者其其类似物作为抗原在所述的抗体库中筛选获得抗自身抗体的抗体或者其类似物的噬菌体单个克隆； [0023] (4)通过扩增分离纯化得到抗自身抗体的抗体或者其类似物。 [0024] 本发明中，所述的制备的自身抗体的抗体或者其类似物，包括抗人胰岛素自身抗体的抗体或者其类似物但不限于此类自身免疫性疾病的抗抗体或者其类似物。 [0025] 本发明中，按上述应用噬菌体抗体库技术制备具有天然自身抗体特征的化合物的方法获得表达自身抗体或者其类似物的噬菌体。 [0026] 本发明中，按上述构建抗自身抗体的抗体及其类似物的方法获得表达抗自身抗体的抗体或者其类似物的噬菌体。 [0027] 更具体的，为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下步骤： [0028] 1.制备克隆化自身抗体 [0029] (a)用人胰岛素作为抗原包被免疫淘筛管； [0030] (b)应用成熟的人天然噬菌体Fab抗体库进行淘选； [0031] (c)将步骤(b)中淘选出的多克隆抗体进行酶联免疫吸附试验检测； [0032] (d)将步骤(c)中多克隆抗体涂板后分离单个克隆进行酶联免疫吸附试验检测； [0033] (e)将步骤(d)中与抗原结合能力强的抗体扩增纯化； [0034] (f)将步骤(e)中纯化的抗体与抗原进行酶联免疫吸附试验，结合能力高的为胰岛素自身抗体。 [0035] 采用本发明的方法生产胰岛素抗体： [0036] (1)获得的抗体能够与胰岛素抗原发生特异性结合； [0037] (2)抗体的Fab段，包含重链的V区和CH1区和完整的轻链。 [0038] 2.制备特异性抗自身抗体的抗体 [0039] (a)用NOD小鼠血清IgG(含自身抗体)，免疫与NOD背景相同的ICR小鼠，测定效价后，获取小鼠脾脏细胞RNA； [0040] (b)RT-PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因； [0041] (c)将步骤(b)中扩增的轻链基因与载体连接后共同转化进入宿主菌，细菌涂板； [0042] (d)将步骤(c)中涂板的单个克隆进行抽质粒、酶切和测序鉴定； [0043] (e)将步骤(c)中轻链和载体连接的产物与重链连接后共同转化入宿主菌，细菌涂板； [0044] (f)将步骤(c)中涂板的单个克隆进行抽质粒、酶切和测序鉴定； [0045] (g)将上述自身抗体作为抗原采用噬菌体抗体筛选技术，利用吸附－洗脱－扩增的方法，获得抗自身抗体的抗体； [0046] (h)将步骤(g)获得的抗抗体与自身抗体进行酶联免疫吸附实验，结合能力高的为抗胰岛素自身抗体的抗体。 [0047] 采用本发明的方法制得的抗胰岛素抗体的抗体特性包括： [0048] (1)获得的抗体能够与胰岛素抗体发生特异性结合； [0049] (2)抗体的Fab段，包含重链的V区和CH1区和完整的轻链； [0050] (3)是独特型抗体，针对抗体的可变区形成抗体，特异性强。 [0051] 本发明的实施例中通过下述方法制备具有自身抗体或类似抗自身抗体的抗体的化合物： [0052] 首先，通过将胰岛素作为自身抗原，利用噬菌体筛选技术通过吸附-洗脱-扩增的过程富集抗胰岛素自身抗体或者其类似物； [0053] 其次，将含有自身抗体的IgG免疫ICR背景小鼠，获取脾脏RNA，逆转录为cDNA； [0054] 进一步，按美Scripps研究所鼠源抗体库构建的引物设计，将上述获取的cDNA基于PCR的基因合成方法(PCR-based gene synthesis)合成抗体Fab轻链(K链)和重链(Fd段)基因的序列，引物序列如SEQ ID NO.1所示； [0055] SEQ NO1. [0056] 用于扩增鼠源性IgG Fab段基因的引物 [0057] [0058] [0059] 然后，构建含有抗体Fab轻链(K链)和重链(Fd段)的基因与pComb3噬菌粒载体的表达载体，K链基因和Fd段基因与载体之间分别通过Sac I/Xba I和Xho I/Spe I双酶切后插入，轻链及重链Fd的表达均受LacZ启动子控制。 [0060] 接下来，将上述表达载体转入XL1-Blue菌中，通过化学转化法，将带有抗体Fab轻链(K链)和重链(Fd段)的基因与pComb3噬菌粒载体整合到XL1-Blue菌中，筛选和培养出带有上述融合基因的转基因菌株，所述菌株在辅助噬菌体的作用下能够产生Fab抗体；并且，该抗体经Elisa和测序鉴定，所述的抗体具有正确的生物学活性； [0061] 最后重复上述噬菌体筛选技术通过吸附-洗脱-扩增的过程富集抗胰岛素自身抗体的抗体。 [0062] 本发明制得的抗胰岛素抗体的抗体具有下述特性： [0063] 获得的抗体能够与胰岛素抗体发生特异性结合；抗体的Fab段，包含重链的V区和CH1区和完整的轻链；获得的抗体是独特型抗体，针对抗体的可变区形成抗体，特异性强。 [0064] 图说明 [0065] 图1是制备自身抗体的方法示意图。 [0066] 图2是抗人胰岛素自身抗体的噬菌体抗体库构建流程。 [0067] 图3是pComb3载体示意图及其单酶切结果。 [0068] 图4是PCR扩增的重链和轻链可变区基因。 [0069] 图5是pComb3和轻链双酶切结果。 [0070] 图6是轻链库连接产物转化细菌菌落生长情况。 [0071] 图7是轻链库双酶切鉴定结果。 [0072] 图8是抗体库的菌落生长情况。 [0073] 图9是多克隆涂板分离单个克隆Elisa结果。 [0074] 图10是纯化的自身抗体与抗原Elisa结果。 [0075] 图11是自身抗体纯化SDS-PAGE结果(还原和非还原)。 [0076] 图12是单克隆抗抗体噬菌体Elisa的筛选结果。 [0077] 图13是特异性抗抗体Elisa检测。 [0078] 图14是抗抗体与抗体Z-DOCK结果。 具体实施方式[0079] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。 [0080] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 [0081] 本发明实验采用的实验材料包括： [0082] 菌株及载体：XL1-BLUE(北京宝科维有限公司)；辅助噬菌体(北京宝科维有限公司)；pcomb3载体(北京宝科维有限公司)； [0083] 实验动物：ICR雌性小鼠(中国科学院实验动物中心)；NOD雌性小鼠(中国科学院实验动物中心)； [0084] 培养基：Luria-Bertani(LB)液体培养基：1％(w/v)胰蛋白胨(OXIOD)，0.5％(w/v)酵母抽提物(安琪酵母公司)，1％(w/v)氯化钠(Genebase)，pH7.0，121℃灭菌20min；对于其固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入1.5％琼脂粉(Genebase)； [0085] SOC液体培养基：0.5％(w/v)酵母抽提物(Angelyeast)，0.05％(w/v)氯化钠(Genebase)2％(w/v)蛋白胨(BD)，2.5mM KCl，10mM MgCl 2，20mM葡萄糖(Genebase)，121℃灭菌20min；对于其固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入1.5％琼脂粉(Genebase)； [0086] 分子生物学试剂及材料：限制性内切酶：Sac I、Xba I、Xho I、Spe I、Nhe I、Not I(New England Biolabs)；DNA聚合酶：Prime STAR HS DNA Polymerase(TAKARA)；DNA连接酶：T4DNA Ligase(Promega)；DNA引物：生工生物工程(上海)股份有限公司； [0087] 噬菌体筛选纯化相关试剂及材料：HRP标记的鼠抗flag抗体(Sigma)；MOPS(生工生物工程(上海)股份有限公司)；PEG8000(生工生物工程(上海)股份有限公司)；超滤管：截留量100KDa(Millipore)；蛋白质浓度测定试剂盒(BIO-RAD)； [0088] 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质免疫印迹实验相关试剂：丙烯酰胺(Genebase)、过硫酸铵(AMRESCO)、Tris base(Genebase)、盐酸(国药集团)、TEMED(Genebase)、甘氨酸(Genebase)、电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液(碧云天)； [0089] 小鼠免疫相关材料和试剂:佐剂：Freund's adjuvant(Sigma)；抗体：驴抗小鼠HRP标记单抗(jackson)；TMB底物(Sigma)、1M硫酸(国药)、PBS溶液、PBST+1％BSA溶液； [0090] 实验仪器:PCR仪：Tanoan公司:恒温培养箱：DNP-9162(上海精宏实验设备有限公司):恒温水浴锅：DK-8D(上海一恒科学仪器有限公司):冰箱：4℃、-20℃(Haier):低温冰箱：-80℃MDFU53V(SANYO):摇床：THZ-03MZR(SHENERGY BIOCOLOR):常温台式离心机：5415D(Eppendorf):冷冻台式离心机：CT15RE(HITACHI):冷冻落地式离心机：5810R(Eppendorf):超速离心机：Optima L-80XP(Beckman):生物安全柜：HR40-IIA2(Haier):电泳仪：ESP300(TANON):酶标仪：IMark microplate reader(BIO-RAD)。 [0091] 实施例1 利用噬菌体库筛选胰岛素抗体 [0092] 用溶于100μL PBS的胰岛素抗原(10ug)包被，4℃过夜，用PBS洗涤并用3％MPBS封闭非特异性结合位点，37℃1h，用PBS洗涤加入100μL滴度为1012噬菌体抗体，37℃孵育，用PBST洗涤后加入对数生长期TG1，37℃孵育，加入800μL三乙胺，将洗脱液转移至1个新试管中，并立刻Tris-Hcl(PH7.4)中和并混匀，将TG1、洗脱液以及TG1合并至一管，37℃孵育，加入终浓度2％的葡萄糖和100ug/μL的氨苄青霉素，37℃摇床1h，加入辅助噬菌体，37℃孵育30min，加入抗性后，30℃摇床过夜扩增，上述细菌回收进行第二轮筛选，循环往复4轮(实验步骤如图1所示)。 [0093] 实施例2 NOD小鼠IgG免疫ICR小鼠获得脾脏RNA [0094] (1)免疫小鼠：将纯化得到的NOD血清IgG溶于PBS溶液(2mg/mL)，伴以等体积的佐剂，随机取6周龄雌性ICR小鼠若干，共三组，第一、二组分别接种NOD及ICR200ug/只，第三组(阴性对照)注射PBS溶液0.2mL/只，每周取血制备血清样本冻存，每隔14天强化免疫一次； [0095] (2)测定免疫效价：在96孔板上包被抗原(50ug/孔)，4℃过夜，使用PBST+1％BSA溶液37℃封闭1小时，使用PBST溶液清洗3次，加入上述三组血清样本(使用10被稀释度梯度稀释，n＝3)，37℃孵育1小时，使用PBST溶液清洗3次，加入山羊抗鼠HRP标记单抗(稀释度1∶5000)，37℃孵育1小时，使用PBST溶液清洗7次，加入TMB底物反应，10分钟后使用1M硫酸终止反应，使用酶标仪在OD450处运用终点计量法检测数值； [0096] (3)脾细胞RNA获取：加强免疫后的3天，取免疫效果好的2只小鼠立即处死，迅速取出脾脏，分离脾细胞。PBS漂洗2次，弃上清，并进行淋巴细胞计数，按每管5x106个细胞转入1.5mLDEPC水处理过的Eppendorf管中。加入1mL Trizol，室温下在摇床上摇动15min使细胞裂解，加入200μL氯仿，剧烈振荡EP管使溶液呈乳白色，室温静置5min。4℃，12000rpm离心 15min，以去除蛋白；此时分为三层：水相，中间相，有机相；小心吸取上层水相，转移至另一新1.5mLEP管中，加入500μL异丙醇轻轻混匀，-20℃静置过夜使RNA充分沉淀；4℃12000rpm离心10min，小心倒掉上清，保留沉淀；在沉淀中加入1mL冰预冷的75％乙醇(DEPC水配置)，轻轻洗涤，悬浮白色沉淀，4℃，7500rpm离心15min，小心倒掉上清，再用小离心机离心，用 20uL移液器将乙醇吸掉倒扣在干净的吸水纸上，5min左右，使RNA恰好干燥。将干燥后的RNA溶于适量的DEPC水中，使RNA溶解至澄清，测定样品的浓度：Nano drop测量仪检测产物浓度；立即进行逆转录或将样品分装、保存于-80℃。 [0097] 实施例3 对载体pComb3进行单酶切鉴定 [0098] 用Sac I、Xba I、Xho I、Spe I、Nhe I、Not I分别酶切pComb3载体，证实载体序列的正确性(如图8所示)。 [0099] 实施例4 抗体Fab轻链(K链)和重链(Fd段)的基因 [0100] 在无RNA酶的1.5mLEP管中加入2ugRNA和1μL Oligo(dt)/(0.5μg/μL)，加水至总体积12μL，轻轻混匀，65℃预变性5min，结束后立即冰上放置；加入5×Reaction Buffer、Ribolock RI和RevertAid后42℃孵育60min，70℃孵育5min，然后立即冰上冷却；以cDNA第1链为模板，分别加入轻链K和重链Fd段的3’端及5’端各自PCR引物，在Taq DNA聚合酶作用下扩增轻链和重链片段。反应条件：94℃for 10s,(94℃for 30sec,59℃for 35sec,72℃for 1min)×35cycles,72℃for 5min。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离得到约700bp的片段(如图4所示)。 [0101] 实施例5 制备含有抗体Fab轻链(K链)和重链(Fd段)的基因与pComb3噬菌粒载体的表达载体 [0102] 用Sac I和Xba I双酶切上述轻链和pComb3载体(如图5所示)，将得到的约700bp片段连接到同样酶切的pComb3载体中，得到载体pComb3+K；载体pComb3和轻链K的连接产物转化XL1-Blue菌，涂板后平板上布满大量细菌克隆(如图6所示)，用Xho I和Spe I双酶切重链Fd段和含有K基因的质粒pComb3+K(如图7所示)，将得到的约700bpFd片段连接到同样酶切的载体pComb3+K中，得到载体pComb3+K+Fd(如图2所示)，将载体pComb3+K和重链Fd的连接产物转化XL1-Blue菌，涂板后平板上布满大量细菌克隆(如图8所示)。 [0103] 实施例6 抗体库的扩增 [0104] 上述产物回收连接后，化学法转化入宿主菌，将菌液转入10mL SB培养基(含20ug/mL Amp)，再37℃继续振荡培养1h，加入100mL SB培养基(含100ug/mL Amp和10ug/mL Tet)，再37℃继续振荡培养1h，加辅助噬菌体VCSMl3溶液，37℃振荡培养2h，加入Kan至终浓度为70ug/mL，37℃，250rpm，振荡培养过夜，将过夜培养的菌液4℃，4000rpm离心15min，上清转入另一无菌离心管中，加入PEG8000/NaCl，使两者终浓度分别为40g/L和30g/L，置于恒温振荡器上振荡5min以促溶，再冰浴30min使噬菌体沉。4℃，9000rpm离心20min，弃上清，2mL PBS重悬噬菌体沉淀，瞬时离心，上清即为Fab噬菌体抗体库，-20℃保存。 [0105] 实施例7 筛选特异性单克隆抗体 [0106] 按实施例1的方法进行抗体筛选，在第四轮筛选富集到的噬菌体中，随机挑选96个噬菌体克隆进行扩增，对其与胰岛素抗原行Elisa测定，筛选到5个噬菌体克隆显示出与抗原的高结合性(如图9所示)。 [0107] 实施例8 特异性胰岛素单克隆抗体的Elisa检测 [0108] 利用胰岛素作为包被蛋白，BSA为对照抗原，结果显示，仅I389和I34抗胰岛素抗体与胰岛素的结合呈剂量依赖关系，即随着抗体浓度的下降，OD405也随之下降(如图10所示)。 [0109] 实施例9 自身抗体纯化SDS-PAGE电泳 [0110] 不连续Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶在Bio-red公司的垂直电泳装置中进行电泳分离，条件为60V电泳1小时后改为100V电泳至溴酚蓝条带跑出凝胶，经考马斯亮蓝染色液染色显示，在还原条件下，在相对分子量55kD处出现特异性条带；在非还原条件下，在相对分子量约为25kD处出现特异性条带；阴性对照未出现任何条带(如图11所示)。 [0111] 实施例10 抗自身抗体的抗体的Elisa检测 [0112] 用胰岛素抗体作为抗原，按实施例1的方法进行筛选，在第四轮筛选富集到的噬菌体中，随机挑选96个噬菌体克隆进行扩增，对其与胰岛素抗原行Elisa测定，筛选到4个噬菌体克隆显示出与抗原的高结合性(如图12所示)。 [0113] 实施例11 特异性单克隆抗体的Elisa检测 [0114] 利用实施例5获得的胰岛素抗体作为包被蛋白，结果显示，仅I3349抗胰岛素抗体的抗体与I389胰岛素抗体的结合呈剂量依赖关系，即随着抗体浓度的下降，OD405也随之下降，另外，抗胰岛素抗体与1型糖尿病病人血清Elisa检测呈阳性反应(如图13所示)。 [0115] 实施例12 [0116] 抗胰岛素抗体与自身抗体经过ZDOCK预测结合状态及结合位点如图14所示。 [0117] SEQ NO1. [0118] 用于扩增鼠源性IgG Fab段基因的引物 [0119] |
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