[0001] 本发明涉及极端环境环境微生物、生物化学及分子生物学等领域，特别是把从南极乔治王岛土壤中分离纯化出土壤微生物约40 kb大片段的DNA 连接到Fosmid载体中构建成宏基因组文库，该文库中包含有南极土壤中原核和真核微生物各种染色体内部基因及其调控信息。

[0002] 本发明针对南极土壤中蕴含的大量生物基因资源，利用分子生物技术手段从南极土壤中分离微生物大片段DNA并连接到宏基因组载体当中，在未培养的情况下直接获得了南极土壤生态环境中各种微生物基因资源。该文库可用于分析南极土壤微生物群落多样性和筛选各种新颖微生物基因资源。

[0003] 根据目前科学界的广泛认为，在自然界栖息群中微生物仅有0.01~10%可以培养，由于缺乏再现环境条件的方法和适宜的培养基质，大部分微生物在目前实验室的条件下不能或很难进行人工培养，因此不可能得到其纯培养并对其进行形态、生理、遗传等特性的研究。宏基因组是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota round in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。到目前为止，土壤宏基因组学技术已在新基因发现、生物活性物质的发现以及土壤生态等几个方面得到了广泛的应用。从土壤宏基因组文库中获得新编码基因是该技术的主要功能所在，已发现的新基因主要有生物催化剂基因、抗生素抗性基因以及编码转运蛋白基因。土壤宏基因组学技术最引人注目的贡献是新生物催化剂的发现，包括淀粉酶、脂肪酶、酯酶、蛋白酶、氧化还原酶等，并且在此基础上获得新酶的许多特征信息。

[0004] 目前随着现代分子生物学的发展，对于生物DNA分子水平研究的需要，构建基因组文库成为了实验室常规的研究方法。它能够分离特定的基因片段，研究基因的表达等，对于人类和动植物基因组的研究有着非常重要的作用。构建基因组文库的载体很多，大致可分为噬菌体系列（如早期的噬菌体、Cosmid、PI 噬菌体和Fosmid 等）和人工染色体系列（如YAC、BAC 和PAC 等）。前者的克隆能力相对较小（噬菌体24kb 左右，Cosmid 35 ～ 45kb），以及构建的一系列人工染色体，如酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC），P1 人工染色体（PI-derived artificial chromosome，PAC）和哺乳动物人工染色体（mammalian artificial chromosome，MAC）等能够满足真核生物庞大并复杂的基因结构。Fosmid 载体是现在流行的用于替代 Cosmid 载体构建大片段文库的新载体，与BAC文库构建相比，Fosmid文库的构建更简单，快速。近年来，Fosmid文库已被广泛应用于基因的图位克隆、物理图谱的构建和比较基因组研究中。其优点如下。

[0005] 1. 由于插入了大肠杆菌致育因子F-因子，所以它在宿主菌中以单拷贝形式存在，稳定性好。

[0006] 2. Fosmid载体上有一个可诱导的oriV高拷贝复制起始点，需要时可诱导达到高拷贝 (50个左右) 。

[0007] 3. 随机性好，保证了每段DNA在文库中出现的频率均等。

[0008] 南极独特的自然环境使得该地区蕴藏着丰富的微生物资源，并蕴藏着多种重要的新颖微生物。国内外研究学者对极地微生物的分布等情况做出了大量的研究，发现南极微生物的种类非常多，而且该地区微生物产生的很多次级代谢产物都拥有新颖的生物活性并具有被用作新的治疗药物的潜能。此外，人们还从极地中分离到了许多微生物物种。由于这些微生物长期生活在寒冷的环境中，它们在适应这些酷寒环境时形成了多种不同的适应该环境的代谢机制，于是就使这些微生物以及它们所产生的代谢产物具有了一定的独特性，蕴涵着不可估量的应用潜力。

[0009] 本发明就是针对南极土壤中蕴含的大量微生物基因组信息，利用土壤大片段DNA 提取技术和Fosmid载体，通过构建宏基因组文库的方式直接获得了包括非培养微生物基因组信息在内的所有的土壤生物信息。该文库的构建能满足于各种酶基因的分离、抗生素的筛选及分子生物学研究需要。

[0010] Fosmid 载体是现在流行的用于替代 Cosmid 载体构建大片段文库的新载体，与BAC文库构建相比，Fosmid文库的构建更简单，快速。本发明根据实际操作经验使用的载体是pCC2FOS，回收的土壤大片段是在40kb左右大小的片段，宿主菌是大肠杆菌。本发明成功的构建了不同位点南极土壤宏基因组Fosmid文库，同时指出每个构建关键步骤操作中的注意事项和该文库的使用范围等供大家根据自己的实际需要参考。

[0011] 对于土壤大片段DNA 的提取和回收，我们使用的是试剂盒的方法，提取的大片段DNA 同时满足以下几个要求：①片段要大约在40kb，因为相同的克隆数中片段大所构建的文库包含的信息内容才大，才能够多的涵盖土壤中遗传信息的内容；②纯度高，尤其是不含或者少含抑制后继实验中酶活力的物质( 土壤中的这类物质很多)；③回收的DNA 中尽可能的包含土壤中所有微生物的遗传信息。

[0012] 本发明提供了一个完整的包含10 万克隆以上的南极土壤宏基因组Fosmid文库。本发明提供了土壤宏基因组文库构建的每个关键步骤的注意事项和原理，可以根据需要片段大小选择不同类型的载体和构建步骤。

[0013] 本发明提供了可根据实际需要更改操作步骤的原理和方法。

[0014] 具体地，提供了该文库从大片段土壤DNA 到文库克隆的整个过程。

[0015] 本发明提供了每个关键环节的详细步骤和原理，并提出了可以调整方案的建议和方法。首先指出了要获得比较大的DNA片段，DNA片段大于25kb，否则会引起奇怪克隆。其次指出了连接过程中的注意事项，首先计算出所需构建的文库所需要的合适的质粒的量。一个反应将产生103-106个克隆，具体取决于“插入DNA”的质量。通过这些可以计算出需要连接反应的次数，连接反应可以扩大和缩小体系。

[0016] 本发明提供的文库可以用于工业用酶基因的筛选、新抗生素的发现、农业用有毒有害物质的降解基因、微生物基因的调控信息等的研究工作，也可以满足一些相关的后继工作需要。具体地，本发明提供了文库的构建立方法和获得的很有开发应用研究价值的文库，具体的方法如下。

[0017] 1. 本发明阐述了该文库的构建方法步骤，根据实际的操作并结合已经公开的方法实践出了切实可行的构建方法，并获得了一个容量超过10 万克隆以上的一个土壤宏基因组文库。

[0018] 2. 不同大小片段的DNA 分子和载体的连接，首先计算出构建文库所需要的合适的质粒的量取决于‘插入DNA’的质量，通过这些可以计算出需要连接反应的次数，连接反应可以扩大和缩小体系。

[0019] 3. Fosmid 克隆的包装，将连接产物进行包装，稀释后的噬菌体微粒感染EPI300-T1R宿主菌。

[0020] 依据本发明提供的原理和通过实施本发明的具体方法并结合需要调整操作步骤，可以达到以下预期效果。

[0021] 1. 提供了一个不同位点南极土壤宏基因组文库，获得的该文库可以用于各种功能基因的筛选、微生物次级代谢产物的分离以及各种后继分子生物学等的科学研究工作。

[0022] 2. 本发明提供了获得的土壤宏基因组文库的构建方法，与常规方法相比具有详细、可操作性强、操作步骤依据需要可调等特点。

[0023] 下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

[0024] 实施例一 土壤DNA提取纯化利用Mobio PowerSoil® DNA Isolation Kit 提取南极土壤总DNA，步骤如下：
1、取0.25g土壤样品加入PowerBead 管中，轻轻涡旋混匀；
2、加入60μL Solution C1，上下颠倒数次混匀；
4、将PowerBead 管固定在涡旋仪适配器上，最大转速3200rpm涡旋连续振荡10min；
5、室温10000g离心30s，转移上清至一个干净的2mL收集管中；
6、加入250μL Solution C2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min；
7、室温10000g离心1min，避开沉淀小珠，转移上清到一个新的收集管中；
8、加入200μl Solution C3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min；
9、室温10000g离心1min，避开沉淀小珠，转移上清到一个新的收集管中；
10、加入1200μL Solution C4到上清中，涡旋混匀5s；
11、加载约675μL上清到Spin Filter中，室温10000g离心1min，弃去滤液，继续加载675μL上清，室温10000g离心1min，重复直至过滤完所有上清；
12、加入500μL Solution C5到Spin Filter中，室温10000g离心30s，弃去上清；
13、室温10000g离心1min，小心转移Spin filter到2mL收集管中；
14、加入100μL Solution C6到白色滤膜中心，室温10000g离心30s；
15、弃去Spin Filter，此时收集管中的DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化。

[0025] 实施例二 大片段与载体的连接。

[0026] 1.Gelase 消化回收有大片段DNA 样品胶块，消化完成后检测大片段DNA的浓度。

[0027] 2. 混合下列溶剂，并在每添加完一种试剂后彻底混匀，组成10μL的连接反应体系。pCC2FOS和“插入DNA”在摩尔比为10：1时最合适：Sterile ddH2O                       2μL
Fast-Link 10 x ligation Buffer      1μL
（10mmol/L）ATP                       1μL
pCC2FOS Vector                      1μL
插入DNA                             4μL
Fast-Link DNA Ligase                1μL
室温培养4小时，将反应体系转移到70℃水浴保温10分钟，使Fast-Link DNA Ligase酶失活。

[0028] 实施例三 Fosmid 克隆的包装、转染在包装反应的前一天，将过夜培养的宿主菌EPI300-T1R Plating Strain接种到含有
10mmol/L硫酸镁和0.2% 麦芽糖的50mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD600在 0.8-1.0之间（约2h），4℃保藏。

[0029] 包装、转染步骤具体如下。

[0030] 1、冰上融化1管MaxPlax Lambda packaging Extracts。

[0031] 2、立即转移25μL上述1的packaging Extracts到另一个1.5mL的无菌EP管中，将剩余的25μL packaging Extracts放回-70℃冰箱。

[0032] 3、取上述实施案例二中的10μL连接反应体系，加至上述2的无菌EP管中，用移液枪混匀液体，注意避免产生气泡。400rpm低速离心，收集溶液到EP管底部。

[0033] 4、上述3的反应液于30℃下包装2小时，包装反应之后，加入上述2中剩余的25μL packaging Extracts，混匀。

[0034] 5、上述4的反应液于30℃下第二次包装反应2小时，包装反应之后，加入噬菌体稀释缓冲液（Phage Dilution Buffer）至1.5mL并温和混匀。按照每100μL EPI300-T1R宿主菌溶液中加入10μL稀释后噬菌体微粒的比例将两者混合，37℃噬菌体吸附1h，将感染了噬菌体的细菌涂布到含有12.5μg/mL氯霉素的LB平板上，37℃培养12~16小时，获得转化平板。或者每管噬菌体微粒加入25μL氯仿，温和混匀后4℃保藏。

[0035] 实施例四 文库的扩增保存及检测。

[0036] 1、加入1~2 ml LB液体培养基到上述步骤5的转化平板上，悬浮菌体细胞；转移悬浮细胞到另一个转化平板上，悬浮菌体细胞；并且重复这个步骤。

[0037] 2、转移最终的菌悬液到无菌EP管中，加入灭菌甘油使其终浓度到达20%，混匀分成小份保存在−70°C。

[0038] 3、进行菌落计数，根据以下公式计算Fosmid文库噬菌体滴度：噬菌体滴度=（平板菌落数×100μL·mL-1×稀释倍数）/涂布体积。

[0039] 4、结果：上述3中，所构建的Fosmid文库的噬菌体滴度为1.12×106 cfu/mL。南极土壤宏基因组插入DNA的平均长度为40kb，按南极土壤中的微生物基因组的平均大小为5Mb算，那么根据下述公式，可以计算出该文库覆盖的样本中的微生物细胞数约为5.8×105个，符合文库构建标准。

[0040] 克隆子数目=（噬菌体滴度×包装体积）/[ln(1-P)/ln(1-f)]其中P=0.9999，是覆盖概率的期望值。f=40kb/5Mb，是每个Fosmid克隆中的插入片段长度占平均基因组的分数；包装体积是1ml。