一种适用于高通量测序中PCR‑Sort‑PCR文库富集方法 |
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| 申请号 | CN201710232989.2 | 申请日 | 2017-04-11 | 公开(公告)号 | CN106868002A | 公开(公告)日 | 2017-06-20 |
| 申请人 | 江苏吉诺思美精准医学科技有限公司; | 发明人 | 曹振龙; 邢红兵; 刘少卿; 彭德镇; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开一种适用于高通量测序中PCR‑Sort‑PCR文库富集方法，包括以下步骤：(1)文库构建过程中，接头连接产物纯化后，开始首轮PCR反应；(2)在首轮PCR之后，所得核酸进行纯化或者 片段 分选；(3)以首轮PCR纯化产物或者片段分选产物为模板进行第二轮PCR反应。在高通量测序中，随着该技术的发展，面临的样品问题越来越严重，主要表现在：样品总量越来越少，复杂度越来越大。相对而言，样品量是主要的限制因素。在获得更多样品总量的不可能的 基础 上，如何顺利完成高通量测序就显得尤为重要，本 专利 的文库富集技术，在文库构建过程中解决样品总量不足的问题，能够获得文库片段较为集中、产量较高的文库，同时保证了样品的丰度。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种适用于高通量测序中PCR-Sort-PCR文库富集方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种适用于高通量测序中PCR-Sort-PCR文库富集方法技术领域[0001] 本发明涉及基因高通量测序技术领域，具体地，涉及一种适用于超低起始核酸模板的高通量建库的PCR-Sort-PCR(PSP)文库富集技术。 背景技术[0002] 在二代和三代测序技术中，构建高质量的测序文库是高通量测序的关键因素。测序文库的质量直接决定测序产出的数据质量，进而对数据分析有着莫大的关联。随着高通量测序技术的快速发展，各大试剂公司，高通量测序在动物学、植物学、微生物学、农业、医学等各个领域得到了极大的应用。高通量测序的建库方法也逐渐被开发、成熟、应用；面对的样品类型越来越复杂，例如单个细胞、cfDNA等，这类样品的获得相当不容易，难以满足高通量测序文库构建的要求。在此情形下，多种建库方法被开发，例如面对单细胞样品，已有单细胞转录文库构建方法及试剂盒、单细胞基因组文库构建方法及试剂盒，但，目前尚不能针对所有低起始量样品开发专门的建库方法与试剂盒。因此，如果能够在文库构建的PCR实验过程中进行优化，将极大地提高高通量测序文库构建的适用范围及适用能力，也将为样品制备节省更多的人力、物力，同时能够提高科研的效率与降低成本。鉴于这样的考虑，本文引入一种适用于高通量测序中PCR-Sort-PCR(PSP)文库富集技术。 发明内容[0003] 本发明的目的在于提供一种适用于高通量测序中PCR-Sort-PCR(PSP)文库富集方法。 [0004] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现： [0005] 一种适用于高通量测序中PCR-Sort-PCR文库富集方法，包括以下步骤： [0006] (1)文库构建过程中，接头连接产物纯化后，开始首轮PCR反应； [0007] (2)在首轮PCR之后，所得核酸进行纯化或者片段分选； [0008] (3)以首轮PCR纯化产物或者片段分选产物为模板进行第二轮PCR反应。 [0009] 本发明方法适用于超低核酸起始量或正常扩增建库流程无法进行的情况，不适用于较高核酸起始量的情况。 [0010] 步骤(1)所述的接头连接产物为按照正常流程构建文库，经过核酸片段化、末端修复、3`末端加A、连接接头之后所获得的样品；所述的接头连接产物需要进行纯化。 [0011] 步骤(1)所述的接头连接产物为高通量建库所得的具备PCR模板条件的接头连接产物，也适用于其他具备PCR条件的模板，例如克隆的质粒等。 [0012] 步骤(1)所述的接头连接产物的纯化方式为磁珠法、过柱法或酚：氯仿抽提法，但不限于此。 [0013] 步骤(1)所述首轮PCR反应的循环数降低至建库流程建议循环数的一半，所述第二轮PCR反应的循环数降低至建库流程建议循环数的另一半。所述建库流程建议循环数为常规建库试剂盒给出的PCR条件中的PCR循环数。 [0014] 本发明技术方案的关键为：在文库构建过程中将PCR扩增由一步扩增设计为两轮PCR扩增，并在两轮扩增中间添加片段分选或DNA纯化步骤，采用该方法可以在首轮PCR之后，样品总量有所提高的情况下，利用纯化或者片段分选的方式对所得核酸进行限定，以期达到片段分布相对集中的文库，并且能够有效避免文库片段类型的丢失，保证了文库的片段类型的丰度；另外，通过纯化或者片段分选，将首轮PCR产品进行除杂，为第二轮PCR提供更加纯净的模板，进而提高第二轮PCR的反应效率。因此，本发明技术在超低核酸起始量的情况下成功构建文库，而在超低核酸起始量的情况下采用一步扩增却无法成功构建文库。 [0015] 步骤(1)所述首轮PCR反应的温度、时间条件结合建库流程设置，但不限于此，可结合实际情况设置。第二轮PCR反应与首轮PCR反应条件相同，但不限于此。 [0016] 步骤(2)中所述片段分选的方法为磁珠法进行核酸片段范围分选或切取琼脂糖凝胶的方法进行核算片段范围分选。 [0017] 步骤(2)中所述纯化的方式包含但不限于磁珠法、过柱法。 [0018] 步骤(3)中第二轮PCR反应获得的产物应进行纯化，所述纯化的方式包含但不限于磁珠法、过柱法。 [0019] 上述的方法在构建高通量测序文库中的应用。 [0020] 本发明所述适用于高通量测序中PCR-Sort-PCR(PSP)文库富集方法，最优选技术方案具体包括以下步骤： [0021] (1)文库构建至PCR反应之前，并进行适当的接头连接纯化后(经过核酸片段化、末端修复、3`末端加A、连接接头、连接产物纯化所获得的样品)；使用文库构建流程提供的条件进行首轮PCR反应，循环数调整至文库构建流程推荐的一半；按照设置好的PCR条件进行PCR反应； [0022] (2)首轮PCR反应产物进行片段分选或纯化，获得分选或纯化后产物； [0023] (3)分选或纯化后产物用于第二轮PCR反应，与首轮PCR条件相同；按照设置好的PCR条件进行第二轮PCR反应；第二轮PCR产物进行纯化。 [0024] 本发明方法中，步骤(1)所述的文库构建至PCR之前，是指含有单次PCR扩增的文库构建流程中的PCR反应之前。进一步地，若某一建库流程存在多次PCR反应，使用本专利的停靠点应结合实际情况安排。 [0025] 本发明的实施例中，所使用的建库试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme)提供的VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for (#ND604)及配套使用的接头与引物试剂盒VAHTSTM DNA Adapters for Illumina(#N801-N812)。实验过程中使用的DNA纯化磁珠为VAHTSTM DNA Clean Beads(#N412)。 [0026] 本发明方法中，步骤(1)中样品为正常建库过程中，添加与测序仪匹配的接头、待PCR扩增的文库。例如mRNA-seq实验过程中加上接头的cDNA、DNA-seq为破碎后并加上接头的DNA，以此类推，并不作限制。 [0027] 本发明方法中，首轮PCR反应条件为相应试剂盒给出的参考条件，本发明中并不作硬性的统一要求，原因是不同的建库流程，其PCR条件、循环数、引物、DNA聚合酶都不尽相同，无法统一。本发明中推荐使用文库构建试剂盒给出的条件，便于实验员操作，也便于本发明的有效应用。 [0028] 本发明方法中，步骤(2)中采用片段分选，一般是指应用DNA Clean Beads对PCR产物进行片段分选，其他分选方式也可以，例如切胶回收。在不需要进行分选的文库构建流程中，可以更改为纯化。 [0029] 本发明方法中，步骤(2)中采用片段分选，目的是减少单次过高PCR过程中，PCR体系达到平台期，从而PCR效率、保真性有所下降；在PCR进行至一半的过程中加入片段分选或者PCR产物纯化，再次PCR时，不仅能及时补充PCR所需的dNTP和引物等，还能去除首轮PCR产物残留的杂质等干扰因素，从而能够有效解决低起始量样品构建文库困难的问题，获得大量、高质量的产物。 [0030] 发明的适用于高通量测序的低起始量文库构建时文库富集技术，具有以下优点及有益效果： [0031] (1)方法简易可行、易于实际执行。 [0032] (2)能够获得较多、均一的文库。 [0034] 图1为本发明实施例1中四个FFPE样品不同处理建库之后电泳图结果。图中M代表电泳所用DNA Marker为100bp DNA Ladder Marker，已标记出500bp位置。A代表1ng FFPE样品在PCR环节直接进行18cycles后纯化的电泳结果；B代表1ng FFPE样品在PCR环节直接进行18cycles后分选的电泳结果；C代表1ng FFPE样品在PCR环节先9cycles、磁珠分选、再9cycles之后电泳结果；D代表1ng FFPE样品在PCR环节先9cycles、磁珠纯化、再9cycles之后电泳结果。 [0035] 图2为本发明实施例2中三个cfDNA样品不同处理建库之后电泳图结果。图中M代表电泳所用DNA Marker为100bp DNA Ladder Marker，已标记出500bp位置。A代表1ng cfDNA样品在PCR环节直接进行18cycles后纯化的电泳结果；B代表1ng cfDNA样品在PCR环节直接进行18cycles后分选的电泳结果；C代表1ng cfDNA样品在PCR环节先9cycles、磁珠纯化、再9cycles之后纯化的电泳结果。 具体实施方式[0037] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。建库试剂为南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme)提供的VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for (#ND604)及配套使用的接头与引物试剂盒VAHTSTM DNA Adapters for Illumina(#N801-N812)。实验过程中使用的DNA纯化磁珠为VAHTSTM DNA Clean Beads(#N412)。 [0038] 实施例1 本发明的适用于超低起始核酸模板的高通量建库的PCR-Sort-PCR(PSP)文库富集技术的实例(1) [0040] 2.在A、B、C、D四个PCR管内，各加入1ng的破碎后的FFPE样品提取的DNA； [0041] 3.按照建库试剂盒VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for (#ND604)提供的方法、步骤建库至连接产物纯化后(经过核酸片段化、末端修复、3`末端加A、连接接头、连接产物纯化所获得的样品)； [0042] 4.按照建库试剂盒给出的PCR条件，将cycles调节至9，C、D两个样品进行第一轮PCR反应；A、B样品直接进行18cycles的PCR反应； [0043] 5.A样品在PCR反应后进行磁珠纯化，B样品进行片段分选；C样品进行片段分选、D样品进行纯化； [0044] 6.C、D样品的纯化/分选产物进行第二轮9cycles的PCR反应，PCR产物进行纯化； [0045] 7.使用Qubit对A、B、C、D最终产物进行浓度测定，结果为：44.6ng/ul，17.6ng/ul，42.6ng/ul，43.4ng/ul；并各取8μl，用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，35min，凝胶成像仪下成像观察，并保存图片(图1)； [0046] 8.通过A、B、C、D四个样品最终文库浓度的比较，发现使用PSP技术获得的C文库，能够产出较高浓度的文库，并且，结合电泳图1能够看出，文库片段较为集中。D文库说明PSP的另一种用处也能获得相应的结果。 [0047] 实施例2 本发明的适用于超低起始核酸模板的高通量建库的PCR-Sort-PCR(PSP)文库富集技术的实例(2) [0048] 1.取cfDNA样品，解冻后置于冰上备用； [0049] 2.在A、B、C三个PCR管内，各加入1ng的cfDNA样品； [0050] 3.按照VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for (#ND604)提供的实验方法、步骤建库至连接产物纯化后； [0051] 4.按照VAHTSTM Universal DNA Library Prep Kit for (#ND604)给出的PCR条件，将cycles调节至9，C样品进行第一轮PCR反应；A、B样品直接进行18cycles的PCR反应； [0052] 5.A样品在PCR反应后进行磁珠纯化，B样品进行片段分选；C样品进行纯化； [0053] 6.C样品的纯化进行第二轮9cycles的PCR反应，PCR产物进行纯化； [0054] 7.使用Qubit对A、B、C最终产物进行浓度测定，结果为：70.6ng/ul，22.9ng/ul，43,7ng/ul；并各取8μl，用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，35min，凝胶成像仪下成像观察，并保存图片(图2)； [0055] 8.通过A、B、C三个样品最终文库浓度的比较，发现使用PSP技术获得的C文库，能够产出较高浓度的文库，并且，结合电泳图2能够看出，文库片段较为集中。与实例1结果一致。A文库所获得最大浓度的文库，但其文库中明显含有大量杂带，影响文库质量。 [0056] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 |
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