一种用于构建微生物细菌16s rDNA可变区测序文库的扩增子引物及构建方法 |
|||||||
| 申请号 | CN201610954147.3 | 申请日 | 2016-11-03 | 公开(公告)号 | CN106497926A | 公开(公告)日 | 2017-03-15 |
| 申请人 | 承启医学(深圳)科技有限公司; | 发明人 | 钟嘉泳; 张弓; 赵盼盼; 王旭; 孙黎; 金静洁; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种用于构建 微 生物 细菌16s rDNA可变区测序文库的 扩增子 引物及构建方法，引物由上游引物和下游引物构成，上游引物包括第一接头序列、第一测序引物序列、第一随机 碱 基序列和上游特异性靶序列引物；下游引物包括第二接头序列、标签序列、第二测序引物序列、第二随机碱基序列和下游特异性靶序列引物。并且采用所述引物可对微生物细菌16s rDNA进行一步法扩增子构建可变区测序文库。本发明增加文库复杂度，保证测序 质量 ，避免了加入PhiX文库浪费测序通量；且本发明扩增效率高，不容易出现二聚体，能够准确快捷、成本低的进行细菌种群的鉴定。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于构建微生物细菌16s rDNA可变区测序文库的扩增子引物，所述引物由上游引物和下游引物构成，所述上游引物由5’端到3’端包括第一接头序列和第一测序引物序列，所述下游引物由5’端到3’端包括第二接头序列、标签序列和第二测序引物序列，其特征在于： |
||||||
| 说明书全文 | 一种用于构建微生物细菌16s rDNA可变区测序文库的扩增子引物及构建方法 技术领域[0001] 本发明涉及微生物基因测序领域，具体涉及一种用于构建微生物细菌16s rDNA可变区二代测序文库的扩增子引物及细菌16s rDNA可变区二代测序文库的构建方法。 背景技术[0002] 16S rRNA基因是原核生物细菌在进化过程中保守的一个基因，但是16s rRNA基因上又有一些高可变区段，这些高可变区段在不同种属的细菌变化很大，所以可以通过对高可变区段的测序来区分细菌的种属。现在对微生物16S rDNA基因进行宏基因组测序一般使用二代测序的方法，特别是选用准确性和通量高的Illumina MiSeq和HiSeq测序平台。 [0003] 目前对少量目标基因进行构建文库的方法，基本使用扩增子文库构建方法。即在特异性基因片段PCR扩增同时，把测序需要接头序列、测序引物序列和测序标签序列同时连接到扩增片段两端。扩增子文库构建又可分两种，一种是多步扩增法，即进行多轮PCR扩增，逐步把测序所需要的序列连接到目标片段两端。另外一种是一步扩增法，即在设计引物时，测序所需要的所有序列都包含在引物上，只需要一轮PCR扩增即构建出完整的测序文库。 [0004] 第一种方法多步扩增发，一般为两步扩增，这种方法也被广泛使用，优点是引物较好设计，引物扩增效率也较好。但缺点是步骤繁琐，而且不适用于同时扩增多个目标片段或者是有些微差别目标片段序列，例如16s rDNA扩增子文库的构建。虽然用同一对引物扩增16s基因的可变区域，但是无法保证对不同细菌16s rDNA序列的扩增效率是一致的。如果第一轮扩增对目标片段有些微偏好性，第二轮扩增时会指数式放大PCR对片段的扩增偏好性。 这种扩增偏好性的缺点在16s rDNA文库构建是无法容忍的，因为测序数据结果不能反应真实微生物群细菌种群的组成。 [0005] 而第二种方法一步扩增法，使用的特异性扩增引物直接包含了测序所需要的所有序列，这会导致引物大小较长(85-100nt)，甚至达到100nt以上。较长的引物序列在PCR扩增过程中扩增效率不好，而且容易出现引物自连接，形成引物二聚体，影响文库构建效率以及给文库带来很多杂质片段，甚至会导致文库构建失败。特别是在为了保证扩增效率的时候，把退火温度设置较低的时候，引物二聚体情况更为严重。 [0006] 另外对于Illumina二代测序平台，扩增子建库方法，如果目标基因数较少时，扩增子文库复杂度小，不能直接上机测序。因为Illumina MiSeq、HiSeq 2000/2500和HiSeq X Five/Ten在测序复杂度地低的文库，例如PCR扩增子文库或简单基因文库时，如果测序每个循环，特别是前5个循环，测到的四种碱基A/C/G/T比例不接近各25％，会导致测序系统无法矫正数据，最终导致测序质量差甚至测序失败。对于这些文库，解决方案是在原测序文库中，混入一种碱基组比例接近25％的PhiX文库，以增加测序文库的复杂度。但是这会造成测序数据通路的浪费。 [0007] 使用Illumina测序平台，对16S文库进行测序时，使用上述的两种方法构建的16S rDNA文库，由于16S rDNA文库是由只有一对或几对特异性引物进行扩增子建库而成，测序文库复杂度都不够，需要加入PhiX文库，否则测序质量会受到严重影响，甚至测序失败。但是加入PhiX文库，会占据75％的测序通量数据，极大浪费测序通量。而且增加了16S rDNA测序的步骤和成本。 [0008] 因此，针对上述问题，迫切需要对现在的16S rDNA扩增子建库方法进行优化改进，以便提供一种快捷方便，准确，成本低的16S rDNA文库构建方法。 发明内容[0009] 有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于构建微生物细菌16s rDNA可变区测序文库的扩增子引物及构建方法，以解决现有技术中提到的不足。 [0010] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现： [0011] 一种用于构建微生物细菌16s rDNA可变区测序文库的扩增子引物，所述引物由上游引物和下游引物构成，所述上游引物由5’端到3’端包括第一接头序列和第一测序引物序列，所述下游引物由5’端到3’端包括第二接头序列、标签序列和第二测序引物序列； [0012] 所述上游引物还包括设置于第一测序引物序列下游的(即设置于第一测序引物序列3’端一侧)上游特异性靶序列引物，所述上游特异性靶序列引物的引物长度不超过30nt，该上游特异性靶序列引物与第一测序引物序列之间设有由5～10个随机碱基构成的第一随机碱基序列，每一个随机碱基均选自A、C、G和T中的任意一个； [0013] 所述下游引物还包括设置于第二测序引物序列下游的(即设置于第二测序引物序列3’端一侧)下游特异性靶序列引物，所述下游特异性靶序列引物的引物长度不超过30nt，所述下游特异性靶序列引物与第二测序引物序列之间设有由5～10个随机碱基构成的第二随机碱基序列，每一个随机碱基均选自A、C、G和T中的任意一个。 [0014] 进一步地，所述上游特异性靶序列引物的引物序列为：SEQ ID NO.1：5’-CCANACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，其长度为24nt，该SEQ ID NO.1中的碱基N选自A、C、G和T中的任意一个； [0015] 进一步地，所述下游特异性靶序列引物的引物序列为：SEQ ID NO.1’：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCCT-3’，其长度为22nt，该SEQ ID NO.1’中的碱基H选自A、C和T中的任意一个，碱基V选自A、C和G中的任意一个。 [0016] 进一步地，所述上游特异性靶序列引物为碱基N分别为A、C、G和T的四种序列，所述上游引物为同时含有这四种所述上游特异性靶序列引物的混合物； [0017] 进一步地，所述下游特异性靶序列引物为H和V按不同的排列组合所形成的九种序列，所述下游引物为同时含有这九种所述下游特异性靶序列引物的混合物。 [0018] 进一步地，所述第一随机碱基序列为由5～10个碱基按不同的排列组合所形成的序列，所述上游引物能够为同时含有不同排列组合所形成的多种第一随机碱基序列的混合物； [0019] 进一步地，所述第二随机碱基序列为由5～10个碱基按不同的排列组合所形成的序列，所述下游引物能够为同时含有不同排列组合所形成的多种第二随机碱基序列的混合物。 [0020] 进一步地，所述上游特异性靶序列引物与第一测序引物序列之间连接有由5个随机碱基构成的第一随机碱基序列；所述下游特异性靶序列引物与第二测序引物序列之间连接有由5个随机碱基构成的第二随机碱基序列； [0021] 进一步地，所述第一接头序列为P5接头序列，所述第一测序引物序列为P5测序引物序列；所述第二接头序列为P7接头序列，所述标签序列为P7标签序列，所述P7标签序列是由6个或8个碱基组成的识别序列，用于识别不同的样品，所述第二测序引物序列为P7测序引物序列。 [0022] 进一步地，所述引物用于构建微生物细菌16S rDNA的v3～v4可变区段的扩增子测序文库。 [0023] 进一步地，所述上游特异性靶序列引物设置于V3可变区上游侧靠近该V3可变区段的保守区；所述下游特异性靶序列引物设置于V4可变区下游靠近该V4可变区段的保守区。 [0024] 一种构建微生物细菌16s rDNA可变区测序文库的的方法，所述方法为：采用上述引物对微生物细菌组16s rDNA进行一步法扩增子构建可变区测序文库。 [0025] 进一步地，所述的构建微生物细菌16s rDNA可变区测序文库的的方法为：S1：提取样品中的微生物细菌DNA；S2：加入所述上游引物和所述下游引物；S3：采用PCR方法扩增细菌组16s rDNA v3～v4可变区，该PCR方法包括降落PCR(TouchDown PCR)扩增。 [0026] 进一步地，步骤S1中在提取样品中的细菌DNA过程中，在细胞壁溶解过程中采用溶球酶与溶菌酶共同作用进行细胞壁的溶解；在热裂解细菌步骤中，体系在65℃下反应20min后，使其在98℃下再反应30min，增加DNA提取效率； [0027] 进一步地，步骤S3中所述PCR方法分为两轮扩增，第一轮：采用降落PCR扩增，退火温度从70℃每个循环降低0.1～1℃，温度降低至50～60℃为止，第一轮扩增循环为10～30个循环；第二轮扩增在50～60℃恒定的退火温度下扩增，扩增循环为10～20个循环；恒定的退火温度为第一轮扩增后的最终温度。 [0028] 本发明至少具有以下有益效果： [0029] ①本发明方法对细菌组16s rDNA扩增子建库方案进行优化，为了在增加文库的复杂度同时也保证扩增的高效性和准确性，本发明提出在扩增子引物中设计一个5～10个随机碱基N的序列，增加文库复杂度，保证测序质量同时，也避免了加入PhiX文库浪费测序通量，同时也可通过一步PCR扩增方法简化了建库的流程步骤和时间。 [0030] 并且本发明以V3可变区上游的邻保守区作为上游靶序列，并设计了只有24nt长度的上游特异性靶序列引物，以V4可变区下游的保守区作为下游靶序列，并设计了只有22nt长度的下游特异性靶序列引物。该特异性引物序列短，扩增效率高，不容易出现由于引物自连接而形成引物二聚体影响文库构建效率以及给文库带来很多杂质片段，甚至会导致文库构建失败的可能； [0031] 通过上述设计，使得本发明扩增效率高，能够准确快捷、成本低的进行微生物细菌种群的鉴定，其能分辨90％以上的细菌种群，具有重要的应用价值。 [0032] ②本发明使用TouchDown PCR一步法构建扩增子文库，在前期退火温度较高时保证扩增的特异性，在后期退火温度较低时也能保证扩增反应的效率，可以避免由于扩增子引物较长出现引物二聚体的情况，保证了扩增的特异性。 [0033] ③本发明通过对商品化的细菌DNA提取试剂盒做了以下优化，即本发明中除了按商品化试剂盒要求加入溶菌酶外，还加入了溶球菌酶，这能加强对球菌细胞壁的溶解能力。另外在热裂解细菌步骤中再做了优化调整，在试剂盒说明书65℃下反应20min后，补充了在 98℃下反应30min，能够达到更好的裂解细菌效果，这两点优化显著提高了样品中细菌DNA提取效率。 [0035] 通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中： [0036] 图1为本发明实施例中所述的细菌16s rDNA一步法扩增子上游引物的结构示意图； [0037] 图2为本发明实施例中所述的细菌16s rDNA一步法扩增子下游引物的结构示意图； [0038] 图3为本发明实施例中所述的大肠杆菌的上、下特异性靶序列引物所在位置的结构示意图； [0039] 图4为本发明实施例中所述的微生物细菌组16s rDNA一步法扩增子文库构建的流程图示意图； [0040] 图5为本发明实施例中所述的TouchDown PCR扩增建库与普通PCR扩增建库方法效果对比； [0041] 图6为本发明实施例中所述的本发明微生物细菌组DNA提取方法与普通方法提取效果对比。 具体实施方式[0042] 以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。 [0043] 实施例1 [0044] 一种用于构建微生物群细菌组16s rDNA扩增子文库的引物，该引物由上游引物和下游引物构成，上游引物包括上游特异性靶序列引物，上游特异性靶序列引物的引物长度为24nt，引物序列为：SEQ ID NO.1：5’-CCANACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，该SEQ ID NO.1中的第四个碱基N为A、C、G或T，即可选自A、C、G和T中的任意一个。在上游特异性靶序列引物的5’端连接有第一随机碱基序列，第一随机碱基序列为由5个随机碱基构成的序列，每一个随机碱基均为A、C、G或T，即每一个随机碱基均选自A、C、G和T中的任意一个。此外，在第一随机碱基序列的5’端还连接有P5测序引物序列，该P5测序引物序列的5’端还连接有P5接头序列。 [0045] 扩增子上游引物的结构组成如图1所示，从5’端到3’端分别是Illumina公司公布的P5接头序列、P5测序引物序列，然后是第一随机碱基序列，最后是靶基因上游特异性引物序列，即上游特异性靶序列引物，其序列号和基因序列如表1所示。 [0046] 表1上游引物的基因序列 [0047] [0048] 下游引物包括下游特异性靶序列引物，该下游特异性靶序列引物的引物序列为：SEQ ID NO.1’：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCCT-3’，其长度为22nt，该SEQ ID NO.1’中的第七个碱基H为A、C或T，即A、C和T中的任意一个，第八个碱基V为A、C或G，即A、C和G中的任意一个。该下游特异性靶序列引物的5’端上连接有由5个随机碱基构成的第二随机碱基序列，每一个随机碱基均位A、C、G或T，即均选自A、C、G和T中的任意一个。第二随机碱基序列的5’端上连接P7测序引物序列，该P7测序引物序列的5’端上连接有P7标签序列，P7标签序列的5’端上连接有P7接头序列。 [0049] 具体地，扩增子下游引物结构组成如图2所示，其由5部分组成，从5’端到3’端分别有Illumina公司公布的P7接头序列和P7标签序列以及P7测序引物序列、第二随机碱基序列和下游特异性靶序列引物；P7标签序列是由8个碱基组成的序列，用于识别不同的样品。下游引物各部分的序列号和基因序列如表2所示。 [0050] 表2下游引物的基因序列 [0051] [0052] 由于扩增子文库用于进行微生物细菌种群的鉴定，其针对的是各种细菌16s rDNA基因，因此，用于构建细菌组16s rDNA可变区二代扩增子测序文库的引物为一混合物；具体地，在上游引物中，第一随机碱基序列为由5个碱基按不同的排列组合所形成的所有序列，上游特异性靶序列引物为其序列中的碱基N分别为A、C、G和T的四种序列，则上游引物为同时含有不同排列组合所形成的所有第一随机碱基序列和上述四种所述上游特异性靶序列引物的混合物。在下游引物中，第二随机碱基序列为由5个碱基按不同的排列组合所形成的所有序列，下游特异性靶序列引物为H和V按不同的排列组合所形成的九种序列，则下游引物为同时含有上述不同排列组合所形成的所有第二随机碱基序列和上述九种所述下游特异性靶序列引物的混合物。 [0053] 上述包括上游引物和下游引物在内的引物主要用于构建微生物细菌组16S rDNA的v3至v4可变区段的扩增子测序文库。上游特异性靶序列引物位于V3可变区上游侧靠近该V3可变区段的保守区；所述下游特异性靶序列引物位于V4可变区下游靠近该V4可变区段的保守区。本发明参考大量文献，根据与微生物细菌组16s rDNA数据库比对分析结果和实际实验验证效果，确定了以下的特异性引物序列。该引物序列对能够特异性扩增V3-V4可变区域。 [0054] 参考大肠杆菌的位置，大肠杆菌的上游特异性靶序列引物位于V3可变区近邻5’端的上游保守区，具体地，长度为24nt的上游特异性靶序列引物(其序列同上，即CCANACTCCTACGGGAGGCAGCAG)位于大肠杆菌16s rDNA基因341bp～344bp之间；大肠杆菌的下游特异性靶序列引物位于V4可变区近邻3’端的下游保守区，具体地，长度为22nt的下游特异性靶序列引物(其序列同上，即GACTACHVGGGTATCTAATCCT)位于大肠杆菌16s rDNA基因771bp～792bp，如图3所示。 [0055] 本实施例中的第一随机碱基序列或第二随机碱基序列中的随机碱基个数可以为6个、7个、8个、9个或10个，当然也可以根据需要选择多余10个或少于5个，但都在本发明的保护范围内。本申请人采用5个是因为5个随机碱基能够满足90％以上细菌种群，因此没必要选择更为复杂的5个以上的随机碱基序列。 [0056] 实施例2 [0057] 一种用于构建微生物群细菌组16s rDNA扩增子文库的方法，具体如下，同时参见图4： [0058] S1：准备上游引物和下游引物，具体参见实施例1，这里不再重复限定； [0059] S2：提取样品中的微生物细菌DNA； [0060] S3：取10～50ng所提取的微生物细菌DNA(总体积<10ul)放入样品管，加入上游引物1ul(20uM)、下游引物1ul(20uM)和PCR Mix(DreamTag)10ul，加入灭菌水ddH2O至总体积20ul；用移液枪吹打均匀体系；将样品管放到PCR扩增仪上，设置程序是预变性温度96℃加热2min，然后进入TouchDown PCR(降落PCR)步骤进行第一轮扩增，变性温度96℃加热30s，第一个循环退火温度为70℃，退火时间1min，延伸温度72℃，延伸时间2min，接下来每个循环退火温度降低0.7℃，一共进行20个循环，最终退火温度降至56℃。然后进行第二轮扩增，变性温度96℃加热30s，在56℃恒定的退火温度下扩增，退火时间60s，延伸温度72℃，延伸时间2min，一共进行15个循环，两轮扩增参见表3。 [0061] 表3：PCR扩增过程 [0062] [0063] 扩增以后便可回收PCR扩增文库产物，然后可通过Illumina上机测其序列。 [0064] 实施例3 [0065] 实验组：实施例2采用TouchDown PCR所得的扩增产物。 [0066] 对照组：使用普通PCR扩增方法，样品、引物、试剂以及各种成分加样量等均与实施例2中的体系一致，采用普通PCR扩增程序，具体如下：第一步预变性温度96℃加热2min，第二步变性温度96℃加热30s，第三步退火温度56℃，退火时间1min，第四步延伸温度72℃，延伸时间2min，接下来第二步到第四步进行34个循环，一共进行35个循环后，设置72℃，2min，最后温度降至4℃保存。 [0067] 实验组和对照组的扩增预期产物大小均为580bp。取实验组和对照组所得的扩增产物各5ul，进行3％琼脂糖凝胶电泳。 [0068] 结论：结果如图5所示，条带1位实验组，条带2位对照组，由图4可以明显看出，对照组的普通PCR方法的扩增产物中在170bp位置有大量引物二聚体条带，特异性扩增片段(即580bp)不明显；而实验组使用TouchDown PCR进行一步法扩增子建库扩增的产物特异性优于对照组的普通PCR方法，引物二聚体情况也较少。 [0069] 实施例4 [0070] 本发明具体实施例中优选人体尿液样品提取细菌的基因组，应注意到，本发明的实施例中阐述的样品种类和具体操作数字表达方式和数值不限制本发明范围。 [0071] 提取样品中的细菌DNA方法为：首先取20mL尿液样品进行离心，10 000g，低温4℃，离心30min；使用1mL PBS缓冲溶液(pH7.8)重悬沉淀物，使用移液枪吹打均匀；样品放到离心机中低温4℃，10 000g离心10min后，使用移液枪吸掉上清液，保留沉淀物，重复两次(即重复样品离心、除上清液)。最后将沉淀样品等量分成两部分。一部分应用本发明优化的提取方法作为实验组，另外一部分使用通用的细菌提取方法作为对照组。 [0072] 对照组：提取样品中微生物细菌组的DNA，可采用商品化试剂盒，本实施例中使用细菌DNA提取试剂盒(Magen,D3146-02)从上述微生物细菌沉淀物中提取DNA，由于其为现有技术，这里不再具体详述其具体步骤。 [0073] 实验组：为了达到更好的细菌DNA抽提效果，本申请人对对照组中的试剂盒做了优化改进，改进的地方如下：加入200μL Buffer STE和30μL溶菌酶(20mg/mL)以1μl溶球酶(20mg/mL)至细菌沉淀团中；涡旋充分重悬细菌，37℃水浴(或金属浴)30min；加入15μl Buffer SDS、10μl Proteinase K(20mg/mL)和5μl RNase Solution至细菌重悬液中，涡旋混匀，65℃水浴(或金属浴)消化20min，然后为了优化提取效果，将样品管再转至98℃，再消化30min。后面步骤按照商品化试剂盒说明书(Magen,D3146-02)即可提取纯度较高的DNA。获得的微生物细菌组DNA可短时间保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。 [0074] 实验组和对照组的两种不同的提取方法最终都用20ul缓冲液重溶DNA。两种方法提出的微生物细菌组DNA各取5ul样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，图6中条带1和2是对照组中用普通细菌DNA提取方法提取的DNA；条带3和4是用实验组优化方法提取的细菌DNA，由图可知，实验组优化的细菌DNA提取方法其DNA提取效率优明显于对照组通用的细菌DNA提取方法。 [0075] 具体实施时，Illumin测序平台双端测序是从P5和P7测序引物处开始，本发明所述的扩增引物在P5和P7测序引物序列后。本发明方法对16s rDNA扩增子建库方案进行优化，为了在增加文库的复杂度同时也保证扩增的高效性和准确性，本发明提出在扩增子引物中设计一个5～10个随机碱基N的序列，通过这个随机序列，使得测序前5个循环，A/C/G/T四种碱基比例接近各25％，例，如果在第一随机碱基序列或第二随机碱基序列中合成5个随机碱基N(N表示A/C/G/T任意一个碱基)，随机碱基序列的数量为45，即1024种不停的序列，在合成的引物中会有1024种不同序列的混合物；如此便可以使得测序的前五位A/C/G/T碱基分布基本平均，接近25％。从而增加文库复杂度，保证测序质量同时，也避免了加入PhiX文库浪费测序通量，同时也可通过一步PCR扩增方法简化了建库的流程步骤和时间。 [0076] 该引物能够很好的构建细菌组16s rDNA可变区二代扩增子测序文库。 [0077] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
||||||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈