[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种利用多重PCR方法扩增鼠T淋巴细胞TCRA基因CDR3区域的引物组，构建TCRA扩增子文库的方法及确定TCRA免疫组库特征的生物信息学方法。

[0002] 得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域已经被应用于T细胞和B细胞受体的免疫组库测序。在获得性免疫中，T细胞和B细胞通过表面的T细胞受体和B细胞受体特异性的识别抗原肽-主要组织相容性复合物(pMHC)进而启动免疫系统活化。通过测序淋巴细胞受体的CDR3免疫组库，确定T、B淋巴细胞中受体分子的组成，可以用以评价免疫组库的多样性等特征参数，并进一步研究获得性免疫系统的应答发生过程及其发生机制。T细胞受体(TCR)由alpha和beta两条肽链组成，分别由TCRA和TCRB基因编码，TCRA基因的胚系基因由多个开放阅读框依次排列组成，可划分为TRAV,TRAJ,TRAC三组片段，其中，TRAV区域含有约98种片段，TRAJ区域含有60种片段，TRAC区域则仅有1种片段。在T淋巴细胞发育过程中，三组片段通过体细胞重排实现不同片段间的随机重组，产生成熟的TCRA分子，这一过程伴随着TRAV和TRAJ区域间非模板碱基插入或缺失，从而为TCR的多样性提供了分子遗传基础。在TCR与抗原肽-主要组织相容性复合物(pMHC)识别的过程中，CDR1和CDR2主要与多样性相对较低的MHC片段结合，而TCRA的互补决定区3(CDR3)则主要与不同的抗原肽结合，其多样性最为丰富。TCRA基因CDR3区域覆盖了TRBV-Junction-TRBJ这一多样性来源区域，对其序列组成进行测序分析可以很好的反映TCR免疫组库的组成及应答状况。

[0003] 目前对于T淋巴细胞TCRA基因CDR3区域的研究方法仍有待改进和简化。

[0004] 为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供基于高通量测序构建鼠TCRA文库的多重PCR引物。

[0005] 本发明目的之二在于提供一种利用所述多重PCR引物构建TCRA文库的方法。

[0006] 一种基于高通量测序构建鼠TCRA文库的多重PCR引物，其特征在于：所述多重PCR引物为SED ID NO.1-SED ID NO.79。

[0007] 一种多重PCR引物构建鼠TCRA文库的方法，按如下步骤进行：

[0008] 先提取正常胃黏膜组织、胃癌组织或外周血总RNA，然后反转合成cDNA，以SEQ ID NO.72所示序列为反转录引物合成cDNA,再以合成的cDNA为模板，SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.72所示序列为引物进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得到鼠TCRA文库。

[0009] 上述多重PCR的扩增条件为：95℃预变性10min,95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃延伸10min。

[0010] 有益效果：

[0011] 本发明公开了构建鼠TCRA文库的多重PCR引物，该引物能够扩增TCRA基因CDR3区域多样性，构建鼠TCRA文库，本发明还构建了鼠TCRA基因CDR3区测序文库的方法，实现T细胞受体免疫组库的稳定检测，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。

[0012] 实施例：

[0013] 下面将结合所示序列，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造商厂商所建议的条件。

[0014] 1、提取鼠组织中总RNA

[0015] 鼠组织中总RNA的提取方法，包括如下步骤：

[0016] a.取鼠胰腺组织和外周血加入Trizol后吹打，室温静置5min，直接提取RNA或放入-80℃冰箱冻存；

[0017] b.按每毫升Trizol加入200ul氯仿，颠倒混匀，室温放置3Min，然后于4℃、12000g离心15Min。

[0018] c.吸取上层水相，按每毫升Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10Min。于4℃、12000g离心10Min。

[0019] d.沉淀按每毫升Trizol加入1ml 75％乙醇，温和震荡，悬浮沉淀，然后于4℃、8000g离心5Min。吸去上清。

[0020] e.室温晾干5-10Min，用合适体积的无RNA酶水溶解RNA。

[0021] 将所提取的RNA利用Biotek EPOCH测定浓度和质量。检测结果显示，OD260/280在1.8-2.0左右。

[0022] 将所提取的RNA利用琼脂糖凝胶胶电泳检测条带完整性。检测结果显示，28S和18S条带明显，5S条带不明显，28S/18S在2.0左右。

[0023] 上述检测结果表明步骤1所提取的RNA质量满足建库要求，能够用于后续建库。

[0024] 2、逆转录和多重PCR

[0025] 将步骤1获得的总RNA样本分别进行逆转录，逆转录使用ReverAid First Strand cDNA Synthesis kit,具体操作按照试剂盒说明书进行，反应体系为：总RNA 0.1-5ug,浓度为20pmol反转录引物(SEQ ID NO.72)1ul，加入DEPC水定容至12ul,然后将混合液在PCR仪中65℃反应5min，反应结束后迅速放入冰上冰浴5min,再加入5x reaction buffer 4ul,RibolockTM抑制剂1ul，1mM dNTP Mix 2ul,revertaidTMM-MLV反转录酶200u/ul 1ul,混匀后离心，然后在42℃反应1h，得到第一链cDNA.

[0026] 根据T淋巴细胞受体Alpha链(TCRA基因)体细胞重排、非模板随机插入缺失的规律，设计多重PCR引物，为方便测序反应，在正向引物和反向引物的上游添加测序接头序列，具体引物如序列表所示：

[0027] 然后以获得的第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.71所示序列为引物，进行PCR扩增，PCR扩增的反应体系如下：multiplex-PCR预混液25ul,正向引物5ul,反向引物5ul,cDNA 5ul,水10ul,共计50ul；PCR扩增条件为：95℃预变性10min,95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃延伸10min。将得到的PCR扩增产物用质量分数为3％的琼脂糖凝胶(低熔点琼脂糖凝胶)，在50V电压下电泳3h,电泳后再紫外下将含有目的条带的凝胶切下，放入1.5ml EP管中，然后加入1ml QG Stablization buffer，在45℃条件下水浴5-10min直至胶块完全溶解，水浴1-1min；离心后倒掉收集管中废液，将吸附柱放在收集管中，向吸附柱加入300ul QG Stablization buffer,18000g离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放在收集管中，18000g离心2min，再将吸附柱放在新的1.5ml EP管中，用吹风机将吸附柱上残留的酒精彻底吹干，向吸附柱中加入60℃预热的超纯水，静置2min,最后18000g离心2min，收集该洗脱液，得到建库样本。

[0028] 为了确定建库样本质量符合要求，对建库样本在质量分数为1.5％琼脂糖凝胶、100V电压下电泳30min,然后通过凝胶成像检测目的条带。上述检测结果表明获得的建库样本满足建库需求，能够用于下一步测序。

[0029] 3、em-PCR(微乳滴PCR)以及PGM测序

[0030] 利用Qubit测定获得的不同样本的建库样本浓度，然后按相同量混合。样本稀释的方法为，假设Qubit测得的浓度为N ng/ul,文库扩增子长度为M kb,则文库的稀释倍数为N*1.515*1000/26*M。

[0031] 然后以稀释后的文库为模板，进行emPCR，emPCR使用Ion OneTouchTM测序系统提供试剂，操作步骤按照试剂盒说明书进行，然后进行PGM测序，测序结果即为鼠的TCRA文库。然后将测序结果进行统计分析。结果表明，利用本发明的方法构建的鼠TCRA文库能够覆盖TCRA基因的多样性信息。

[0032] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本方明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术鼠员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求所限定的范围。