人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法 |
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| 申请号 | CN201610630541.1 | 申请日 | 2016-08-04 | 公开(公告)号 | CN106190968A | 公开(公告)日 | 2016-12-07 |
| 申请人 | 领航干细胞再生医学工程有限公司; | 发明人 | 王军霞; 殷鉴强; 刘定生; 谢再东; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，包括以下步骤：人脂肪组织采集、亚全能干细胞分离和获得、亚全能干细胞培养与扩增、亚全能干细胞冻存、产品 质量 控制、干细胞建库和干细胞复苏年检；本发明使用的混合胶原酶能够有效的从人脂肪组织中分离出亚全能干细胞，组织消化均一，没有明显的组织残留，细胞活性好，贴壁快，均一性好；本发明的冻存液能够有效的维持细胞的活性，采用梯度降温盒冻存细胞不影响细胞活性，而且操作简单，方便，效率高。 | ||||||
| 权利要求 | 1.人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：人脂肪组织采集、亚全能干细胞分离和获得、亚全能干细胞培养与扩增、亚全能干细胞冻存、产品质量控制、干细胞建库和干细胞复苏年检；所述具体步骤如下： |
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| 说明书全文 | 人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法技术领域[0001] 本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法。 背景技术[0002] 干细胞是一类具有自我更新和多项分化潜能的细胞，根据分化潜能的不同，干细胞可以分为全能干细胞、亚全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，亚全能干细胞是一类分化潜能仅次于全能干细胞的原始干细胞亚群，处于干细胞等级的最上层，主要来源于人体中广泛存在的间质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等，亚全能干细胞的特征在于其具有上皮样形态，Flk1+CD73+CD90+CD105+CD44+表型，无致瘤性，且单克隆来源的该细胞在体外具有分化成三胚层来源的组织细胞的能力，目前，已有利用亚全能干细胞治疗肺纤维化、肝硬化、心肌梗塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤和肌肉萎缩等病症。 [0003] 人脂肪亚全能干细胞是近年来从脂肪组织中分离获得的一种干细胞，由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。 [0004] 脂肪来源的亚全能干细胞具有以下特点：组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制；分离过程简单，无外源污染引入；过程可控性强，重复性好；可获得足够细胞，细胞活力好；培养周期短，成本低。 [0005] 为了提高干细胞资源的利用率，目前全国各地已建立了多个干细胞库，干细胞库是在-196℃深低温液氮环境中存储干细胞并收集存储的干细胞相关资料并有效保存的场所。目前国内已建立脐带血干细胞库，新生儿胎盘干细胞库，脂肪干细胞库，牙髓干细胞库等自体库或公共库。可以为以后的细胞治疗提供数量足够，活力良好的细胞来源。 [0006] 中国专利CN103651331A公开了一种脂肪干细胞库的构建方法，该方法中将脂肪组织洗涤剪碎后直接用冻存液冻存，建库，待客户需要时再复苏组织，分离提取细胞。这种方法虽然简单，但是，干细胞的存活率大大降低，不利于长期的保存。 发明内容[0007] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种通过酶消化法获得Flk1+CD90+CD73+CD105+CD44+的亚全能干细胞，通过专用培养基扩增培养足够数量细胞，加入冻存液低温冷冻暂存，质量检测合格后入库长期保存，定期年检，不仅保证了细胞的干性和存活率，而且操作简单，保障了细胞长期储存安全性的人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法。 [0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，其创新点在于：包括以下步骤：人脂肪组织采集、亚全能干细胞分离和获得、亚全能干细胞培养与扩增、亚全能干细胞冻存、产品质量控制、干细胞建库和干细胞复苏年检；所述具体步骤如下：（1）人脂肪组织采集：供着HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体检测项目均为阴性，无血液系统疾病史、免疫系统疾病史、神经系统病史、内分泌系统病史的供体；脂肪组织由专业医院或美容机构通过肿胀法吸脂手术获得腹部、大腿根部、背部浅表层的脂肪组织；将分离的脂肪组织放入100 ml无菌采集瓶内，并向采集瓶内按每 200-800 IU/ml的量加入庆大霉素，维持在2-8℃的环境中运输，24h内分离； （2）亚全能干细胞分离和获得：将上述无菌采集瓶运送至公司生产部门，核对客户信息和采集信息，确定无误后打印条形码，并将无菌采集瓶传入GMP生产车间进行生产；将脂肪组织从无菌采集瓶内吸出，放入50 ml离心管内，每管10-25 ml，加入等量生理盐水，在150- 400 rpm转速下离心6-10 min，剔除上层油脂和底层血水，再加入等量生理盐水，在150-400 rpm转速下离心6-10 min，向离心管内加入等体积配制的混合胶原酶，充分混匀，所述混合胶原酶为胶原酶P和I型胶原酶的混合物，浓度为0.1-0.5%，在37℃、120-180 rpm转速条件下震荡消化6-50 min，补充等量生理盐水，选用150目筛网进行过筛，将滤液以1600-2000 rpm转速进行离心8-15 min，重复3次，弃上清液，将底层细胞拍散后加入培养基重悬，获得亚全能干细胞种子； （3）亚全能干细胞培养与扩增：将干细胞种子以1×104/cm2的密度接种于T75培养瓶内，并加入12 ml培养基，放入37℃、5%的CO2培养箱内培养，第2天首次换液，剔除非贴壁细胞，将换液的上清收集到离心管内上机菌检，之后每3天换液一次，待细胞长至80%-90%汇合度，进行细胞传代； （4）亚全能干细胞冻存：将P1代细胞长至80-90%的汇合度，用显微镜拍照后，将细胞消化下来，步骤同细胞传代，离心前留取细胞悬液1.5 ml，用于细胞计数、活力和流式检测；离心后将洗液倒入离心管内用于菌检检测，细胞沉淀拍散后，根据计数结果以500-800万个细胞/ml冻存液的密度加入4℃预冷的冻存液，吹匀、分管，做好标识，贴好冷冻条形码，放入梯度降温盒，在-80℃冰箱过夜后，从梯度降温盒取出，放于-80℃冰箱暂存；细胞冻存液的构成成分为40-50%培养基，30-40%人血白蛋白，15-25%CryoSure-DEX40，0.1-0.5 mol/ml海藻糖； （5）产品质量控制：自供体脂肪组织进入公司开始进行取样检测，检测项目为：菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型，将菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型等各项检测均合格的细胞由-80℃冰箱转移到-196℃液氮存储箱内长期保存；同时将自采集到存储过程的所有记录单全部收集起来，建立档案，并保存； 而检测不合格的细胞出具不合格报告和废弃通知单，根据条形码编号将相应冻存的细胞一并废弃，并有专门人员做无害化处理，并作好相应的记录； （6）干细胞建库：将每一份脂肪亚全能干细胞按着合同上要求进行细胞制备和存储，建立每份细胞详细的纸质档案和电脑数据库，包含客户脂肪从运入公司到干细胞入库的所有信息，建立人脂肪成体干细胞库； （7）干细胞复苏年检：在每个液氮存储箱中放一个公共干细胞样本，各项检测指标符合标准，冻存30支，每年质量部门定期复苏1支检测细胞活性，表型，扩增能力，各项指标的详细信息质量控制部门确认无误后，由客户服务部统一录入系统，客户采用条形码登录公司网站查询干细胞产品的年度检测情况。 [0009] 进一步的，所述步骤（3）中的细胞传代的具体步骤为：待细胞长至80-90%汇合度，倒掉T75培养瓶内的培养基，用0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入5 ml浓度为0.075%-0.125%的胰蛋白酶，在37℃消化1-3 min后，加入等量培养液终止消化，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，取样计数，1000-1500 rpm转速条件下离心6-10 min，将离心所得的细胞沉淀用培养基重悬，1：4比例接种进行P1代培养，2-3天细胞即可达到85%以上汇合度，原代培养期间培养基中含有抗生素，抗生素的成分为青霉素和链霉素和两性霉素B。 [0010] 进一步的，所述步骤（7）中的干细胞复苏过程为：核对好干细胞信息后，从液氮取出，37℃水浴快速化冻，然后将细胞快速转移到含有10 ml复苏液的50 ml离心管中，吹匀，取0.5 ml细胞悬液，计细胞活性，剩余细胞在1200-1600 rpm转速下离心6-10 min，弃上清，调整细胞浓度接种培养。 [0011] 本发明的有益效果如下：（1）本发明使用的混合胶原酶能够有效的从人脂肪组织中分离出亚全能干细胞，组织消化均一，没有明显的组织残留，细胞活性好，贴壁快，均一性好。 [0012] （2）本发明的冻存液能够有效的维持细胞的活性，采用梯度降温盒冻存细胞不影响细胞活性，而且操作简单，方便，效率高。 [0013] （3）原代培养期间培养基中含有抗生素，抗生素的成分为青霉素，链霉素和两性霉素B；青霉素能够有效抑制或杀死革兰氏阳性菌，链霉素能够有效抑制或杀死革兰氏阴性菌，两性霉素能够有效抑制真菌的生长；但抗生素在抑菌的同时也对细胞的增殖产生影响，而且长期使用抗生素影响细胞临床应用，容易引起干细胞使用者的过敏，因此我们只在原代培养期加入抗生素，一旦细胞进入扩增阶段就不添加任何抗生素，不仅有效的预防采集和分离环节引入污染，而且能够保证干细胞临床应用的安全性。附图说明 [0014] 图1为不同消化液浓度作用下获得的亚全能种子首次换液后贴壁图；图2为不同消化液浓度作用下获得的亚全能种子长至85%汇合度图； 图3为不同分离方法获得的亚全能干细胞增殖曲线图； 图4为不同代次细胞长至80%汇合度图； 图5为P1代细胞流式图； 图6为P5代细胞流式图； 图7为P10代细胞流式图； 图8为P1代细胞冻存前后细胞扩增能力比较图； 图9为P5代细胞冻存前后细胞扩增能力比较图； 图10为P10代细胞冻存前后细胞扩增能力比较图。 具体实施方式[0016] 以下结合试验对本发明的所述的培养方法的优化点进行进一步的说明。 [0017] 实施例1人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，包括以下步骤：人脂肪组织采集、亚全能干细胞分离和获得、亚全能干细胞培养与扩增、亚全能干细胞冻存、产品质量控制、干细胞建库和干细胞复苏年检；具体步骤如下： （1）人脂肪组织采集：供着HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体检测项目均为阴性，无血液系统疾病史、免疫系统疾病史、神经系统病史、内分泌系统病史的供体；脂肪组织由专业医院或美容机构通过肿胀法吸脂手术获得腹部、大腿根部、背部浅表层的组织；将分离的脂肪组织放入100 ml无菌采集瓶内，并向采集瓶内按每200 IU/ml的量加入庆大霉素，维持在2℃的环境中运输，24 h内分离； （2）亚全能干细胞分离和获得：将上述无菌采集瓶运送至公司生产部门，核对客户信息和采集信息，确定无误后打印条形码，并将无菌采集瓶传入GMP生产车间进行生产；将脂肪组织从无菌采集瓶内吸出，放入50 ml离心管内，每管10 ml，加入等量生理盐水，在150 rpm转速下离心8 min，剔除上层油脂和底层血水，再加入等量生理盐水，在150 rpm转速下离心 8 min，向离心管内加入等体积配制的混合胶原酶，充分混匀，混合胶原酶为浓度为0.5%，胶原酶P和I型胶原酶的比例为3：2，在37℃、120 rpm转速条件下震荡消化6 min，补充等量生理盐水，选用150目筛网进行过筛，将滤液以1600 rpm转速进行离心10 min，重复3次，弃上清液，将底层细胞拍散后加入培养基重悬，获得亚全能干细胞种子； 4 2 （3）亚全能干细胞培养与扩增：将干细胞种子以1×10 /cm 的密度接种于T75培养瓶内，并加入12 ml培养基，放入37℃、5%的CO2培养箱内培养，第2天首次换液，剔除非贴壁细胞，将换液的上清收集到离心管内上机菌检，之后每3天换液一次，待细胞长至80%汇合度，进行细胞传代； 细胞传代的具体步骤为：待细胞长至80%汇合度，倒掉T75培养瓶内的培养基，用0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入5 ml浓度为0.075%的胰蛋白酶，在37℃消化3 min后，加入等量培养液终止消化，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，取样计数，1000 rpm转速条件下离心6 min，将离心所得的细胞沉淀用培养基重悬，1：4比例接种进行P1代培养，2天细胞即可达到85%以上汇合度，原代培养期间培养基中含有抗生素，抗生素的成分为青霉素和链霉素和两性霉素B； （4）亚全能干细胞冻存：将P1代细胞长至80%的汇合度，用显微镜拍照后，将细胞消化下来，步骤同细胞传代，离心前留取细胞悬液1.5 ml，用于细胞计数、活力和流式检测；离心后将洗液倒入离心管内用于菌检检测，细胞沉淀拍散后，根据计数结果以500万个细胞/ml冻存液的密度加入4℃预冷的冻存液，吹匀、分管，做好标识，贴好冷冻条形码，放入梯度降温盒，在-80℃冰箱过夜后，从梯度降温盒取出，放于-80℃冰箱暂存；细胞冻存液的构成成分为50%培养基，30%人血白蛋白，20%CryoSure-DEX40，0.1 mol/ml海藻糖 （5）产品质量控制：自供体脂肪组织进入公司开始进行取样检测，检测项目为：菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型，将菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型等各项检测均合格的细胞由-80℃冰箱转移到-196℃液氮存储箱内长期保存；同时将自采集到存储过程的所有记录单全部收集起来，建立档案，并保存； 而检测不合格的细胞出具不合格报告和废弃通知单，根据条形码编号将相应冻存的细胞一并废弃，并有专门人员做无害化处理，并作好相应的记录； （6）干细胞建库：将每一份脂肪亚全能干细胞按着合同上要求进行细胞制备和存储，建立每份细胞详细的纸质档案和电脑数据库，包含客户脂肪从运入公司到入库的所有信息，建立人脂肪成体干细胞库； （7）干细胞复苏年检：在每个液氮存储箱中放一个公共干细胞样本，各项检测指标符合标准，冻存30支，每年质量部门定期复苏1支检测细胞活性，表型，扩增能力，各项指标的详细信息质量控制部门确认无误后，由客户服务部统一录入系统，客户采用条形码登录公司网站查询干细胞产品的年度检测情况； 干细胞复苏过程为：核对好干细胞信息后，从液氮取出，37℃水浴快速化冻，然后将细胞快速转移到含有10 ml复苏液的50 ml离心管中，吹匀，取0.5 ml细胞悬液，计细胞活性，剩余细胞在1200 rpm转速下离心6 min，弃上清，调整细胞浓度接种培养。 [0018] 实施例2人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，包括以下步骤：人脂肪组织采集、亚全能干细胞分离和获得、亚全能干细胞培养与扩增、亚全能干细胞冻存、产品质量控制、干细胞建库和干细胞复苏年检；具体步骤如下： （1）人脂肪组织采集：供着HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体检测项目均为阴性，无血液系统疾病史、免疫系统疾病史、神经系统病史、内分泌系统病史的供体；脂肪组织由专业医院或美容机构通过肿胀法吸脂手术获得腹部、大腿根部、背部浅表层的组织；将分离的脂肪组织放入100 ml无菌采集瓶内，并向采集瓶内按每800 IU/ml的量加入庆大霉素，维持在8℃的环境中运输，15 h内分离； （2）亚全能干细胞分离和获得：将上述无菌采集瓶运送至公司生产部门，核对客户信息和采集信息，确定无误后打印条形码，并将无菌采集瓶传入GMP生产车间进行生产；将脂肪组织从无菌采集瓶内吸出，放入50 ml离心管内，每管25 ml，加入等量生理盐水，在400 rpm转速下离心6 min，剔除上层油脂和底层血水，再加入等量生理盐水，在400 rpm转速下离心 6 min，向离心管内加入等体积配制的混合胶原酶，充分混匀，混合胶原酶的浓度为0.1%，胶原酶P和I型胶原酶的比例为3：2，在37℃、180 rpm转速条件下震荡消化46 min，补充等量生理盐水，选用150目筛网进行过筛，将滤液以2000 rpm转速进行离心8 min，重复3次，弃上清液，将底层细胞拍散后加入培养基重悬，获得亚全能干细胞种子； （3）亚全能干细胞培养与扩增：将干细胞种子以1×104/cm2的密度接种于T75培养瓶内，并加入12 ml培养基，放入37℃、5%的CO2培养箱内培养，第2天首次换液，剔除非贴壁细胞，将换液的上清收集到离心管内上机菌检，之后每3天换液一次，待细胞长至90%汇合度，进行细胞传代； 细胞传代的具体步骤为：待细胞长至90%汇合度，倒掉T75培养瓶内的培养基，用0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入5 ml浓度为0.125%的胰蛋白酶，在37℃消化1 min后，加入等量培养液终止消化，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，取样计数，1500 rpm转速条件下离心10 min，将离心所得的细胞沉淀用培养基重悬，1：4比例接种进行P1代培养，3天细胞即可达到85%以上汇合度，原代培养期间培养基中含有抗生素，抗生素的成分为青霉素和链霉素和两性霉素B； （4）亚全能干细胞冻存：将P1代细胞长至90%的汇合度，用显微镜拍照后，将细胞消化下来，步骤同细胞传代，离心前留取细胞悬液1.5 ml，用于细胞计数、活力和流式检测；离心后将洗液倒入离心管内用于菌检检测，细胞沉淀拍散后，根据计数结果以800万个细胞/ml冻存液的密度加入4℃预冷的冻存液，吹匀、分管，做好标识，贴好冷冻条形码，放入梯度降温盒，在-80℃冰箱过夜后，从梯度降温盒取出，放于-80℃冰箱暂存；细胞冻存液的构成成分为50%培养基，35%人血白蛋白，15%CryoSure-DEX40，0.5 mol/ml海藻糖。 [0019] （5）产品质量控制：自供体脂肪组织进入公司开始进行取样检测，检测项目为：菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型，将菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型等各项检测均合格的细胞由-80℃冰箱转移到-196℃液氮存储箱内长期保存；同时将自采集到存储过程的所有记录单全部收集起来，建立档案，并保存；而检测不合格的细胞出具不合格报告和废弃通知单，根据条形码编号将相应冻存的细胞一并废弃，并有专门人员做无害化处理，并作好相应的记录；（6）干细胞建库：将每一份脂肪亚全能干细胞按着合同上要求进行细胞制备和存储，建立每份细胞详细的纸质档案和电脑数据库，包含客户脂肪从运入公司到入库的所有信息，建立人脂肪成体干细胞库； （7）干细胞复苏年检：在每个液氮存储箱中放一个公共干细胞样本，各项检测指标符合标准，冻存30支，每年质量部门定期复苏1支检测细胞活性，表型，扩增能力，各项指标的详细信息质量控制部门确认无误后，由客户服务部统一录入系统，客户采用条形码登录公司网站查询干细胞产品的年度检测情况； 干细胞复苏过程为：核对好干细胞信息后，从液氮取出，37℃水浴快速化冻，然后将细胞快速转移到含有10 ml复苏液的50 ml离心管中，吹匀，取0.5 ml细胞悬液，计细胞活性，剩余细胞在1600 rpm转速下离心10 min，弃上清，调整细胞浓度接种培养。 [0020] 实施例3人脂肪亚全能干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，包括以下步骤：人脂肪组织采集、亚全能干细胞分离和获得、亚全能干细胞培养与扩增、亚全能干细胞冻存、产品质量控制、干细胞建库和干细胞复苏年检；具体步骤如下： （1）人脂肪组织采集：供着HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体检测项目均为阴性，无血液系统疾病史、免疫系统疾病史、神经系统病史、内分泌系统病史的供体；脂肪组织由专业医院或美容机构通过肿胀法吸脂手术获得腹部、大腿根部、背部浅表层的组织；将分离的脂肪组织放入100 ml无菌采集瓶内，并向采集瓶内按每500 IU/ml的量加入庆大霉素，维持在5℃的环境中运输，4 h内分离； （2）亚全能干细胞分离和获得：将上述无菌采集瓶运送至公司生产部门，核对客户信息和采集信息，确定无误后打印条形码，并将无菌采集瓶传入GMP生产车间进行生产；将脂肪组织从无菌采集瓶内吸出，放入50 ml离心管内，每管17.5 ml，加入等量生理盐水，在275 rpm转速下离心10 min，剔除上层油脂和底层血水，再加入等量生理盐水，在275 rpm转速下离心10 min，向离心管内加入等体积配制的混合胶原酶，充分混匀，混合胶原酶浓度为 0.25%，胶原酶P和I型胶原酶的比例为3：2，在37℃、150 rpm转速条件下震荡消化22 min，补充等量生理盐水，选用150目筛网进行过筛，将滤液以1800 rpm转速进行离心10 min，重复3次，弃上清液，将底层细胞拍散后加入培养基重悬，获得亚全能干细胞种子； （3）亚全能干细胞培养与扩增：将干细胞种子以1×104/cm2的密度接种于T75培养瓶内，并加入12 ml培养基，放入37℃、5%的CO2培养箱内培养，第2天首次换液，剔除非贴壁细胞，将换液的上清收集到离心管内上机菌检，之后每3天换液一次，待细胞长至80%-90%汇合度，进行细胞传代； 细胞传代的具体步骤为：待细胞长至85%汇合度，倒掉T75培养瓶内的培养基，用0.9%的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入5 ml浓度为0.1%的胰蛋白酶，在37℃消化2 min后，加入等量培养液终止消化，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，取样计数，1250 rpm转速条件下离心8 min，将离心所得的细胞沉淀用培养基重悬，1：4比例接种进行P1代培养，2天细胞即可达到85%以上汇合度，原代培养期间培养基中含有抗生素，抗生素的成分为青霉素和链霉素和两性霉素B； （4）亚全能干细胞冻存：将P1代细胞长至85%的汇合度，用显微镜拍照后，将细胞消化下来，步骤同细胞传代，离心前留取细胞悬液1.5 ml，用于细胞计数、活力和流式检测；离心后将洗液倒入离心管内用于菌检检测，细胞沉淀拍散后，根据计数结果以650万个细胞/ml冻存液的密度加入4℃预冷的冻存液，吹匀、分管，做好标识，贴好冷冻条形码，放入梯度降温盒，在-80℃冰箱过夜后，从梯度降温盒取出，放于-80℃冰箱暂存；细胞冻存液的构成成分为45%培养基，35%人血白蛋白，20%CryoSure-DEX40，0.3 mol/L海藻糖 （5）产品质量控制：自供体脂肪组织进入公司开始进行取样检测，检测项目为：菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型，将菌检、病毒检测、支原体检测、细胞活力、细胞数量和细胞表型等各项检测均合格的细胞由-80℃冰箱转移到-196℃液氮存储箱内长期保存；同时将自采集到存储过程的所有记录单全部收集起来，建立档案，并保存； 而检测不合格的细胞出具不合格报告和废弃通知单，根据条形码编号将相应冻存的细胞一并废弃，并有专门人员做无害化处理，并作好相应的记录； （6）干细胞建库：将每一份脂肪亚全能干细胞按着合同上要求进行细胞制备和存储，建立每份细胞详细的纸质档案和电脑数据库，包含客户脂肪从运入公司到入库的所有信息，建立人脂肪成体干细胞库； （7）干细胞复苏年检：在每个液氮存储箱中放一个公共干细胞样本，各项检测指标符合标准，冻存30支，每年质量部门定期复苏1支检测细胞活性，表型，扩增能力，各项指标的详细信息质量控制部门确认无误后，由客户服务部统一录入系统，客户采用条形码登录公司网站查询干细胞产品的年度检测情况； 干细胞复苏过程为：核对好干细胞信息后，从液氮取出，37℃水浴快速化冻，然后将细胞快速转移到含有10 ml复苏液的50 ml离心管中，吹匀，取0.5 ml细胞悬液，计细胞活性，剩余细胞在1400 rpm转速下离心8 min，弃上清，调整细胞浓度接种培养。 [0021] 试验1、将获得的人脂肪组织分别采用以下方法进行消化，研究不同胶原酶配比对分离亚全能干细胞数量和活力的影响。 [0022] 不同配比消化液母液的配制：分别向100 ml DPBS中加入不同比例胶原酶P与I型胶原酶配制呈1%的母液，混匀后，用0.22 µm的滤器过滤除菌，然后再用DPBS将母液稀释成终浓度为0.25%、0.1%或0.5%；不同浓度消化方法得到的细胞，结果如表一： 表一为不同消化液浓度作用下获得的亚全能干细胞数、活力，纯度的比较； 从上述试验中可以看出，本发明使用的混合胶原酶能够有效的从人脂肪组织中分离出亚全能干细胞，组织消化均一，没有明显的组织残留，细胞活性好，贴壁快，均一性好，另胶原酶P与I型胶原酶的最佳配比为3:2，最佳浓度为0.25%，即混合胶原酶的终浓度为0.15%胶原酶P和0.1%I型胶原酶，最优的消化时间为15-25 min；P0代的生长周期短，一般为6-7天。 [0023] 试验2、不同分离方法获得的人脂肪亚全能干细胞体外增殖研究将6种方法获得的亚全能干细胞分别以1×104/孔接种于6孔板中，每组12空，置培养箱，每3天换液一次；细胞计数：24h在各组中抽取1孔，将细胞消化下来，台盼蓝染色血细胞计数板计数活细胞，连续计数12天，将所得资料以天数为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制曲线；如图3，从图中可以看出方案2分离获得的细胞最早进入分裂增殖期，而后进入对数生长期，6-7天时达到最高峰；而其他几组细胞进入增殖期相对晚1-2天，到达最高峰的时间在8- 13天不等。 [0024] 人脂肪亚全能干细胞体外形态和细胞表型研究采用本发明中方案2的方法分离脂肪亚全能干细胞，采用专用培养基进行培养扩增，将细胞连续培养10代，观察细胞的生长形态，并取P1、P5、P10代细胞进行流式检测。流式细胞仪表型检测：取P1，P5，P10代细胞，消化离心后，将细胞沉淀用DPBS洗涤2次，取0.8-1×106/ 100 µl细胞悬液放于EP管中，加入一抗15 µl，4℃避光孵育30 min，加入400 µl DPBS，1500 rpm离心6 min，弃去上清，加入10 µl的二抗，4℃避光孵育30 min后，加入400 µl DPBS， 1500 rpm离心6 min，弃去上清，加入500 µl DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测。 结果表明：此培养基能够很好的维持细胞的形态，细胞呈典型的梭形和纺锤体形，如图4；流式表型显示细胞呈FLK1，CD73，CD90，CD105，CD44阳性，如表2和图5-7。 [0025] 表2 细胞流式表型试验4冻存液成分和冻存方法对细胞活性的影响 分别采用以下8种方案对P1，P5，P10代细胞冻存前和冻存后活力进行比较，活力通过台盼蓝染色和血细胞计数板来进行的； 方案1：90%胎牛血清+10%DMSO；程控 方案2：90%胎牛血清+10%DMSO；梯度降温盒 方案3：90%DMEM/F12+10%DMSO；程控 方案4：90%DMEM/F12+10%DMSO；梯度降温盒 方案5：80%胎牛血清+20%CryoSure-DEX40 方案6：80%胎牛血清+20%CryoSure-DEX40 方案7：50%培养基，30%人血白蛋白，20%CryoSure-DEX40，0.2 mol/ml海藻糖；程控方案8：50%培养基，30%人血白蛋白，20%CryoSure-DEX40，0.2 mol/ml海藻糖；梯度降温盒 程控程序为第一步 4℃等待，第二步 1.0℃/min 降至-4℃，第三步 25.0℃/min 降至-40℃，第四步 10.0℃/min降至-12℃，第五步 1.0℃/min 降至-40℃，第六步 10.0℃/min 降至-90℃。 [0026] 表3冻存液成分和冻存方法对细胞活性的影响结果显示本发明的冻存液能够有效的维持细胞的活性，采用梯度降温盒冻存细胞不影响细胞活性，而且操作简单，方便，效率高。 [0027] 试验4采用方案8的冻存不同批次细胞复苏后细胞扩增能力的比较；将P1，P5，P10代的细胞通过方案8冻存入库1年后进行复苏培养，观察和统计细胞扩增能力：将分离获得的干细胞种子，核对好干细胞信息后，从液氮取出，37℃水浴快速化冻，然后将细胞快速转移到含有10 ml复苏液的50 ml离心管中，吹匀，1200-1600 rpm，离心6-10 min，弃上清，调整细胞浓度以1×104/cm2的密度接种于6孔板中，每组3孔，置37℃5%的CO2培 4 2 养箱，此后每3天按着1×10/cm的密度传代，将细胞连续培养9天，每天每组消化1孔细胞，用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞数量，并统计作图。从结果看，细胞冻存前后细胞的增殖能力基本上相同，与细胞代次没有直接关系，如图8。 [0028] 上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。 |
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