一种基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用 |
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| 申请号 | CN201610139977.0 | 申请日 | 2016-03-11 | 公开(公告)号 | CN105695448A | 公开(公告)日 | 2016-06-22 |
| 申请人 | 浙江圣庭生物科技有限公司; | 发明人 | 丁聪聪; 丁志远; 叶佳芝; 牟晓威; 邱宝义; 刘明明; 陈贤丰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、 试剂 及其应用，构建过程包括血液游离DNA提取、末端修复、 片段 选择、接头连接、 磁珠 纯化、文库扩增、文库检测、高通量测序等步骤。本发明还提供一种用于构建基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库的血液游离DNA提取试剂、末端修复试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂。本发明明显提高了孕妇 血浆 胎儿 游离DNA的提取浓度，且步骤简单，成本低，提高了建库的成功率；优化后的文库构建体系更利于操作，节省成本，且更换磁珠后，纯化回收效率更高；文库扩增也不需凑够样本量和二次检测，操作更加简单。本发明方法更适用于胎儿 染色 体非整倍体无创产前诊断。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | TM一种基于Ion Proton 测序平台的血液游离DNA的文库构建方 法、试剂及其应用 技术领域[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体是一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用。 背景技术[0002] 据美国2006年的出生缺陷全球报告统计全球每年至少新增出生缺陷790万例，占出生人口的6％，而我国又是出生缺陷的高发国，目前出生缺陷发生率约5.6％，每年新增出生缺陷约90万例。有报告显示，我国严重出生缺陷患儿中除30％经早期诊断治疗可正常生 活，约30％在出生后死亡，40％将成为终生残疾，不仅给家庭造成严重经济负担，同时也给家庭带来严重的心理负担和精神痛苦，此外给国家和社会的经济发展也造成了沉重的负 担。据统计，我国每年出生缺陷患儿的治疗费用高达数百亿元，维持基本的生活费用高达数百亿元，给国家带来了约数千亿元的间接费用。 [0003] 出生缺陷是指婴儿在出生之前，在母体子宫里就发生的发育异常以及存在于身体某些部位的畸形。这些缺陷大多是由各种各样的遗传病引起的。遗传病的种类大致可分为 三类：单基因遗传、多基因遗传病、染色体病。由于染色体病累及涉及的基因数目较多，故症状通常更严重。在众多染色体异常疾病中，染色体非整倍体导致的残疾及生活障碍尤为明 显，是胎儿出生缺陷最常见病因之一。染色体非整倍体是指细胞的染色体数目多或少了一 条或多条。新生儿中染色体异常的发病率为1/160，临床上常见的非整倍体有21-三体综合 征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)，以及一些性染色体畸变，例如X单体(Turner综合征)，或性染色体三体，如47XXX(X三体综合征)、 47XXY(Klinefelter综合征)、47XYY(XYY综合征)，其中以21-三体综合征、18-三体综合征和 13-三体综合征最为常见，有研究显示胎儿21三体和18三体发病率分别为1/800和1/6000， 而13三体发病率为1/10000。目前此类疾病没有有效的治疗方法，因此通过产前诊断胎儿是否患有遗传缺陷病是减少畸形儿出生率最为有效的方法之一。 [0004] 相对于该类疾病的传统的检测方法，基于高通量测序技术的胎儿游离DNA检测技术作为针对胎儿染色体非整倍体产前筛查技术的优势在于：第一，无创伤性，只需抽取母体外周血进行检测，避免了有创性取材方式带来的污染、感染，及胎儿流产风险。第二，对于疾病有高的检出率和低的假阳性率。该技术对常见染色体非整倍体异常总检出率在99％以 上，假阳性0.1％左右，大大优于传统检测方式。第三，适用孕周范围较大，孕12-24周都可接受无创产前DNA检测，做产前诊断最佳穿刺抽取羊水时间是妊娠16-20周，而无创产前基因 检测更是把时间提前到了12周，能够更早的检测出结果并做出相应对策。第四，临床所需信息少，操作较简单，质量可以控制。 [0005] 高通量测序技术又称为下一代测序技术，第二代高通量Ion ProtonTM测序平台具有测序通量高、准确度高、成本低、操作简便等优点，在基于Ion ProtonTM平台进行高通量产前检测的流程中，文库的制备是非常重要的一步，文库质量的高低将直接影响测序质量 的高低并对检测结果产生影响。 [0006] 现有技术中基于Ion ProtonTM平台的文库构建方法主要包括以下步骤： [0007] (1)提取样本DNA； [0008] (2)将样本DNA与末端修复试剂和末端修复酶混合进行反应； [0009] (3)将步骤(2)所得到的DNA片段与连接酶、聚合酶、连接反应缓冲液、接头、标签接头混合进行反应； [0010] (4)将步骤(3)所得到的反应产物进行磁珠筛选大小和纯化得到DNA文库； [0011] (5)QPCR检测文库浓度，不同样本进行等浓度混样； [0012] (6)将步骤(5)得到的文库加入扩增酶Mix和扩增引物进行PCR扩增，再进行磁珠筛选大小和纯化得到游离DNA文库； [0013] (7)文库检测后进行高通量测序。 [0014] 血浆中游离DNA的总量非常少，而孕妇体内胎儿游离DNA仅占孕妇血浆中的3％-6％，上述技术中用金麦格血清游离DNA提取试剂盒提取出来的血浆游离DNA的浓度较低，且提取出来的游离DNA可能有部分缺失，导致文库质量下降，成功率降低，对测序结果的准确性也带来了很大的影响；而将得到的小片段文库混合后进行扩增，虽然减少了文库之间的 扩增偏差，但需凑够样本量再进行扩增，操作较复杂且需要二次检测，成本较高。此外，现有文库构建方法体系较大，不利于操作，且试剂浪费严重，成本较高，而利用Biocanal Magbeads磁珠进行纯化，回收效率较低，文库质量和浓度均有所下降，造成测序质量下降，甚至测序失败。 发明内容[0015] 本发明的目的在于提供一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。 [0016] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： [0017] 一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，包括以下步骤： [0018] (1)血液游离DNA提取：采用磁珠法提取样品中的血液游离DNA； [0019] (2)末端修复：将步骤(1)所得到的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA； [0020] (3)片段选择：利用磁珠对步骤(2)所得到的平末端DNA进行片段大小筛选并进行磁珠纯化； [0021] (4)接头连接：将步骤(3)所得到的DNA片段与接头连接反应试剂、接头、标签接头混合进行接头连接反应； [0022] (5)磁珠纯化：将步骤(4)所得到的反应产物利用磁珠进行纯化； [0023] (6)文库扩增：将步骤(5)纯化后的DNA片段加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，再利用磁珠进行纯化，得到血液游离DNA文库； [0024] (7)文库检测：将步骤(6)所得到的血液游离DNA文库采用Qubit和Agilent Bioanalyzer2100检测文库浓度及文库片段大小； [0025] (8)高通量测序：基于Ion ProtonTM测序平台，将步骤(7)中所得到的不同血液游离DNA文库样本等浓度混样进行高通量测序； [0026] 其中，步骤(1)所述样品为孕12-24周的孕妇血浆； [0027] 步骤(1)采用试剂盒提取血液游离DNA，所述试剂盒为血清游离DNA提取试剂盒； [0028] 步骤(2)中进行末端修复时所用的末端修复试剂pH值为7.4-7.6，溶剂为水，溶质为：5-15mM的Tris-HCl缓冲溶液、40-60mM的NaCl溶液、8-12mM MgCl2、2-4mM二硫苏糖醇、8- 12mM ATP、8-12mM dNTPs混合液，末端修复酶为8-12U/μl的End Repair酶； [0029] 步骤(3)中所用磁珠为Agencourt AMPure XP磁珠； [0030] 步骤(4)中接头连接反应试剂由酶与连接反应缓冲液组成，所述酶为300-500U/μl的T4DNA Ligase和6-10U/μl的Nick Repair DNA Polymerase；连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH7.8-8.2、40-60mM的Tris-HCl缓冲溶液、8-12mM的KCl、8-12mM二硫苏糖醇、0.5-2mM的ATP、1-3nM的dNTPs混合液、8-12mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4； [0031] 步骤(5)中所用磁珠为Agencourt AMPure XP磁珠； [0032] 步骤(6)中扩增试剂pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：1-3U/μl PCR SuperMix High Fidelity、pH 8.8-9.0的64-68mM的Tris-SO4、15-25mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4、200-250μM dNTPs混合液； [0033] 步骤(6)中所用磁珠为Agencourt AMPure XP磁珠。 [0034] 作为本发明进一步的方案：步骤(1)中的孕妇血浆取自孕妇外周血的血浆，将孕妇血浆4℃下1600g离心15min后，取上清于2ml离心管中，4℃下16000g离心10min，将孕妇血浆转移至新的离心管中，该孕妇血浆用于后续实验或-80℃冻存备用。 [0035] 作为本发明进一步的方案：其中步骤(3)筛选片段大小为200-300bp。 [0036] 作为本发明进一步的方案：步骤(4)的接头是由如下正反两个序列组成的P1： [0037] 5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3' [0038] 5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3' [0039] P1的正序列如SEQ ID NO:1所示，P1的反序列如SEQ ID NO:2所示。 [0040] 作为本发明进一步的方案：步骤(4)中的标签接头是由如下正反两个序列组成的Ion Xpress Barcode X： [0041] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3' [0042] 5'ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3' [0043] Ion Xpress Barcode X的正序列如SEQ ID NO:3所示，Ion Xpress Barcode X的反序列如SEQ ID NO:4所示。 [0044] 作为本发明进一步的方案：Ion Xpress Barcode X选自： [0045] Barcode 1： [0046] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3' [0047] 5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0048] Barcode 1的正序列如SEQ ID NO:5所示，Barcode 1的反序列如SEQ ID NO:6所示； [0049] Barcode 2： [0050] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3' [0051] 5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0052] Barcode 2的正序列如SEQ ID NO:7所示，Barcode 2的反序列如SEQ ID NO:8所示； [0053] Barcode 3： [0054] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3' [0055] 5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0056] Barcode 3的正序列如SEQ ID NO:9所示，Barcode 3的反序列如SEQ ID NO:10所示； [0057] Barcode 4： [0058] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3' [0059] 5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0060] Barcode 4的正序列如SEQ ID NO:11所示，Barcode 4的反序列如SEQ ID NO:12所示； [0061] Barcode 5： [0062] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3' [0063] 5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0064] Barcode 5的正序列如SEQ ID NO:13所示，Barcode 5的反序列如SEQ ID NO:14所示； [0065] Barcode 6： [0066] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3' [0067] 5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0068] Barcode 6的正序列如SEQ ID NO:15所示，Barcode 6的反序列如SEQ ID NO:16所示； [0069] Barcode 7： [0070] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3' [0071] 5'ATCGTTCGTGGCACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0072] Barcode 7的正序列如SEQ ID NO:17所示，Barcode 7的反序列如SEQ ID NO:18所示； [0073] Barcode 8： [0074] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATACGAT3' [0075] 5'ATCGTATCTCAGGCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0076] Barcode 8的正序列如SEQ ID NO:19所示，Barcode 8的反序列如SEQ ID NO:20所示； [0077] Barcode 9： [0078] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTCGAT3' [0079] 5'ATCGAATGAGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0080] Barcode 9的正序列如SEQ ID NO:21所示，Barcode 9的反序列如SEQ ID NO:22所示； [0081] Barcode 10： [0082] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTCGAT3' [0083] 5'ATCGAGGTTGTAACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0084] Barcode 10的正序列如SEQ ID NO:23所示，Barcode 10的反序列如SEQ ID NO:24所示； [0085] Barcode 11： [0086] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCATCCGCGAT3' [0087] 5'ATCGCGGATGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0088] Barcode 11的正序列如SEQ ID NO:25所示，Barcode 11的反序列如SEQ ID NO:26所示； [0089] Barcode 12： [0090] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCCGGAATCGAT3' [0091] 5'ATCGATTCCGGATCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0092] Barcode 12的正序列如SEQ ID NO:27所示，Barcode 12的反序列如SEQ ID NO:28所示； [0093] Barcode 13： [0094] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGACCACTCGAT3' [0095] 5'ATCGAGTGGTCGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0096] Barcode 13的正序列如SEQ ID NO:29所示，Barcode 13的反序列如SEQ ID NO:30所示； [0097] Barcode 14： [0098] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAGGTTATCGAT3' [0099] 5'ATCGATAACCTCGCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0100] Barcode 14的正序列如SEQ ID NO:31所示，Barcode 14的反序列如SEQ ID NO:32所示； [0101] Barcode 15： [0102] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCAAGCTGCGAT3' [0103] 5'ATCGCAGCTTGGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0104] Barcode 15的正序列如SEQ ID NO:33所示，Barcode 15的反序列如SEQ ID NO:34所示； [0105] Barcode 16： [0106] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTTACACACGAT3' [0107] 5'ATCGTGTGTAAGACTGAGTCGGAGACACGC3'。 [0108] Barcode 16的正序列如SEQ ID NO:35所示，Barcode 16的反序列如SEQ ID NO:36所示。 [0109] 作为本发明进一步的方案：步骤(6)中所用的扩增引物为： [0110] Primer 1：5'CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3' [0111] Primer 2：5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC3'。 [0112] Primer 1的序列如SEQ ID NO:37所示，Primer 2的序列如SEQ ID NO:38所示。 [0113] 根据上述方法构建血液游离DNA文库。 [0114] 本发明还提供一种用于构建基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库的血液游离DNA提取试剂，由以下物质组成：Lysis Buffer、Wash Buffer Ⅰ、Wash Buffer Ⅱ、Elution Buffer、Magnetic beads磁珠、助沉剂和蛋白酶K。 [0115] 一种用于构建基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库的末端修复试剂，pH值为7.4-7.6，溶剂为水，溶质为：5-15mM的Tris-HCl缓冲溶液、40-60mM的NaCl溶液、8-12mM MgCl2、2-4mM二硫苏糖醇、8-12mM ATP、8-12mM dNTPs混合液，末端修复酶为8-12U/μl的End Repair酶。 [0116] 作为本发明进一步的方案：末端修复试剂，其pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris-HCl缓冲溶液、50mM的NaCl溶液、10mM MgCl2、3mM二硫苏糖醇、10mM ATP、10mM dNTPs混合液，末端修复酶为10U/μl的End Repair酶。 [0117] 一种用于构建基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库的接头连接反应试剂，由酶与连接反应缓冲液组成，所述酶为300-500U/μl的T4DNA Ligase和6-10U/μl的Nick Repair DNA Polymerase；连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH7.8-8.2、40- 60mM的Tris-HCl缓冲溶液、8-12mM的KCl、8-12mM二硫苏糖醇、0.5-2mM的ATP、1-3nM的dNTPs混合液、8-12mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4。 [0118] 作为本发明进一步的方案：所述酶为400U/μl的T4DNA Ligase和8U/μl的Nick Repair DNA Polymerase；连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH 8.0、 50mMTris-HCl缓冲溶液、10mM的KCl、10mM二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4。 [0119] 一种用于构建基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库的扩增试剂，pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：1-3U/μl PCR SuperMix High Fidelity、pH 8.8-9.0的 64-68mM的Tris-SO4、15-25mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4、200-250μM dNTPs混合液。 [0120] 作为本发明进一步的方案：扩增试剂的pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μlPCR SuperMix High Fidelity、pH8.9的66mM的Tris-SO4、20mM的(NH4)2SO4、2mM的 MgSO4、220μM dNTPs混合液。 [0121] 根据上述血液游离DNA提取试剂、末端修复试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂在血液游离DNA文库构建中的应用。 [0122] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0123] 本发明明显提高了孕妇血浆胎儿游离DNA的提取浓度，且步骤简单，成本低，提高了建库的成功率；优化后的文库构建体系更利于操作，节省成本，且更换磁珠后，纯化回收效率更高；文库扩增也不需凑够样本量和二次检测，操作更加简单。本发明方法更适用于胎儿染色体非整倍体无创产前诊断。 附图说明 [0124] 图1是基于本发明Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA提取及建库流程图。 [0125] 图2是采用Agilent Bioanalyzer2100对本发明文库的检测结果图。 具体实施方式[0126] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0127] 实施例1 [0128] 请参阅图1，本发明实施例中，一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法 [0129] 1、试剂 [0130] 本实施例采用以下试剂：End Repair Enzyme(life)、T4DNA Ligase(life)、Nick Repair DNA Polymerase(life)、 PCR SuperMix High Fidelity(life)、接头P1Adapters和Ion Xpress Barcode X(life)。 [0131] 血液游离DNA提取试剂为：Lysis Buffer、Wash Buffer Ⅰ、Wash Buffer Ⅱ、Elution Buffer、Magnetic beads磁珠、助沉剂和蛋白酶K。 [0132] 末端修复试剂pH值为7.5，溶剂为水，溶质为：10mM的Tris-HCl缓冲溶液、50mM的NaCl溶液、10mM MgCl2、3mM二硫苏糖醇、10mM ATP、10mM dNTPs混合液，末端修复酶为10U/μl的Klenow酶； [0133] 连接反应所用的酶为T4DNA Ligase(400U/μl)和Nick Repair DNA Polymerase(8U/μl)，连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：50mM Tris-HCl缓冲溶液(PH8.0)， 10mM的KCl，10mM二硫苏糖醇、1mM的ATP、2nM的dNTPs混合液、10mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4； [0134] PCR扩增所用的扩增试剂pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：2U/μl PCR SuperMix High Fidelity、66mM的Tris-SO4(Ph8.9)、20mM的(NH4)2SO4、2mM的MgSO4、220μM dNTPs混合液。 [0135] 2、实验步骤 [0136] (1)采集母体外周血，制备血浆。 [0137] 在本实施例中，总共抽取了60名孕妇的外周血，编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60。将血样4℃下1600g离心15min后，取上清于2ml离心管中，4℃下16000g离心10min，将600μl血浆转移至新的离心管中，该血浆可用于后续实验或-80℃冻存备用。上述血样均经过染色体核型分析。实验中加入阴性对照，阴性对照以经过灭菌的超纯水代替血浆。 [0138] (2)提取血浆中的血液游离DNA。 [0139] 采用壹锋血清游离DNA提取试剂盒(磁珠法，货号：BL-150)提取600μl血浆游离DNA。提取试剂为：Lysis Buffer、Wash Buffer Ⅰ、Wash Buffer Ⅱ、Elution Buffer、Magnetic beads磁珠、助沉剂和蛋白酶K。 [0140] Qubit检测血液游离DNA提取浓度，具体检测结果如表1所示。 [0141] 表1 [0142] [0143] [0144] 从表1中的数据可知，本发明的血液游离DNA提取浓度远远高于现有技术血液游离DNA提取浓度。 [0145] (3)构建血液游离DNA文库。 [0146] a、末端修复 [0147] 将上一步获取的血液游离DNA按照下面表2的配置反应体系。 [0148] 表2 [0149] [0150] [0151] 混匀后室温孵育30min。 [0152] b、片段选择 [0153] Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠纯化并按照DNA与磁珠的比例筛选片段大小，27μl 0.1×TE溶液溶解洗脱。 [0154] c、接头连接 [0155] 配置一下反应体系，如表3所示： [0156] 表3 [0157]组分 体积 上步所得产物 25μl Ion P1Adapters 1μL Ion Xpress Barcode X 1μL 10×Ligase Buffer 5μL T4DNA Ligase 1μL Nuclease-free water 12μL dNTP 1μL Nick Repair DNA Polymerase 4μL 总体积 50μL [0158] 其中Ion P1Adapters和Ion Xpress Barcode X需稀释5倍，PCR反应条件：25℃，25min；72℃，5min；4℃，holding。 [0159] 接头P1为： [0160] 5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3' [0161] 5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。 [0162] 样品的Ion Xpress Barcode X分别如下： [0163] Barcode 1： [0164] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3' [0165] 5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0166] Barcode 2： [0167] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3' [0168] 5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0169] Barcode 3： [0170] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3' [0171] 5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0172] Barcode 4： [0173] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3' [0174] 5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0175] Barcode 5： [0176] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3' [0177] 5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0178] Barcode 6： [0179] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3' [0180] 5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0181] Barcode 7： [0182] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3' [0183] 5'ATCGTTCGTGGCACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0184] Barcode 8： [0185] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCCTGAGATACGAT3' [0186] 5'ATCGTATCTCAGGCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0187] Barcode 9： [0188] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCTCATTCGAT3' [0189] 5'ATCGAATGAGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0190] Barcode 10： [0191] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTACAACCTCGAT3' [0192] 5'ATCGAGGTTGTAACTGAGTCGGAGACACGC3'。 [0193] Barcode 11： [0194] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAACCATCCGCGAT3' [0195] 5'ATCGCGGATGGTTCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0196] Barcode 12： [0197] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGATCCGGAATCGAT3' [0198] 5'ATCGATTCCGGATCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0199] Barcode 13： [0200] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGACCACTCGAT3' [0201] 5'ATCGAGTGGTCGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0202] Barcode 14： [0203] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCGAGGTTATCGAT3' [0204] 5'ATCGATAACCTCGCTGAGTCGGAGACACGC3'； [0205] Barcode 15： [0206] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCAAGCTGCGAT3' [0207] 5'ATCGCAGCTTGGACTGAGTCGGAGACACGC3'； [0208] Barcode 16： [0209] 5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTTACACACGAT3' [0210] 5'ATCGTGTGTAAGACTGAGTCGGAGACACGC3'。 [0211] d、磁珠纯化 [0212] 连接完后Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠纯化，17μl 0.1×TE溶液溶解洗脱。 [0213] e、文库扩增 [0214] 配置如下体系进行PCR扩增，如表4所示： [0215] 表4 [0216] [0217] [0218] PCR反应条件：95℃，5min；(95℃，15s；62℃，15s；70℃，1min)11cycles；70℃，5min；4℃，holding。PCR结束后，用Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，20μl 0.1×TE溶液溶解洗脱。 [0219] PCR扩增引物序列为： [0220] Primer 1：5'CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3' [0221] Primer 2：5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC3'。 [0222] (4)文库检测。 [0223] 用Qubit检测文库浓度，用具体检测结果如表5所示。 [0224] 表5 [0225] [0226] [0227] 从上表中的数据可知，本发明的血液游离DNA提取和文库构建方法所构建的文库浓度远远高于Ion ProtonTM测序平台上机浓度(100pM)。 [0228] 用Agilent Bioanalyzer2100检测文库片段大小，部分样品检测结果见附图2。 [0229] (5)高通量测序及结果分析。 [0230] 每次测序反应检测15个样本，总共进行4次测序反应，测序平台为Ion ProtonTM平台。 [0231] 通过对Ion ProtonTM平台的4次测序反应的测序结果进行分析，得到如表6所示的结果： [0232] 表6 [0233] [0234] [0235] 且所有的样本的数据量都高于5M reads，每次测序反应的14个样本的数据量分布均匀。文库的GC含量正常范围是39％-42％，经过分析，所有样本的测序数据的GC含量均在正常的范围内，不需要重新进行文库构建，合格率100％。 [0236] 60份血样的测序分析结果与医院核型结果完全一致，其中共有7个21三体样本，4个13三体样本，3个18三体样本及46个正常样本。 [0237] 从上述分析结果可以看出，本发明能显著提高血液游离DNA的提取浓度，保证了文库的质量，提高了文库构建的成功率，减少了文库扩增成本。 [0238] 上表中数据显示，60份血样的测序分析结果与医院核型结果完全一致。这说明该TM 发明的血液游离DNA提取及磁珠筛选纯化、文库构建方法适用于Ion Proton 测序平台，并 且该方法适用于在Ion ProtonTM测序平台上进行孕妇外周血胎儿染色体非整倍体检测。 [0239] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。 [0240] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。 |
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