一种基于合成单链DNA文库进化酶的方法 |
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| 申请号 | CN201510213131.2 | 申请日 | 2015-04-29 | 公开(公告)号 | CN104877977A | 公开(公告)日 | 2015-09-02 |
| 申请人 | 江南大学; | 发明人 | 康振; 陈坚; 金鹏; 堵国成; 张琳培; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种基于合成单链DNA文库进化酶的方法，属于基因工程技术领域。本发明基于PCR技术，先得到单链突变体，再以此为模板获得多样性丰富的双链突变体文库。突变文库重组表达载体后转化宿主进行高通量筛选进化突变株。本发明采用此技术，成功对酶基因进行体外改造，获得了性质非常优异的突变株。本方法实现了基因的快速体外进化，操作简单，特别适合于对基因内部引入丰富的突变多样性，进行快速定向进化。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种高效进化酶的方法，其特征在于，主要包括制备单链突变体文库、制备双链突变体文库、筛选突变体，单链突变体文库与双链突变体文库分步或同时构建；为构建单链突变体文库，针对亲本基因的各个目标突变区域分别设计引物，各引物方向相同，并通过向PCR体系中添加DNA连接酶来连接各发生突变的核苷酸片段，得到完整的单链突变体；为构建双链突变体文库，单链突变体的两端需带上额外的锚点序列，便于在双链化时，设计用于特异性扩增单链突变体的引物。 |
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| 说明书全文 | 一种基于合成单链DNA文库进化酶的方法技术领域[0001] 本发明涉及一种基于合成单链DNA文库进化酶的方法，属于基因工程技术领域。 背景技术[0002] 随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，已有数千种类的天然酶基因被发现，由于酶介导的生物催化具有环境友好型，高效专一性和反应条件温和等优点，作为生催化的主导者，被广泛应用于复杂的药物、中间体、化合物的合成，甚至生物燃料的合成。合成生物和代谢工程中酶是核心的参与者，通过构建一系列的代谢合成途径，可以实现微生物代谢合成各种有机合成无法获得的复杂化合物，如芳烃、碳水化合物、有机酸、醇和其他次级代谢产物。然而，在大多数情况中，天然酶的性质的局限性，极大地限制了它在各种复杂条件下的使用。 [0003] 自然界在遗传突变与自然选择的动态平衡过程中，进化出了非常精确且又高效的酶，然而自然选择的速度非常缓慢，需要漫长的时间。人们迫切需要对天然酶进行人工进化和改造，以期获得能够满足人们需求的功能更强大的新酶。在当今实验技术条件下，人们通过物理化学等方法，例如紫外、射线和亚硝酸盐等极大地提高了基因突变的频率，为人工快速进化基因提供了可能。然而，物理化学等方法造成的突变往往都是有害突变，且随机性较大，还无法满足大规模的进化需求。随着分子生物学技术的日趋成熟，从基因操作水平上直接对天然基因引入特定的或随机的突变位点已成为可能。随机突变方法是通过引进随机的碱基替换，进而筛选理想的突变体。例如易错PCR技术，是目前使用较广的基因进化方式之一，通过在体外聚合酶链反应(PCR)过程中随机引入突变点，高通量筛选有益进化的基因。经过多轮次操作后，可以获得酶学性质和功能发生明显变化的新酶。在此基础上发展起来的各种依赖PCR技术引入突变点进化基因的技术如定点突变、基因嵌合以及瞬时模板的随机嵌合等方法。然而，上述方法产生的突变点多样性少，产生的突变体也多为有害突变，工作量大而且效率极低。 [0004] 1994年，一种的定向进化新技术DNA改组(DNA shuffling)悄然诞生，Stemmer在Nature发表了一篇题为Rapid evolution of a p rotein in vitro by DNA shuffling的文章，首次提出了DNA改组技术。研究者以β-内酰胺酶系统为试验对象，运用DNA改组，经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株，其头孢噻肟(cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了16000倍，远高于错误倾向PCR的突变筛选结果。随后发展起来的各种以重组技术为基础的方法，以提高基因杂交的程度和筛选效率为目标，都获得了比较好的效果。然而，DNA shuffling技术对序列同源性的要求较高(同源性大于75％)且需要获取同源基因材料。这两个条件极大限制了DNA shuffling技术的应用，同时该技术产生的突变体往往有较多的移码突变体。 [0005] 此外，当前合成生物学和代谢工程对合成途径的改造基本都注重在对合成途径基因的表达调控上，例如增强途径基因的表达，敲除或者抑制竞争途径，例如优化启动子或者核糖体结合位点，优化基因的密码子，改造途径基因的间隔调控区域等。另外，对合成途径中的酶进行改造也是非常有必要的，例如关键酶的限速问题、受产物或者底物反馈抑制。因为，如果仅仅加强表达水平，可能会导致细胞合成能力的浪费和细胞生长负担，而不能从根本上解决代谢途径流量平衡的问题。 [0006] 本发明采用体外PCR重组技术为基础，通过人工合成单链DNA文库，采用PCR技术获得含有多样性极其丰富的突变文库，再采用体外重组技术构建突变筛选文库。此技术克服了上述随机突变多样性不足、DNA shuffling技术同源序列和同源基因材料的限制等因素，而且操作实施简单，易于获得丰富的突变体文库，为基因体外快速进化奠定了基础，同时，结合蛋白结构生物信息学和合成生物学，特别适合于酶基因和代谢合成途径的快速定向进化应用。当然，本发明同样适用于只有一个目标突变区域的情况。 发明内容[0007] 本发明提供了一种基于合成单链DNA文库进化酶的方法(Rapidly Efficient Combinatorial Oligonucleotides for Direct Evolution，RECODE)，主要包括制备突变体文库、筛选突变体；所述突变体文库包括单链突变体文库和双链突变体文库，单链突变体文库和双链突变体文库可以分开构建，也可以同步构建得到。为构建单链突变体文库，针对亲本基因的各个目标突变区域分别设计引物，各引物方向相同，并通过向PCR体系中添加DNA连接酶来连接各发生突变的核苷酸片段，得到完整的单链突变体；为构建双链突变体文库，单链突变体的两端需带上额外的锚点序列，便于在双链化时，设计用于特异性扩增单链突变体的引物。 [0008] 所述目标突变区域可以是有目的地选择得到的或随机产生的。对一条链上进行同时突变的区域数量在理论上不受限制，实际操作中可根据需要自行设定，2k以内的基因可以在1-15个位点之间。 [0009] 所述方向相同，是指各引物均为3’至5’方向，或均为5’至3’方向。当亲本基因是双链DNA时，引物方向相同可以保证PCR过程仅以特定方向的DNA链为模板，最终得到单链突变体。 [0010] 所述亲本基因编码的是酶基因；亲本基因的存在形式不受限制，可以为质粒、基因组、双链DNA片段或者单链cDNA。 [0011] 所述单链突变体文库和双链突变体文库同步构建，是直接向构建单链突变体文库的PCR体系中添加特异结合单链突变体的引物，边PCR获得单链突变体，边以单链突变体为模板进行双链化反应和双链突变体的扩增反应。 [0012] 所述单链突变体文库和双链突变体文库分步构建时，直接以含单链突变体文库的PCR混合物作为模板，不更换反应体系，直接向其中加入特异结合单链突变体的引物进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体；或者以经柱纯化回收后的单链突变体文库作为模板，重新配制反应体系进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体。 [0013] 为构建单链突变体文库，针对亲本基因的一个或多个目标突变区域，分别设计相应的引物，称为编辑引物。所述编辑引物含有需要向突变区域引入的突变碱基且3’和5’端分别有适当长度的与模板链匹配的序列；涉及多个突变区域时，各编辑引物为同方向，均与同一模板链配对结合。同时，合成两条与编辑引物同方向的锚点引物，其中一条是上游锚点引物，一条是下游锚点引物，所述上游锚点引物含有一段与模板链3’端匹配的核苷酸序列，此外，该上游锚点引物的5’端还有15-25bp的锚点序列；所述下游锚点引物含有一段与模板链5’端匹配的核苷酸序列，此外，该下游锚点引物的3’端还有15-25bp的锚点序列。 [0014] 对于编辑引物，为节省合成费用，一般建议编辑引物长度低于59bp，若有需要可增加引物长度，或者可分为两条短引物。需要进行突变的位点一般置于编辑引物的中间部位，根据需要可进行高度简并，若亲本编码的是蛋白序列，为避免终止密码子TAA、TAG和TGA出现，三联密码子可简并为VNN或者降低终止子出现的概率，编辑引物合成优选PAGE纯化方式。 [0015] 所述锚点引物，还可以兼具编辑引物的功能，即在作为锚点引物的同时，还可以含有需要向突变区域引入的突变碱基。 [0016] 所述锚点序列，一方面可以在构建双链突变体文库时，用于设计专一与单链突变体结合的外端引物，另一方面还可作为同源重组序列，用于突变体文库与表达载体的连接。在将双链突变体与载体连接时，不建议使用限制性酶切位点进行重组载体，因为高度简并的突变引入，可能会使基因内部出现相应的酶切位点。 [0017] 所述需要在突变区域引入的突变碱基可以是具体的碱基序列，也可以是简并碱基序列。 [0019] 所述编辑引物的3’和5’端序列分别保留15-30bp的与模板完全匹配的寡聚核苷酸序列。 [0020] 制备单链突变体文库的反应过程是DNA延伸和DNA连接同步进行的反应：上、下游锚点引物、编辑引物与模板DNA以适当摩尔比混合，添加DNA聚合酶和DNA连接酶，反应缓2+ 冲液。反应缓冲液中Mg 浓度为1-10mM，PCR退火温度为40-66℃，PCR延伸温度为65-72℃，PCR反应循环数为1-35个。PCR产物中包括变性解链后未用作模板的单链DNA、大量的发生突变的单链DNA、与模板结合着的处于双链状态的发生突变的DNA链。 [0021] 在本发明的一种实施方式中，制备单链突变体文库时，与模板链不同位置结合的引物的摩尔数相同。 [0022] 为构建双链突变体文库，可以以含单链突变体文库的PCR混合物或者经柱纯化回收后的单链突变体文库作为模板，进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体基因产物；或者直接向构建单链突变体文库的反应体系中添加特异结合单链突变体的引物，边PCR获得单链突变体边进行双链化反应和双链突变体的扩增反应(简称为一步PCR)。为构建双链突变体文库，以单链突变体为模板设计一对用于扩增单链突变体全长基因的外端引物。所述外端引物分别与锚点引物的锚点序列相匹配或相同。只有发生突变的带上锚点序列的单链DNA能与外端引物结合，因而扩增产物是双链突变体文库。制备好的PCR产物，纯化回收后，采用体外重组技术进行克隆，构建高通量筛选文库，筛选具备所需性质特征的突变子。 [0023] 所述以单链突变体文库或者经柱纯化回收后的单链突变体文库作为模板进行第二轮PCR制备全长完整的双链突变体基因产物时，只需经过少数循环，就能得到大量双链突变体。所述的单链突变体文库，在进行双链突变体文库的制备之前，可以采用DpnI限制性内切酶消化模板链。当然，即使不使用DpnI限制性内切酶降解模板DNA，在制备双链突变文库的PCR过程中，由于一对外端引物含有与锚点序列匹配的序列，而模板DNA不含有与锚点序列匹配的序列，因此，模板DNA并不会发生扩增。 [0024] 所述直接向构建单链突变体文库的反应体系中添加特异结合单链突变体的引物，边PCR获得单链突变体，边进行双链化反应和双链突变体的扩增反应的一步PCR中，将上、下游锚点引物、编辑引物与模板DNA以适当摩尔比混合，同时，分别加入2-5倍锚点引物量2+ 的上、下游外端引物，添加DNA聚合酶、DNA连接酶和反应缓冲液。反应缓冲液中Mg 浓度为1-10mM，PCR退火温度为40-66℃，PCR延伸温度为65-72℃，PCR反应循环数为1-35个。 PCR产物含大量的双链突变体，及极少量的模板DNA。 [0025] 所述一步PCR的退火过程中，为避免锚点引物与外端引物的结合，锚点引物中锚点序列的长度约占锚点引物长度的三分之一。 [0026] 所述一步PCR中，上(下)游锚点引物长度可以为60bp，其中40bp与亲本模板完全匹配，还有20bp的锚点序列；上(下)游外端引物长度为20bp，与锚点序列相同或互补。 [0027] 所述一步PCR中，上(下)游锚点引物和上(下)游外端引物的添加比例可以为1：(2-5)，过量的上(下)游外端引物能使生成的单链突变体完全双链化成双链突变体。 [0028] 在本发明的一种实施方式中，采用的DNA聚合酶为高保真的耐热DNA聚合酶，优选5’-3’外切酶活性缺失的高保真DNA聚合酶，如Phusion DNA polymerase(NEB)。 [0029] 在本发明的一种实施方式中，采用的DNA连接酶为耐热DNA连接酶，如Taq DNA ligase(NEB)、9N DNA ligase(NEB)和Ampligase(EPI)，优选Ampligase。 [0030] 为筛选突变体，可将突变体文库与载体同体外组装技术进行整合。 [0031] 所述的体外组装技术可以为融合PCR、Gibson组装、T4DNA聚合酶介导的重组技术或者体内酵母组装技术。Gibson组装技术的原理为在组装反应体系中，T5核酸外切酶能从双链DNA片段的5’端往里进行切割，产生3’端突出的黏性末端，由于各个片段之间具有同源臂序列，相邻近的两个完全互补配对的黏性末端片段发生结合，产生的缺口由DNA聚合酶补平和Taq DNA连接酶连接完成，从而实现重组片段的无缝组装。 [0032] 图1可以帮助理解本发明的原理，图1不代表本发明的唯一实施方式。本发明主要包括分别采用不同引物进行的两轮PCR以及对第二轮PCR产物进行筛选的过程。第一轮PCR涉及图1上端显示的5条5’至3’方向的引物，其中带有虚线的两条引物为锚点引物，虚线所示部分即为锚点序列，分别带有★、▲、◆的为针对不同目标突变区域设计的编辑引物；在PCR过程的变性阶段，亲本DNA解链得到两条单链DNA，由于5条引物都只能与3’至5’方向的DNA链结合，因此，整个PCR过程中只有3’至5’方向的亲本DNA链能作为模板链，相应地，这一轮PCR结束后会得到大量5’至3’方向的单链突变体、少量未被用作模板的单链DNA、少量与模板结合着的处于双链状态的发生突变的DNA链。以第一轮PCR混合产物作为模板，或采用DNA溶液柱纯方式回收单链突变体作为模板，以减少其它影响因素。相应地，第二轮PCR可以不更换反应体系，直接向第一轮PCR混合产物中加入上、下游外端引物，或者重新配制PCR反应体系。第二轮PCR涉及一对外端引物，该外端引物与第一轮PCR中的锚点引物的锚点序列匹配或相同，因此该外端引物只与带有锚点序列的单链DNA结合进行扩增反应，而亲本DNA由于缺少能与锚点序列匹配的序列而得不到扩增。最后，通过对丰富的双链突变体库进行筛选获取理想的突变体。 [0033] 图4为在图1的基础上进行简化后得到的一步PCR，能直接制备双链突变体文库。一步PCR是在第一轮PCR反应体系中就添加了上、下游外端引物，这样，在反应的过程中，新生成的单链突变体与上游或下游外端引物结合，并扩增形成双链突变体，而亲本链由于不能和外端引物结合，不会被扩增。在此过程中，形成的突变体以指数的形式增长，相比两轮PCR反应体系，产生的突变体更多。同时，在操作上更加方便，耗时短。 [0034] 本发明以体外PCR重组技术为基础，人工合成单链突变体文库，通过设计针对多个目标区域的编辑引物，PCR后获得含有多样性极其丰富的突变文库，双链化后再采用体外重组技术构建突变体筛选文库。本发明克服了现有随机突变多样性不足、DNA shuffling技术受同源序列和同源基因材料限制的缺点，而且操作实施简单，易于获得丰富的突变体文库，为基因体外快速进化奠定了基础。本发明成功将水蛭透明质酸酶的酶活提高了2.5倍。附图说明 [0035] 图1所示为合成单链DNA文库快速组合进化酶和代谢途径的方法示意图；两端虚线位置为锚点序列。 [0036] 图2所示为透明质酸酶突变体显示的不同酶活力示意图。 [0037] 图3所示为表现酶活差异的透明质酸酶突变体的氨基酸突变位点示意图。 [0038] 图4所示为RECODE技术采用一步PCR反应系统组合进化DNA的方法示意图；两端虚线位置为锚点序列。 具体实施方式[0039] 实施例1一步PCR构建双链突变体文库对透明质酸酶进行体外改造[0040] 以水蛭透明质酸酶基因LHyal为改造对象，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据序列比对，选取10处保守的位点，设计10条编辑引物(JPS/7HF-P1F至JPS/7HF-P10F)，引物信息如下所示： [0041] JPS/7HF-P1F:TCTCCGAAAGTTTCCATVNNVNNVNNNNNGATGSGVNNVNNTTTTCACCGAAAGGGTTG [0042] JPS/7HF-P2F:ATCACATCACCGARATTGNNNVNNCTCVNNVNNVNNCTCTCTCCAGSTTWTTTCCGCGT [0043] JPS/7HF-P3F:GTCGGAGGGACGNNNVNNVNNTKGTTAVNNTTTRRCCYCGATGAAAACAACAAATGGAA [0044] JPS/7HF-P4F:GTCAAAYTCRCCAAMKGATCTVNNVNNVNNNTGMTGNTTNATTTAAACGCTGAAGTCAG [0045] JPS/7HF-P5F:AAGGCTATGGAGATNACVNNRRCTGGGAAVNNVNNVNNVNNCCGGATCATACGTCCGCA [0046] JPS/7HF-P6F:CATAAAGTGCTGGAAAAMNATVNNVNNVNNVNNVNNVNNNCATTANTGGGCCCTGACGT [0047] JPS/7HF-P7F:ACGCTTCACCASTACKDSNTTRACGGCMRWNCCKCARMTRDGAGCACATACCTGGACGC [0048] JPS/7HF-P8F:GCACCAAAGATSTTTCGNVVNVVNNTVNNVNNGGTTTTNTTWSGCTTGACAAACTGGGT [0049] JPS/7HF-P9F:AGCCGAATCCAGATTATTGGCTGVNNVNNVNNVNNVNNTCGTTAGTAGGGMVTACGGTC [0050] JPS/7HF-P10F:GAGTGTACGCACAMTGCNCCAAMVNNVNNNCAVNNVNNVNNCAGAGTCGTTWCTACAAG [0051] JPS/7HF-HM-F:GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTCCACCACCACCACCACCACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATAGACG [0052] JPS/7HF-HM-R:TGTAGTCAGCGATGCAAATGTTGAAGCGTGCAAAAAGTAAGCGGCCGCGAATTAATTCGC [0053] LHyal-F:GAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC [0054] LHyal-R:GCGAATTAATTCGCGGCCGC [0055] 两条锚点引物Jps/7HF-HM-F和Jps/7HF-HM-R与编辑引物为同方向，且与同一单链模板配对，两锚点引物的外端带有20多bp的锚点序列，可用于同源重组克隆。克隆载体pPIC9K采用EcoRI和NotI限制性内切酶进行双切制备线性化的缺口载体。根据锚点序列，设计一对用于扩增全长突变基因的外端引物LHyal-F和LHyal-R，与锚点完全互补配对或者一致。 [0056] 构建突变文库的操作步骤如下：首先将10条编辑引物和末端下游锚点引物JPS/7HF-HM-R等摩尔比混合，磷酸化处理后，70℃10min失活酶。在25μl反应体系中：2.5μl 10x反应缓冲液，上游锚点引物Jps/7HF-HM-F、磷酸化的下游锚点引物Jps/7HF-HM-R和磷酸化的编辑引物适量(根据磷酸化体系计算，每条编辑引物1-5pmol)，DNA模板加入量约10-50ng(与引物比例为1:100)，上游外端引物LHyal-F、下游外端引物LHyal-R分别加入相对于下游锚点引物2倍的量，加入Phusion DNA polymerase(NEB)0.5μl，Ampligase(EPI)连接酶1μl。混匀后按如下PCR程序运行： 94℃2min，[94℃30s，50℃1min，66℃5min]x32，72℃5min，4℃hold on。PCR产物为突变体文库。 [0057] PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳切胶回收。采用凝胶回收试剂盒按说明书推荐方法回收PCR产物。将回收的突变库产物与载体进行重组，线性化载体加入50ng，突变文库片段与载体等摩尔比的量。重组反应体系混匀后50℃反应60min。全部反应液转化毕赤酵母GS115感受态，按正常转化步骤操作，30℃后培养1h后，全部涂布含2mg/ml g418抗生素的MD平板，倒置30℃培养48h。 [0058] 长出的克隆随机挑取1000个接种于96深孔板，含有诱导表达培养基BMMY中(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4，11.8g/L KH2PO4，加水至895mL，121℃灭菌20-4分钟，然后加入100×YNB 100mL(13.4g/L)，500×生物素1mL(4×10 g/L)，甲醇5mL)。 30℃200rpm培养，每24h向培养基中添加1％终浓度进行诱导表达，诱导表达72h。 [0059] 对突变体初酶活的测定进行批量在96孔板中进行，96孔板培养液进行3500rpm离心5min，发酵上清液进行适当稀释后，加入96孔板中，添加适当的透明质酸底物(2mg/ml)。在38℃下反应10min，95℃适合2min，再加入2倍体积的DNS，充分混匀后，100℃煮沸10min，反应结束后，加入去离子水适当稀释后，采用酶标仪在540nm下扫描吸光值，然后根据标准曲线计算突变体的酶活力。结果如图2所示，透明质酸酶活性表现出较大的差异，突变体的酶活提高至近2.5倍。同时，测序结果分析显示，透明质酸酶内部序列的突变位点随机组合呈现出丰富的多样性组合，突变位点基本覆盖了10个区域，且同时引入突变区域的组合数有1-5个位置不等，最多的氨基酸同时突变达到30个以上，图3所示。上述实施例明显的证明了本发明方法在体外能快速对酶基因进行高效的进化改造。 |
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