用于增强的抗-IGF1R表达的βGl-IgG内含子

申请号 CN200980153968.5 申请日 2009-11-12 公开(公告)号 CN102369285B 公开(公告)日 2014-06-18
申请人 默沙东公司; 发明人 德巴·P·萨哈;
摘要 本 发明 提供了用于靶基因如免疫球蛋白的增强的表达的多核苷酸。也包括用本发明的多核苷酸表达靶基因的方法。
权利要求

1.分离的质粒载体,所述载体包含由β-珠蛋白剪接供体位点、γ免疫球蛋白剪接受体位点和所述位点之间的间隔核苷酸序列组成的多核苷酸,其中所述β-珠蛋白剪接供体位点的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示,所述γ免疫球蛋白剪接受体位点的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示,并且所述间隔核苷酸序列为SEQ ID NO: 3的第51-175位核苷酸;所述多核苷酸可操作性连接于启动子,所述多核苷酸和启动子可操作性连接于编码抗-IGF1R、抗-IL-23 p19、抗-IL23受体、抗-IL-17、抗-PD1或抗-HGF抗体免疫球蛋白轻链或重链的基因,所述链任选融合于免疫球蛋白恒定区。
2.权利要求1的质粒载体,其中所述启动子是CMV启动子。
3.权利要求1的质粒载体,其中所述基因编码与κ免疫球蛋白恒定区融合的免疫球蛋白轻链。
4.权利要求1的质粒载体,其中所述基因编码与γ-1免疫球蛋白恒定区融合的免疫球蛋白重链。
5.权利要求4的质粒载体,其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的第
20-128位基酸或SEQ ID NO 31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3;或其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 7、12、13、14或22的第20-137位氨基酸或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。
6.权利要求5的质粒载体,其中所述基因编码SEQ ID NO: 8、9、10或11的第20-128位氨基酸。
7.权利要求5的质粒载体,其中所述基因编码SEQ ID NO: 12或13的第20-137位氨基酸。
8.权利要求1的分离的质粒载体,其特征在于选自图1、2和5-10的图中所示的质粒图。
9.权利要求1的质粒载体,其中所述多核苷酸如SEQ ID NO: 3的第39-190位核苷酸所示。
10.分离的宿主细胞,其包含权利要求1的质粒载体。
11.权利要求10的宿主细胞,其中所述质粒载体整合到宿主细胞的染色体DNA中。
12.权利要求11的宿主细胞,其包含两个或更多个拷贝的所述质粒载体。
13.权利要求10的宿主细胞,其中所述质粒载体不整合到宿主细胞的染色体DNA中。
14.权利要求13的宿主细胞,其包含两个或更多个拷贝的所述质粒载体。
15.制备主细胞库的方法,该方法包括将权利要求1的质粒载体导入宿主细胞,选择包含所述质粒载体的宿主细胞的单克隆群体,培养所述克隆群体,确定来自所述培养物的细胞是否含有细菌、病毒、真菌和/或支原体,并且,如果都没有检测到,则在冷冻条件下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。
16.权利要求15的方法,其中所述质粒载体包含图1或2的质粒图。
17.权利要求16的方法,其中所述质粒载体包含图6、7、8、9或10的质粒图。
18.权利要求15的方法,其中所述细菌、病毒、真菌和/或支原体是选自下组的一个或多个成员:人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、人巨细胞病毒、人嗜T淋巴细胞病毒、EB病毒、人单纯疱疹病毒、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
19.通过权利要求15的方法生产的主细胞库。
20.制备工作细胞库的方法,该方法包括培养来自权利要求19的主细胞库的细胞,并且在冷冻下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。
21.权利要求20的方法,其中所述质粒载体包含图1或2的质粒图。
22.权利要求20的方法,其中所述质粒载体包含图6、7、8、9或10的质粒图。
23.权利要求20的方法,其中测试所述培养的细胞的细菌、病毒、真菌和/或支原体,并且,如果都没有检测到,则在冷冻下保存来自所述培养物的细胞。
24.通过权利要求20的方法生产的工作细胞库。
25.包含权利要求10的宿主细胞的主细胞库。
7
26.权利要求25的主细胞库,其中所述细胞是在小瓶中,所述小瓶含有约10 个细胞/小瓶,并且不含可检测平的细菌、病毒、支原体和真菌。
27.权利要求26的主细胞库,其包含200个或更多个小瓶的所述细胞。
28.权利要求25的主细胞库,其包含CHO-DXB11细胞,所述细胞包含特征在于图1的质粒图的质粒载体。
29.权利要求25的主细胞库,其包含CHO-DXB11细胞,所述细胞包含特征在于图2的质粒图的质粒载体。
30.包含权利要求10的宿主细胞的工作细胞库。
7
31.权利要求30的工作细胞库,其中所述细胞是在小瓶中,所述小瓶含有约10 个细胞/小瓶,并且不含可检测水平的细菌、病毒、支原体和真菌。
32.权利要求31的工作细胞库,其包含200个或更多个小瓶的所述细胞。
33.权利要求30的工作细胞库,其包含CHO-DXB11细胞,所述细胞包含特征在于图1的质粒图的质粒载体。
34.权利要求30的工作细胞库,其包含CHO-DXB11细胞,所述细胞包含特征在于图2的质粒图的质粒载体。
35.用于在宿主细胞中表达由与启动子可操作性缔合的基因编码的靶多肽的方法,所述基因编码抗-IGF1R、抗-IL-23 p19、抗-IL23受体、抗-IL-17、抗-PD1或抗-HGF抗体免疫球蛋白轻链或重链,所述链任选融合于免疫球蛋白恒定区,该方法包括将权利要求1的质粒载体导入宿主细胞,并且在表达靶多肽的条件下培养所述宿主细胞。
36.权利要求35的方法,进一步包括纯化所述靶多肽。
37.权利要求35的方法,其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的第
20-128位氨基酸或SEQ ID NO 31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3;或其中所述基因编码包含SEQ ID NO: 7、12、13、14或22的第20-137位氨基酸或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。
38.权利要求37的方法,其中所述基因编码SEQ ID NO: 8、9、10或11的第20-128位氨基酸。
39.权利要求37的方法,其中所述基因编码SEQ ID NO: 12或13的第20-137位氨基酸。
40.权利要求37的方法,进一步包括分离所述多肽。
41.权利要求37的方法,其中所述基因、启动子和多核苷酸是在质粒载体中,所述质粒载体的特征在于图1的质粒图。
42.权利要求41的方法,其中所述特征在于图1的质粒图的质粒载体包含SEQ ID NO:
35的核苷酸序列。
43.权利要求42的方法,其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

说明书全文

用于增强的抗-IGF1R表达的βGl-IgG内含子

[0001] 本申请要求2008年11月12日提交的美国临时专利申请号61/113,807的权益,该申请在此通过全文引用并入本文。发明领域
[0002] 本发明涉及包含可操作性连接于启动子/β-珠蛋白-γ免疫球蛋白(βGl-IgG)内含子构建体的靶基因的多核苷酸,以及表达所述靶基因的方法。
[0003] 发明背景
[0004] 抗体、抗体片段和其它治疗蛋白的临床和商业成功,导致对在哺乳动物细胞培养物中非常大规模生产的需要。这导致总体生产能的快速扩展、反应器大小的增加(最高达20,000 L)以及显著增加的努力,用于改进方法效率并伴随制造成本降低。
[0005] 例如,大多数抗体治疗需要在长时间使用高剂量,这需要每个患者使用大量纯化产品。因此,满足抗体生产需要的制造能力是真正的挑战;期望具有高度多产的制造过程
[0006] 用于改进抗体或其它蛋白的体内生产平的一种手段是制备新的多核苷酸表达构建体,其导致与标准构建体相比,蛋白生产水平提高。本发明解决本领域的此需要。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明的一部分提供包含β-珠蛋白剪接供体位点和γ免疫球蛋白剪接受体位点的分离的βGl-IgG内含子多核苷酸,其中所述位点间隔约125个核苷酸。除了βGl-IgG内含子,本发明包括用于以高水平表达靶多肽的使用方法。质粒、宿主细胞、主细胞库(master cell banks)和工作细胞库(working cell banks)也形成本发明的部分。
[0009] 例如,在本发明的一个实施方案中,多核苷酸包含β-珠蛋白剪接供体位点和γ免疫球蛋白剪接受体位点,所述β-珠蛋白剪接供体位点包含核苷酸序列CAGGTAAGTTTA (SEQ ID NO: 4),所述γ免疫球蛋白剪接受体位点包含核苷酸序列TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5),其中所述位点间隔约125个核苷酸;例如,其中剪接供体位点和剪接受体位点由以下序列间隔开:
[0010]
[0011] (SEQ ID NO: 3的核苷酸51-175)。在本发明的一个实施方案中,βGl-IgG内含子在基因的上游,并且在与所述基因可操作性缔合(operably associated)的启动子下游。基因可以是任何类型,例如,免疫球蛋白,例如,其中所述免疫球蛋白是与IGF1R、IL-23 p19、IL23受体(其任何亚基,如IL-12β1或IL-23R)、IL-17A、PD1或HGF特异性结合的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区(任选包括信号肽)或重链可变区(任选包括信号肽)或这两者,例如,其中该基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的基酸20-128或SEQ ID NO31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3;和/或其中该基因编码包含SEQ ID NO:
7、12、13、14或22的氨基酸20-137或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。βGl-IgG内含子可以放置在任何多核苷酸,例如,载体,如质粒载体或病毒载体中。
[0012] 本发明在其范围内包括含有βGl-IgG内含子的分离的质粒,该质粒的特征在于图1-10中任何一幅图的质粒载体图,例如,其中所述质粒包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的βGl-IgG内含子核苷酸39-190。
[0013] 包含本发明的 βGl-IgG内含子的宿主细胞也在本发明的范围内。例如,在宿主细胞中,βGl-IgG内含子多核苷酸可以整合到宿主细胞的染色体DNA中或不整合。此外,宿主细胞可以含有高拷贝数的多核苷酸,例如,每个细胞两个或更多个拷贝。
[0014] 主细胞库(MCBs)也形成本发明的部分。因此,本发明包括制备主细胞库的方法,该方法包括将本发明的βGl-IgG内含子多核苷酸(例如,显示于图1-10中任何一幅图的质粒载体)导入宿主细胞(如,哺乳动物细胞,如CHO细胞,如CHO-DG44、CHO-K1或CHO-DXB11),选择包含所述多核苷酸的宿主细胞的单克隆群体,培养所述克隆群体,确定来自所述培养物的细胞是否含有细菌、病毒、真菌和/或支原体,并且,如果都没有检测到,则在冷冻条件下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。在本发明的一个实施方案中,主细胞库不含生物污染物,如细菌、病毒、真菌和/或支原体。可以在冷冻条件下保存主细胞库。例如通过描述的制备MCB的方法生产的主细胞库也是本发明的部分。本发明进一步提供制备工作细胞库(WCB)的方法,该方法是通过培养来自本发明的主细胞库的细胞,并且在冷冻下在一个或多个容器中保存来自所述培养物的细胞。类似于制备MCB的方法,该方法可以包括测试WCB中的细菌、病毒、真菌和/或支原体的步骤,并且,如果都没有检测到,则在冷冻下保存来自所述培养物的细胞。例如通过描述的制备WCB的方法生产的工作细胞库也是本发明的部分。例如,在本发明的一个实施方案中,在MCB或WCB中,细胞是在小瓶(如,约7
200个或更多个)中,所述小瓶含有约10 个细胞/小瓶,并且不含可检测水平的细菌、病毒、支原体和真菌。
[0015] 本发明也提供了用于在宿主细胞(如哺乳动物细胞,如CHO细胞,如CHO-K1、CHO-DXB11或CHO-DG44细胞)中表达由与启动子可操作性缔合的基因编码的靶多肽的方法,该方法包括在表达靶多肽的条件下将启动子和编码靶多肽的多核苷酸之间的、包含β-珠蛋白剪接供体位点和γ免疫球蛋白剪接受体(其中所述位点间隔约125个核苷酸)的βGl-IgG内含子多核苷酸(如质粒pAIG1FRLCb2V1,如包含SEQ ID NO: 35的核苷酸序列的该质粒)导入宿主细胞;并且,任选地,纯化所述靶多肽。在本发明的一个实施方案中,β-珠蛋白剪接供体位点包含核苷酸序列CAGGTAAGTTTA (SEQ ID NO: 4),免疫球蛋白剪接受体位点包含核苷酸序列TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5),例如,其中剪接供体位点和剪接受体位点由以下序列间隔开:
[0016]
[0017] (SEQ ID NO: 3的核苷酸51-175)。在本发明的一个实施方案中,基因是免疫球蛋白,例如,其中所述免疫球蛋白是与IGF1R特异性结合的抗体的轻链可变区或重链可变区,例如,其中该基因编码包含SEQ ID NO: 6、8-11、18或26的氨基酸20-128或SEQ ID NO 31的轻链免疫球蛋白的CDR-L1、CDR-L2 和CDR-L3;或其中该基因编码包含SEQ ID NO: 7、12、13、14或22的氨基酸20-137或SEQ ID NO: 30的重链免疫球蛋白的CDR-H1、CDR-H2 和CDR-H3。
[0018] 附图简述
[0019] 图1. pAIG1FRLCb2V1的质粒图。该质粒的特征图如下所示:
[0020] AP(R)
[0021] 起始: 3965 终止: 4828
[0022] (互补的)
[0023] VDJ
[0024] 起始: 5966 终止: 6393
[0025] IgG1
[0026] 起始: 6393 终止: 7373
[0027] IgG1非基因组区
[0028] DHFR cDNA
[0029] 起始: 601 终止: 1347
[0030] (互补的)
[0031] SV40 t Ag内含子
[0032] 起始: 11916 终止: 600
[0033] κ
[0034] 起始: 10055 终止: 10378
[0035] (互补的)
[0036] Κ链
[0037] VJ
[0038] 起始: 10379 终止: 10756
[0039] (互补的)
[0040] IGF-1R的VJ (LCb,人种系序列)
[0041] pBR322
[0042] 起始: 2811 终止: 3019
[0043] (互补的)
[0044] pBR322
[0045] 起始: 3020 终止: 5033
[0046] TK-潮霉素序列
[0047] 起始: 7682 终止: 9691
[0048] (互补的)
[0049] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0050] 起始: 7398 终止: 7636
[0051] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0052] 起始: 9784 终止: 10032
[0053] (互补的)
[0054] SV40聚腺苷酸信号
[0055] 起始: 11669 终止: 11917
[0056] MMTV-LTR
[0057] 起始: 1348 终止: 2810
[0058] (互补的)
[0059] hCMV/βGl-IgG内含子
[0060] 起始: 5069 终止: 5910
[0061] 人CMV启动子/βGl-IgG内含子
[0062] hCMV/βGl-IgG内含子
[0063] 起始: 10778 终止: 11619
[0064] (互补的)
[0065] 人CMV启动子/βGl-IgG
[0066] 内含子
[0067] pBR ORI
[0068] 起始: 3207 终止: 3207
[0069] 图2. pAIG1FRLCb2V3的质粒图。该质粒的特征图如下所示:
[0070] AP(R)
[0071] 起始: 3965 终止: 4828
[0072] (互补的)
[0073] IgG1
[0074] 起始: 7371 终止: 8351
[0075] (互补的)
[0076] IgG1非基因组区
[0077] VDJ
[0078] 起始: 8351 终止: 8778
[0079] (互补的)
[0080] DHFR cDNA
[0081] 起始: 601 终止: 1347
[0082] (互补的)
[0083] SV40 t Ag内含子
[0084] 起始: 11916 终止: 600
[0085] Κ
[0086] 起始: 10055 终止: 10378
[0087] (互补的)
[0088] Κ链
[0089] VJ
[0090] 起始: 10379 终止: 10756
[0091] (互补的)
[0092] IGF-1R的VJ (LCb, 人种系序列)
[0093] pBR322
[0094] 起始: 2811 终止: 3019
[0095] (互补的)
[0096] pBR322
[0097] 起始: 3020 终止: 5033
[0098] TK-潮霉素序列
[0099] 起始: 5053 终止: 7062
[0100] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0101] 起始: 7108 终止: 7346
[0102] (互补的)
[0103] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0104] 起始: 9784 终止: 10032
[0105] (互补的)
[0106] SV40 POLYA
[0107] 起始: 11669 终止: 11917
[0108] MMTV-LTR
[0109] 起始: 1348 终止: 2810
[0110] (互补的)
[0111] hCMV/βGl-IgG内含子
[0112] 起始: 8834 终止: 9675
[0113] (互补的)
[0114] 具有βGl-IgG内含子的人CMV启动子
[0115] hCMV/βGl-IgG内含子
[0116] 起始: 10778 终止: 11619
[0117] (互补的)
[0118] 人CMV启动子和βGl-IgG内含子
[0119] pBR ORI
[0120] 起始: 3207 终止: 3207
[0121] 图3. pAIG1FRV1的质粒图。
[0122] AP(R)
[0123] 起始: 3965 终止: 4828 (互补的)
[0124] VDJ
[0125] 起始: 5824 终止: 6251
[0126] 19D12杂交瘤的IGFR1的VDJ
[0127] IgG1
[0128] 起始: 6241 终止: 7231
[0129] IgG1非基因组区
[0130] DHFR cDNA
[0131] 起始: 601 终止: 1347 (互补的)
[0132] SV40 t Ag内含子
[0133] 起始: 11740 终止: 600
[0134] Kap
[0135] 起始: 9898 终止: 10233 (互补的)
[0136] 人抗IGFR基因的Κ链
[0137] VJ
[0138] 起始: 10234 终止: 10614 (互补的)
[0139] 轻链的人抗IGFR基因的VJ结构域
[0140] pBR322
[0141] 起始: 2811 终止: 3019 (互补的)
[0142] pBR322
[0143] 起始: 3020 终止: 5033
[0144] K-潮霉素序列
[0145] 起始: 7540 终止: 9549 (互补的)
[0146] Union U-3中测序的TK-潮霉素
[0147] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0148] 起始: 7256 终止: 7494
[0149] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0150] 起始: 9642 终止: 9890 (互补的)
[0151] SV40 聚腺苷酸
[0152] 起始: 11493 终止: 11741
[0153] MMTV-LTR
[0154] 起始: 1348 终止: 2810 (互补的)
[0155] CMV
[0156] 起始: 10801 终止: 11455 (互补的)
[0157] CMV
[0158] 起始: 5069 终止: 5723
[0159] T 7启动子/引发位点
[0160] 起始: 5723 终止: 5742
[0161] T 7启动子/引发位点
[0162] 起始: 10782 终止: 10801 (互补的)
[0163] pBR ORI
[0164] 起始: 3207 终止: 3207
[0165] 图4. pAIG1FRV3的质粒图。
[0166] AP(R)
[0167] 起始: 3965 终止: 4828 (互补的)
[0168] IgG1
[0169] 起始: 7371 终止: 8361 (互补的)
[0170] IgG1非基因组区
[0171] VDJ
[0172] 起始: 8351 终止: 8778 (互补的)
[0173] 19D12杂交瘤的IGFR1的VDJ
[0174] DHFR cDNA
[0175] 起始: 601 终止: 1347 (互补的)
[0176] SV40 t Ag内含子
[0177] 起始: 11740 终止: 600
[0178] Kap
[0179] 起始: 9898 终止: 10233 (互补的)
[0180] 人抗IGFR基因的Κ链
[0181] VJ
[0182] 起始: 10234 终止: 10614 (互补的)
[0183] 轻链的人抗IGFR 基因的VJ结构域
[0184] pBR322
[0185] 起始: 2811 终止: 3019 (互补的)
[0186] pBR322
[0187] 起始: 3020 终止: 5033
[0188] TK-潮霉素序列
[0189] 起始: 5053 终止: 7062
[0190] TK-潮霉素
[0191] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0192] 起始: 7108 终止: 7346 (互补的)
[0193] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0194] 起始: 9642 终止: 9890 (互补的)
[0195] SV40聚腺苷酸
[0196] 起始: 11493 终止: 11741
[0197] MMTV-LTR
[0198] 起始: 1348 终止: 2810 (互补的)
[0199] CMV
[0200] 起始: 10801 终止: 11455 (互补的)
[0201] T 7启动子/引发位点
[0202] 起始: 8860 终止: 8879 (互补的)
[0203] CMV
[0204] 起始: 8879 终止: 9533 (互补的)
[0205] T 7启动子/引发位点
[0206] 起始: 10782 终止: 10801 (互补的)
[0207] pBR ORI
[0208] 起始: 3207 终止: 3207
[0209] 图5. pAIG1FRLCB2-V1K的质粒图。
[0210] AP(R)
[0211] 起始: 3965 终止: 4828 (互补的)
[0212] VDJ
[0213] 起始: 6356 终止: 6356
[0214] 抗-IL10 (12G8)的VDJ区
[0215] IgG1
[0216] 起始: 6361 终止: 7341
[0217] IgG1非基因组区
[0218] VJ
[0219] 起始: 10368 终止: 10745 (互补的)
[0220] IgK
[0221] 起始: 10013 终止: 10367 (互补的)
[0222] 12G8轻链 (抗-IL10)的VDJ-IgK
[0223] DHFR cDNA
[0224] 起始: 601 终止: 1347 (互补的)
[0225] SV40 t Ag内含子
[0226] 起始: 11899 终止: 600
[0227] pBR322
[0228] 起始: 2811 终止: 3019 (互补的)
[0229] pBR322
[0230] 起始: 3020 终止: 5033
[0231] TK-潮霉素序列
[0232] 起始: 7650 终止: 9659 (互补的)
[0233] TK-潮霉素
[0234] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0235] 起始: 7366 终止: 7604
[0236] β珠蛋白聚腺苷酸信号
[0237] 起始: 9763 终止: 9996
[0238] SV40 聚腺苷酸
[0239] 起始: 11652 终止: 11900
[0240] MMTV-LTR
[0241] 起始: 1348 终止: 2810 (互补的)
[0242] hCMV/βGl-IgG内含子
[0243] 起始: 5069 终止: 5910
[0244] 具有杂合内含子的人CMV启动子
[0245] hCMV/βGl-IgG内含子
[0246] 起始: 10773 终止: 11614 (互补的)
[0247] 人CMV启动子和杂合内含子
[0248] pBR ORI
[0249] 起始: 3207 终止: 3207
[0250] 图6. pAIL23V1K的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23 Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23 Ig.重链构建体的质粒载体。 βGl-IgG内含子位于核苷酸10906-10755和5760-5911。
[0251] 图7. pAIL23RV1的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23R Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-23R Ig.重链构建体的质粒载体。 βGl-IgG内含子位于核苷酸 10914-10763和5760-5911。
[0252] 图8.pAIL17AV1的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-17 Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-IL-17 Ig.重链构建体的质粒载体。 βGl-IgG内含子位于核苷酸10934-10783和5759-5910。
[0253] 图9.pAPD16V1-GA的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-PD1 Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-PD1 Ig.重链构建体的质粒载体。βGl-IgG内含子位于核苷酸10871-10720和5759-5910。
[0254] 图10.pAHGFV1的质粒图。包含hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-HGF Ig.轻链和hCMV启动子-(βGl-IgG内含子)-抗-HGF Ig.重链构建体的质粒载体。βGl-IgG内含子位于核苷酸10922-10771和5760-5911。
[0255] 发明详述
[0256] 本发明的一部分提供表达构建体,由所述表达构建体可以以特别高的水平(相对于常规表达构建体)表达靶基因,如免疫球蛋白轻链或重链。例如,本发明包括多核苷酸(如质粒载体),所述多核苷酸包括与启动子可操作性连接的要表达的靶基因(如免疫球蛋白轻链和/或重链基因),其中,在基因和启动子之间,存在构建体,所述构建体包含β-珠蛋白内含子剪接供体位点,接着是约125个核苷酸,然后接着是γ免疫球蛋白内含子受体位点。本发明还包括使用本发明的表达构建体表达靶基因的方法。
[0257] 分子生物学
[0258] 根据本发明,可以使用本领域技术范围内的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中完整解释。参见,例如,Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (本文中称作 "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
[0259] “多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”包括DNA和RNA。
[0260] “多核苷酸序列”、“核酸序列”或“核苷酸序列”是核酸如DNA或RNA中的一系列核苷酸,并且表示任何两个或多个核苷酸的链。
[0261] “编码序列”或“编码”表达产物(如RNA、多肽、蛋白或酶)的序列是在表达时导致产生产物的核苷酸序列。
[0262] 术语“基因”包括编码或对应于特定核糖核苷酸或氨基酸序列的DNA,所述核糖核苷酸或氨基酸序列包括一个或多个RNA分子或蛋白的全部或部分。基因可以从DNA转录为RNA,所述RNA可以翻译或不翻译为氨基酸序列。“靶基因”或“靶多核苷酸”是例如编码实施者意欲表达或正在表达的靶多肽的多核苷酸,所述表达例如是通过将多核苷酸导入用于在例如宿主细胞中表达的表达构建体中。
[0263] 术语“分离的多核苷酸”或“分离的多肽”等分别包括与通常存在于细胞或重组DNA表达系统中的其它成分部分或完全分开的多核苷酸(如RNA或DNA分子)或多肽。这些成分包括但不限于细胞膜、细胞壁、核糖体、聚合酶、血清成分和外来基因组序列。在本发明的一个实施方案中,分离的多核苷酸或多肽将是分子的基本均质的组合物,但可能含有一些异质性。
[0264] 本文使用的DNA的“扩增”包括使用聚合酶链反应(PCR)来增加DNA序列混合物内特定DNA序列的浓度。对于PCR的描述,参见Saiki, et al., Science (1988) 239: 487。
[0265] 如本文使用的,术语“寡核苷酸”包括通常具有至少10个(如10、11、12、13或14个),优选至少15个(如15、16、17、18或19个),更优选至少20个核苷酸(如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个),优选不超过100个核苷酸(如40、50、60、70、80或90个)的核酸,其可以与编码基因的基因组DNA分子、cDNA分子或mRNA分子、mRNA、cDNA或其它感
32 3 14 35
兴趣的核酸杂交。例如,可以通过掺入 P-核苷酸、H-核苷酸、C-核苷酸、S-核苷酸或共价缀合于标记如生物素的核苷酸而对寡核苷酸进行标记。在本发明的一个实施方案中,标记的寡核苷酸可以用作探针来检测核酸的存在。在另一实施方案中,寡核苷酸(其中之一或两者可以被标记)可以用作PCR引物,用于克隆基因的全长或片段,或用于检测核酸的存在。通常,合成制备寡核苷酸,例如在核酸合成仪上制备。
[0266] 可以通过本领域已知的任何方法(如化学测序或酶测序)对任何核酸的序列进行测序。DNA的“化学测序”包括诸如Maxam和Gilbert (1977) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560)的方法,其中用各个基特异性反应随机切割DNA。DNA的“酶测序”可以包括诸如Sanger (Sanger, et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463)的方法。
[0267] 在本发明的一个实施方案中,本发明的核酸可以侧接天然调节(表达控制)序列,或可以与异源序列缔合,所述异源序列包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、应答元件、阻抑基因、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5’-和3’-非编码区等。
[0268] 在本发明的一个实施方案中,“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(如直接或通过其它启动子结合的蛋白或物质)并起始编码序列(如免疫球蛋白,如抗-IGF1R免疫球蛋白)的转录的DNA调节区。通常,启动子序列在其3’末端以转录起始位点为边界,并且向上游延伸(5’方向),以包括起始任何水平的转录所必须的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内可以存在转录起始位点(例如,通过用核酸酶S1作图而方便地确定),以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域(共有序列)。启动子可以与其它表达控制序列包括启动子和阻抑物序列或与本发明的核酸可操作性缔合。可以用于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV) 启动子 (美国专利号5,385,839 和5,168,062)、SV40早期启动子区(Benoist, et al., (1981) Nature 290:304-310)、包含在劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复序列中的启动子 (Yamamoto, et al., (1980) Cell 22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子 (Wagner, et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列 (Brinster, et al., (1982) Nature 296:39-42); 原核表达载体,如β-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731),或tac启动子(DeBoer, et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25); 也参见Scientific American (1980) 242:74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白”; 和来自酵母或其它真菌的启动子,如Gal 4 启动子、 ADC (醇脱氢酶) 启动子、PGK (磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。
[0269] 当转录或翻译控制序列指导RNA聚合酶介导的编码序列转录为RNA,如mRNA时,所述编码序列在细胞中是在转录或翻译控制序列的“控制下”、与转录或翻译控制序列“功能性缔合(functionally associated with)”或“可操作性连接”或“可操作性缔合(operably associated with)”,所述RNA,如mRNA随后可以进行反式RNA剪接(如果它含有内含子),并且,任选地,翻译为编码序列编码的蛋白。如果βGl-IgG内含子导致相对于无βGl-IgG内含子的启动子而言从启动子的表达水平增加,则启动子是与βGl-IgG内含子可操作性连接的。
[0270] 术语“表达”表示使得或导致基因,如RNA或DNA中的信息展现出来;例如,通过激活参与相应基因的转录和翻译的细胞功能而产生蛋白。DNA序列可以在细胞中表达,或由细胞表达,以形成“表达产物”,如RNA(如mRNA)或蛋白。表达产物自身也可以描述为由细胞“表达”。
[0271] 术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”包括这样的运载体(如质粒):通过其可以将核酸导入宿主细胞,从而转化宿主,并且任选地,促进核酸编码的基因的表达和/或导入的核酸的复制。在本发明的一个实施方案中,载体是自主复制的核酸,如环状质粒。
[0272] 术语“转化”表示将核酸导入细胞。该术语包括将编码抗-IGF1R、抗-IL23、抗-IL23R、抗-IL17、抗-PD1或抗-HGF抗体或其抗原结合片段的核酸导入细胞中。导入的基因或序列可以称作“克隆”。接受了导入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”,并且是“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源,包括与宿主细胞相同属或种的细胞,或不同属或种的细胞。可以通过本领域公知的许多方法中的任何方法将质粒导入细胞中。例如,本发明的质粒可以用于通过磷酸方法、电穿孔、DEAE-右旋糖酐方法或脂质体方法转化细胞。
[0273] 术语“宿主细胞”包括任何以下生物的任何细胞:所述生物以任何方式选择、修饰、转染、转化、生长或使用或操作,用于由细胞生产物质,例如由细胞表达或复制基因、DNA或RNA序列、蛋白或酶。宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞,如CHO-K1细胞(ATCC保藏号CRL-9618)、CHO-DG44细胞和CHO-DXB-11细胞。
[0274] “表达构建体”是一种多核苷酸,其能够驱动该多核苷酸内编码的靶基因的表达。例如,其中该基因可操作性连接于启动子(如CMV启动子),βGl-IgG内含子位于所述基因和启动子之间。
[0275] “启动子/βGl-IgG内含子”是可操作性连接于βGl-IgG内含子的启动子。βGl-IgG内含子导致比缺乏βGl-IgG内含子的情况下从启动子的表达水平更高。
[0276] “βGl-IgG内含子”是包含剪接供体(如β-珠蛋白)和剪接受体位点(如IgG)的内含子。
[0277] 在本发明的一个实施方案中,表达构建体包含Kozak共有序列,如gccgccaccatgg (SEQ ID NO: 1)或gccgccaccatg (SEQ ID NO: 2)。
[0278] 术语“表达系统”表示宿主细胞和相容的载体,它们在合适的条件下能够表达由该载体携带,并且导入宿主细胞中的蛋白或核酸。常用的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体,以及哺乳动物宿主细胞和载体。如上文所提到的,宿主细胞包括CHO(中国仓鼠卵巢)细胞,如CHO-K1或DXB-11;也包括HeLa细胞和NIH3T3细胞以及NSO细胞(不产生Ig的鼠骨髓瘤细胞系)。
[0279] 本发明的质粒载体可以包括本领域已知的数种可扩增标记中的任何一种。可扩增标记的使用在Maniatis, Molecular Biology: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989))中讨论。用于在耐药哺乳动物细胞中进行基因扩增的有用的选择标记包括DHFR (MTX (氨甲喋呤)抗性) (Alt et al., J. Biol. Chem. 253:1357 (1978); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 (1980)); 金属硫蛋白 (镉抗性) (Beach et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 78:210 (1981)); CAD (N-(膦酰乙酰(phosphonoacetyl))-l-天冬氨酸(PALA)抗性) (Wahl et al., J. Biol. Chem.254: 8679 (1979)); 腺苷酸脱氨酶 (助间型霉素抗性) (Debatisse et al., Mol. Cell. Biol. 6:1776 (1986)); IMP 5’-脱氢酶 (霉酚酸抗性) (Huberman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3151 (1981))和本领域已知的其它标记(例如,综述于Kaufman et al., Meth. Enzymology 185:537-566 (1988))。
[0280] 本发明考虑对氨基酸或核苷酸序列进行任何表面或轻微的修饰,所述序列编码本发明的质粒所编码的靶基因,例如,本发明的抗体或其抗原结合片段。多核苷酸序列的“序列-保守变体”是其中给定密码子中一个或多个核苷酸的改变不引起在该位置编码的氨基酸改变的那些。本发明的靶基因的功能-保守变体也是本发明所考虑的。“功能-保守变体”是其中蛋白中一个或多个氨基酸残基改变而不改变多肽总体构象和功能的那些,包括,但决不限于将氨基酸替换为具有相似性质的氨基酸。具有相似性质的氨基酸是本领域公知的。例如,可以互换的极性/亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸;可以互换的非极性/疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;可以互换的酸性氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸,可以互换的碱性氨基酸包括组氨酸、赖氨酸和精氨酸。氨基酸序列的保守取代是指那些:其中一种亚型的氨基酸(如极性/亲水性)的氨基酸被相同亚型的另一种氨基酸替代;并且,在本发明的一个实施方案中,其中保守取代的多肽保留基本相同水平的生物活性。
[0281] 本发明包括质粒,所述质粒包含编码靶基因的核酸以及与其杂交的核酸。在本发明的一个实施方案中,核酸在低严格性条件下,更优选在中等严格性条件下,最优选在高严格性条件下杂交。当核酸分子的单链形式在合适的温度和溶液离子强度条件下(参见上文的Sambrook, et al.)能够与另一核酸分子退火时,该核酸分子与另一核酸分子,如cDNA、基因组DNA或RNA是“可杂交的”。温度和离子强度条件决定杂交的“严格性”。在本发明o的一个实施方案中,典型的低严格性杂交条件包括55C, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25% 乳,并且无甲酰胺;或30%甲酰胺, 5X SSC, 0.5% SDS。典型地,中等严格性杂交条件类似于低严格性条件,不同的是杂交是在40% 甲酰胺中, 5X或6X SSC条件下进行的。高严格性杂交条件类似于低严格性条件,不同的是杂交条件是在50%甲酰胺, 5X或6X SSC中进行o o o o o o o
的,任选地,在更高温度下进行(如57C、59C、60C、62C、63C、65C或68C)。通常,SSC是
0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠。杂交需要两个核酸含有互补序列,但是根据杂交的严格性,碱基之间的错配是可能的。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补程度,它们是本领域公知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性的程度越高,核酸可以杂交的严格性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂交体,推导了用于计算解链温度的公式(参见,上文Sambrook, et al., 9.50-9.51)。对于与较短核酸,即寡核苷酸的杂交,错配的位置变得更重要,并且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见上文Sambrook, et al.,
11.7-11.8)。
[0282] 本发明也包括了质粒,其包含编码靶多肽的靶核苷酸序列,当通过BLAST算法进行比较时,所述靶多肽包含的氨基酸序列与本发明的参照核苷酸和氨基酸序列(如SEQ ID NOs: 6-31的任意一个)具有至少约70%的同一性,优选至少约80%的同一性,更优选至少约90%的同一性,最优选至少约95%的同一性(如95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%),其中选择所述算法的参数,以得到在各个参照序列的整个长度上各个序列之间的最大匹配。本发明也包括多肽,当用BLAST算法进行比较时,所述多肽包含的氨基酸序列与本发明的参照氨基酸序列(如SEQ ID NOs: 6-31的任意一个)具有至少约70%的相似性,优选至少约80%的相似性,更优选至少约90%的相似性,最优选至少约95%的相似性(如95%, 96%, 97%,
98%, 99%, 100%),其中选择所述算法的参数,以得到在各个参照序列的整个长度上各个序列之间的最大匹配。
[0283] 序列同一性是指进行比较的两个序列的核苷酸或氨基酸之间的精确匹配。序列相似性是指进行比较的两个多肽的氨基酸之间的精确匹配以及不相同的、生物化学相关的氨基酸之间的匹配。上文讨论了具有相似特性并且可以互换的生物化学相关的氨基酸。
[0284] 以下关于BLAST算法的参考文献在此通过引用并入本文: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol.266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci.
10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol.
36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York。
[0285] 内含子
[0286] 本发明包含多核苷酸,例如,载体(如质粒),其包含启动子(如人巨细胞病毒(CMV)启动子,如人巨细胞病毒的立即-早期启动子-调节区),所述启动子与包含β-珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白剪接受体的βGl-IgG内含子可操作性连接,所述启动子/内含子组合与靶基因,如免疫球蛋白可操作性连接。使用本发明的多核苷酸表达所述靶基因的方法也是本发明的部分。如本文讨论的,发现从人CMV启动子进行的基因(如抗-IGF1R免疫球蛋白)的表达在CMV启动子与βGl-IgG内含子 (β-珠蛋白剪接供体/Ig. 剪接受体)连接时显著增加。
[0287] 例如,在本发明的一个实施方案中,启动子/内含子构建体在与其可操作性连接的靶基因的上游。包括将靶基因与启动子/内含子可操作性连接的用于增加靶基因表达的方法也在本发明的范围内。
[0288] 在本发明的一个实施方案中,包含β-珠蛋白剪接供体和IgG.剪接受体的βGl-IgG内含子包含以下核苷酸序列:
[0289]
[0290] (SEQ ID NO: 3)。β-珠蛋白剪接供体位点加实线下划线,免疫球蛋白剪接受体加虚线下划线。在本发明的一个实施方案中,β-珠蛋白剪接供体位点包含核苷酸序列CAGGTAAGTTTA (SEQ ID NO: 4)。在本发明的一个实施方案中,免疫球蛋白剪接受体位点来自IgG可变区,例如,包含核苷酸序列TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5)。
[0291] 在本发明的一个实施方案中,βGl-IgG内含子包含
[0292]
[0293] (SEQ ID NO: 3的核苷酸39-190)。
[0294] 免疫球蛋白
[0295] 本发明包括实施方案,其包括多核苷酸(如质粒),所述多核苷酸包含与靶基因如免疫球蛋白可操作性缔合的启动子/内含子构建体。在本发明的一个实施方案中,免疫球蛋白包含任选与免疫球蛋白恒定区连接的抗IGF1R免疫球蛋白轻链或重链可变区。
[0296] 在本发明的一个实施方案中,免疫球蛋白链编码任意以下所述的那些;例如,任意以下免疫球蛋白轻链或重链或其任意CDR。虚线下划线字体编码信号肽。实线下划线字体编码CDRs。无格式字体编码构架区。在本发明的一个实施方案中,抗体链是缺乏信号肽的成熟片段。在本发明的一个实施方案中,表达包含信号肽的未加工的免疫球蛋白链,其从宿主细胞分泌,从而加工和除去信号肽,产生成熟的免疫球蛋白链。所述组合物和表达方法形成本发明的部分。
[0297] 编码任意以下靶免疫球蛋白氨基酸序列的多核苷酸形成本发明的部分。
[0298] 19D12/15H12轻链(SEQ ID NO: 6)
[0299]
[0300] 19D12/15H12重链(SEQ ID NO: 7)
[0301]
[0302] 19D12/15H12轻链-C (LCC) (SEQ ID NO: 8)
[0303]
[0304] 19D12/15H12轻链-D (LCD) (SEQ ID NO: 9)
[0305]
[0306] 19D12/15H12轻链-E (LCE) (SEQ ID NO: 10)
[0307]
[0308] 19D12/15H12轻链-F (LCF) (SEQ ID NO: 11)
[0309]
[0310] 19D12/15H12重链-A (HCA) (SEQ ID NO: 12)
[0311]
[0312] 19D12/15H12重链-B (HCB) (SEQ ID NO: 13)
[0313]
[0314] 参见国际申请公开号WO2003/100008,其中公开了每个序列;该申请在此通过全文引用并入本文。
[0315] 2C6重链
[0316]
[0317] 2C6轻链
[0318]
[0319] 9H2重链
[0320]
[0321] 9H2轻链
[0322]
[0323] 重链免疫球蛋白可变区 # 1.0 序列
[0324]
[0325] 轻链免疫球蛋白可变区# 1.0序列
[0326]
[0327] 本发明的实施方案包括那些:其中多核苷酸(如质粒)包含启动子/βGl-IgG内含子构建体,该构建体可操作性连接于一种以上免疫球蛋白,例如,本文所述任意免疫球蛋白的组合(如重链Ig. # 1.0和轻链Ig. #1.0;或LCC 和HCA;或LCF和HCA;或LCC和HCB)。
[0328] 质粒
[0329] 本发明的一部分提供了分离的质粒,其展示抗-IGF1R重链和轻链的高水平表达。这些质粒是pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3。这些质粒编码包括LCF和HCA的抗体并指导所述抗体的表达。质粒的序列如下所示:
[0330]
[0331]
[0332]
[0333]
[0334]
[0335]
[0336]
[0337] 本发明的一部分进一步提供了分离的质粒,其展示抗-IL-23 p19重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAIL23V1-K。pAIL23V1-K质粒的序列如下所示:
[0338]
[0339]
[0340]
[0341]
[0342] 本发明的一部分进一步提供了分离的质粒,其展示抗-IL-23R重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAIL23RV1。pAIL23RV1质粒的序列如下所示:
[0343]
[0344]
[0345]
[0346]
[0347]
[0348] 本发明的一部分进一步提供了分离的质粒,其展示抗- IL-17重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAIL17AV1。pAIL17AV1质粒的序列如下所示:
[0349]
[0350]
[0351]
[0352]
[0353] 本发明的一部分进一步提供了分离的质粒,其展示抗- PD1 (程序化死亡1)重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAPD16V1-GA。pAPD16V1-GA质粒的序列如下所示:
[0354]
[0355]
[0356]
[0357]
[0358]
[0359] 本发明的一部分进一步提供了分离的质粒,其展示抗-HGF(肝细胞生长因子)重链和轻链的高水平表达。一种质粒是pAHGFV1。pAHGFV1质粒的序列如下所示:
[0360]
[0361]
[0362]
[0363]
[0364] 这些质粒的质粒图在本文也提供在图1-10中。
[0365] 表达
[0366] 可以通过本领域已知的数种方法中的任意方法,将包含要表达的靶基因的载体,如质粒(如图1-10)导入宿主细胞中。如果不具有细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞,可以通过Graham and Van der Eb, Virology, 52: 546 (1978)描述的磷酸钙沉淀方法进行转化。但是,也可以使用用于将DNA导入细胞中的其它方法,如通过细胞核注射或通过原生质体融合。用于转化的其它方法包括电穿孔、脂质体转化和DEAE-右旋糖酐转化。
[0367] 如果使用原核细胞(如大肠杆菌如BL21或BD21DE3或HB101或DH1或DH5)或含有实质性细胞壁构造的细胞(如啤酒糖酵母),可以如Cohen, F. N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. ( USA) 69: 2110 (1972)的描述,通过使用氯化钙的钙处理来进行转化。
[0368] 可以选择和筛选包含本发明的载体(如图1-10)的宿主细胞,从而鉴定具有用于表达靶基因所必需的特征的克隆。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,用于实现最大表达的一种常见方法涉及使用突变细胞系和在数月中对于共转染的选择标记如二氢叶酸还原酶 (DHFR)的选择压力的逐渐增加 (Kaufman et al. (1982) J. Mol. Biol. 159: 601–621; Schimke et al. (1982) Natl. Cancer Inst. Monogr. 60: 79–86)。为了实现高生产率,用包含与要表达的靶基因组合的功能性DHFR 基因的表达载体转化二氢叶酸还原酶(DHFR)阴性细胞系(如CHO细胞系)(Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216–4220)。反应于渐增量的DHFR拮抗剂氨甲蝶呤(MTX)在培养基中的加入,发生载体插入的靶基因的扩增,并且产生携带多个拷贝的重组基因的克隆或亚群,并且可以进行选择(Wurm (1990) Biologicals 18:159–164)。基因扩增过程典型地需要数月,直到获得稳定的细胞系,其显示高靶基因拷贝数和所需蛋白的高生产率。
[0369] 在本发明的一个实施方案中,本发明的多核苷酸整合到宿主细胞(如CHO, CHO-K1, CHO-D1 DXB11)DNA中,或是异位的(非整合的)。在本发明的一个实施方案中,本发明的多核苷酸以每个细胞数个拷贝(如2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20个)存在于细胞中。在表达载体已经整合到宿主细胞的基因组DNA中以改进稳定性的情况下,载体DNA的拷贝数,以及,同时,能够表达的产物量,可以通过选择细胞系而增加,所述细胞系中载体序列在整合到宿主细胞的DNA中之后得到扩增。
[0370] 本领域已知的数种细胞培养基中的任意培养基都可以用于增殖表达靶基因的细胞。可以获得一些商业上可获得的培养基。如果表达要在治疗上使用的蛋白,则不含动物产物的培养基(如无血清培养基(SFM))可能是期望的。存在数种本领域已知的方法,通过这些方法可以使得细胞适应于在无血清培养基中生长。例如,直接适应包括仅仅将细胞从补充血清的培养基转换到无血清培养基。序贯适应或戒断(weaning)包括以数个步骤将细胞从补充血清的培养基转换到无血清培养基(如 25% SFM, 50% SFM, 75% SFM, 然后, 90% SFM 进行约3 次传代,然后100% SFM)。序贯适应相对于直接适应倾向于对细胞较不严苛。通常,为了使细胞适应无血清培养基,培养物应该是在对数中期中,> 90%存活,并且以比适应过程中更高的初始细胞接种物进行接种。
[0371] 包含本发明的宿主细胞的细胞系也可以保存在主细胞库 (MCB)和工作细胞库(WCB)中。典型地,当细胞系要在很多个制造周期中使用时,可以建立由主细胞库或主接种库(master seed bank, MSB)和工作细胞库组成的两层细胞库系统。从单宿主细胞克隆建立细胞系,并且该细胞系用于构成MCB。通常,该MCB必须鉴定和广泛测试污染物,如细菌、真菌、病毒和支原体。可以扩增来自MCB的细胞的样品,用于形成WCB,在制造过程中使用之前,鉴定所述WCB的细胞生存力。MCB或WCB中的细胞可以保存在小瓶中,例如,在低温下o o o(如0C或更低, -20C或-80C)保存。
[0372] 典型地,工作细胞库包括来自一个小瓶的主库的细胞,所述细胞在保存前已经生长了数代。通常,当将来需要细胞时,从工作细胞库取出它们;然而,当必要时仅仅使用主细胞库,确保具有低传代数的细胞储存物,从而避免细胞培养物内的遗传性变异。
[0373] 因此,本发明包括制备主细胞库的方法,该方法包括用本发明的质粒转化细胞,如CHO细胞,选择所述转化的细胞的单克隆群体(如在培养板上的单集落生长),培养所述克隆群体(如在液体生长培养基中),确定来自所述培养物的细胞是否含有细菌、病毒、支原体和/或真菌,并且,如果培养物的细胞不含可检测水平的所述物质,在冷冻条件下(如o 7在-80C),例如在一个或多个分开的容器,如小瓶(如每小瓶包含约10 个细胞)中保存从所述培养物取出的细胞。本发明也包括制备工作细胞库的方法,该方法包括选择来自主细胞库的细胞的样品,使细胞生长,并且将细胞保存在一个或多个容器,如小瓶中。也可以测试用于制备工作细胞库以及主细胞库的细胞的细菌、病毒、支原体或真菌。
[0374] 本发明也包括主细胞库和/或工作细胞库,其中包含本发明的任何宿主细胞(如本文所述)或来自其的一个或多个细胞。主细胞库或工作细胞库中的细胞可以在冷冻条件o o o下(如0C或更低, -20C或-80C)保存在数百个(如100, 200, 500, 700, 1000,或2000 个小瓶或更多)容器中。
实施例
[0375] 这些实施例意欲进一步阐明本发明,并不限制本发明。实施例中阐述的任何组合物或方法(全部或部分)都形成本发明的一部分。
[0376] 实施例1: 抗体表达盒中的内含子元件的评价
[0377] 通过PCR合成含有与pDSRG的序列的一部分一起存在于质粒pDSRG中的 β-珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白剪接受体的βGl-IgG内含子:
[0378]
[0379] (SEQ ID NO: 3)
[0380] 含有CAGGTAAGTTTA (SEQ ID NO: 4) 的序列是β-珠蛋白剪接供体,含有TTTCTCTCCACAGGC (SEQ ID NO: 5)的序列是免疫球蛋白受体位点。短斜线表示预测的供体和受体序列之间的剪接位点。
[0381] 内含子插入在人CMV启动子下游,表达盒的5’侧翼区内,预期增强表达。为此,通过PCR延伸βGl-IgG内含子的5’末端,从而包含CMV启动子的部分序列。用EcoRI消化得到的延伸的PCR产物,用Klenow聚合酶补平,用NcoI消化。同时,也用NheI消化轻链表达质粒pUhCMVIGFRLCb2,用Klenow聚合酶补平,用NcoI消化。然后将内含子连接于pUhCMVIGFRLCb2,用于构建pUIGFRLCb2 (SEQ ID NO: 32)。为了将内含子插入重链表达质粒,用SnaBI和AflII消化PCR延伸的、含内含子的片段。同时,通过SnaBI和AflII消化pUhyg(-)IG1FRhuH,插入内含子,用于构建pUIG1FRmodH (SEQ ID NO: 33)。随后,如下构建含重链和轻链表达盒这两者的单个质粒载体:通过RsrII 和PacI消化pUIGFRLCb2,用于转移轻链表达盒。也通过 RsrII和PacI消化pXBLS,将含有LCB2的轻链表达盒插入构建体pAIGFRLCb2 (SEQ ID NO: 34)中。然后通过BssHII消化pUIG1FRmodH,用于释放携带重链和潮霉素-B磷酸转移酶表达盒的片段。也通过BssHII消化pAIGFRLCb2,在该位点插入重链表达盒,用于构建pAIG1FRLCb2V1 (SEQ ID NO: 35)和pAIG1FRLCb2V3 (SEQ ID NO:36)。
[0382] 通过ELISA,评估含有内含子的质粒在瞬时转染中的抗体表达。结果证明,当用在重链和轻链表达盒中都携带该内含子的质粒进行转染时,抗-IGF1R的表达比通过不含内含子的相似质粒进行转染获得的表达高约2-3倍。
[0383] 评估两个单个表达质粒pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3在KIRA (激酶受体激活) 测定中的生物活性。结果表明,这两个单个表达质粒显示与从19D12杂交瘤获得的纯化抗体相同的生物活性。
[0384] 通过PCR进一步修饰一些质粒载体,以便在重链和轻链cDNA序列的5’末端掺入Kozak共有序列(下文以粗体显示)。下文指出的引物中的限制位点是加下划线的,并且起始甲硫氨酸密码子(atg)以粗体和斜体表示。
[0385] 重链的引物对如下所示:
[0386]
[0387] 5’引物具有KpnI (ggtacc) 位点以及Kozak序列,3’引物具有ApaI位点(gggccc)。
[0388] 对于轻链,使用以下引物:
[0389]
[0390] 轻链的5’引物具有EcoRI (gaattc) 和PmeI (gtttaaac)位点以及Kozak序列,3’引物具有BsiWI 位点(cgtacg)。将PmeI位点添加到5’引物,作为PCR产物与质粒的成功连接的指示物。
[0391] 将扩增的重链序列克隆到pUIG1FRmodH/Kan中的KpnI和ApaI位点,用于构建pAIG1FRH-K (SEQ ID NO: 41),将轻链序列克隆到pAIGFRLCb2中的EcoRI和BsiWI位点,用于构建pAIGFRLCb2(-)L-K (SEQ ID NO: 42)。
[0392] 然后通过BssHII消化pAIG1FRH-K,用于将重链表达盒连同潮霉素-B抗性基因表达盒一起转移到pAIGFRLCb2(-)L-K。也通过BssHII消化 pAIGFRLCb2(-)L-K,将重链表达盒插入相同位点,用于构建pAIG1FRLCb2V1-K (SEQ ID NO: 43)。
[0393] 用含有和不含有内含子的表达质粒转染DXB11细胞。βGl-IgG内含子的存在带来了DXB11细胞中抗-IGF1R表达的约2-3倍增加。pAIG1FRV1和pAIG1FRV3是不含内含子的、携带抗-IGF1R的重链和轻链表达盒的质粒。pAIG1FRLCB2V1和pAIGFRLCB2V3是携带抗-IGF1R的重链和轻链表达盒以及内含子的质粒。通过ELISA分析来自转染后3天和5天的上清液。来自ELISA分析的数据在下文列于表1。
[0394] ELISA程序
[0395] 试剂-
[0396] ·抗-IGF1R 20.24 mg/mL浓缩物
[0397] ·人IgG-包被的平板
[0398] ·HRP-缀合的山羊抗-人IgG
[0399] ·ELISA稀释液- 0.1% BSA (血清白蛋白) / PBST (磷酸缓冲盐水和Tween20
[0400] ·TMB液体底物系统: 来自Pierce的1步涡轮(turbo)系统
[0401] ·终止试剂(约2M H2SO4)
[0402] 程序-
[0403] A. 标准曲线的制备
[0404] 在ELISA稀释液中将纯化的抗-IGF1R稀释到200 ng/mL。
[0405] 20,240,000 ng/mL ÷ 200 ng/mL = 1:101200稀释
[0406] 加入10μL人IgG1标准物到990 μL ELISA 稀释液(I)。
[0407] 通过加入49.4μL的(I)到49950.6 μL ELISA稀释液中稀释到200ng/mL。
[0408] 制备200 ng/mL标准物的4mL等分物,在4oC下保存。在测定日,通过将200μL标准物加样到A行并且从顶部标准物到底部进行1:2系列稀释 (3.125 ng/mL),制备标准曲线的其余部分。用ELISA稀释液作为空白或0 ng/mL标准。
[0409] B. 对照的制备
[0410] 以300 ng/mL制备对照。
[0411] 加入74.1 μL的(I)(参见标准曲线的制备)到49925.9 μL的ELISA稀释液中。o
制备 2.5 mL等分物,在4C下保存。
[0412] C. 测定
[0413] 在使用前,使所有试剂加温到室温。
[0414] 1.设定标准曲线和未知值的模板表示位置。
[0415] 2.用EIA洗涤缓冲液洗涤平板1次。
[0416] 3.根据模板,在合适的孔中添加标准物、对照和样品。
[0417] 每个孔中的最终体积是100 μL。
[0418] 覆盖平板,在室温下温育1小时。
[0419] 4.在ELISA稀释液中以1:10,000稀释HRP-缀合的抗-huIgG。
[0420] 通过在990μL 0.1% BSA-PBST中加入10 μL 抗-huIgG储备液,进行最初的1:100稀释,然后通过在34650 μL 0.1% BSA-PBST中加入350μL最初的稀释液,进行另外的1:100稀释。该溶液的最终稀释度是1:10000。
[0421] 5.吸出孔中的液体。用EIA洗涤缓冲液洗涤孔4次。
[0422] 6.在所有孔中添加100 µL HRP缀合物。覆盖平板,在室温下温育30分钟。
[0423] 7.如步骤5那样洗涤孔。
[0424] 8.通过在每个孔中加入100 µL TMB底物,在孔中进行显色。
[0425] 9.根据孔中蓝色的量,以与步骤8中分配的相同顺序在所有孔中加入50 µL终止试剂。这需要大约2-4分钟。对平板显色2分钟。
[0426] 10. 在添加终止试剂的30分钟内,用微量滴定板读数器对每个孔的吸光度进行读数,设定波长为450-650 nm。
[0427] D. 数据分析-
[0428] 用4参数对数曲线拟合分析数据。
[0429] 激酶受体激活(KIRA)测定程序
[0430] 1) 在不含牛胰岛素的培养基中以200,000个细胞/孔(2.0x106个细胞/mL - 0.1 mL)制备MCF-7细胞。将细胞接种在96孔组织培养板(Falcon # 35-3075)中。每个样品o制备双份孔。在CO2培养箱(5-6% CO2, 35-37C)中孵育平板过夜。
[0431] 2) 用100µL/孔的抗-IGF1R捕获抗体(可商购的IgG1特异性抗体)包被ELISA板(NUNC MAXI-SORP)。将纯化的、杂交瘤来源的19D12制备到1.0 µg/mL。测试每个批次o备用。在4C下孵育ELISA板过夜。
[0432] 3) 从培养箱取出组织培养板。从除了未处理的(EMEM)对照孔的所有孔中取出培养基。采用12通道的多通道移液管,一次取出一行培养基,以防止加样前孔干燥。
[0433] 4) 为了得到96孔稀释板中的稀释曲线,在第1-10和12列添加100 µl/mL EMEM。添加200 µL/孔5.0 µg/mL的对照Ab到第11列的合适孔中。添加200 µl/孔的样品到第
11列的合适孔中。使用系列稀释容器,将100µl (1:2)从第11列转移到第1列(第12列是未处理的细胞对照)。从细胞板的孔取出培养基。将50 µl/孔从稀释板转移到细胞板的对o
应孔中。在CO2培养箱(5-6% CO2, 35-37C)中孵育30分钟。
[0434] 5) 在EMEM (无FBS)中制备75 ng/mL的IGF-I (R&D Systems; Minneapolis, MN)。从培养箱取出组织培养板。从所有孔取出内容物(每次一个平板)。在样品孔以及IGF-I 对照孔中加入100µL孔的IGF-I。在第12列加入100 µl/孔的EMEM。
[0435] 6)在孵育细胞板同时,封闭以前包被的ELISA板。弃去捕获抗体(倒入容器是可接受的),并且用纸巾吸干。加入150 µL/孔封闭缓冲液(参见试剂页)。室温下在平板振荡器上将平板轻柔振荡1小时。
[0436] 7) 在细胞板的IGF-I孵育后,取出组织培养板的所有孔的内容物(所有孔都可以取出/96孔板)。加入100 µL/孔的裂解缓冲液。室温下在平板振荡器上将平板振荡1小时。
[0437] 8) 在ELISA板的封闭缓冲液孵育后,弃去封闭缓冲液(倒出,吸干)。用150 µL/孔的洗涤缓冲液(参见试剂页)洗涤平板6次。每次洗涤后倒出并吸干。
[0438] 9) 在细胞板的裂解缓冲液孵育后,将85 µL从细胞板的孔转移到ELISA板的对应孔中。用12通道的多通道移液管,一次转移一整行。在转移前,上下往复轻柔吸取转移体积,从而打碎一些剩余的细胞团。吸取裂解物的时候避免产生气泡。室温下在平板振荡器上将平板振荡2小时。
[0439] 10) 在稀释缓冲液(参见试剂页)中制备0.2 µg/mL生物素化的抗-磷酸酪氨酸检测Ab - 4G10 (Upstate USA; Lake Placid, NY)。裂解物的孵育后,弃去裂解物(倒出,吸干)。用100 µL/孔的洗涤缓冲液,洗涤ELISA板四次。每次洗涤后倒出并吸干。
[0440] 11) 在ELISA板中加入100 µL/孔的4G10 Ab (抗-磷酸酪氨酸抗体)。室温下在平板振荡器上将平板轻柔振荡2小时。
[0441] 12) 在稀释缓冲液中制备0.025 µg/mL的HRP缀合的链霉亲和素(Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.; Gaithersburg, MD) 。移入室温下。4G10 (抗-磷酸酪氨酸抗体)孵育后,弃去检测抗体(倒出,吸干)。用100 µL/孔的洗涤缓冲液洗涤ELISA 板4次。每次洗涤后倒出并吸干。
[0442] 13) 加入100 µL/孔HRP缀合的链霉亲和素。 室温下在平板振荡器上将平板轻柔振荡30分钟。
[0443] 14) 以组分A与组分B的1:1混合物制备TMB底物(2组分系统,R&D Systems) 。移入室温下。在ELISA板中进行链霉亲和素孵育后,弃去链霉亲和素(倒出,吸干)。用100 µL/孔的洗涤缓冲液洗涤ELISA 板4次。每次洗涤后倒出并吸干。
[0444] 15)在ELISA板中加入100µL/孔的TMB底物。室温下在平板振荡器上将平板振荡15分钟。
[0445] 16) TMB孵育后,加入50 µL/孔的1N H2SO4 终止试剂。在平板读数器上以450 nm/570 nm对平板读数。在添加终止试剂的20分钟内对平板读数。
[0446] 表1. 从各个质粒的抗-IGF1R表达水平
[0447]
[0448] 这些数据证明与缺乏βGl-IgG内含子的相关质粒pAIG1FRV1和pAIG1FRV3相比,与含βGl-IgG的质粒pAIG1FRLCB2V1和pAIG1FRLCB2V3相关的优越表达水平。当Kozak共有序列与质粒pAIG1FRLCB2V1的免疫球蛋白基因可操作性缔合以产生pAIG1FRLCB2-V1K时,甚至更高的表达水平是可能的。
[0449] 通过KIRA测定,分析来自19D12亲本杂交瘤和来自质粒pAIG1FRLCB2V1和pAIG1FRLCB2V3的19D12抗体的生物活性。这些数据在下文示于表2。
[0450] 表2. 来自19D12杂交瘤和来自含有质粒pAIG1FRLCB2V1和pAIG1FRLCB2V3的CHO-DXB11细胞的抗-IGF1R抗体的评估
[0451]
[0452] “nM Ab” 表示每个测定中使用的抗体的浓度(纳摩尔)。19D12对应于用19D12抗体产生的信号。pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3 对应于用从这两个质粒表达和纯化的抗体(轻链F/重链A)产生的数据。
[0453] 这些数据证明,pAIG1FRLCb2V1和pAIG1FRLCb2V3质粒产生生物活性的抗-IGF1R抗体。
[0454] 本发明的范围不限于本文描述的具体实施方案。实际上,本发明的范围包括本文具体阐述的实施方案和本文没有具体阐述的其它实施方案;本文具体阐述的实施方案并不一定是穷举的。除了本文描述的实施方案,本发明的各种变化也是本领域技术人员从前述说明书中可以显而易见的。所述变化意欲落入权利要求的范围。
[0455] 在本申请通篇引用了专利、专利申请、公开文献、产品说明书和方案,为了所有目的,其公开内容通过全文引用并入本文。
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