一直以来，作为基因的分析方法，众所周知例如分析cDNA文库等的方 法。cDNA文库是通过从生物细胞提炼出mRNA，并由该mRNA合成cDNA 来制作的。此时，从细胞提炼的mRNA通常是极微量的。当从生体内存在的 许多种细胞提炼mRNA时，如果用于mRNA提炼的细胞数多，就能获得合 成cDNA文库所必需的足量mRNA。但是，由生体内只存在极少的细胞(例 如干细胞或生殖细胞等)提炼mRNA等情况下，会对可用于合成cDNA文库 的mRNA量产生很大的限制。在这种情况下，为了合成cDNA，需要扩增提 炼的mRNA。于是，以往开发了对极微量的mRNA进行扩增的方法。
作为上述那样的mRNA的扩增方法，一般有采用PCR来扩增mRNA的 方法。mRNA的具体扩增方法如下。首先，由细胞提炼mRNA。其次，通过 逆转印反应来调制cDNA。接着，以该cDNA为模板，通过DNA聚合酶来调 制双链(double-stranded)DNA。然后，利用PCR来扩增该双链DNA。最 后，使RNA聚合酶作用于扩增后的双链DNA，调制mRNA，获得扩增的mRNA (例如，参照专利文献1)。
专利文献1：日本特开2002-238575号公报(2002年8月27日公开)
但是，如上述专利文献1所记载的利用PCR来扩增mRNA的方法，存 在不能以相同的效率扩增短的mRNA和长的mRNA的问题。
具体说明则如下。PCR具有可有效率地扩增较短的碱基序列但不能有效 率地扩增较长的碱基序列的特性。因此，如专利文献1那样利用PCR来扩增 作为mRNA模板的扩增用双链DNA的方法，可有效率地扩增具有较短碱基 序列的扩增用双链DNA，但无法有效率地扩增具有较长碱基序列的扩增用双 链DNA。即，在合成mRNA时作为模板的扩增用双链DNA的扩增量因扩增 用双链DNA碱基序列的长度而异。因此，在以利用上述PCR来扩增的用双 链DNA为模板扩增mRNA的场合，可有效率地扩增较短的mRNA，但存在 不能以相同的效率扩增较长的mRNA的问题。该缺点在想要制作多样性高的 cDNA文库时会成为很大的问题。即，上述传统的方法存在这样的问题，即 在作为cDNA文库最为重要的mRNA(cDNA)的量分布在得到扩增后，会 广泛崩解的问题。
故，强烈要求开发不受碱基序列长度的影响，不管短的mRNA还是长的 mRNA都可同样有效率地扩增的微量mRNA的扩增方法。

本发明鉴于上述传统技术的问题构思而成，其目的在于提供不受碱基序 列长度的影响而不论是短的mRNA还是长的mRNA都可同样有效率地扩增 的微量mRNA的扩增方法及其应用方法。
为了解决上述问题，本发明人认真进行研究的结果，发现当扩增对象的 mRNA在反应液中仅存在极微量的场合，向反应液添加虚拟RNA(dummy RNA)并合成扩增用双链DNA，从而能够将扩增用双链DNA量增加至RNA 聚合酶的最宜基质浓度(毫摩(mM)左右)，能够显著提升至今为止因基质 浓度低而反应速度极慢的RNA合成反应速度，并可有效率地扩增mRNA。 又，依据该技术，证实了由于不需要经过利用PCR来扩增双链DNA的工序， 可不受其碱基序列长度影响而有效率地扩增mRNA，并完成了本发明。本发 明基于该新颖的知识而完成，并包含以下的发明。
即，为了解决上述问题，本发明的微量mRNA的扩增方法的特征在于包 含：在包含微量mRNA的溶液中添加虚拟RNA来制作混合溶液的第一工序； 根据使用混合溶液作为模板的逆转印反应，合成反义(anti-sense)DNA的 第二工序；对于合成后的反义DNA合成互补的正义DNA，形成由正义DNA 和反义DNA组成的双链DNA的第三工序；在所形成的双链正义DNA的正 义DNA的5’末端侧连接RNA聚合酶的启动子(promoter)序列制作扩增用 双链DNA的第四工序；以及通过RNA聚合酶，由扩增用双链DNA扩增RNA 的第五工序。
依据上述构成，能够通过向微量mRNA添加虚拟RNA来增加混合溶液 中的RNA量。其结果，与混合溶液中的RNA只是微量mRNA的场合相比， 所制作出的扩增用双链DNA的量增加，此时，扩增用双链DNA的量调制为 RNA聚合酶的最宜基质浓度。其结果，能够进行基于RNA聚合酶的转印反 应，因此不受碱基序列长度影响，不管是短的mRNA还是长的mRNA都可 同样有效率地扩增。
即，依据本发明的微量mRNA的扩增方法，能够通过利用虚拟RNA增 加起始RNA浓度来解决因起始RNA的量少而双链DNA量变少，从而难以 进行转印反应的问题。本发明的特征在于此。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述第四工序最好包含在 第三工序中形成的双链DNA的两末端侧连接启动子序列，再仅切断连接在双 链DNA的正义DNA的3’末端侧的启动子序列的第六工序。
依据上述构成，可以只将微量mRNA及虚拟RNA的正义链选择性转印， 结果能够只扩增正义链。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述第四工序最好在双链 DNA的正义DNA的3’末端侧形成限制酵素位点，以便能够在第三工序中 形成的双链DNA的两末端侧连接了启动子序列时，只切断连接在双链DNA 的正义DNA的3’末端侧的启动子序列。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述第四工序最好包含除 去切断的启动子序列及虚拟RNA的第七工序。
依据上述构成，在根据RNA聚合酶扩增RNA时，RNA聚合酶不会结合 到切断的启动子序列上，而可以仅由连接在上述双链DNA的正义DNA的5’ 末端侧的启动子序列转印RNA。因而，可以有效率地转印正义链的微量 mRNA和虚拟RNA。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述虚拟RNA的序列最 好包含聚腺苷酸(poly A)。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述虚拟RNA的序列最 好是由序列号4、序列号6或序列号16所示的碱基序列。
依据上述构成，微量mRNA和虚拟RNA都具有聚腺苷酸序列。因而， 在逆转印微量mRNA和虚拟RNA时，可以采用包含寡聚核苷酸(oligo)dT 序列的相同引物(primer)来同时逆转印。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述虚拟RNA最好被生 物素化(biotin)。
依据上述构成，被生物素化的虚拟RNA可特异性结合到链酶亲合素 (strepto avidin)。因而，通过使用链酶亲合素柱(column)等，可从反应溶 液特异性仅除去虚拟RNA。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述RNA聚合酶优选T7 聚合酶、T3聚合酶或SP6聚合酶。
依据上述构成，可有效率地转印微量mRNA和虚拟RNA。
此外，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，上述混合溶液中的虚拟 RNA的浓度优选0.5～10μg/μL。
依据上述构成，可制作出适合RNA聚合酶反应的浓度的扩增用双链 DNA。其结果，能够扩增本来因转印反应速度慢而不能扩增的微量mRNA。
为了解决上述问题，本发明的cDNA文库的制作方法的特征在于其中一 个工序包含上述微量mRNA的扩增方法。
依据上述构成，即便起始mRNA量为微量也可有效率地扩增mRNA。故， 可从微量mRNA制作cDNA文库。
为了解决上述问题，本发明的探针制作方法的特征在于其中一个工序包 含上述微量mRNA的扩增方法。
依据上述构成，即便起始mRNA量为微量也可有效率地扩增mRNA。故， 可从微量mRNA制作探针。
为了解决上述问题，本发明的阶段性减影方法的特征在于其中一个工序 包含上述微量mRNA的扩增方法。
依据上述构成，即便起始mRNA量为微量也可有效率地扩增mRNA。故， 可从微量mRNA实施阶段性减影方法。
本发明其它的目的、特征及优点，以下借助附图理解的关于本发明的详 细说明将给出清晰阐述。

图1(a)是本发明特征的示意图。
图1(b)是本发明特征的示意图。
图2表示本发明的实施方式，是表示本发明的微量mRNA的扩增方法的 各工序的流程图。
图3表示本发明的实施方式，是虚拟RNA制作方法的示意图。
图4表示本发明的实施方式，是表示本发明的cDNA文库的制作方法的 各步骤的流程图。
图5是在实施例中制作的用于制作虚拟RNA的载体(vector)的模式图。
图6(a)是表示探讨实施例中虚拟RNA的最佳量的结果的电泳图。
图6(b)是表示探讨实施例中虚拟RNA的最佳量的结果的图表。
图7(a)是表示实施例中可扩增的微量mRNA的量的电泳图。
图7(b)是表示实施例中可扩增的微量mRNA的量的电泳图。
图7(c)是表示实施例中可扩增的微量mRNA的量的电泳图。
图8是表示实施例中cDNA文库的片段(insert)长度分布的图表。
图9(a)是表示扩增的mRNA的尺寸分布的图表。
图9(b)是表示扩增的mRNA的尺寸分布的图表。
图10(a)是表示扩增的mRNA的尺寸分布之比较结果的图表。
图10(b)是表示扩增的mRNA的尺寸分布之比较结果的图表。
图11是表示实施例中针对一种RNA的扩增效果的电泳图。
图12是表示实施例中采用具有不同碱基序列的虚拟RNA时的mRNA的 扩增效果的电泳图。
图13是表示实施例中荧光色素交换实验结果的图表。
图14是表示实施例中cDNA文库的制作工序的流程图。

以下，根据图1(a)、图1(b)、2及5，就本发明的一个实施方式进 行说明。首先，对于本发明的基本原理，一边与传统技术做比较一边进行说 明。
如上所述，作为传统的扩增RNA的方法，有对利用扩增用双链DNA和 RNA聚合酶的RNA进行扩增的方法，其中扩增用双链DNA上连接了RNA 聚合酶的启动子序列。但是，在上述方法存在如果扩增用双链DNA的量多就 能扩增RNA，但如果扩增用双链DNA的量少就不能扩增RNA的问题。
可由米式方程式(Michaelis Menten equation)容易理解这种扩增用双链 DNA的量少时不能扩增RNA的理由。即，众所周知用于cDNA文库制作的 RNA聚合酶等酵素的最宜基质浓度为毫摩(mM)程度。上述最宜基质浓度 (米氏(Michaelis)常数：Km值)由米式方程式(参照式(1))获得。还 有，在式(1)中，Km＝(K2+K3)/K1，Vmax表示最大反应速度，[S]表示 基质浓度。
V＝Vmax[S]/(Km+[S])......(1)
当[S]＝Km时，V＝Vmax/2。此时，Vmax为全部酵素形成与基质的复合体 时的反应速度。由上述式(1)可了解到[S]极少时，酵素反应几乎不进行。 还有，上述式(1)中的[S]相当于扩增用双链DNA的浓度，利用上述式(1) 算出反应速度的酵素相当于RNA聚合酶。
因此，在专利文献1那样的传统方法中，通过利用PCR对扩增用双链 DNA进行扩增，然后使RNA聚合酶作用于该扩增用双链DNA而扩增微量 mRNA，来解决上述问题。
但是，利用上述PCR的方法中不能对短的mRNA和长的mRNA都同样 有效率地扩增。对此参考图1(a)进行具体说明。图1(a)是例示了模板采 用具有3种长度的扩增用双链DNA，并使聚合酶作用于该扩增用双链DNA 的PCR。在这种PCR中，规定时间内最长的模板会扩增1次，次长的模板会 扩增3次，最短的模板会扩增6次。其结果，通过上述PCR来扩增的扩增用 双链DNA中短的双链DNA多且长的双链DNA少。使RNA聚合酶作用于这 种因序列长度而以不同量扩增的扩增用双链DNA调制出mRNA，结果存在 所得到的mRNA也是短的mRNA多且长的mRNA少的缺点。
另一方面，在本发明中，在调制扩增用双链DNA时，预先混合虚拟RNA 和扩增对象的mRNA。其结果，具有即使扩增对象的mRNA少的情况下也会 增加逆转印酵素的反应速度，可有效地合成扩增用双链DNA的特征。更具体 地说，在本发明的微量mRNA的扩增方法中，首先，向微量mRNA加入虚 拟RNA，从而增加全部RNA的量，显著提高基质浓度(米氏常数：Km值)。 由于利用该基质RNA制作扩增用双链DNA，其结果制作的扩增用双链DNA 的量可调制为RNA聚合酶的最宜基质浓度。其结果，即使mRNA的量少的 情况下可进行本来没有进行的转印反应。
此外，本发明的微量mRNA的扩增方法的由RNA聚合酶扩增mRNA的 前阶段不需要使用PCR。因此，不依赖碱基序列的长度，而能够将短的mRNA 和长的mRNA同样有效率地扩增。关于这一点借助图1(b)进行说明。在图 1(b)中示出利用RNA聚合酶来扩增RNA的工序。该图中，模板采用具有 3种长度的扩增用双链DNA，并使RNA聚合酶作用于该扩增用双链DNA， 来扩增RNA。此时，在规定时间内，最长的模板会扩增6次，次长的模板会 扩增6次，最短的模板也扩增6次。即，在本发明的mRNA的扩增方法中， 规定时间内扩增的次数不依赖扩增用双链DNA的长度。故，可将短的mRNA 和长的mRNA同样有效率地扩增。
如上所述，本发明的微量mRNA的扩增方法是根据与传统mRNA的扩 增方法完全不同的原理，在不受碱基序列长度影响的情况下，而可将短的 mRNA和长的mRNA同样有效率地扩增的划时代的方法。以下，就本发明的 微量mRNA的扩增方法的各工序进行详细说明。
[微量mRNA的扩增方法]
本发明的微量mRNA的扩增方法包括以下工序即可，即包括：向包含微 量mRNA的溶液添加虚拟RNA制作混合溶液的第一工序；根据使用混合溶 液作为模板的逆转印反应，合成反义DNA的第二工序；对合成后反义DNA 合成互补的正义DNA，形成由正义DNA和反义DNA组成的双链DNA的第 三工序；在所形成的双链DNA的正义DN的5’末端侧连接RNA聚合酶的 启动子序列制作扩增用双链DNA的第四工序；以及通过RNA聚合酶，由扩 增用双链DNA扩增RNA的第五工序。对于其它的材料、工序、条件、使用 器具等具体构成没有特别限定。以下对各工序进行详细说明。
<第一工序>
上述第一工序是向包含微量mRNA的溶液添加虚拟RNA制作混合溶液 的工序。
在本说明书中“微量mRNA”的“微量”指的是由该mRNA合成扩增用 双链DNA的场合，后段的第五工序中，以上述扩增用双链DNA为模板进行 基于RNA聚合酶的转印反应时导致转印反应速度极慢程度的mRNA的量。 此外，可由本说明书容易理解到即使进行mRNA的量较多的基于RNA聚合 酶的转印反应的情况下，能够通过使用虚拟RNA来进一步增加转印反应速 度。
此外，在本说明书中“虚拟RNA”指的是通过加入到想要扩增的RNA， 至少在逆转印反应时以及后段的连接酶(ligase)反应时，可增加成为逆转印 酵素的基质的RNA量及成为连接酶的基质的RNA量的RNA。
上述mRNA可为从动物、植物或微生物等的细胞或组织等提炼的mRNA， 或者，可为合成的mRNA，并没有特别限定。此外，微量mRNA的提炼方法 也没有特别限定，可采用合适、公知的方法进行提炼。
虚拟RNA的序列没有特别限定，但最好包含聚腺苷酸序列。能够通过使 虚拟RNA具有聚腺苷酸序列，使用相同引物逆转印mRNA和虚拟RNA。例 如，上述引物可列举出聚核苷酸dT引物。
此外，上述聚腺苷酸序列的长度为可使聚核苷酸dT引物特异性退火 (annealing)而逆转印的长度即可，没有特别限定。例如，上述聚腺苷酸序 列可至少由18个腺苷酸(adenylic acid)组成。
更具体地说，虚拟RNA的序列优选序列号4、序列号6或序列号16所 示的碱基序列。如上所述，能够通过使虚拟RNA具有聚腺苷酸序列，利用包 含聚核苷酸dT序列的相同的引物同时逆转印微量mRNA和虚拟RNA。
虚拟RNA的制作方法没有特别限定，可采用合适且公知的方法。例如， 虚拟RNA可由结合了包含虚拟RNA的序列的双链DNA的载体体现虚拟 RNA来制作。利用载体制作虚拟RNA的方法构筑一次载体就无论几次都可 制作虚拟RNA，因此具有可低价大量制作虚拟RNA的优点。具体地说，在 合成对虚拟RNA的碱基序列进行编码的正义链DNA和反义链DNA之后， 进行退火而形成双链DNA。然后，将该双链DNA结合到体现载体等，可通 过公知的RNA聚合酶来转印并制作。还有，上述体现载体并没有特别限定， 只要具有RNA聚合酶的启动子序列即可，以便可从结合的双链DNA转印 RNA。
此外，虚拟RNA也可通过公知的方法来合成并制作。通过合成来制作虚 拟RNA的方法与利用载体制作的方法相比，成本高，但具有可对虚拟RNA 进行生物素化等各式各样的化学修饰的优点。例如，将虚拟RNA生物素化时， 该虚拟RNA可特异性结合到链酶亲合素。即，通过生物素/链酶亲合素法， 可从反应混合液等中只特异性除去上述虚拟RNA。
此外，虚拟RNA最好被生物素化。由于虚拟RNA被生物素化，例如可 从反应混合液中只特异性除去虚拟RNA。例如，在将虚拟RNA生物素化后， 能够通过生物素/链酶亲合素法来只特异性除去虚拟RNA。将虚拟RNA生物 素化的方法并没有特别限定，可采用合适且公知的方法。
上述混合溶液中的虚拟RNA的浓度优选0.5～10μg/μL。此外，上述混合 溶液中的虚拟RNA的浓度更优选0.5～2.5μg/μL，若为1μg/μL则将更好。还 有，这些优选的浓度范围是在后述实施例中发明人重点研究后独自确定的浓 度范围。由于虚拟RNA的浓度为上述浓度，可将混合溶液中的全部RNA量 调制为毫摩(mM)程度。其结果，从混合溶液制作的扩增用双链DNA的浓 度也成为毫摩(mM)程度。由于RNA聚合酶的最宜基质浓度为毫摩(mM) 程度，其结果，能够有效率地进行本来因扩增用双链DNA的量少而难以进行 的转印反应。
包含上述微量mRNA和虚拟RNA的混合溶液的溶媒，只要不阻碍后段 的逆转印反应即可，没有特别限定。例如可适当采用用于水或Tris-HCl等 缓冲液的适合的材料。
<第二工序>
第二工序是根据使用混合溶液作为模板的逆转印反应，合成反义DNA的 工序。
在图2的步骤1中模式地示出本工序。在本工序中，如图2的步骤1所 示，根据使用混合溶液中的微量mRNA和虚拟RNA作为模板的逆转印反应， 合成上述微量mRNA及上述虚拟RNA的反义DNA。在本工序中所使用的逆 转印酵素没有特别限定，只要适当使用公知的逆转印酵素即可。
此外，引物只要能对微量mRNA和虚拟RNA进行退火即可，没有特别 限定，但微量mRNA和虚拟RNA都有聚腺苷酸序列的场合，最好采用聚核 苷酸dT引物。通过聚核苷酸dT引物，可同时对双方的RNA进行逆转印， 其结果，能够减少复杂操作或经费。
<第三工序>
第三工序是对第二工序中合成的反义DNA合成互补的正义DNA，形成 由正义DNA和反义DNA组成的双链DNA的工序。
在图2的步骤2中模式地示出本工序。本工序中，如图2的步骤2所示， DNA聚合酶只要可以对反义DNA合成互补的正义DNA即可，可适当采用 公知的DNA聚合酶。
此外，第三工序最好包括这样的步骤，即，作为DNA聚合酶合成正义 DNA的前阶段，通过RNase，将上述第二工序中合成反义DNA时作为模板 使用的微量mRNA和虚拟RNA分解的步骤。上述RNase只要能分解微量 mRNA和虚拟RNA即可，没有特别限定。例如，上述RNase可采用RNase II。
<第四工序>
第四工序是在由第三工序中形成的双链DNA的正义DNA的5’末端侧 连接RNA聚合酶的启动子序列而制作扩增用双链DNA的工序。
上述第四工序只要是其结果为仅在第三工序中形成的双链DNA的正义 DNA的5’末端侧连接RNA聚合酶的启动子序列的工序即可，其方法没有 特别限定。
例如，上述第四工序最好包括在第三工序中形成的双链DNA的两末端连 接包含RNA聚合酶的启动子序列的扩增适配器(asapter)之后仅切断连接在 双链DNA的正义DNA的3’末端侧的扩增适配器的第六工序。仅切断连接 在双链DNA的正义DNA的3’末端侧的扩增适配器的方法，没有特别限定， 但最好使用限制酵素进行切断。在利用限制酵素进行切断的场合，最好在双 链DNA的正义DNA的3’末端侧形成限制酵素位点，以便在第三工序中形 成的双链DNA的两末端连接了启动子序列时，能够只切断连接在双链DNA 的正义DNA的3’末端侧的启动子序列。此时上述限制酵素只要不在双链 DNA的正义DNA的5’末端侧即可，没有特别限定。此外，上述限制酵素 位点最好结合到聚核苷酸dT引物内。
在图2的步骤3中模式地示出本工序。在步骤3中，首先，在步骤2中 形成的双链DNA的两末端侧连接包含RNA聚合酶的启动子序列的扩增适配 器。此时，仅在上述双链DNA的正义DNA的3’末端侧连接了扩增适配器 时，制作聚核苷酸dT引物，以便在该3’末端侧形成NotI位点。因而，如果 由NotI处理连接扩增适配器后的双链DNA，就能只切断连接在上述双链DNA 的正义DNA的3’末端侧的扩增适配器。此外，也可只切断连接在上述双链 DNA的5’末端侧的扩增适配器。如此，通过切断连接的一方扩增适配器， 可有选择地只扩增正义RNA或反义RNA。
此外，上述第四工序最好包含除去切断的扩增适配器及虚拟RNA的第七 工序。在第七工序中，通过除去切断的扩增适配器及虚拟RNA，不会在后段 的第五工序中通过RNA聚合酶扩增RNA时出现切断的扩增适配器及虚拟 RNA上结合RNA聚合酶的情况，可使RNA聚合酶只与连接在上述双链DNA 的正义DNA的5’末端侧的扩增适配器结合。因而，不仅可有效率地转印微 量mRNA和虚拟RNA，可减少容易在微量mRNA的扩增工序中发生的各式 各样的干扰(noise)。
上述第七工序只要能除去切断的扩增适配器及虚拟RNA即可，没有特别 限定。例如，上述第七工序可采用使用凝胶(gel)过滤柱的尺寸分度法。此 外，上述凝胶过滤柱没有特别限定，根据所要分度的尺寸采用适当公知的柱 即可。若采用使用上述凝胶过滤柱的尺寸分度法，可同时除去切断的扩增适 配器及虚拟RNA这双方。此外，在虚拟RNA被生物素化的情况下，上述第 七工序可包括基于生物素/链酶亲合素法等的虚拟RNA除去工序。众所周知 生物素对链酶亲合素特异性结合。因而，如果使反应溶液通过链酶亲合素柱 等，就可特异性地除去被生物素化的虚拟RNA。
在上述扩增适配器中包含RNA聚合酶的启动子序列。上述启动子序列只 要是结合RNA聚合酶，并能转印位于该启动子序列下游的碱基序列即可，没 有特别限定。例如上述启动子序列可列举出包含T7启动子序列、T3启动子 序列或SP6启动子序列的碱基序列，但并不限定于此。若例示上述各启动子 序列的具体碱基序列，则可如下：
T7启动子序列：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’(序列 号1)；
T3启动子序列：5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’(序列号2)；
SP6启动子序列：5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3’(序列 号3)。
将上述启动子序列连接于双链DNA的场合，优选使包含上述启动子序列 的序列和该序列的互补链DNA退火而形成扩增适配器后，使该扩增适配器连 接于双链DNA。还有，上述启动子序列和该启动子序列的互补DNA链的制 作方法没有特别限定，可采用公知的方法合成。
此外，将上述扩增适配器连接于双链DNA的场合，最好采用DNA连接 酶来连接。上述DNA连接酶只要能够将扩增适配器连接于双链DNA即可， 没有特别限定。
<第五工序>
第五工序是通过RNA聚合酶，由扩增用双链DNA扩增RNA的工序。
如图2的步骤4所示，第五工序是利用上述第四工序中形成的扩增用双 链DNA和RNA聚合酶扩增微量mRNA和虚拟RNA的工序。上述RNA聚 合酶只要是与在扩增用双链DNA连接的扩增适配器中的启动子序列结合，并 能够由位于该启动子序列下游的DNA转印RNA即可，就没有特别限定。例 如上述RNA聚合酶最好是T7聚合酶、T3聚合酶或SP6聚合酶。还有，上述 启动子序列最好采用可通过各RNA聚合酶受转印控制的启动子序列。
[cDNA文库的制作方法]
本发明的DNA文库的制作方法只要一个工序包含本发明的微量mRNA 的扩增方法即可，对于其它的材料、工序、条件、使用器具等的具体构成没 有特别限定。
具体地说，本发明的cDNA文库的制作方法最好包括这样的工序，即由 本发明的微量mRNA的扩增方法获得的扩增的mRNA制作双链DNA，然后， 将该双链DNA导入到载体的工序。其作成方法也没有特别限定，可适当采用 公知的方法制作(例如参照“生物人工系列(バイオマニユアルシリ—ズ)2 基因文库的作成法”，(野岛博编)羊土社，1994或“基础生化学实验 法”(大岛泰郎编)第四卷、核酸/基因实验II、东京化学同人，2000)。
在图4中模式地示出本发明的一例cDNA文库的制作方法。还有，本发 明显然不限于以下说明。
图5的步骤1是根据使用本发明的微量mRNA的扩增方法的第五工序中 扩增的mRNA作为模板的逆转印反应，合成反义DNA的步骤。该方法跟随 本发明的微量mRNA的扩增方法的第二工序，亦可。还有，在上述第五工序 中扩增的mRNA中包含扩增的微量mRNA和扩增的虚拟RNA。
图5的步骤2是对上述步骤1中合成的反义DNA合成互补的正义DNA， 形成由正义DNA和反义DNA组成的双链DNA的步骤。该方法按照本发明 的微量mRNA的扩增方法的第三工序进行，亦可。
图5的步骤3是利用DNA连接酶在上述步骤2中形成的双链DNA的正 义DNA5’末端侧连接连接适配器的步骤。上述DNA连接酶只要能将连接适 配器连接到双链DNA的两末端侧即可，没有特别限定。
此外，上述连接适配器只要能连接到双链DNA的两末端侧即可，没有特 别限定。上述聚核苷酸dT引物的碱基序列最好在连接适配器连接在双链DNA 的两末端侧的场合，可通过限制酵素仅切断一方连接适配器。上述限制酵素 没有特别限定。例如，图5的步骤3中例示了上述限制酵素为NotI的场合。 此外，上述连接适配器最好制作成没有连接到双链DNA的一侧为限制酵素位 点。上述限制酵素位点没有特别限定。例如，在图5的步骤3中例示了上述 限制酵素位点为BgIII位点的场合。其结果，在步骤3中由NotI处理后的双 链DNA的两末端侧存在BgIII位点及NotI位点，因此能够容易结合到载体中。
在上述步骤3之后，为了除去切断的连接适配器和扩增的虚拟RNA，最 好包含步骤4。步骤4只要能除去切断的连接适配器和扩增的虚拟RNA即可， 没有特别限定。例如，步骤4可采用使用凝胶过滤柱的尺寸分度法。还有， 不受上述凝胶过滤柱的限定，而根据想要分度的尺寸采用适当公知的柱也可。 此外，上述步骤4最好进行多次。通过将步骤4进行多次，可有效率地除去 切断的连接适配器和扩增的虚拟RNA。
使用DNA连接酶，将经过上述步骤1～4提炼的双链DNA结合到载体， 从而能够制作cDNA文库。上述载体没有特别限定，可采用适当公知的载体。 例如，可采用质粒载体(plasmid vector)、粘粒载体(cosmid)或噬菌体载 体(phage vector)等公知载体。
[探针的制作方法]
本发明的探针的制作方法只要一个工序包含本发明的微量mRNA的扩增 方法即可，对于其它的材料、工序、条件、使用器具等具体构成没有特别限 定。
具体地说，本发明的探针的制作方法是使用根据本发明的微量mRNA的 扩增方法扩增的mRNA，来制作探针的方法。本说明书中“探针”指的是RNA 探针及DNA探针。由mRNA制作RNA探针或DNA探针的方法没有特别限 定，可根据适当公知的方法(例如参照“生物人工系列(バイオマニユアル シリ—ズ)2基因文库的作成法”，(野岛博编)羊土社，1994或“基 础生化学实验法”(大岛泰郎编)第四卷、核酸/基因实验II、东京化学同 人，2000)来制作。
本发明的探针的制作方法例如可制作cDNA微阵列(Microarray)用的探 针。
[阶段性减影方法]
本发明的阶段性减影方法(别名：多台阶减法)只要一个工序包含本发 明的微量mRNA的扩增方法即可，对于其它的材料、工序、条件、使用器具 等具体构成没有特别限定。
具体地说，本发明的阶段性减影方法是使用根据本发明的微量mRNA的 扩增方法扩增的mRNA作为被检对象进行的阶段性减影方法。上述阶段性减 影方法没有特别限定，可采用适当公知的方法(例如参照“生物人工系列(バ イオマニユアルシリ—ズ)2基因文库的作成法”，(野岛博编)羊土社， 1994或“基础生化学实验法”(大岛泰郎编)第四卷、核酸/基因实验II、 东京化学同人，2000)来进行。
〔实施例〕
以下借助实施例，对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于此。本 领域的技术人员在不超出本发明的范围内，可进行各种变更、修正及改变。
〔1：虚拟RNA制作用载体的制作〕
首先，借助图4说明本发明的虚拟RNA制作用载体的制作方法。
首先，制作虚拟RNA的正义链(Sense)和反义链(Antisense)退火而 成的虚拟RNA单元。为了制作虚拟RNA单元，而将虚拟RNA的正义链 (Sense)和反义链(Antisense)分别进行了合成。还有，上述正义链的5’ 末端为结合到载体而磷酸化。以下，示出正义链及反义链的碱基序列。
Sense：5’-
AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGC-3’ (序列号4)
Antisense：5’-
GGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTATCCAGACG-3’(序列 号5)
在退火缓冲液(10mM Tris-HCl(Ph7.5)，1mM EDTA，10mM MgCl2) 中溶解了上述正义链和反义链，使它们的浓度分别相等，且正义链和反义链 的全部量成为0.35μg/μL。然后，通过在65℃中2分钟、37℃中10分钟以及 在室温中5分钟的条件下依次进行保温来将正义链和反义链退火，制作了虚 拟RNA单元。还有，在上述虚拟RNA单元的两末端形成了EcoRI位点及 NotI位点，利用两限制酵素位点可结合到体现载体。
接着，制作了用于结合上述虚拟RNA单元的载体。该载体采用了 pAP3neo(タカラバイオ社制)。在EcoRI及NotI切断pAP3neo后，在琼脂 糖凝胶(agarose gel)中电泳，由该琼脂糖凝胶提炼出pAP3neo。接着，通过 在上述pAP3neo结合上述虚拟RNA试剂盒(cassette)来制作虚拟RNA制作 用载体(pDurin-1)。
〔2：虚拟RNA的调整〕
利用上述pDurin-1制作虚拟RNA的方法按照以下1)～11)进行。此 外，在图3中模式地示出利用上述pDurin-1制作虚拟RNA的方法。
1)首先在10μg的pDurin-1加入20μL的10×notI缓冲液(Buffer) (100mM Tris-HCl(pH7.5)，1.5M NaCl，70mM MgCl2，10mM DTT，0.1％ BSA，0.1％Triton X-100)，再加水使全量成为200μL。
2)加入5单元的NotI，在37℃中2小时保温。反应后，由琼脂糖电泳 确认pDurin-1切断的情况。
3)在上述反应液中加入与反应液等量(210μL)的苯酚/三氯甲烷溶液(1： 1)后进行搅拌。
4)用微型引信(micro fusee)进行1分钟的离心分离。
5)在离心分离之后，将上清移到新的微型引信管，加入上清的大致0.08 倍量(17μL)的3M醋酸钠和上清的大致2倍量(420μL)的乙醇，干冰中 冷却15分钟。
6)用微型引信进行15分钟的离心，利用500μL的70％乙醇轻轻清洗所 获得的沉淀后，进行2秒的离心。在去除上清后，再次进行2秒的离心。在 去除残留在微型管底部的少量的70％乙醇后，在没有对沉淀进行干燥的情况 下，以原先潮湿的状态进入下个操作。
7)对包含NotI中切断的pDurin-1的上述沉淀物，加入20μL的10× T7 Pol缓冲液(400mM Tris-HCl(pH8.0)，80mM MgCl2，20mM亚精胺 (spermidin)，50mM DTT)、16μL的25mM NTP混合物，再加水而使全量 成为200μL。
8)加入50单元(大致1～5μL)的T7RNA聚合酶，在37℃中进行60 分钟的保温。
9)进而，加入5单元(大致1μL)的DNase(没有混入RNase活性)， 在37℃中进行20分钟的保温。
10)进行与上述3)～6)同样的操作，得到沉淀。
11)对10)中获得的沉淀加入100μL的TE(10mM Tris-HCl(pH7.5)， 0.1mM EDTA)，利用UV测量器测定虚拟RNA的浓度。还有，如果溶液为 OD260＝1.0，该溶液中的虚拟RNA的浓度为40μL/μL。在测定虚拟RNA的 浓度后，加入TE，以使虚拟RNA的浓度成为5μg/μL。然后，将虚拟RNA 分注到微型引信管等，在-20℃或-80℃中进行保存。如此，借助虚拟RNA 制作用载体制作了虚拟RNA。
此外，采用上述以外的方法如化学合成来制作虚拟RNA。此时，将虚拟 RNA化学合成，并将其3’末端侧生物素化。通过HPLC来提炼生物素化的 虚拟RNA。还有，这种生物素化的虚拟RNA也可购买。以下示出上述虚拟 RNA的碱基序列。
虚拟RNA：5’-
AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(序 列号6)
将合成的虚拟RNA溶解在水中，以使浓度成为1μg/mL之后，在-20℃ 或-80℃中进行保存。还有，在以下的实验中采用生物素化的虚拟RNA。
〔3：双链DNA的制作〕
双链DNA的制作方法按照以下的1)～10)进行。
1)首先，向1ng左右的想要文库化的微量mRNA(来源于大概100个细 胞)，加入虚拟RNA为0、0.5、1.0、2.5、5.0或10.0μg，并加入5mM Tris -HCl(pH7.5)，以使各自全量成为7.5μL。接着，在65℃中进行5分钟的 加热处理后，进行冰冷却。还有，微量mRNA的取得方法采用公知的微量 mRNA的取得方法。具体地说，采用QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (Amersham Biosciences社制)取得微量mRNA。还有，具体操作按照附加 的协议进行。还有，如果在抽取mRNA时加入虚拟RNA，可将RNase带来 的mRNA的分解抑制在最小限度内。此外，本实施例中，微量mRNA采用 源自293T细胞或HeLa细胞的mRNA。
2)向上述微量mRNA和虚拟RNA的混合物中依次加入2.5μL的10×第 一链缓冲液(First Strand Buffer)(500mM Tris-HCl(pH8.3)，750mM KCl， 30mM MgCl2)、2.5μL的0.1M DTT、1.5μL的10×第一链混合物(10mM dATP， 10mM dGTP，10mM dTTP，5mM5-甲基-dCTP)、1.0μL(1.6μg)的(T7) 连接引物(Linker primer)、以及0.5μL(20单元)的RNase抑制剂(Inhibitor) (Promega社制)。然后，加水并使全量成为25μL。还有，以下示出(T7) 连接引物的序列。还有，上述(T7)连接引物采用由HPLC提炼的引物。
(T7)连接引物：5’-
GAGAGAGAGAGAGAGATAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGCCGCT TTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(序列号7)
3)在室温中放置10分钟，从而将mRNA和(T7)连接引物退火。
4)加入1μL(50单元)的StrataScript RT(Stratagene社制，Stratagene cDNA Synthesis Kit)和0.5μL的SuperScript III(Invitrogen社制)，在42℃ 反应45分钟。然后，再加入0.5μL的SuperScript III，在50℃中反应30分钟。 然后，再在55℃中反应30分钟。
5)在反应结束后，将反应液移至冰中。
6)将上述反应液在冰中冷却的状态下，加入20μL的10×第二链缓冲液 (188mM Tris-HCl(pH8.3)，906mM KCl，46mM MgCl2)、7.5μL的0.1M DTT、以及3μL的第二链核苷混合物(10mM dATP，10mM dGTP，10mM dTTP，25mM dCTP)。然后，加入冰冷却的水，使全量成为200μL。
7)而且，在冰中进行5分钟的保冷。
8)加入1.5μL(2单元)的RNase H(タカラバイオ社制)和10μL(50 单元)的E.coli DNA聚合酶I(タカラバイオ社制)。
9)在16℃中反应150分钟。
10)加入200μL的苯酚/三氯甲烷溶液并均匀搅拌后，进行了离心分离 (15,000rpm，3min，4℃)，将上清液移至新的管并进行乙醇沉淀(在-80℃ 中10分钟以上)后，用70％乙醇来清洗沉淀物。沉淀物在不进行干燥的情况 下用于以下的工序。
〔4：与虚拟RNA的最佳量相关的研讨〕
研讨了制作双链DNA时的虚拟RNA的量与双链DNA的制作效率之间 的关系。
将上述沉淀物溶解在85mL的水中，将其中的1μL用于模板(template)。 对于该模板，加入1μL的10×Ex缓冲液、0.8μL的dNTP混合物、下述的 引物(hsGAPDH-F及hsGAPDH-R)各1μL、0.1μL的Ex taq、5.1μL的水， 使全量成为10μL。然后，在95℃中进行5分钟的变性后，在95℃中进行30 秒的变性反应，进行将由55℃中30秒的退火反应及72℃中1分钟的伸长反 应构成的循环进行30～50循环的PCR反应。还有，在微量mRNA为源自大 致1细胞的场合，上述循环数最好为50循环，而在微量mRNA为源自大致 10细胞的场合，上述循环数最好为40循环，又在微量mRNA为源自大致100 细胞的场合，上述循环数最好为30循环。
hsGAPDH-F：5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’(序列号8)
hsGAPDH-R：5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’(序列号9)
PCR反应之后，使PCR反应产物(5μL)在2％琼脂糖凝胶中电泳。电 泳后，用“Socion Image(NIH图像)”测定各片段的荧光强度(intensity)。 还有，关于结果将在后述的〔结果1〕中进行说明。
〔5：与微量mRNA量相关的研讨〕
调制出向由293T细胞或HeLa细胞抽取的mRNA(大致0.1ng(大致相 当于10细胞)或大致0.01ng(大致相当于1细胞))添加1.0μg的虚拟RNA 的抽样和没有添加虚拟RNA的抽样。
利用该抽样，根据上述的方法，制作了双链DNA。然后，根据记载于上 述〔4：与虚拟RNA的最佳量相关的研讨〕的方法，研讨了可由本发明的扩 增方法来扩增的微量mRNA的量。还有，在微量mRNA为0.01ng的场合， 将PCR反应的循环数设为50循环，在微量mRNA为0.1ng的场合，将PCR 反应的循环数设为40循环。关于该结果在后述的〔结果2〕中进行说明。
〔6：扩增用双链DNA的制作〕
扩增用双链DNA的制作方法按照以下1)～13)步骤进行。
1)为了制作扩增适配器，而分别合成了正义链和反义链。还有，上述正 义链中包含了T7聚合酶的启动子序列。下面示出正义链及反义链的碱基序 列。
正义T7：5’-
CACTAGTACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAATTCCCCGGG-3’(序 列号10)
反义T7：5’-
CCCGGGGAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTACTAGTGAGCT- 3’(序列号11)
在退火缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，10mM MgCl2) 中溶解上述正义T7和反义T7，以使各自的浓度相等，且正义T7和反义T7 的全量成为0.35μg/μL。然后，在65℃中2分钟、37℃中10分钟及室温中5 分钟的条件下依次进行保温，从而将正义T7和反义T7退火，制作了扩增适 配器。将上述扩增适配器保存在-20℃中。
2)对〔3：双链DNA的制作〕中提炼的沉淀物，加入10μL的10×T4 DNA 聚合酶缓冲液、5μL的2.5mM dNTP混合物以及水，使全量成为100μL。向 该溶液中加入3.5μL(大致5单元)的T4DNA聚合酶，在37℃中反应30分 钟。接着，加入100μL的苯酚/三氯甲烷溶液进行搅拌后，进行了离心分离。 然后，将上清液移至新的管并进行乙醇沉淀(在-80℃中10分钟以上)后， 用70％乙醇清洗沉淀物。通过该工序得到平滑末端化的双链DNA。
3)向上述平滑末端化的双链DNA(沉淀物)加入2μL的10×连接酶缓 冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，70mM MgCl2，10m MDTT)、2μL的10mM rATP、以及1μL的扩增适配器(0.35μg)，然后，加水使全量成为18.5μL。
4)在加入1.5μL(大致4单元)的T4DNA连接酶后，在8℃中反应一 晚。
5)在70℃中进行30分钟的加热处理，从而使连接酶失去活性。接着， 进行5秒的离心分离提炼出上清。
6)此时，在〔3：双链DNA的制作〕中作为沉淀提炼出的双链DNA的 两端上连接了扩增适配器。在这种情况下，如果使T7RNA聚合酶作用于该 双链DNA，则不仅转印微量mRNA的正义链而且还会转印反义链。因而， 由NotI来处理，从而除去了控制微量mRNA反义链的转印的扩增适配器。 首先，向上述上清加入了27μL的NotI缓冲液添加剂(Supplement)(278mM NaCl，8mM MgCl2，1.8mM DTT 0.018％ Triton X-100)及3μL的NotI。由 此，制作了用于扩增mRNA的扩增用双链DNA。
7)接着，为了除去通过限制酵素来切断的扩增适配器而使用CHROMA SPIN-400(Clontech社制)，进行了尺寸分度。首先，将CHROMA SPIN -400均匀地悬浊(上下移动柱来混合)后去掉上下盖。将CHROMA SPIN -400承载于附属管(或去掉盖的1.5mL微型引信管)，静放10分钟而排出 柱中剩余的1×TE(100mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA)。 而且，将上述CHROMA SPIN-400和1.5mL微型引信管放入1.5mL的塑料 管中，在此状态下进行低速离心。还有，使用低速离心机(BECKMAN J2- 21)，以1800rpm、3分钟的条件(700×g)进行离心处理。
8)在低速离心后，除去流出1.5mL微型引信管的缓冲液，再次以1800rpm 在3分钟的条件下进行离心处理。
9)在低速离心后，除去流出1.5mL微型引信管的缓冲液。
10)将上述CHROMA SPIN-400插入新的1.5mL微型引信管中，向 CHROMA SPIN-400中心的树脂上加入10μL的步骤6)中制作的扩增用双 链DNA。将插入新的微型引信管的CHROMA SPIN-400放入15mL的塑料 管中，利用低速离心机，在1800rpm、5分钟的条件下进行了离心处理。
11)对流出微型引信管的抽样(大致50μL)加入130μL的TE、20μL的 5M NaCl、以及等量的苯酚/三氯甲烷溶液并均匀搅拌后，进行了2分钟的离 心处理。
12)将上层的水层移至新的管中，加入400μL的100％乙醇并搅拌后， 在-80℃中静放10分钟或在-20℃中静放一晚。
13)在15000rpm、10分钟、4℃的条件下对上述水层进行离心处理回收 沉淀物。然后，用70％乙醇来清洗该沉淀物。
通过以上工序来制作出扩增用双链DNA。
〔7：虚拟RNA的除去〕
1)将上述〔6：扩增用双链DNA的制作〕中回收的沉淀物溶解于水中后， 加入链酶亲合素，在充分搅拌后，室温中静放5分钟。
2)向反应溶液加入苯酚/三氯甲烷溶液并进行搅拌，回收了水层。还有， 虚拟RNA/链酶亲合素复合体移动到苯酚/三氯甲烷层，因此通过回收水层， 能够除去虚拟RNA。
3)向2)中残留的苯酚/三氯甲烷层加入TE进行搅拌后，再回收了水层。
4)对于上述2)及3)的工序中回收的水层加入链酶亲合素，反复进行 上述1)～3)的工序。
5)使用小型离心机30过虑器(东ソ—制)(MINICENT-30(Cat.# 08627))，从回收的水层提炼出扩增用双链DNA。还有，提炼方法按照附 加协议来进行。
〔8：cDNA文库的制作〕
在图14示出cDNA文库的制作工序，并且在下面对此进行详细说明。
1)向制作的扩增用双链DNA(沉淀物)加入1μL的虚拟RNA(5μg/μL)、 10μL的10×T7 Pol缓冲液、8μL的25mM NTP混合物、以及水，使全量成 为95μL～99μL。
2)向上述溶液加入50单元(大致1～5μL)的T7RNA聚合酶，在37℃ 中进行60分钟的保温。
3)使用CHROMA SPIN-400，根据上述的方法，除去了扩增的mRNA 过剩量的虚拟RNA。还有，通过乙醇沉淀，以沉淀物的方式回收了除去虚拟 RNA后的扩增的mRNA。还有，在本实施例中，使用此处得到的mRNA，并 且在以后的工序中使用总共反复进行4次的〔3：双链DNA的制作〕～〔8： cDNA文库的制作〕的工序而扩增的mRNA。
4)向上述3)中回收的mRNA加入7.5μL的5mM Tris-HCl(pH7.5)， 在65℃中进行5分钟的加热处理后，进行冰冷却。
5)向上述溶液依次加入2.5μL的10×第一链缓冲液、2.5μL的0.1M DTT、 1.5μL的10×第一链混合物、1.0μL(1.6μg)的(T7)连接引物(序列号7)、 以及0.5μL(20单元)的RNase Inhibiton(Promega社制)。然后，加水使全 量成为25μL。
6)将上述溶液在室温中放置10分钟，从而将mRNA和(T7)连接引物 退火。
7)向上述溶液加入1μL(50单元)的StrataScript RT(Stratagene社制， Stratagene cDNA Synthesis Kit)和0.5μL的SuperScript III(Invitrogen)，在 42℃中反应45分钟。然后，还加入0.5μL的SuperScript III，在50℃中反应 30分钟。然后，还在55℃中反应30分钟。
8)在反应结束后，将上述溶液移至冰中。
9)在利用冰来冷却上述溶液的状态下，加入了20μL的10×第二链缓 冲液、7.5μL的0.1M DTT、以及3μL的第二链核苷混合物。然后，加入冰冷 却后水，使全量成为200μL。
10)还将上述溶液在冰中进行5分钟的保冷。
11)向上述溶液加入1.5μL(2单元)的RNnase H(タカラバイオ社制) 和10μL(50单元)的E.coli DNA聚合酶I(タカラバイオ社制)。
12)使上述溶液在16℃中反应150分钟。
13)对于上述溶液加入200μL的苯酚/三氯甲烷溶液并均匀搅拌后，进行 了离心分离(15,000rpm，3min，4℃)。将上清液移至新的管中进行乙醇沉 淀(在-80℃中进行10分钟以上)后，用70％乙醇清洗沉淀物。
14)向上述沉淀物加入10μL的10×T4 DNA聚合酶缓冲液、5μL的2.5mM dNTP混合物以及水，使全量成为100μL。向该溶液加入3.5μL(大致5单元) 的T4DNA聚合酶，使之在37℃中反应30分钟。接着，加入100μL的苯酚/ 三氯甲烷溶液进行搅拌后，进行了离心分离。然后，将上清液移至新的管中 进行乙醇沉淀(在-80℃中进行10分钟以上)后，用70％乙醇清洗了沉淀物。 通过该工序得到平滑末端化的双链DNA。
15)向上述平滑末端化的双链DNA(沉淀物)加入2μL的10×连接酶 缓冲液、2μL的10mM rATP及两种适配器(全量1μL，0.35μg)，然后，加 水使全量成为20μL。还有，上述适配器的一方是由具有连接多个以下序列号 12所示的BamHI(BgIII)-Smal断片的序列的双链DNA构成的适配器。此 外，上述适配器的另一方是由具有连接多个以下序列号13所示的Smal断片 的序列的双链DNA构成的适配器。
BamHI(BgIII)-Smal断片：5’-GATCCCCGGG-3’(序列号12)
Smal断片：5’-CCCGGG-3’(序列号13)
还有，该适配器的制作方法是按照由上述的正义T7和反义T7构成的扩 增适配器的制作方法来进行的。
16)向上述溶液加入1.5μL(大致4单元)的T4DNA连接酶后，使之 在8℃中反应一晚。
17)对于上述溶液在70℃进行30分钟的加热处理，从而使连接酶失去 活性。接着，进行5秒的离心分离提炼出上清。
18)向上述溶液加扩27μL的NotI缓冲液添加剂及3μL的NotI，使之在 37℃中反应90分钟。在反应后，加入5μL的10×STE及2μg的tRNA。然后， 使用CHROMA SPIN-400，根据上述的方法，除去残留的虚拟RNA等。还 有，除去了虚拟RNA等之后的双链DNA以沉淀物的方式通过乙醇沉淀来回 收。
19)向上述沉淀物加入3μL的10×连接酶缓冲液、3μL的10mM rATP、 及1μL(100ng～300ng)的pAP3neo载体(由NotI及BgII来完成切断)。 然后，加水使全量成为30μL。
20)向上述溶液加入1μL(4单元)的T4DNA连接酶后，在12℃中反 应了一晚反应。
20)将上述溶液在70℃中加热30分钟。
21)在加热后，向上述溶液加入70μL的TE、以及加扩100μL的苯酚/ 三氯甲烷溶液并进行搅拌后，进行了1分钟的离心分离(15000rpm)。在离 心分离后，回收了100μL的上清。利用过虑器(ミリポア社制UFCP3TK50)， 并使上述上清无菌化。
22)借助电穿孔(electroporation)法，将上述无菌化的溶液(5μL)导 入大肠菌(GIBCO-BRL社制的ElectroMAX DHI2S Cells)。还有，电穿孔 法以2.5kv、129欧姆的条件下进行。在SOC培养基中施加电压后的大肠菌， 在37℃且培养1小时。
23)将上述大肠菌移至100mL的LB培养基(包含50mg/L浓度的氨苄 青霉素(ampicillin))。将10μL或100μL的含有大肠菌的LB培养基，卷 到分别含有氨苄青霉素的LB培养基(固体培养基)上，并在37℃中培养一 夜，算出大肠菌的形质转换效率。此外，残留的大肠菌含有LB培养基直到 达到OD600＝1.0为止在37℃中培养数小时。在培养后，向大肠菌含有LB培 养基加入DMSO，将该溶液在-80℃中冻结保存。
还有，关于文库的制作，可参考通常的cDNA文库制作协议(例如参照 “生物人工系列(バイオマニユアルシリ—ズ)2基因文库的作成法”， (野岛博编)羊土社，1994或“基础生化学实验法”(大岛泰郎编)第 四卷、核酸/基因实验II、东京化学同人，2000)而制作。还有，关于结果在 后，根据〔结果3〕进行说明。
〔结果1〕
在图6(a)及图6(b)示出虚拟RNA的最佳量的研讨结果。还有，在 本实施例中，关于虚拟RNA的研讨效果，以GAPDH的cDNA化的效率为指 标。但是，GAPDH只是一例指标，对于本领域技术人员来说，能够容易理解 虚拟RNA对于其它基因的cDNA化也具有与GAPDH同样的效果。
如图6(a)及图6(b)所示，能够确认对想要文库化的大致1ng的微量 mRNA(大概源自100个细胞)加入0.5、1.0、2.5、5.0或10.0μg的虚拟RNA 的场合，cDNA都比没有加入虚拟RNA的场合有效率地合成。
此外，如图6(a)及图6(b)所示，在向微量mRNA加入了虚拟RNA 的场合，可最有效率地合成cDNA。
〔结果2〕
在图7(a)、图7(b)及图7(c)中示出研讨可扩增的微量mRNA量 的电泳图。
如图7(a)及图7(b)所示，能够确认无论在微量mRNA(源自293T 细胞)的量大致为0.1ng，还是微量mRNA的量大致为0.01ng，都有效率地 合成cDNA。
此外，如图7(c)所示，能够确认即使源自Hela细胞的微量mRNA (0.01ng)，也有效率地合成cDNA。
〔结果3〕
在图8中示出cDNA文库的片段长度的分布。还有，在上述实施例中， 得到6.6×105cfu的群体。对于该群体研讨片段的插入率的结果为38.8％(23 库仑/60库仑)。此外，在23库仑之中，插入的人的基因为15库仑，在该 15库仑中，只有2库仑插入了相同的基因(表1的抽样3)。
如图7所示，可确认在本发明的方法中制作的cD NA文库被插入较长的 片段。还有，上述片段的平均长为0.75kb。
此外，在表1示出读出cDNA文库的片段的序列的结果。
表1

而且，比较了由本发明的方法制作的cDNA文库的品质和利用从100万 个293T细胞抽取的mRNA通过传统方法(Kobori M ct al.，Genes Cells，1998； 3：459-475)来制作的cDNA文库的品质。
具体地说，对于任意选择的28基因，利用PCT法研讨该基因是否属于上 述文库进行研究。
表2是利用本发明的方法来制作的cDNA文库以及通过传统方法来制作 的cDNA文库这两方所包含的基因。
表2


如表2所示，28基因中的25基因包含在两方文库。
此外表3中示出仅存在用传统方法来制作的cDNA文库的基因。
表3

由表1～表3可明显确认按照本发明的方法制作的cDNA文库中插入了多 样性富余的片段。此外，可确认根据本发明的方法制作的cDNA文库中还插 入了细胞内体现量低的基因。
即，根据本发明的方法制作的文库具有不逊色于利用多量的mRNA制作 的文库的复杂度、插入效率及平均链长。
〔结果4〕
关于通过虚拟RNA来扩增的cDNA组合(pool)的尺寸偏移以及mRNA 扩增效率的上升效果，采用可进行微量mRNA的正确分析的安捷伦(Agilent) 社制的Bioanalyzer 2100进行了评价。
具体地说，利用虚拟RNA进行第一次mRNA的扩增，然后，通过PCR 法来确认了GAPDH的扩增。又，利用扩增的mRNA和虚拟RNA，进行第二 次mRNA的扩增，然后，调查虚拟RNA的mRNA的扩增效果。
首先根据上述的协议制作扩增用双链DNA后，利用荧光色素(Cy5)进 行了标识(label)化cRNA的扩增。然后，用电泳图谱(electroferrogram) (叠加)来表示实验结果。
其结果，如图9(a)所示，可观察到利用虚拟RNA进行扩增的cRNA与 没有加入虚拟RNA的扩增相比，其扩增上升到6倍以上。为了避免偶然情况， 即使采用其它荧光色素(Cy3)进行同样的实验的情况下，也确认采用虚拟 RNA的场合(蓝线)中具有30倍以上的扩增效果(参照图9(b))。
绿线表示RNA指针的峰，可知加入虚拟RNA的两条蓝线与没有加入虚 拟RNA的相比，在4kb以上的范围内有效率地转印扩增。该结果表示因添加 虚拟RNA而针对少数mRNA的基于逆转印酵素的cDNA化和基于T7RNA 聚合酶的转印扩增中的酵素反应，对mRNA没有偏重而广泛进行。这一点表 示采用虚拟RNA的技术比无法避免扩增偏重的PCR法优越。
〔结果5〕
关于利用虚拟RNA制作的纳米cDNA文库的mRNA的种类，为了调查 是否包含使扩增有偏重的基因，利用安捷伦(Agilent)社的cDNA微阵列(2 色法，Dyeswap法)进行了验证。
具体地说，将利用虚拟RNA从相当于10个HcLa细胞的极微量RNA扩 增的纳米cDNA文库(+dRNA)和采用源于100万个左右HcLa细胞的大量 mRNA并根据传统方法制作的cDNA文库(+dRNA)进行比较。
首先，利用源自两方cDNA文库的质粒DNA，由T7RNA聚合酶转印 mRNA，然后利用RNase自由基(free)的DNase对上述mRNA进行了处理。
以上述mRNA为试料，根据上述的协议制作扩增用双链DNA后，利用 荧光色素(Cy5)进行了标识化cRNA的扩增。分别测定RNA浓度的结果， 纳米cDNA文库为0.06mg/ml、通常的纳米cDNA文库为0.53mg/ml。此外利 用Bioanalyzer2100评价它们的的尺寸分布的结果，显示无论在Cy5标识(参 照图10(a))的情况下还是在Cy3标识(参照图10(b))的情况下，其获 取率和尺寸分布都大致相同。
接着，以这些标识RNA为探针，利用承载44,000个cDNA的cDNA微 阵列(Agilent社制的“agilentHu44K”)进行了荧光色素交换实验(DyeSwap)。 还有，该荧光色素交换实验的实验结果是通过(-dRNA/Cy3：+dRNA/Cy5) /(+dRNA/Cy3：-dRNA/Cy3)来求出。具体地说，1块阵列上，使由Cy3 及Cy5分别标识的两种抽样以竞争方式杂交，求出实验结果。
图13中示出荧光色素交换实验的结果。还有，图13中以中央区域的黑色 来表示具有相同荧光强度的基因群，以上侧浓的灰色表示加入虚拟RNA (dRNA)的场合增加杂交强度的基因群，以下侧浅的灰色表示通过加入虚拟 RNA来减少杂交强度的基因群。
各探针比较已杂交的cDNA的强度分布的结果，两者中仅仅数个基因不 同以外，图案大致一致。这启示两者具有cDNA文库的品质大致相同的cDNA 种分子。即，越来越明显利用虚拟RNA，以相当于10个HcLa细胞的极微量 的RNA为出发点制作的纳米cDNA文库为高品质。
〔结果6〕
上述的例子研讨了从细胞提炼的mRNA，即对包含各式各样种类的mRNA 的mRNA混合物进行扩增的情况。因此，研究了对一种mRNA，本发明的方 法是否也能有效率地进行扩增。
作为一种mRNA，采用了人体GAPDH的mRNA。人体GAPDH的mRNA 是通过使用下述的GAPDH S引物及GAPDH AS引物的PCR法来从HeLa cDNA文库中无性生殖的。
GAPDH S：5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’(序列号14)
GAPDH AS：5’-
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGAGCACAGGGTA CTTTATTG-3’(序列号15)
抽取相当于人体GAPDH的DNA断片(大致1300bp)后，利用TA-无 性生殖法，将该DNA断片插入pT7Blue载体(invitrogen Corp.，Carlsbad， CA，USA)。
通过BamlII处理来使所获得的载体成为串链状之后提炼。在提炼后，用 MEG Ascript(Ambion社制)转印了RNA(在37℃中4小时)。然后，加入 TURBODNA-free(Ambion社制)，在37℃中处理1小时。然后，提炼出 转印的RNA。
利用上述人体GAPDH的mRNA，根据上述的〔3：双链DNA的制作〕～ 〔6：扩增用双链DNA的制作〕制作了扩增用双链DNA。还有，在本实施例 中使用的人体GAPDH的mRNA的量为4.9、0.49、0.049或0.0049fg。此外， 在本实施例中使用的虚拟RNA是序列号6所示的虚拟RNA。
如图11所示，只要是本实施例的方法，也能对0.49fg/mL这种微量浓度 的mRNA进行扩增。还有，在图11中采用PCR法来确认人体GAPDH的 mRNA的扩增，此时PCR法的扩增次数为40次。
〔结果7〕
研究了具有不同序列的虚拟RNA是否也具有同样的mRNA扩增效果。
根据上述的〔3：双链DNA的制作〕～〔6：扩增用双链DNA的制作〕， 使用1μg的序列号16所示的虚拟RNA，对从10个293T细胞提炼的mRNA (大致0.1ng)进行了扩增。以下示出虚拟RNA的碱基序列。还有，在图12 中由“NotI-dRNA”表示虚拟RNA。
虚拟RNA：5’-
AATCTGTCGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(序 列号16)
如图12所示，依据本实施例的方法，即使使用具有不同序列的虚拟RNA 的场合，也能对mRNA进行扩增。还有，在图12中，利用PCR法确认人体 GAPDH的mRNA的扩增，此时PCR法的扩增次数为40次。
此外本发明并不限定于以上所说的各构成，可在权利要求的范围内进行各 种变更，通过适当组合不同实施方式或实施例所各自公开的技术方案获得的 实施方式或实施例，也被本发明的技术范围所涵盖。
产业上的可利用性
本发明的微量mRNA的扩增方法包括：向包含微量mRNA的溶液添加虚 拟RNA制作混合溶液的第一工序；根据使用混合溶液作为模板的逆转印反 应，合成反义DNA的第二工序；对合成后的反义DNA合成互补的正义DNA， 形成由正义DNA和反义DNA组成的双链DNA的第三工序；在所形成的双 链DNA的正义DNA的5’末端侧连接RNA聚合酶的启动子序列制作扩增用 双链DNA的第四工序；以及通过RNA聚合酶，由扩增用双链DNA扩增RNA 的第五工序。
依据上述方法，在扩增双链DNA时不使用PCR，因此起到不受扩增的微 量mRNA的碱基序列长度的影响，而能够对短的mRNA和长的mRNA都同 样有效率地扩增的效果。故，能够用于cDNA文库、探针的制作或阶段性减 影的实施等情形。
如上所述，本发明中使微量mRNA与虚拟RNA一起扩增，因此可有效率 地扩增微量mRNA，且扩增的mRNA上没有偏重。因此，本发明不仅能够用 于RT-PCR、cDNA微阵列、cDNA文库的制作、mRNA的扩增(例如，SPIA 等)、采用mRNA的标识探针的制作、以及阶段性减影，而且可广泛用于需 要微量mRNA的扩增工序的领域。
此外。现在的研究趋势已进入了以1个细胞到数个细胞为对象的纳米级的 分析，只要能够从极少量的mRNA有效率地合成cDNA，就能得到对应的详 细数据。由于本发明可以只采取少数细胞，可用于基因水平的分析较迟的干 细胞研究或采用患者患部组织的病因分析中。此外，通过结合本发明和多台 阶减法，可进行由1个细胞特异地体现的基因的总括地单离。
序列表
<110>国立大学法人大阪大学
<120>微量mRNA的扩增方法及其应用
<130>G20070027
<150>JP 2006-246053
<151>2006-09-11
<160>16
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述；人工合成引子序列
<400>1

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