PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法

技术领域：

本发明涉及一种siRNA分子库制备方法。

背景技术：

siRNA(small interfering RNA：小片段干扰核糖核酸)是双链短 小核酸碱基片断，一般功能长度为19-23bp。其作用是与特定靶基因mRNA 结合引起同源mRNA特异性降解失去功能。这种双链介导的高效转录的 基因沉默现象称之为RNAi(RNA interference：核糖核酸干扰)，是自然存 在于细胞的防御能力：双链RNA进入细胞内被体内Dicer酶切割成 21-23个核酸碱基片断的siRNA，先与细胞内的其他成分结合成一个核 酸复合体而形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex， RISC)。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上并切割而导致 mRNA降解，从而清除细胞内特定的基因表达而发挥作用。siRNA不仅 广泛应用于生物医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、血 管神经系统疾病等具有广阔的前景。它是继单克隆抗体之后的一种划时 代的能用于治疗多种疾病的生物药分子类型，是当今靶向性基因药物开 发的热点。

RNAi靶向性基因药物开发的第一步就是在靶基因的众多的siRNA 分子中筛选siRNA的最佳结合位点-即靶点(通常指该基因的沉默效率最 高，结构最稳定的且与别的基因不同源的siRNA)。筛选样本中的siRNA 分子的代表性和多样性至关重要。靶基因的siRNA是否能多，快，好， 省的合成直接影响到RNAi靶向性基因药物开发的进展。

纵观siRNA合成方法可分两大类：即化学合成和生物合成。

siRNA化学合成是用核酸合成仪直接合成核酸碱基片断。可以直接 合成RNA碱基小片段(siRNA)或先合成DNA碱基小片段，再克隆到siRNA 表达载体，利用载体的RNA聚合酶III启动子(U6或/和H1)在细胞 内将DNA片段转录成siRNA。直接合成RNA碱基片段费用昂贵而且RNA 片段不能直接进入细胞内发挥作用，必需外加其它的化学修饰才能跨膜 传输到细胞内。先合成DNA碱基小片段再克隆到siRNA表达载体细胞内 表达，因涉及分子克隆过程，在众多siRNA分子合成时量化极其困难。 除此之外，在选择哪段序列进行合成上一直存在盲点。siRNA的最佳靶 点是很难被电脑程序“猜”到的。

siRNA生物合成是利用生物酶以全长双链cDNA或双链RNA为底物 的一系列催化反应而实现的。而合成的siRNA是分子库的形式出现，理 论上具有全部siRNA分子，是靶点筛选的良好工具。

以双链RNA(dsRNA)为底物是凭借T7RNA聚合酶以DNA为摸板 在体外转录制备长双链RNA片断，然后用Dicer酶直接将其切割成短 小RNA片断。Dicer酶是核糖核酸酶III(Ribonuclease III，RNase III)家族 的成员，广泛存在于蠕虫真菌物及哺乳动物细胞内。体外重组Dice酶 利用Dicer酶直接将其切割成21-23bp短小RNA片断，模仿体内自然的 RNA干扰起始阶段，该酶在市场上已有销售(Ambion，USA)。Dicer酶得 到一群siRNA分子，这种siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单 一的siRNA转染一样。由于siRNA“群”有许多不同的位点的siRNAs， 通常能够保证目的基因被有效地抑制。这种方法有两个缺点：1)短小RNA 片断不可能再逆转录成cDNA，无法加以克隆，导致无法分离siRNA“群” 中的RNAi分子，无法进行siRNA药物靶点的筛选。2)siRNA分子群体 一并投入，容易引发非特异的基因沉默。

以DNA模板(靶基因cDNA；总体cDNA或基因组DNA)构建siRNA 分子库可以将siRNA分子各种位点一并加以克隆，克服上述双链RNA为 底物的瓶颈，不但可以用于高通量的siRNA介导的功能基因组研究，更 重要的是便于实行RNAi基因治疗最佳靶点的筛选。但Dicer酶无法作 用于cDNA模板，目前报道的以DNA模板构建siRNA分子库方法都通过 II型限制性内切酶Mmel实现的。Mmel能识别和限定切割其相邻任意 18-20个核苷酸序列，是II型限制性内切酶的最长识别位点，无法模仿 体内Dicer酶自然形成的21-23bp siRNA片断，在实行RNAi基因治疗 最佳靶点的筛选上存在盲点与瓶颈。

最近III型限制性内切酶EcoP15I已问世(New England Biolabs； USA)，能识别和限定切割其相邻任意的25-27个核苷酸序列(是目 前切割跨度最长的限制性内切酶)。在一个DNA底物分子中必须有两 个对立而置EcoP15I的识别序列才能被切割：

----->

5’CAGCA(N)25---------------------------------------------------27(N)GTGCTG3’

3’GTCGT(N)27---------------------------------------------------25(N)CACGAC5’

                                                                   <---------

基于上述限定的条件，目前尚未见有用于siRNA分子库的构建的报 道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种III型限制性内切酶介导的PCR高通量 构建siRNA全位点分子库制备方法。本方法克服了目前其它II型型限制 性内切酶介导的siRNA分子库构建方法存在的盲点和瓶颈，产生的 siRNA片断能任意控制在16-23bp之间，不但可完全模仿体内自然的 siRNA21-23bp长度，而且可以囊括目前II型型限制性内切酶介导的 siRNA分子构建长度(18-20bp)，适用于RNAi基因治疗最佳靶点的筛 选。

本发明的技术解决方案是：

1、一种PCR高通量构建siRNA全位点分子库的制备方法，其特征 是：为依次包括下列步骤和结构：

(1)将起始DNA在Mn2+的缓冲体系中用DNAse I行不完全消化， 消化后的DNA和产生16-23bp的siRNA环状磷酸接头-1进行平端连接；

结构上，各环状磷酸接头-1都包含一个III型限制性酶切位点，该位 点的近端即近接头平端，与多聚A/T序列相接续，远端即近发夹环部， 与一个II型限制性酶切位点相接续，通过加减多聚A/T碱基对的数目， 可以控制各环状磷酸接头-1中的III型限制性酶切长度，使siRNA长度呈 可控性分布，远端II型限制性酶切位点能介导多聚A/T的克隆方式，一 旦克隆能产生U6和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止信号， 去除启动子和siRNA之间多余的克隆位点序列；

所述的环状磷酸接头-1的通式为： 5’pC(n)TTTTN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环 3’G(n)AAAAN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环

上述P：磷酸键；N：G，C，T，A任意碱基；n：碱基数(0-20)，可计算 上述两种限制性内切酶的距离相应调整；

(2)以上述平端连接反应后的产物为模板，用环状磷酸接头-1的 反义链序列为引物进行“单引物”PCR扩增，选择性扩增两个对立而置 的III型限制性酶切位点分子，使之能被III型限制性酶消化；

(3)PCR产物用III型限制性内切酶消化，酶切后的DNA呈粘性末端；

(4)上述DNA酶切后的粘端用DNA聚合酶在dNTPs存在下补平， 然后与磷酸接头-2进行平端连接。该接头包含一个II型限制性内切酶消 化位点(与磷酸接头-1产生相同的粘端)，为进行克隆所用；

(5)将经步骤(4)平端连接后的产物用5’(磷酸接头-1)和3’ 磷酸接头-2)引物进行PCR扩增；

(6)纯化PCR产物后进行II型限制性内切酶消化，两侧产生AAAA 粘端；

(7)分离目的片段后，克隆到带有T5/A1粘端的表达载体构建siRNA 分子库或miRNA(microRNA，即：微小RNA)分子库；前者带有U6和H1 双启动子，表达双链的siRNA；后者为U6或H1单一启动子，表达单链 的miRNA。

一经克隆能产生U6或/和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止 信号。

在环状磷酸接头-1的转录起始信号多聚A后加一个增强转录效率 的“G”碱基。

上述步骤可用以下产生19-23bp的siRNA分子库为例来表示：

具体可以解释为：

1.)环状磷酸接头-1的结构和连接：

DNA在锰离子存在下经DNase I不完全消随机消化的片段为平端， 可以直接和环状磷酸接头-1进行平端连接。为了构建各种功能长度的 siRNA的分子以供靶点的筛选，本发明首先采用III型限制性内切酶构 建siRNA分子库的方法。III型限制性内切酶Ecop15I是目前切割跨度 最长的限制性内切酶，可以限定切割其相邻任意的25-27个核苷酸序 列。为了分别产生固定的19bp；20bp；21bp；22bp和23bp siRNA的长 度，本发明设计了各种相应的环状磷酸接头-1。图中所示的19-23bp的 环状磷酸接头-1仅为示范，如需要可以继续向下设计到16-18bp。

本发明的环状磷酸接头-1有三大特点：

I)起siRNA分子各种功能长度控制作用：siRNA分子功能长度一般 为19-23bp，目前只能依赖核酸仪一一化学合成。以全长基因为原料的 生物合成是一系列的酶促反应，目前还没有任何生物合成的方法能指定 合成这一长度分布。在图示的环状磷酸接头-1的结构中，本发明的技术 方案特点之一是在Ecop15I位点的近端(近接头平端)与多聚A/T序列 相接续，通过加减多聚A/T碱基对的数目，可以控制各环状磷酸接头-1 中Ecop15I的酶切指定长度，使siRNA长度呈可控性分布于19-23bp， 也可根据需要固定在其某一长度。这样不但可以模仿体内DICER酶所 产生的自然长度(21-23bp)，也可以囊括目前其它siRNA分子库构建方 法所用的II型限制性酶Mmel实现的极限长度(19-20bp)，并能扩展到 其它长度(如16-18bp等)。基于Ecop15I是目前切割长度最长的III 型限制性内切酶，随着具有更长切割长度的III型限制性内切酶出现， 视需要可根据本发明技术路线将siRNA长度向上延伸(如24-29bp)。但 目前公认，siRNA长度过长(＞30bp)或过短(＜16bp)都会引起核酸 干扰反应失败。前者引起细胞凋亡，后者则反应无效。本发明的所列举 的19-23bp的长度是目前公认的siRNA定义长度。

II)多聚A/T序列起克隆位点的和RNA聚合酶III启动和终止信号 的作用：

RNA聚合酶III启动子(U6和H1)的起始信号为AAAAA，终止信 号为TTTTT。环状磷酸接头-1中Ecop15I的远端(近发夹环部)所设 置的II型限制性酶FokI酶能识别和限定切割其相邻任意9-13个核苷 酸序列，通过和Ecop15I之间“N”碱基数的调节，切点能产生A4(4 个“AAAA”碱基)的粘性末端和表达载体的T5/A1粘性末端连接。 当siRNA分子克隆到表达载体后，即产生启动子的AAAAA起始信号和 TTTTT终止信号。运用本发明的技术方案，RNA聚合酶III(U6和H1) 在启动子的AAAAA起始信号和siRNA之间去除与siRNA无关的多余克 隆位点的序列，降低siRNA在靶点筛选中的脱靶现象。除此之外，在 U6和H1的起始信号AAAAA之后加碱基“G”可以增强siRNA转录效 率。本发明在产生22bp以下的siRNA环状磷酸接头-1结构的多聚A前 都含有碱基“G”。克隆后碱基“G”位于AAAAA之后。而产生23bp 的siRNA环状磷酸接头-1的结构中，为了Ecop15I保证产生足够的长度， 碱基“G”被省略，而被视为特列。如特殊需要，此时碱基“G”可以 加在表达载体上。随着具有更长切割长度的III型限制性内切酶出现， 产生23bp以上的siRNA环状磷酸接头-1的结构也可列入上述通列中。

III)环状磷酸接头的结构在siRNA构建过程中起保护作用

环状磷酸接头由于是一端呈环状结构(发夹环状)的二级结构，可 防磷酸接头充当PCR引物在在后续的PCR扩增中起非特异性扩增的副 作用。除此之外，环状结构与DNA片段连接的过程中可以防止形成多 个磷酸接头的自身连接。这种自连现象极易发生在双平端磷酸接头而形 成磷酸接头的多聚体。磷酸接头多聚体一旦形成，因长度和正常连接的 DNA分子相仿，不易被分离而造成siRNA分子库的污染，使有效克隆 数严重降低。

2.)单引物PCR扩增：

III型限制性内切酶介导的消化反应的必需条件是在底物 (DNA)同一分子内存在两个酶切位点，而且这两个位点必需对立而置。 以EcoP15I为例：

(A)

EcoP15I---->

-----CAGCA(N)25(多聚A)------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---

-----GTCGT(N)27(多聚T)-------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---

                                                         <----EcoP15I

然而，由于环状磷酸接头-1和DNA的平端连接，除上述可消化分子 (A)外，还可以出现其它两种不可消化分子(B和C)：

(B)

---GTCGT(N)27(多聚T)-----------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---

---CAGCA(N)25(多聚A)-----------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---

(C)

---CAGCA(N)25(多聚A)------------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---

---GTCGT(N)27(多聚T)------------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---

本发明用单一引物PCR选择性扩增III型限制性内切酶可消化的(A) 分子：

单一引物

5’------>3’

---CAGCA(N)25(多聚A)---------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---

---GTCGT(N)27(多聚T)---------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---

                                                         3’<------5’

                                                        单一引物

由于此单一引物为环状磷酸接头-1的反义链(指环状磷酸接头-1的 无磷酸键的链)，只对已获得对立而置的III型限制性内切酶位点(上述 A)分子进行特异性的扩增。PCR产物可被III型限制性内切酶EcoP15I 消化。上述(B)、(C)分子在PCR过程中被淘汰。

3.)EcoP15I消化：

对PCR产物进行III型限制性内切酶(如EcoP15I)消化，限定 切割其相邻任意的25-27个核苷酸序列。5种混合环状磷酸接头-1， 由于调节了Ecop5I相邻的多聚A/T碱基数，切割的DNA(除去磷酸接 头序列)呈现19-23bp可控性多样分布。

4.)粘性补平，与环状磷酸接头-2连接：

EcoP15I消化后的DNA为粘性末端，用DNA聚合酶在dNTPs存 在下将其补平。分离目的片段后与环状磷酸接头-2进行平端连接。环状 磷酸接头-2起PCR锚和克隆作用。环状磷酸接头-2的平端连接可随机 产生如下两种分子：

(A)：

Fok I                            siRNA                           Fok I

---GGATG--------(多聚A)---------------------------(多聚A)--------GTAGG---

---GCTAC--------(多聚T)----------------------------(多聚T)--------CATCC---

(环状磷酸接头-1)                                          (环状磷酶接头-2)

(B)：

Fok I                             siRNA                            Fok I

---GGATG--------(多聚A)----------------------------(多聚T)---------CATCC---

---GCTAC--------(多聚T)----------------------------(多聚A)---------GTAGG---

(环状磷酸接头-1)                                          (环状磷酸接头-2)

Fok为II型限制性内切酶，限定切割其相邻任意的9-13个核 苷酸序列。切割位点设计在磷酸接头多聚A/T序列处，但唯有在正义 链和反义链的5’端产生AAAA才能在本系统中进行克隆：

                 siRNA

5’AAAA----------------------------------3’

    3’----------------------------------AAAA5’

以上(B)的接序结构可以满足这种要求。用5’(磷酸接头-1)和3’ (磷酸接头-2)引物以选择性扩增(B)分子。

5’------->                   siRNA

---------GGATG----(多聚A)---------------------(多聚T)------CATCC-------

---------GCTAC-----(多聚T)--------------------(多聚A)------GTAGG-------

                                                               <---------3’

(5-7.)双引物PCR扩增，FokI消化，克隆到表达载体：

用5’(磷酸接头-1)和3’(磷酸接头-2)引物行PCR扩增。纯化PCR产 物后进行FokI酶消化，分离目的片段，克隆到siRNA表达载体(具有 U6和H1双启动子，表达双链的siRNA)，完成siRNA分子库的构建。 也可克隆到miRNA(micro RNA)表达载体(具有U6或H1单一启动子； 表达单链的miRNA)构建miRNA分子库。

本发明解决了以III型限制性内切酶介导的PCR高通量构建siRNA 全位点分子库制备方法，由此产生的siRNA功能片断可控性分布在 19-23bp，这样可完全模仿体内自然的siRNA分子多样性，适用于RNAi 基因治疗最佳靶点的筛选，克服了目前其它siRNA分子库构建方法存在 的盲点和瓶颈。

附图说明：

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1：本实施例的起始DNA：SARS冠状病毒膜蛋白666bpDNA的 1％Agarose电泳图。

图2：经DNAse I不完全酶切后1％Agarose电泳图。

图3：单一引物PCR(PCR-1)扩增后的1％Agarose电泳图。

图4：跟踪酚提后DNA回收的1％Agarose胶电泳图。

图5：证实Ecop15I消化后66bpDNA片段的20％PAGE电泳图。

图6：证实PCR-2反应产生109bp特异条的20％PAGE电泳图。

图7：Fok I酶切产物的20％PAGE电泳图。

图8：菌检PCR产物的1％Agarose胶检电泳图。

图9：菌检PCR产物SfiI酶切的1％Agarose胶检电泳图。

图10：菌检PCR产物阳性克隆接菌扩大培养、抽提质粒1％Agarose 胶检电泳图。

图11：siRNA表达载体示意图和克隆前后的接续方式。

具体实施方式：

1.1材料、试剂和主要仪器

(1)目的DNA：SARS冠状病毒膜蛋白(NCBI库号：AY536759)全 长cDNA由本公司基因合成组合成，见图1，其长度为666bp。

(2)试剂：1kb plus DNA Ladder(invitrogen)；DNase I(Roche)； MnCl2(BBI)；磷酸接头(Sigma-aldrich)；ATP(BBI)；BSA(NEB)； BmsbI(NEB)；T4 DNA Ligase(NEB)；Tag DNA聚合酶(Biocolor Shanghai)；Agarose(BBI)；dNTP(上海生工)；酚氯仿抽提试剂(上 海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB)；EcoP15I(NEB)；T4 DNA聚 合酶(NEB)；FokI酶(NEB)；SfiI酶(NEB)；感受态细胞(invitrogen)； PU6H1-GFP表达载体(NT Oimcs，USA)。其他生化试剂均购于 Sigma-aldrich。

(3)Oligao序列：

Sigma-aldrich公司合成；(P＝Phosphat：磷酸键)

(A)磷酸接头(以下磷酸接头在Sigma-aldrich公司合成；

(去除P＝Phosphat)

磷酸环状接头-1：

19LP：

5’PCTTTTTTTCTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT

3’GAAAAAAAGACTTGACCCTAGGCAACCTACACA

EcoP15I  FokI

20LP：

-1T             +1G

5’PCTTTTTTGCTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT

3’GAAAAAACGACTTGACCCTAGGCAACCTACACA

EcoP15I    FokI

21LP：

-2T             +2G

5’PCTTTTTGGTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT

3’GAAAAACCACTTGACCCTAGGCAACCTACACA

EcoP15I    FokI

22LP：

-3T          +3G

5’PCTTTTGGGCTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT

3’GAAAACCCGACTTGACCCTAGGCAACCTACACA

EeoP15I      FokI

23LP：

-1C；-3T     +4G

5’PTTTTGGGGCTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT

3’AAAACCCCGACTTGACCCTAGGCAACCTACACA

EcoP15I      FokI

磷酸环状接头-2：

5’PCTTTTTGAGACCGACTCTGCAGACGATCCATCAGAGTCAG

3’GAAAAACTCTGGC TGAGACGTCTGCTAGGTAGTCTCAGTC

FokI

(B)PCR引物(以下PCR引物在invitrogen公司合成)

PCR-1引物(单引物扩增)：

3’BH1：5’ACACATCCA ACGGATCCCAGTTCAG 3’

PCR-2引物：

5’LG：5’GACTCTGATGGATCGTCTGCAGAG 3’

3’BH1：5’ACACATCCA ACGGATCCCAGTTCAG 3’

(C)质检PCR：

5’U6：5’AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC 3’

3’H1：5’TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT 3’

(4)试剂盒：凝胶抽提试剂盒：QIAEX II Gel Extration Kit(QIAGEN)； 质粒纯化试剂盒：TIANprep Mini Plasmid Kit(TIANGEN)等。

(5)主要仪器：PCR仪(PE9600)；电转仪(BIO-RAD，MicroPulser)； 长波长紫外灯等。

2.1 DNase I不完全酶切

DNA在Mn2+的缓冲体系中，用DNase I进行不完全酶切，得到的 DNA片段均为平端。

先将10U的DNaseI用NEB Buffer-2和80％甘油稀释到0.01U，-20℃ 保存。SARS全长cDNA，在Mn2+的缓冲体系中，用0.01～003U的DNase I在冰上反应1分钟，然后70℃灭活20分钟，Agarose电泳检测，如 图2所示，DNA不完全酶切后呈雾状分布，在100～300bp处呈亮区。

2.2磷酸接头-1连接和PCR-1反应

DNase I酶切过的DNA通过用平端连接的方法接上磷酸接头1。

磷酸接头1为19LP1、20LP1、21LP1、22LP1、23LP1。退火处理 (95℃1分钟，自然降至室温)。

上述各磷酸接头-1连接反应：取2.5μl经过DNase I酶切过的DNA， 在10×连接反应Buffer(500mM Tris-HCl(pH7.5，25℃)，100mM MgCl2， 100mM DTT，25μg/μlBSA)的体系中，加入1μl(10mM)磷酸接头-1， 1μl 10mM ATP，0.5μl T4DNA Ligase和0.5μl10×Buffer，在PCR仪上 16℃过夜反应。

PCR-1：在各连接反应体系中取出0.5μl作为模板进行50μl PCR反 应：0.5μl模板DNA，2μl单一引物BH1(20μM)，1μl dNTP(10mM)， 0.5μl Tag酶，用D-H2O补足到50μl，反应条件为：95℃1分钟预变性， 95℃15秒变性，68℃1min退火和延伸，28个循环。1％Agarose胶 电泳检测，如图3所示，5种PCR产物：19LP1、20LP1、21LP1、22LP1、 23LP1都显示阳性结果，说明5种接头-1连接成功。

将各PCR-1产物进行酚提，乙醇沉淀(-20℃，2小时)离心后，沉淀 物加20μl D-H2O溶解，-20℃保存。为了跟踪沉淀物，在下一步反应前 再进行1％Agarose胶电泳检测，如图4所示，5种PCR产物：19LP1、 20LP1、21LP1、22LP1、23LP1酚提后回收正常。

2.3EcoP15I酶切

为了合理使用EcoP15I酶，将纯化后的19LP1、20LP1、21LP1、 22LP1、23LP1PCR-1产物以各5μl混合，加入10μl ATP(10mM)，10μl10X NEB Buffer-3，1μl BSA(100×)(10mg/ml)，10U EcoP15I酶，用D-H2O补 足到100μl，37℃水浴，酶切过夜。将EcoP15I酶切产物进行酚提，乙 醇沉淀(-20℃，4小时)后，离心后加入11μl D-H2O溶解沉淀物，-20℃ 保存。

2.4T4DNA聚合酶补平DNA

EcoP15I酶切后的DNA 11μl，加1.5μl(4.5U)T4DNA聚合酶；1.5μl NEB Buffer-2，2μl dNTP(1mM)，总反应体积为15μl，混合均匀，置于 PCR仪37℃孵化15分钟。

2.5PAGE分离DNA目的条带

在修补成平端的15μl DNA中加入1.5μl的DNA上样Buffer(30mM EDTA；36％(V/V)丙三醇；0.05％(W/V)溴酚蓝；pH＝7.0)，6.5μl X3 点样到20％TBE聚丙烯胺凝胶。电泳：200V，90分钟，分离DNA片 段。电泳结束后，取出凝胶置于含10％EB(溴化乙锭)的TBE染液 中行DNA染色20分钟。如图5所示，66bp的EcoP15I酶切片段清晰 可见。

在紫外灯下，胶切66bp的DNA片段，置于1.5ml离心管中。加入 150μl溶胶Buffer(0.5M NH4Ac，10mM Mg(Ac)2，1mM EDTA (pH8.0))，55℃烘箱过夜，溶出DNA。用QIAEX II Gel Extration Kit 抽提DNA，加D-H2O洗脱。

2.6磷酸接头-2连接

取2.5μl PAGE分离的DNA，加入1μl(20mM)磷酸接头-2， 0.5μl 10×连接Buffer，0.5μl ATP(10mM)，0.5μl T4DNA Ligase，用 D-H2O补到5μl，混合均匀，PCR仪16℃过夜反应。

2.7PCR-2反应

在反应体系中用灭菌的D-H2O补足到50μl，从中取出5μl作为模板， 1μl 5’LG(10μM)；1μl 3’BH1(10μM)，lμl dNTP(10mM)，0.5μl Tag

DNA聚合酶，用D-H2O补到50μl进行PCR反应。反应条件为：95℃ 1分钟预变性，95℃15秒变性，68℃2min退火和延伸，28个循环。 PAGE检测。10μl PCR-2产物PAGE检测结果如图6所示，连接产物 DNA片段大小为109bp片段，显示磷酸接头-2连接成功。

PCR-2产物进行酚提，乙醇沉淀(-20℃，2小时)后，离心加入 20μl D-H2O，-20℃保存。

2.8 FokI酶切

FokI酶消化PCR-2产物，切成粘端DNA片段。

取20μl PCR-2DNA，加入2μl FokI酶，5μl NEBuffer-3，用D-H2O 补到50μl，混匀后加100μl，37℃反应100分钟。10μl酶切产物PAGE 检测，如图7所示，目的片段为29～33bp，如箭头所示。其它3条带至 上而下为：未消化条带；不完全消化条带；消化的两边接头条带(因重 叠，故信号较强)。

PAGE分离目的片段，胶切和回收和上述2.5。

2.9与siRNA表达载体连接

将FokI酶切后的DNA片段连接到带有U6和H1双启动子的siRNA 表达载体pU6H1-GEP，如图10所示。

反应体系为：1μl载体，2μl Fok1酶切的DNA，10μl 1.5X P Buffer (90mM Tris((PH8.5～9.0)；12mM DTT；6mM MgCl2；40％PEG8000)， 0.5μl ATP(10mM)，0.25μl T4DNA Ligase，用D-H2O补足到15μl， 16℃反应30分钟。连接后用D-H2O补到100μl，进行连接产物纯化： 加1.5μl glycogen，253μl的预冷无水乙醇，-70℃放置30分钟沉淀后， 离心加5μlD-H2O溶解DNA沉淀。

1.10电转化

融化-80℃保存的感受态细胞。将40μl的细胞和5μl纯化后的连接 产物在冰上混匀，放置1分钟，然后加入到预冷的电击杯中，进行电击。 加入150μl SOC培养基(2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast，0.05％ (W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖，pH＝7.0)， 37℃摇床，220rpm振摇40～60分钟。将菌液均匀涂布到含50μg/ml Kan 的LB琼脂平板(1％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast，1％(W/V)NaCl， 1.5％(W/V)Agar，pH＝7.0)上，37℃恒温培养箱过夜培养。

1.11 PCR菌检

随机挑取菌斑至400μl LB(1％(W/V)，Tryptone0.5％(W/V)， Yeast1％(W/V)，NaCl，pH＝7.0)1.5ml EP管(或48深孔板)中37℃摇 床，220rpm振摇2h。

PCR检测：取2μl培养菌液为模板，进行PCR反应。PCR体系 为：2μl菌液，0.5μl 3’H1(10pM)，0.5μl 5’U6(10pM)，0.5μl dNTP (10mM)，3μl 10×PCR Buffer，0.3μl Tag DNA polymerase，用D-H2O 补到30μl。反应体系为95℃5分钟预变性，94℃30秒变性，62℃30 秒退火，72℃40秒延伸，72℃7终末延伸，25个循环。5μl PCR产物 Agarose胶检测，如图8所示，出现400bp左右条带的为阳性；没有PCR 产物的为没挑到菌斑或接菌培养失败。在随机挑取的48个克隆中，44 例阳性，阳性率为91.6％。

SfiI酶切证实真阳性：400bp左右条带的阳性条带中，siRNA只有 19-13bp，siRNA重组体(真阳性克隆)和非重组体(假阳性空载体克隆) 的PCR产物长度鉴定极为困难。为了进一步鉴定真阳克隆，本发明利 用空载体多克隆位点含有SfiI酶切位点的特点，将菌液PCR产物进行 SfiI酶切，PCR产物不能被消化者为真阳性克隆。

取4μl菌液PCR产物，加入0.25μl SfiI酶，0.75μl NEBuffer-2， 混匀后PCR仪，50℃，反应1.5小时。5μl酶切产物Agarose胶检测， 如图9所示，43例检测中，只有1例被SfiI消化，重组率为97.6 ％。

1.12接菌扩大培养，质粒抽提

100μl 2小时培养的菌液接种到4ml Ka+LB液体培养基试管中， 37℃摇床，220rpm过夜摇菌。次日取800μl菌液保种为20％的甘油菌， -20℃保存；用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒，50μl D-H2O洗脱 DNA，-20℃保存。1μl质粒Agarose胶电泳检测，如图10所示，质粒 大小为5.5kb，与。

1.13测序鉴定

从抽提的质粒中取出20μl，送测序(上海英骏生物技术有限公司)。 所得序列用alignment program软件和SARS全长基因进行序列比对。

2.结果分析

从SARS siRNA分子库中，随机抽样30例进行测序，所得结果统 计见下表：

  编   号   克隆号   siRNA分子序列  siRNA长度   位点所在   1   S061218-1   TACAATTTGCCTATTCTAATC  21   101～121   2   S061218-11   GGCTCTTGTGGCCAGTAACA  20   161～181   3   S061220-10   GGAAAACAAGCTTTATTATG  20   529～510   4   S061220-19   TACGGTAGCGGTTGTATGC  19   87～69   5   S070115-21   TATTCTAATCGGAACAGGTT  20   112～131   6   S070115-26   GAGCAAACAGCCTGAAGGAAGC  22   378～357   7   S070115-46   GTACCCGCTCAATGTGGTCA  20   311～330   8   S070119-27   GTACATAATAAAGCTTGTTTTC C  23   135～157   9   S070119-28   AGAATGTTTGTTTCTGGGT  19   332～312   10   S070119-30   CATTGGTGCTGTGATCATTC  20   414～433   11   S070119-31   GAGAATGTTTGTTTCTGGGT  20   332～314   12   S070119-32   CTTTATTATGTACAAAAACC  20   539～520*   13   S070119-34   GATTAGAATAGGCAAATTGT  20   565～546   14   S070122-7   GGAAGCAACGAAGTAGCTAAGCC  23   395～373   15   S070122-12   GAGCGGGTACGAGCAAACAGCC  22   368～347   16   S070122-14   TCTCCGGGGGACAATTGTGAC  21   366～386*   17   S070122-19   TGTTACTACAATTTGCCTATTC  22   95～116   18   S070122-22   GCTTTATTATGTACAAAAACC  21   539～519*   19   S070122-30   GAATGACCACATTGAGCGGGT  21   354～334   20   S070122-32   GTGATGTAGCCACAGTGATC  20   169～150   21   S070122-48   TCAACCCAGAAACAAACATTC  21   332～352   22   S070307-4   GTATTGTAGGCTTGATGTGGCT  22   254～275*   23   S070307-45   CTACAATTTGCCTATTCTAATC  22   100～121   24   S070307-48   TACAATACAAGCCATTGCAATC  22   427～406   25   S070316-11   CATCAAGCCTACAATACAAGCC  22   418～397*

30例中，5例为序列重复克隆(*)，25例为不同位点随机分布。长 度可控性分布在19～23bp之间，显示出位点及长度的多样性。