【発明の詳細な説明】 【０００１】 発明の分野： 本発明は、薬剤標的として有用なペプチドを同定するためのコンピューターベースの方法に関する。 より詳細には、本発明は、潜在的な薬剤標的として有用な種々の生物体のタンパク質配列データにおける不変のペプチドモチーフの同定のための方法に関する。 本発明はさらに、正確なアミノ酸配列同一性サインを介した、未知の機能の仮説的なオープンリーディングフレーム（タンパク質）への機能の割り当てのための方法を提供する。 【０００２】 本発明は、薬剤標的のための潜在的な候補として作用し得るタンパク質の保存された不変のアミノ酸配列の構造的および機能的なサインを同定するための新規なアプローチを提供する。 薬剤耐性系統の出現は、新規な薬剤および薬剤標的の同定を必要としてきた。 病原体のタンパク質に存在するが宿主のタンパク質に不在の独特の不変のペプチドモチーフは、潜在的な薬剤標的を示す。 本発明はまた、同時の多数のタンパク質配列のゲノム様式の比較のための方法を提供する。 なお別の利用性は、感染の特定の診断のために有用なペプチド配列を同定するためである。 【０００３】 発明の背景： 感染を治癒するために今日利用可能であるほとんどの薬剤が、原因となる生物体の細胞中の特定のタンパク質標的分子に結合することが知られ、例えば、いくつかの抗生物質は、タンパク質翻訳が影響されるようにリボソームの機能を破壊することが知られる。 これらの場合において、薬剤は、リボソームＲＮＡに直接的に結合するか、またはＲＮＡタンパク質複合体に結合するかのいずれかであることが見出されている（Ｗｉｍｂｅｒｌｙら、１９９９）。 化学的プローブ化実験は、薬剤が、異なる生物体中の構造的に類似な領域において「不変」であるリボソームＲＮＡのあるヌクレオチド配列に結合することを示した（ＰｏｒｓｅおよびＧａｒｒｅｔｔ、１９９９）。 他のクラスの薬剤は、転写のような他の機能（Ｃｕｔｌｅｒら、１９９９）、または細菌細胞における脂肪酸生合成（ＭｃＣ
ａｆｆｅｒｔｙら、１９９９）をブロックするように作用する。 【０００４】 近年、病原体細菌のいくつかの薬剤耐性系統（ＧｈａｎｎｏｕｍおよびＲｉｃ
ｅ、１９９９）が出現し、これは細菌の病原に起因して、感染を治癒するにおいて従来の処置手順を無効にする。 これは、新規な薬剤標的および対応する薬剤の同定を必要とする。 この目的のために、種々の微生物からの完全なゲノム配列の利用可能性が、所与のゲノムにおいてコードされる全てのタンパク質を分析する機会を私達に提供する。 今日公知のほとんどの薬剤がタンパク質を標的するので、所与の細菌において全てのタンパク質を分析することは、新規に有効な薬剤標的を提供し得るようである。 【０００５】 タンパク質における保存された不変の配列の知見は、セグメントの包埋された位置対曝露された位置、または特異的な二次構造エレメントの存在のような、タンパク質の構築のある特徴を理解するにおいて有用であり得る（ＲｏｏｍａｎおよびＷｏｄａｋ、１９８８、Ｐｒｅｓｎｅｌｌら、１９９２）。 タンパク質の機能的な役割は、保存された不変の配列の最も重要な局面である、通常の配列解析の方法としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）およびＦＡＳＴ
Ａ（ＷｉｌｂｕｒおよびＬｉｐｍａｎ、１９８３）が挙げられる。 これらの方法は、アミノ酸配列置換マトリクスを使用してその質が評価される配列アラインメントを行う。 統計学的な算定が行われ、そして結果が格付けされた様式において出力され、最も類似な配列が第１に格付けされる。 しかし、これらの方法は、この研究において特に重要である不変の配列モチーフを同定するために、同時にゲノム様式の比較を行うように設計されていない。 【０００６】 ある生物体の各タンパク質と、いくつかの他の生物体の全ての別のタンパク質とを比較するためには、ＢＬＡＳＴを１つ１つ使用しなければいけないか、またはバッチＢＬＡＳＴが使用されなくてはいけないかのいずれかであり、これは非常に時間がかかりすぎおよびそれゆえ実施可能ではない。 仮にこれが行われたとしても、実行の終わりに、相同なタンパク質およびアラインメントのセットの総括的な類似性が得られることであろう。 【０００７】 複数の配列アラインメントを用いる問題は、これがタンパク質の選択に偏ることである。 機能的に関連されるタンパク質のみが、選択されたタンパク質間で任意の関係の明らかな像を与える。 このような手順は、労働集中的であり、および時間がかかりすぎ、そしてさらなるプロセシングおよびフィルタリングを必要とする結果を導く。 しかし、これらの方法によって、いくつかの生物体の全てのタンパク質を比較し、そして保存された不変のペプチドを検索することは不可能である。 【０００８】 本発明は、上記のような多様な使用を導く、および上述に列挙される欠点を取り除く、不変の配列モチーフを探索するための新規なコンピューターベースの方法を提供する。 【０００９】 出願人のアプローチは、異なる細菌タンパク質間の不変の配列モチーフが、タンパク質の構造および機能についての重要な役割を担わなくてはならないという範例に基づく。 薬剤標的が同定され得る多数の方法のうち、本発明者らは比較的なおよび構造的なゲノミクスに基づくアプローチを採用した。 この場合において、不変の配列モチーフは、直接的または間接的のいずれかで問題のタンパク質分子の機能に関与され得る。 このアプローチは、離れてまたは密接してのいずれかで関連される、細菌にわたって変化されずに残存している不変の配列モチーフが、損なわれ得ない独特の構造的特徴を発展したという概念に由来する。 実際、いわゆる保存的な置換はまた、これらの不変の配列モチーフにおいて寛容されないことがさらに起こり得る。 この目的のために、本発明者らは、任意の事前の推定を伴わずに、種々の細菌ゲノム間の直接的な配列比較によっていくつかの不変のペプチドモチーフを同定した。 配列を研究するこの公平なおよび未推定の方法は、種々のゲノムにおいて未同定の配列特性を解明する利点を有する。 【００１０】 不変の配列モチーフは問題のタンパク質分子の機能に重要であり得るので、本発明者らの目的は、潜在的な広範囲の抗細菌性の薬剤標的としてこれらのペプチドモチーフを発展させることである。 これらの不変の配列に特異的に結合し得る小分子は、問題のタンパク質分子の機能の破壊を引き起こし得ることが考えられ得る。 このコンピューター内のアプローチが利用可能なデータベースに存在するタンパク質配列から機能を引き出すための実験的な検証のための新規な手本を提供することが予期される。 【００１１】 発明の目的： 本発明の主な目的は、いくつかの生物体のゲノム様式のタンパク質配列の比較、および不変の保存されたペプチドの同定のための方法を提供することである。 【００１２】 本発明の別の目的は、いくつかの生物体のゲノム様式の比較を行うための新規なコンピューターベースの方法に関し、ここで当該コンピューター法は、いくつかの生物体のタンパク質配列からのペプチドライブラリーの作製、そして続いて保存された不変のペプチドモチーフの同定を導く比較を包含する。 【００１３】 本発明のなお別の目的は、潜在的な薬剤標的の同定のために有用な、および広範囲の抗細菌剤についての薬剤スクリーニングとして作用し得る、ならびに感染の特異的な診断のために有用な方法を提供することに関する。 【００１４】 本発明のなお別の目的は、未だ未知の機能のタンパク質に、適切な機能を割り当てることである。 【００１５】 なお別の目的は、潜在的な薬剤標的を同定するために不変のペプチドまたはそれらのアナログを組み込むコンピューター法を提供することである。 【００１６】 発明の要旨 出願人は、自然淘汰に耐えた多くの生物体のタンパク質配列に存在する数百万個のペプチドから得られる、不変のペプチドモチーフを同定するための方法を発明した。 従って、これらの配列は、タンパク質の構造決定因子であり、これは標的され得るか、または薬剤発見のための標的としてふるいとして使用され得る。
これらの特別の不変のペプチドサインはまた、特別に機能的なクラスのタンパク質に関連されることが見出される。 【００１７】 本発明の方法はまた、毒性、病原性生物体の特異的なペプチドモチーフに対して標的される薬物についての宿主細胞における代替の標的、または疾患プロセスを担う任意の宿主タンパク質標的を予測することを可能にする。 方法は、より多くのタンパク質に対してより低いストリンジェンシーを用いて、およびまた、真核生物および多細胞生物体について拡張され得る。 【００１８】 本発明の他のおよびさらなる局面、特徴、および利点は、開示の目的のために与えられる本発明の現在好ましい実施態様の以下の記載から明白である。 【００１９】 コンピュータープログラムの簡単な説明 １． ＰＥＰＬＩＢ 目的：生物体のペプチドライブラリーをそれらのＦＡＳＴＡ形式タンパク質ファイルから作製するためのもの。 従って、使用者に規定される長さの重複するペプチドが作製され、次いで非重複性のペプチドのみが出力ファイルにおいてアルファベット順に配置される。 プログラミング言語：ＩＲＩＸプラットフォームにおけるＰＥＲＬ。 ２． ＰＥＰＬＩＭＰ 目的：このプログラムは、使用者によって選択される生物体のペプチドライブラリーを比較し、そしてゲノムにわたって共通であるペプチド配列を報告する。 プログラミング言語：ＩＲＩＸプラットフォームにおけるＰＥＲＬ。 ３． ＰＥＰＸＴＲＡＣＴ 目的：このプログラムは、入力としてペプチドファイルを用い、ＦＡＳＴＡ形式タンパク質ファイル（ｐｅｐファイル）においてサーチし、そしてペプチドについての詳細を報告する。 詳細はＰＩＤ、タンパク質におけるペプチドの位置、
生物体名などを含む。 プログラミング言語：ＩＲＩＸプラットフォームにおけるＰＥＲＬ ４． ＰＥＰＳＴＩＴＣＨ 目的：このプログラムは、ある固定された規準（２つのペプチドは同じＰＩＤ
を有するべきであり、およびそれらの位置は近接するべきである）に依存してペプチドをつなぎ、そして重複を取り出し、そして全ての保存された不変のペプチドを報告する。 プログラミング言語：ＩＲＩＸプラットフォームにおけるＰＥＲＬ 【００２０】 発明の詳細： 理論的にいうと、莫大な数の組み合わせが、所与の長さのペプチドを形成するためにアミノ酸レベルで可能であるが、制限された画分のみが生物学的系において観察されている。 この制限された画分以外に、数個のペプチドのみが、異なる生物体のゲノムにわたって不変なままである。 本研究において、本発明者らは、
全ての病原性および非病原性細菌ゲノムにわたって不変であるペプチドの性質に相応する質問を解答することを追求した。 【００２１】 本発明において、種々の生物体のタンパク質におけるアミノ酸保存のストレッチが異なるクラスのタンパク質間の正確な区別を提供し得ることが示された。 一般的に、これらのタンパク質は、生物体の生存において非常に基本的な機能を有するタンパク質として同定される。 【００２２】 いくつかの生物体のタンパク質配列は、既存のデータベース（ＮＣＢＩ、ｇｅ
ｎｂａｎｋ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ｂａｃｔｅｒｉａ）からコンピューター処理的に得られた。 次いで、これらは特別に開発されたコンピュータープログラムＰＥＰ
ＬＩＢによって「Ｎ」アミノ酸残基のペプチドフラグメントにコンピューター処理的に切断された。 長さ「Ｎ」のペプチドのライブラリーは、同時に１残基により配列に沿って長さ「Ｎ」のウィンドウをスライディングすることによって、各生物体の全てのタンパク質について作製された。 このように得られたペプチドは、単一文字アミノ酸コードに従ってアルファベット順にコンピューター処理的に選別され、そして重複性が、重複されたペプチドを削除することによって取り出された。 次いで、種々の生物体のペプチドは、共通のペプチドを見出すためにコンピューター処理的に比較された。 比較は、特別に開発された、ＰＥＰＬＩＭＰ
と標識されたコンピュータープログラムを使用して行われた。 共通のペプチドは、ＰＥＰＸＴＲＡＣＴプログラムを使用して元来のタンパク質においてコンピューター処理的に配置され、そして続いてそれらのタンパク質の起源および位置で標識された。 これらの共通のペプチドは、共通のペプチドの長い鎖を形成するためにコンピューター処理的にバックステッチされた。 これは、ＰＥＰＳＴＩＣＨ
プログラムを使用して行われた。 【００２３】 このようにして得られた共通のペプチドのこれらのフラグメントは、それらが機能的に保存されたタンパク質に由来するので、不変のペプチドとして命名された。 次いで、同じタンパク質から得られた全ての保存された不変のペプチドを１
つの群に集団化した。 これらのペプチドの二次構造は、タンパク質結晶構造データ−ベース、従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から検証された。 【００２４】 従って、本発明は、薬剤標的として有用な不変のペプチドモチーフを同定するためのコンピューターベースの方法を提供し、以下の工程ｉ）http://www.ncbi.nlm.nih.govにて入手可能な選択された生物体の全てのタンパク質配列から重複するペプチドライブラリーをコンピューター処理的に作製する工程、 ｉｉ）上述のようにして得られた長さ「Ｎ」のペプチドを、単一文字のアミノ酸コードに従って、アルファベット順にコンピューター処理的に選別する工程、 ｉｉｉ）選択された細菌の共通のペプチド配列をコンピューター処理的にマッチングする工程、 ｉｖ）元来のタンパク質においてこれらの共通のペプチドを、コンピューター処理的に配置し、そして続いてそれらの起源および位置でそれらを標識する工程、
ｖ）重複する共通のペプチドをコンピューター処理的に合わせて、不変のペプチド配列の長い鎖を得る工程、 ｖｉ）結晶構造データベースからこれらの保存されたペプチドの二次構造を注釈付けする工程、 ｖｉｉ）非病原性系統のゲノムに対して病原性系統のゲノムを比較し、そしてこれらの２つの群において共通に保存されない配列を選択する工程、ならびにｖｉｉｉ）宿主ゲノムにおいて所与の保存された配列についてサーチし、そして宿主ゲノムに存在する配列を却下することによって、潜在的な薬剤標的配列として不変の配列モチーフを、コンピューター処理的に検証する工程、を包含する。 【００２５】 本発明の実施態様において、長さ「Ｎ」のスライディングウィンドウの長さは、アミノ酸残基の４〜任意の長さの範囲であり得る。 【００２６】 本発明の実施態様において、タンパク質配列データは、任意の生物体から採用され得るが、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａ
ｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような微生物に具体的に制限されない。 【００２７】 さらなる実施態様において、同定されるような保存されたペプチドモチーフは、以下を含む： １． ＡＡＱＳＩＧＥＰＧＴＱＬＴ ５１． ＮＴＤＡＥＧＲＬ ２． ＡＧＤＧＴＴＴＡＴ ５２． ＰＳＡＶＧＹＱＰＴＬＡ ３． ＡＧＲＨＧＮＫＧ ５３． ＱＲＶＡＩＡＲＡ ４． ＡＨＩＤＡＧＫＴＴＴ ５４． ＱＲＹＫＧＬＧＥＭ ５． ＣＰＩＥＴＰＥＧ ５５． ＲＤＧＬＫＰＶＨＲＲ ６． ＤＥＰＳＩＧＬＨ ５６． ＳＡＬＤＶＳＩＱＡ ７． ＤＥＰＴＳＡＬＤ ５７． ＳＧＧＬＨＧＶＧ ８． ＤＥＰＴＴＡＬＤＶＴ ５８． ＳＧＳＧＫＳＳＬ ９． ＤＨＡＧＩＡＴＱ ５９． ＳＧＳＧＫＳＴＬ １０． ＤＨＰＨＧＧＧＥＧ ６０． ＳＶＦＡＧＶＧＥＲＴＲＥＧＮＤ １１． ＤＬＧＧＧＴＦＤ ６１． ＴＧＲＴＨＱＩＲＶＨ １２． ＤＶＬＤＴＷＦＳＳ ６２． ＴＧＶＳＧＳＧＫＳ １３． ＥＲＥＲＧＩＴＩ ６３． ＴＬＳＧＧＥＡＱＲＩ １４． ＥＲＧＩＴＩＴＳＡＡＴ ６４． ＴＮＫＹＡＥＧＹＰ １５． ＥＳＲＲＩＤＮＱＬＲＧＲ ６５． ＴＰＲＳＮＰＡＴＹ １６． ＦＳＧＧＱＲＱＲ ６６． ＶＥＧＤＳＡＧＧ １７． ＧＥＰＧＶＧＫＴＡ ６７． ＶＲＫＲＰＧＭＹＩＧ １８． ＧＦＤＹＬＲＤＮ １９． ＧＨＮＬＱＥＨＳ ２０． ＧＩＤＬＧＴＴＮＳ ２１． ＧＩＮＬＬＲＥＧＬＤ ２２． ＧＩＶＧＬＰＮＶＧＫＳ ２３． ＧＫＳＳＬＬＮＡ ２４． ＧＬＴＧＲＫＩＩＶＤＴＹＧ ２５． ＧＰＰＧＴＧＫＴＬＬＡ ２６． ＧＰＰＧＶＧＫＴ ２７． ＧＳＧＫＴＴＬＬ ２８． ＧＴＲＩＦＧＰＶ ２９． ＩＤＴＰＧＨＶＤＦＴ ３０． ＩＩＡＨＩＤＨＧＫＳＴＬ ３１． ＩＮＧＦＧＲＩＧＲ ３２． ＩＲＥＧＧＲＴＶＧ ３３． ＩＶＧＥＳＧＳＧＫＳ ３４． ＫＦＳＴＹＡＴＷＷＩ ３５． ＫＭＳＫＳＫＧＮ ３６． ＫＭＳＫＳＬＧＮ ３７． ＫＮＭＩＴＧＡＡＱＭＤＧＡＩＬＶＶ ３８． ＫＰＮＳＡＬＲＫ ３９． ＬＦＧＧＡＧＶＧＫＴＶ ４０． ＬＧＰＳＧＣＧＫ ４１． ＬＨＡＧＧＫＦＤ ４２． ＬＩＤＥＡＲＴＰＬＩＩＳＧ ４３． ＬＬＮＲＡＰＴＬＨ ４４． ＬＰＤＫＡＩＤＬＩＤＥ ４５． ＬＰＧＫＬＡＤＣ ４６． ＬＳＧＧＱＱＱＲ ４７． ＭＧＨＶＤＨＧＫＴ ４８． ＮＡＤＦＤＧＤＱＭＡＶＨ ４９． ＮＧＡＧＫＳＴＬ ５０． ＮＬＬＧＫＲＶＤ 【００２８】 本発明に対するなお別の実施態様において、不変のペプチドの数は、生物間の関連性および比較される生物の数に従って変化し得る。 【００２９】 なお別の実施態様において、不変の配列は、データベースhttp://www.ncbi.nl m.nih.govにおいて入手可能なような以下のタンパク質に属し得、ここでタンパク質の列挙は、以下を含む： Ｉ ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼベータ鎖ＩＩ エキシヌクレアーゼＡＢＣサブユニットＡ ＩＩＩ エキシヌクレアーゼＡＢＣサブユニットＢ ＩＶ ＤＮＡジャイレースサブユニットＢ Ｖ ＡＴＰシンターゼベータ鎖ＶＩ Ｓ-アデノシルメチオニンシンセターゼＶＩＩ グリセルアルデヒド ３-リン酸デヒドロゲナーゼＶＩＩＩ 伸長因子Ｇ（ＥＦ-Ｇ） ＩＸ 伸長因子ＴＵ（ＥＦ-ＴＵ） Ｘ ３０Ｓ リボソームタンパク質 Ｓ１２ ＸＩ ５０Ｓ リボソームタンパク質 Ｌ１２ ＸＩＩ ５０Ｓ リボソームタンパク質 Ｌ１４ ＸＩＩＩ バリルｔＲＮＡシンセターゼ（ＶＡＬＲＳ） ＸＩＶ 細胞分裂タンパク質ＦｔＳＨ ホモログＸＶ ＤｎａＫタンパク質（ＨＳＰ７０） ＸＶＩ ＧＴＰ結合タンパク質 ＬｅｐＡ ＸＶＩＩ 輸送体ＸＶＩＩＩ オリゴペプチド輸送ＡＴＰ結合タンパク質ＯＰＰＦ 【００３０】 本発明に対するなお別の実施態様において、上述で説明される方法の工程（ｉ
ｉｉ）において与えられるようなペプチドライブラリーを比較する当該方法は、
図１において与えられる工程を従うことによって行われる。 【００３１】 本発明に対するなお別の実施態様において、上述で説明される方法の工程（ｉ
ｖ）において与えられるような元来のタンパク質配列において共通のペプチドを配置する当該方法は、図２において与えられる工程を従うことによって行われる。 【００３２】 別の実施態様において、上述で説明される方法の工程（ｖ）において与えられるような重複を取り出した後に種々の長さの共通のペプチドを作製する当該方法は、図３において与えられる工程を従うことによって行われる。 【００３３】 本発明に対する別の実施態様において、本発明の方法を行うためのマイクロプロセッサーベースの系は、以下ｉ）ペプチドライブラリーの作製のためのアミノ酸配列ウインドウを決定する、
および続いて選別する手段、 ｉｉ）ペプチドライブラリーを比較する手段、 ｉｉｉ）元来のタンパク質においてこれらの共通のペプチドをコンピューター処理的に配置すること、ならびに続いてそれらの起源および位置でそれらを標識すること、そしてｉｖ）重複する共通のペプチドをコンピューター処理的に合わせて、不変のペプチド配列の長い鎖を得ること、を備える。 【００３４】 本発明の別の実施態様において、本発明の方法を行うためのコンピューター系は、中央処理装置を備え、ペプチドライブラリー作製プログラム（ＰＥＰＬＩＢ
）、ペプチドライブラリーマッチングプログラム（ＰＥＰＬＩＭＰ）、ペプチドステッチングプログラム（ＰＥＰＳＴＩＴＣＨ）、ペプチド抽出プログラム（Ｐ
ＥＰＸＴＲＡＣＴ）を行い、ここで当該プログラムは全て、中央処理装置が使用者インターフェース装置での使用者の入力に応答して上記のプログラムのスクリーンを示すディスプレイに接続される中央処理装置によってアクセスされる記憶装置において保存される。 【００３５】 本発明のなお別の実施態様において、公的に利用可能なデータベース（ＳＷＩ
ＳＳＰＲＯＴ）における他のタンパク質配列に対して相同性なし／または弱い相同性を示す未知の機能のタンパク質に機能を割り当てるための方法は、以下の工程： Ｉ． 未知の機能のタンパク質配列からの重複するペプチドライブラリーをコンピューター処理的に作製する工程、 ＩＩ． 上述のように得られた長さ「Ｎ」（Ｎはアミノ酸のスライディングウインドウの長さである）のペプチドを、単一文字アミノ酸コードに従って、アルファベット順にコンピューター処理的に選別する工程、 ＩＩＩ． 全ての機能的に公知のタンパク質のペプチドライブラリーと、現在のライブラリーとをコンピューター処理的にマッチングして共通のペプチドを得る工程、 ＩＶ． 元来のタンパク質においてこれらの共通のペプチドをコンピューター処理的に配置し、そして続いてそれらの起源および位置でそれらを標識する、工程、
Ｖ． 重複する共通のペプチドをコンピューター処理的に合わせて、不変のペプチド配列の長い鎖を得る、工程、 ＶＩ． ペプチド配列同一性の最大の長さが見出されるタンパク質の機能に基づいて未知のタンパク質に機能を割り当てる工程、を用いることにより行われ得る。 類似の機能のタンパク質との適合の数が多いほど、機能的な割り当ての尤度が高くなる。 【００３６】 生物体の、それらの名称、系統、アクセス番号、および他の詳細のような項目は、以下に与えられる。 【００３７】 ゲノム 系統 アクセス番号 全塩基配列 完成の日付Mycobacterium tuberculosis H37Rv AL123456 4411529bp 1998年6月11日Cole,STら、Nature 393(6685)、537-544(1998) Bacillus subtilis DY AL009126 4214814bp 1997年11月20日Kunst,F.ら、Nature 390(6657)、249-256(1997) Mycoplasma genitalium G37 L43967 580074bp 1995年10月30日Fraser,CMら、Science 270(5235)、397-403(1995) Mycoplasma pneumonia M129 U00089 816394bp 1996年11月15日Himmelreich,Rら、Nucleic Acids Res. 24(22)、4420-4449(1996) Escherichia coli K-12 U00096 4639221bp 1998年10月13日Blattner、FRら、Science 277(5331)、1453-1474(1997) Helicobacter pylori 26695 AE000511 1667867bp 1997年8月6日Tomb,J.-F.ら、Nature 388(6642)、539-547(1997) Haemophilus influenzae Rd L42023 1830138bp 1995年７月25日Fleischmann,RDら、Science 269(5223)、496-512(1995) 【００３８】 ゲノム タンパク質 ８マーのペプチドの数 共通のペプチドが見出されるタンパク質の番号Bacillus subtilis 4100 1174826 69 Escherichia coli 4289 1302149 81 Haemophilus influenzae 1709 504044 56 Helicobacter pylori 1566 474087 51 Mycoplasma genitalium 467 165523 30 Mycoplasma pneumonia 677 221216 43 Mycobacterium tuberculosis 3918 1252582 58 【００３９】 本発明は以下の実施例の補助を伴って説明されるが、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。 【００４０】 実施例実施例１ １． ペプチドライブラリー作製プログラム（ＰＥＰＬＩＢ） プログラムの目的は、同時に１アミノ酸残基によりウィンドウをスライディングすることによって所与のゲノムの使用者に特定されるウィンドウ長さ「Ｎ」の非重複性のペプチドライブラリーを作製することである。 プログラムは以下のように作用する： http://www.ncbi.nlm.nih.govから得られるインターネットでダウンロードされたＦＡＳＴＡ形式ファイルは、名称＜organism#name＞.pepによって保存され、実行時に特定されるような長さの独特のペプチドを作製するＰＥＲＬプログラムへの入力として適用される。 入力／出力ファイル形式：ダウンロードされたファイルおよびそれらの形式： ＜organism#name＞.pep：注釈およびタンパク質配列を保存するファイル。 ＜organism#name＞は、Ｔｂ（Mycobacterium tuberculosis）、Ｂｓ（Bacillus
subtilis）、Ｍｇ（Mycoplasma genitalium）、Ｍｐ（Mycoplasma pneumonia）
、Ｅｃ（Escherichia coli）、Ｈｐ（Helicobacter pylori）、Ｈｉ（Haemophil
us influenzae）をいう。 形式：ＦＡＳＴＡ “＞gi|”＜注釈＞ ＜＜完全長タンパク配列… … … … …. 例えば、 ＞gi|2808711|emb|CAA16238.1|dnaA MTDDPGSGFTTVWNAVVSELNGDPKVDDGPSSDANLSAPLTPQQRAWLNLVQPL TIVEGFALLSVPSSFVQNEIERHLRAPITDALSRRLGHQIQLGVRIAPPATDEADDTT VPPSENPATTSPDTTTDNDEIDDSAAARGDNQHSWP....... ＞gi|3261513|emb|CAA16239.1|dnaN MDAATTRVGLTDLTFRLLRESFADAVSWVAKNLPARPAVPVLSGVLLTGSDNGL TISGFDYEVSAEAQVGAEIVSPGSVLVSGRLLSDITRALPNKPVDVHVEGNRVALT CGNARFSLPTMPVEDYPTLPTLPEETGLLPAE.......... 出力ファイル：＜organism#name＞＜peptide#length＞.txt 形式： ＜実行時に特定される長さの全ての独特なペプチド＞ 例えば、Tb8.txtの形式： AAAAAAAA AAAAAAAG AAAAAAAQ AAAAAAAS AAAAAAAT ................. 【００４１】 実施例２ペプチドライブラリーマッチングプログラム（ＰＥＰＬＩＭＰ） プログラムの目的は、使用者に規定されるペプチドライブラリーを互いに比較し、そして共通の／独特なペプチドを報告することである。 プログラムＰＥＰＬ
ＩＢの出力ファイルは、ＰＥＰＬＩＭＰプログラムについての入力として使用される。 プログラムが実行される場合、使用者は比較されるライブラリーを選択することを促される。 選択されるライブラリーに依存して、共通のペプチドを有する出力ファイルが作成される（図１）。 上記の７つの生物体の８マーペプチドライブラリーの比較は、１６４個の８マーペプチドを生じた。 Mycobacterium tuberculosis、Helicobacter pylori、Mycoplasma pneumonia
、およびHaemophilus influenzaeのような４つの病原性生物体の比較は、２０６
個の不変のペプチドを生じ、ならびにBacillus subtilis、Mycoplasma genitali
um、およびEscherichia coliのような３つの非病原性生物体の比較は、６０１個の不変のペプチドを生じた。 比較樹形図は以下のようである： 【００４２】 【表１】 【００４３】 実施例３ペプチド抽出プログラム（ＰＥＰＸＴＲＡＣＴ） 本プログラムは、ＰＥＰＬＩＭＰプログラムの出力、すなわち、全ての不変のペプチドを入力として採用し、そして元来のデータベースからのタンパク質配列においてこれらのペプチドを配置し、そしてさらなる解析のためにタンパク質同定番号（ＰＩＤ）、位置、および生物体名でそれらを標識する。 このプログラムの論理回路は、図２において示されるフローチャートにおいて説明される。 【００４４】 実施例４ペプチドステッチングプログラム（ＰＥＰＳＴＩＴＣＨ） 本プログラムは、重複する不変のペプチドを知的に取り出し、そして考慮下のタンパク質に存在する不変のペプチドの全ての連続的なストレッチを報告する。
これは、先ず生物体の同じタンパク質からの「Ｎ」マーペプチドをグループ分けし、そして次いでそれらの位置上に形跡を維持して、それらが長い単一のペプチドに合わされることによってなされる。 このプログラムの論理回路は図３において示される。 【００４５】
実施例５仮説的なタンパク質の機能の予測 配列ＦＳＧＧＱＲＱＲを有する不変のペプチドが、７つの試験されたうちの６
つの生物体（M．tuberculosisを除く）のｏｐｐＦ／ｄｐｐＦタンパク質に存在することが見出された。 このタンパク質はＡＴＰ結合タンパク質として機能する。 この不変のペプチドはまた、M． tuberculosisにおけるＲｖ１２７３ｃ遺伝子によってコードされる仮説的なタンパク質上に位置されることが見出されたので、Ｒｖ１２７３ｃ遺伝子によってコードされるこのタンパク質は、ＡＴＰ結合タンパク質として機能しなければならないことが、これがこのクラスのタンパク質のサインを保持するので、示唆される。 【００４６】
実施例６仮説的なタンパク質の機能の予測 配列ＧＩＶＧＬＰＮＶＧＫＳを有する別の不変のペプチドが、７つの試験されたうちの６つの細菌（M．tuberculosisを除く）においてＧＴＰ結合機能を有するタンパク質において見出され、ここでは同じ不変の配列がM． tuberculosisにおけるＲｖ１１１２遺伝子によってコードされる仮説的なタンパク質に存在する。 この仮説的なタンパク質は、ＧＴＰ結合特性を有し得ることが、これがこのクラスのタンパク質のサインを保持するので、強く示唆される。 【００４７】 実施例７不変のペプチドモチーフに基づく薬剤標的の同定 酵素ＤＮＡジャイレースは、ＤＮＡの高次コイルを減少することが知られる。
このタンパク質はヒトに不在であり、過去数年間標的として考慮されてきた。 しかし、薬剤分子が標的化されるべき正確な配列は未だ明らかでない。 多くの病原性および非病原性細菌のＤＮＡジャイレースベータサブユニットにわたって不変であるが、宿主において不在であるＶＲＫＲＰＧＭＹＩＧ、ＬＨＡＧＧＫＦＤ、
ＳＧＧＬＨＧＶＧ、ＬＰＧＫＬＡＤＣ、ＶＥＧＤＳＡＧＧ、およびＱＲＹＫＧＬ
ＧＥＭのような不変のペプチドは、細菌感染に対する潜在的な薬剤標的として使用され得る構造的決定因子である。 これらのペプチドのうちの３つの結晶構造が図４において示される。 【００４８】
実施例８未知の機能のタンパク質への機能の割り当て 本発明の方法の補助を伴って、以下の工程を用いることによって、公的に利用可能なデータベース（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ）において他のタンパク質配列に対し相同性なし／弱い相同性を示す未知の機能のタンパク質に機能を割り当て得る：
Ｉ． 未知の機能のタンパク質配列からの重複するペプチドライブラリーをコンピューター処理的に作製する工程、 ＩＩ． 上述のように得られた長さ「Ｎ」（Ｎはアミノ酸のスライディングウインドウの長さである）のペプチドを、単一文字アミノ酸コードに従って、アルファベット順にコンピューター処理的に選別する工程、 ＩＩＩ． 全ての機能的に公知のタンパク質のペプチドライブラリーと、現在のライブラリーとをコンピューター処理的にマッチングして共通のペプチドを得る工程、 ＩＶ． 元来のタンパク質においてこれらの共通のペプチドをコンピューター処理的に配置し、そして続いてそれらの起源および位置でそれらを標識する、工程、
Ｖ． 重複する共通のペプチドをコンピューター処理的に合わせて、不変のペプチド配列の長い鎖を得る、工程、 ＶＩ． ペプチド配列同一性の最大の長さが見出されるタンパク質の機能に基づいて未知のタンパク質に機能を割り当てる工程。 【００４９】 類似の機能のタンパク質との適合の数が多いほど、機能的な割り当ての尤度が高くなる。 【００５０】 利点： １． 本発明の主要な利点は、不変のペプチド配列モチーフサインを達するために、ある生物体の多数（数千個）のタンパク質と、他の生物体のタンパク質とのゲノム様式の同時比較の新規な方法を提供することである。 ２． これは、不変のペプチドモチーフの同定の迅速な方法を提供する。 ３． これは、複雑な数学的算定を全く含まないので、不変のペプチドモチーフを決定する簡便なおよび非常に正確な方法を提供する。 ４． これは、広範囲の抗細菌化合物についてのスクリーニングアッセイについての基礎を提供する。 【００５１】 参考文献： Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ． Ｆ． 、Ｃａｒｏｌ，Ｒ． Ｊ． 、＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ． Ｊ
． （１９９０）。 基本的な局所的アラインメントサーチ道具。 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉ
ｏｌ． ２１５、４０３-４１０。 Ｃｕｔｌｅｒ Ｎ． Ｓ． 、Ｈｅｉｔｍａｎ Ｊ． 、Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｍ． Ｅ．
、（１９９９）。 酵母から哺乳動物まで保存されるシグナル伝達経路におけるＴ
ＯＲキナーゼホモログ機能。 Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １５５
（１-２）、１３５-１４２。 Ｇｈａｎｎｏｕｍ、Ｍ． Ａ． およびＲｉｃｅ、Ｌ． Ｂ． （１９９９）。 抗真菌剤：作用の態様、耐性の機構、および細菌耐性とこれらの機構との相関。 Ｃｌｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １２(４)、５０１-５１７。 ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｄ． Ｇ． 、Ｃｕｄｉｃ、Ｐ． 、Ｙｕ、Ｍ． Ｋ． 、Ｂｅｈ
ｅｎｎａ、Ｄ． Ｃ． 、Ｋｒｕｇｅｒ、Ｒ.、（１９９９）。 ペプチド抗生物質機構における相乗作用および二様性。 Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ
３（６）、６７２-６８０。 Ｐｏｒｓｅ、Ｂ． Ｔ． 、＆Ｇａｒｒｅｔｔｅ、Ｒ． Ａ． (１９９９)。 リボソーム機構、抗生物質、およびＧＴＰ加水分解。 Ｃｅｌｌ ９７、４２３-４２６。 Ｐｒｅｓｅｎｅｌｌ、Ｓ． Ｒ． 、Ｃｏｈｅｎ、Ｂ． Ｉ． 、＆ Ｃｏｈｅｎ、Ｆ．
Ｅ． 、（１９９２）。 タンパク質二次構造予測に対するセグメントベースのアプローチ。 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１、９８３-９９３。 Ｒｏｏｍａｎ、Ｍ． Ｊ． 、＆ Ｗｏｄａｋ、Ｓ． Ｊ． （１９８８）。 タンパク質構造データベースサイズによって制限される予測的な配列モチーフの同定。 Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３５、４５-４９。 Ｗｉｌｂｕｒ、Ｗ． Ｊ． 、＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ． Ｊ． （１９８３）。 核酸およびタンパク質データバンクの迅速な類似性サーチ。 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０、７２６-７３０。 Ｗｉｍｂｅｒｌｙ、Ｂ． Ｔ． 、Ｇｕｙｍｏｎ、Ｒ． 、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ、Ｗ
ｈｉｔｅ、Ｓ． Ｗ． 、＆ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ、Ｖ． 、（１９９９）。 リボソーム活性部位の詳細な見解：Ｌ１１-ＲＮＡ複合体の構造。 Ｃｅｌｌ ９７
、４９１-５０２。 【図面の簡単な説明】 【図１】 図１は、ペプチドライブラリーマッチングプログラムの論理回路を示す。 【図２】 図２は、ペプチド抽出プログラムの論理回路を示す。 【図３】 図３は、ペプチドステッチングプログラムの論理回路を示す。 【図４】 図４は、ＤＮＡジャイレースＢタンパク質からの３つの不変のペプチド（ＶＲ
ＫＲＰＧＭＹＩＧ、ＬＨＡＧＧＫＦＤ、およびＳＧＧＬＨＧＶＧ）の結晶構造を示す。
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