现代药品开发、疾病诊断、基因发现、以及多种与基因有关的技 术和研究越来越依赖于制备、筛选、以及检测大量的化学和/或生化化 合物。传统的一次一种的制备和检测化合物的方法变得越来越不够用 了。因此需要有一种化学/生化反应系统，来进行高通量的合成，并且 检测包括DNA杂交及氢键反应的化学及生化反应。
以微阵列形式对化学/生化化合物进行平行合成和分析是一种效 率最高并且最有效的高通量的方法。将以半导体为基础的光刻法和固 相有机化学组合在一起的光引发芯片(on-chip)平行合成，已经被开 发用于很大规模地制备寡核苷酸和肽的微阵列(Pirrung等，美国专利 US 5,143,854)。所述微阵列已经提供了用于筛选生物活性的合成分子 库(Pease等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5022-5026(1994))。
Pirrung等描述了一种在涂布有连接分子的平面基片上合成寡核 苷酸的方法。所述连接分子的末端含有一个活性官能团，如利用可光 除去的保护性基团保护的羟基。应用以光掩膜为基础的平版印刷方法， 可光除去的保护性基团通过第一个光掩膜进行曝光，并且在选定区域 内从连接分子上除去。洗涤基片，然后使之与亚磷酰胺单体接触，所 述亚磷酰胺单体与连接分子上暴露的羟基反应。每个亚磷酰胺单体分 子在其羟基末端上含有一个可光除去的保护性基团。利用第二个光掩 膜，然后使基片曝光，并且重复该过程直到寡核苷酸阵列形成，从而 使所有需要的寡核苷酸分子都在预定的位置形成。然后使之暴露于带 有荧光标记的生物受体，可以测试寡核苷酸阵列的生物活性，并且利 用所述受体培育整个阵列。如果所述受体与阵列中的任何寡核苷酸分 子相连，则荧光标记的位置可以光学检测到。该荧光数据可以输送给 计算机，计算机将计算哪个寡核苷酸分子进行了反应以及反应的程度。
对分子阵列的合成来说，上述方法有几个明显的缺点：(a)涉及 利用可光除去的保护性基团的合成化学是复杂并且昂贵的；(b)与常规 方法相比，该合成方法每步的产率(每个单体添加步骤的产率)较低， 并且该方法不能产生高纯度的寡聚体产物；(c)对光刻法来说，需要大 量的光掩膜(制备含有20个碱基长的寡核苷酸的微阵列需要多达80 个光掩膜)，因此该方法是昂贵的，并且对改变微阵列设计来说是不灵 活的。
另外一种进行平行化学/生化反应的方法依赖于利用微流动设备， 所述设备包括阀、泵、压缩器、混合器以及其它结构(Zanzucchi等， 美国专利US 5,846,396)。这些流动设备控制不同量和/或不同种类的 化学反应物输送给各相应的反应容器，从而促进各反应容器中的不同 的化学反应。这种方法可以应用传统化学，因此能够处理各种化学/ 生化反应。但这类流动设备复杂且其制造成本高。因此该方法不适于 制备低成本的化学/生化微阵列。
本发明通过利用新开发的进行光引发化学反应的化学方法(Gao 等，J.Am.Chem.Soc.120，12698-12699(1998)和WO09941007A2)， 简化了用于平行进行离散化学反应的流动设备的结构。已经发现在另 一种传统DNA合成的去封闭(deblock)反应中，通过用原位光生酸(PGA) 代替标准酸(如三氯乙酸)，可以有效地利用光来控制在固体载体上 DNA寡聚体分子的合成。所述光酸的前体和所产生的酸都处于溶液相 中。该新方法的主要优点包括对已经建立好的传统合成过程的改动最 小，可商购得到并且所涉及的化学反应物成本低，以及比利用传统合 成方法所能达到的更高的产率。通过利用各种适当选择的光生反应物 (PGR)，例如光生酸和碱，可以将这种方法扩展到控制或引发其它利用 光的化学/生化反应。
利用PGR在固体表面上平行合成各种分子的微阵列的方法以前被 Gao等在WO09941007A2中公开，在此作为参考引入其中的教导。平行 合成中的一个重要步骤是在固体表面上形成离散的反应位点，从而在 光生反应物参加化学反应的过程中，使光解过程产生的反应物能够被 限制在选定的位点上。在固体表面上分别利用物理隔栅和低表面张力 的图案膜来形成隔离的微孔和小滴。这种方法可有效防止相邻反应位 点间的串扰(crosstalk)(由于扩散和/或流体流动造成的质量传递)。 但在光生反应物生成并且参加相应的反应的过程中，限制在反应位点 的液体必须保持基本静止，即在反应过程中没有流体流动。这种缺乏 流体流动可能会限制在液体反应物和反应固体表面之间的质量传递， 因此对相应的反应速率来说可能会有负面影响。
上述方法的另一个潜在问题是由于曝光过程中自由基的产生，可 能会有副反应。另外，反应固体表面经常是透明视窗的一部分，通过 该视窗进行光照，因此在固体表面上可能会发生不希望的已合成分子 的光子诱导降解。
因此，希望在以下方面进行改进：强化质量传递同时保持离散反 应位点隔离、减小基团诱导的副反应的可能性、以及避免光照诱导的 降解反应。优选地，利用简单并且低成本的流动设备结构可以同时达 到上述改进目标。

一方面，提供一种改进的微流动反应器，该反应器包括多个用于 平行化学反应的流通反应池，每个反应池包括(i)至少一个照射室，和 (ii)至少一个反应室，其中在反应池中，照射室和反应室流动连通， 但在空间上是分隔开的。
另一方面，提供一种改进的微流动反应器，该反应器包括多个用 于平行化学反应的流通光照反应池，该反应池与至少一个入口通道和 至少一个出口通道流体连通。
具体地，本发明提供一种微流动反应器，包括：i.多个流通反应 池，每个反应池包括至少一个照射室和至少一个反应室，其中照射室 和反应室流动连通；ii.与多个流通反应池流体连通的至少一个入口通 道和至少一个出口通道；以及iii.与各反应池相连的至少一个节流 孔；其中所述节流孔限制反应池内的液体溶液流回入口通道，或者限 制出口通道内的液体溶液流回反应池。
更具体地，本发明提供一种微流动反应器，包括至少一个微流动 模板和至少一个附着于模板上的视窗板，所述微流动模板和视窗板定 义了多个反应池，而这些反应池提供通过反应池的液体溶液的流量， 每一个反应池包括一个与第二室流体连通但在空间上隔开的第一室， 第一室适合用作照射室，而第二室适合用作反应室。
更具体地，本发明提供一种适合于原位应用溶液中的光生反应物 的微流动反应器，其中反应器包括入口通道、照射室、连接通道、反 应室和出口通道，其中照射室与入口通道相连，连接通道连接照射室 和反应室，而出口通道与反应室相连。
又一方面，提供另一种微流动反应器的实施方案、以及所述改进 的微流动反应器的使用方法和制备方法。
附图说明
图1A示意性描述了利用光生反应物的流通反应器系统的操作原 理。在具有隔开的照射室和反应室的反应池中，进行照射和涉及光生 反应物的化学/生化反应。
图1B示意性描述了利用光生反应物进行平行化学反应的流通反应 器系统的操作原理。在具有隔开的照射室和反应室的反应池中，进行 照射和涉及光生反应物的化学/生化反应。
图1C示意性描述了利用光生反应物的流通反应器系统的操作原 理。在反应池中进行照射和涉及光生反应物的化学/生化反应，其中照 射室和反应室组合在一起。
图1D示意性描述了利用光生反应物进行平行化学反应的流通反应 器系统的操作原理。在反应池中进行照射和涉及光生反应物的化学/ 生化反应，其中照射室和反应室组合在一起。
图2A示意性描述了单入口单出口的流通多池反应器系统的双层设 备构造的流路。
图2B示意性描述了单入口多出口的流通多池反应器系统的双层设 备构造的流路。
图2C示意性描述了单入口单出口的流通多池反应器系统的单层设 备构造的流路。
图2D示意性描述了单入口多出口的流通多池反应器系统的单层设 备构造的流路。
图3A为体现本发明的流通多池反应器设备的剖视图。
图3B示意性描述了图3A所示的微流动设备的横截面，以及该设 备的操作原理。
图3C示意性描述了图3B所示的流通多池反应器的一种变化，其 中带有附着于视窗内表面和反应室顶部表面的固定化合物。这种变化 还包括在视窗内表面上的遮蔽屏(shadow mask)。
图3D为包括垂直毛细管反应室的流通多池反应器设备的剖视图。
图4A为体现本发明的高密度流通多池反应器设备的剖视图。
图4B示意性描述了图4A所示的微流动设备的横截面，以及该设 备的操作原理。
图5A为体现本发明的单层流通多池反应器设备的剖视图。
图5B示意性描述了图5A所示的微流动设备的第一横截面，以及 该设备的操作原理。
图5C示意性描述了图5A所示的微流动设备的第二横截面，以及 该设备的操作原理。
图5D示意性描述了图5A所示的微流动设备的横截面，其反应室 的内表面涂布有基片材料的薄层。
图5E示意性描述了微流动阵列芯片设备，该设备包括图5A所示 的微流动结构、二元流动分配通道、以及入口和出口。
图5F示意性描述了微流动阵列芯片设备，其中含有两个用于多个 样品检测的阵列。
图5G示意性描述了微流动阵列芯片设备，其中含有渐缩的流体通 道。
图5H示意性描述了微流动阵列芯片设备，其中含有渐缩流体通道 的另一种变化。
图6A为体现本发明的高密度、单层流通多池反应器设备的剖视图。
图6B示意性描述了图6A所示的微流动设备的横截面，以及该设 备的操作原理。
图7A示意性描述了带有其中装有小球的反应室的流通多池反应器 的一种变化，其中在所述反应室中发生固相化学反应。
图7B示意性描述了其反应室中装有填料的流通多池反应器的一种 变化，其中在所述反应室中发生固相化学反应。
图8示意性描述了带有其中装有小球的反应室的单入口多出口的 流通多池反应器的流路，其中在所述反应室中发生固相化学反应。
图9A为注入第一液体的微流动设备的剖视图(所述液体可以在图 9D中看到)。
图9B示意性描述了当第二液体通过第一流体通道送入同时第二流 体通道中不允许有流动时，微流动设备的透视图(所述液体可以在图 9E中看到)。
图9C示意性描述了当第二液体通过第二流体通道送入同时第一流 体通道中不允许有流动时，微流动设备的透视图(所述液体可以在图 9F中看到)。
图9D示意性描述了图9A所示的微流动设备的横截面。该设备注 入第一液体。
图9E示意性描述了在第一组流体通道注入第二液体后，图9B的 微流动设备的横截面。
图9F示意性描述了在第二组通道注入第二液体后，图9C的微流 动设备的横截面。
图9G示意性描述了允许流体通过液体通道的流体结构。
图10A示意性给出了已经制造好的微流动多池反应器设备的剖视 图。
图10B给出了用作微流动模板初始原料的晶片基片。
图10C给出了在微流动模板制造过程中经过第一蚀刻步骤后的板 状基片。
图10D给出了在微流动模板制造过程中经过第二蚀刻步骤后的板 状基片。
图10E给出了完成后的微流动模板。
图10F给出了完成后的微流动阵列设备的照片。
图11给出了寡核苷酸阵列的荧光图像。
图12给出了利用二氢荧光素标记的目标杂交后的寡核苷酸阵列的 荧光图像。

术语的定义：
术语“光生反应物前体”(PRP)指的是当其用确定波长的光子辐射 或照射时，能产生一种或多种反应性化学反应物的化合物。所述波长 可以是任合合适范围内的红外线、可见光、紫外线或X-射线。
术语“光生酸前体”(PGAP)指的是当其用确定波长的光子辐射或 照射时，能产生酸的化合物。所述波长可以是任合合适范围内的红外 线、可见光、紫外线或X-射线。
术语“光生酸”(PGA)指的是酸，该酸由PGAP在确定波长的光子 辐射或照射下产生。所述波长可以是任合合适范围内的红外线、可见 光、紫外线或X-射线。
术语“光生反应物”(PGR)指的是化合物，该化合物由光生反应物 前体的辐射或照射产生。在大多数情况下，PGR是所涉及的化学或生 化反应中的反应物。但该术语可以用于指任意由光生反应物前体辐射 得到的化合物，并且在某些化学/生化反应中，它可以是反应性的，也 可以不是。
术语“探测分子”指的是配体分子，它被用于与其它化学实体相 连，并形成更大的化学复合物，从而可以检测到所述化学实体的存在。 优选地，在适当的化学和物理条件范围内，如pH值、盐浓度和温度， 探测分子选择性地连接到其它特定化学序列、特定构象以及任何其它 特定化学或物理性质的化学实体上。
方法
本发明提供一种在离散的反应容器中进行平行化学/生化反应的 方法。本发明一个优选方面是利用原位生成的化学反应物去影响和/ 或引起感兴趣的化学/生化反应。图1A示意性描述了利用光生反应物 的流通反应器系统的操作原理。含有至少一种光生反应物前体的溶液 111流过入口通道101进入照射室103。在照射室103中照射光hν使 光生反应物前体产生活性化学反应物。然后含有活性化学反应物的溶 液112流过连接通道104进入反应室105，在反应室105中含有处于 溶液相中或位于固相基片上的反应性化合物和/或物质，从而引起化 学/生化反应。在反应室105中的反应性化合物和/或物质可以被固定 在室内，或者通过单独的通道(图1A中未画出)输送到室中。化学/生 化反应进行后，流出物113通过出口通道107流出反应器系统。
在本发明的一个方面中，作为反应池一部分的照射室103和反应 室105在空间上是分隔开的，从而可以防止照射光hν用于反应室 105。另外，从照射室103出来后，溶液112优选在连接通道104中 停留足够长的时间，从而在溶液112进入反应室105之前，使在照射 室103中可能产生的任何自由基均失去活性。对于溶液112在连接通 道104中停留的时间优选长于自由基的半衰期。对于溶液112在连接 通道104中停留的时间更优选长于自由基半衰期的两倍。这将使反应 池的反应室105中不希望的自由基诱导的副反应发生的可能性最小。
应该理解的是本发明并不排除反应池的照射室103和反应室105 相互部分或全部重叠的情况。图1C示意性描述了一个具有反应池的 反应系统，其中的反应池在一个室143中进行光照和化学/生化反 应。这种重叠方案在某些情况下是优选的，例如当重叠允许制造更简 单和/或更便宜的反应器设备时。在全部重叠的实施方案中，因为只 有一个单一的组合室，术语反应池和反应室可以互换使用。
图1B示意性描述了利用光生反应物进行平行化学反应的流通反 应器系统的操作原理。含有至少一种光生反应物前体的溶液131通过 入口120流入反应器系统。然后溶液131通过一个公用入口通道121 和分支入口通道121a、121b、121c和121d分别进入反应池的照射室 123a、123b、123c和123d。对于相应的照射室123a、123b、123c和 123d应用预定的照射光hνa、hνb、hνc和hνd，从而由光生反应物前体 生成活性化学反应物。在本发明的一种实施方案中，所有照射光均包 含相同的波长分布，只是其强度不同。在这种情况下，优选调节照射 光和溶液131中光生反应物前体的浓度，使产生的活性化学反应物的 量与照射光的量或强度成比例。这样所产生的溶液132a、132b、 132c和132d均含有相应浓度的活性化学反应物。然后溶液132a、 132b、132c和132d流过连接通道124a、124b、124c和124d进入反 应池相应的反应室125a、125b、125c和125d，这些反应室中含有处 于溶液相或位于固相基片上的反应性化合物和/或物质，从而引起相 应程度的化学/生化反应。在反应池的反应室125a、125b、125c和 125d中的反应性化合物和/或物质可以被固定在室中或通过单独的通 道(图1B中未画出)输送到室中。然后流出物133a、133b、133c和 133d通过出口通道127a、127b、127c和127d流出反应器系统。
在本发明的另一种实施方案中，溶液131含有多种光生反应物前 体，这些前体具有不同的激励波长并产生不同的化学反应物。在这种 情况下，通过应用不同波长分布的照射光hνa、hνb、hνc和hνd，在相 应的照射室123a、123b、123c和123d中生成不同的化学反应物。这 样在相应的反应室125a、125b、125c和125d中可以同时进行不同类 型的化学反应。本发明可以按人们的意愿并且在实验条件允许的条件 下，用于进行尽可能多的平行化学反应。
对于某些应用，其中照射光不会造成明显的不利化学/生化反 应，或者简化的反应器结构是首要考虑的问题时，在反应池中可以不 必具有单独的照射室和反应室。图1D示意性描述了进行平行化学反 应的反应器系统，其中光照和化学/生化反应在单个池或室163a、 163b、163c和163d中进行。
设备构造：
图2A示意性描述了单入口单出口的流通多池反应器系统的双层 设备构造。公用入口221、分支入口221a、221b、221c和221d、以 及照射室223a、223b、223c和223d设置在第一层上。连接通道 224a、224b、224c和224d使反应池第一层的照射室与第二层的反应 室225a、225b、225c和225d分别相连。各反应室的流出物流过出口 227a、227b、227c和227d，合并进入公用出口227，然后流出反应 器系统。对于这种构造，由照射室、连接通道和反应室组成的各反应 池均为各化学/生化反应的发生提供了宿主(host)。这种构造特别适 合于进行平行固相化学/生化反应和/或合成，其中反应产物保留在固 体载体/表面上，出自各反应池的流出物不需要单独收集。由于只有 一个公用入口和一个公用出口，反应器系统很容易构造和操作，并且 特别适合于低成本应用。
除了涉及光化学反应的步骤外，图2A所示的反应器系统的典型 应用通常包括许多反应和淋洗步骤。对于大多数步骤，特别是那些涉 及光化学反应的步骤来说，图2A中的箭头指的是流体流动的方向。 但在某些步骤中，特别是那些需要延长反应物接触或搅拌的步骤来 说，反向流动是允许的，或者甚至是希望的。在以图2A所示的结构 为基础设计和构造实际设备时，应该采取措施避免光化学反应期间反 应池之间的串扰(化学混合)。例如，通道和入口应该足够长，从而使 从照射室223a、223b、223c和223d到公用入口221之间的反向扩散 可以忽略。入口221a、221b、221c和221d的合适长度的确定是以扩 散速度和流体在入口内的停留时间为基础的，这对于流体流动和质量 传递领域的熟练技术人员来说是公知的。
对于某些应用来说，其中照射光不会造成明显的不利化学/生化 反应，或者简化的反应器结构是首要考虑的问题时，可以通过合并所 述池相应的照射室和反应室，使反应器的结构进一步简化，形成如图 2C所示的单层设备构造。流体通过公用入口261、分支入口261a、 261b、261c和261d，进入各反应池263a、263b、263c和263d，这 些反应池同时作为照射室和反应室。各反应池的流出物流过出口 267a、267b、267c和267d，合并进入公用出口267，然后流出反应 器系统。
图2B示意性描述了用于单入口多出口的流通多池反应器系统的 双层设备构造。对于这种构造，来自各反应室225a、225b、225c和 225d的流出物可以在相应的出口228a、228b、228c和228d处被收 集，而其余的设备结构和功能与图2A所示的类似。这种构造特别适 合于其中化学/生化反应的产物以溶液相存在并且需要单独收集用于 分析或其它用途的那些应用。
图2D示意性描述了用于单入口多出口的流通多池反应器系统的 单层设备构造。这种构造的大部分结构和功能均与图2B所示的类 似，只是各反应池263a、263b、263c和263d的流出物在相应的出口 268a、268b、268c和268d处收集。对于其中照射光不会造成明显的 不利化学/生化反应，或者简化的反应器结构是首要考虑的问题的应 用，这种构造是本发明的优选实施方案。
图3A描述了一种流通多池反应器设备的剖视图，这是本发明的 一种优选实施方案。在该设备中，微流动模板310被夹在第一视窗板 351和第二视窗板361之间。当反应池较小时，微流动模板310优选 由硅制成。在这种情况下，相邻反应池间的距离优选为10-5000μm。 更优选地，该距离为10-2000μm。进一步优选地，该距离为10- 500μm。甚至更优选地，该距离为10-200μm。所述硅微流动模板310 用蚀刻法形成，该蚀刻法对半导体处理和微制造(Madou，M.，微制造 基础(Fundamentals of Microfabrication)，CRC Press，New York，(1997))领域的熟练技术人员来说是公知的。微流动模板310的 顶部表面313优选涂布有二氧化硅，该涂布可以在制造过程中通过氧 化或蒸发来完成。当反应池较大时，例如相邻反应池之间的距离大于 5000μm时，塑料材料是优选的。即使当相邻反应池之间的距离小于 5000μm时，对于大量生产多池反应器设备来说，塑料材料也可以是 优选的。优选的塑料包括聚乙烯、聚丙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、以 及聚四氢乙烯，但不局限于此。所述塑料微流动模板310可以应用模 塑法制造，这种模塑法对于塑料处理领域的熟练技术人员来说是公知 的。本发明的一个方面，第一视窗板351和第二视窗板361优选由透 明玻璃制成，并与微流动模板310结合在一起。在本发明的另一个方 面中，第一视窗板351和第二视窗板361优选由透明塑料制成，该透 明塑料包括聚苯乙烯、丙烯酸以及聚碳酸酯，但不局限于此，其优点 在于成本低和易于处理。
图3A所示的微流动设备体现了图2A所示的双层设备构造。在图 中看不到的微流动模板310底部的外形结构为在图中可以看到的顶部 的镜像。图3B示意性描述了图3A所示的微流动设备的横截面，以及 该设备的操作原理。第一视窗板351和第二视窗板361在微流动模板 310的结合部位311和315与微流动模板310结合或附着在一起。结 合或附着可以用共价或非共价的方法来完成。在涉及利用光生反应物 的反应过程中，含有光生反应物前体的进料溶液331从入口321流过 入口节流孔322进入照射室323。在照射室323中曝光hν后，产生活 性化学反应物，并且所形成的反应性溶液332流过连接通道324进入 反应室325。在反应室325中，反应性溶液332与微流动模板310顶 部表面313上的固定分子340接触。反应性溶液332中的活性反应物 与固定分子340间发生化学反应。然后溶液流过出口节流孔326作为 流出物333进入出口327。
在微流动模板310的脊312和第一视窗板351的内表面352之间 形成的入口节流孔322，其功能是阻止在照射室325内产生的任何化 学反应物反向进入入口321区域。类似地，在微流动模板310的脊 314和第二视窗板361的内表面362之间形成的出口节流孔326是为 了阻止在出口327区域内的任何化学反应物进入反应室325。当在窄 的节流孔中由于流体流动所造成的质量传递大于由于扩散所造成的 时，即可实现这一点。
在一种优选实施方案中，入口321和出口327通道的截面积要足 够大，从而使通过通道的压降明显小于通过各单个反应池的压降，每 个反应池均包括入口节流孔322、照射室323、连接通道324、反应 室325以及出口节流孔326。另外，每个反应器系统中的所有反应池 优选同样地进行设计和构造。为了在所有反应池中均达到相同的流 量，从而达到均一的反应条件，这些措施是必须的。
图3C示意性描述了一种改进微流动设备的横截面。在第二视窗 361的内表面362上加一个遮蔽屏364。在进行光测量过程中，例如 通过第二视窗361进行的荧光成像，遮蔽屏364排除了由于微流动模 板310外形特点的可能的光干扰。遮蔽屏364可以由金属薄膜或任何 其它合适的不透明材料制成，所述材料包括铬、铝、钛和硅，但不局 限于此。所述膜可以通过各种公知的薄膜沉积法很容易地制成，例如 电子束蒸发法、喷镀法、化学气相沉积以及真空气相沉积，这些方法 对半导体处理和微制造领域的熟练技术人员来说是公知的(Madou，M.， 微制造基础(Fundamentals of Microfabrication)，CRC Press，New York，(1997))。
图3C所示的本发明的另一方面是在微流动模板310的顶部表面 313和第二视窗361的内表面362上分别使用了固定分子341和 342。在其中使用固定分子341和342作为探测分子的微流动设备的 检测应用中，使用双层构造的优点是增加了探测物的面积密度，因此 增加了检测的敏感度。
图3D给出了本发明的微流动设备的另一种变化。在这种变化 中，反应室325为毛细管形式，在反应室325的垂直壁313上有固定 分子(图中未画出)。所述毛细管的直径优选为0.05-500微米。所述 毛细管的直径更优选为0.1-100微米。这种变化的主要优点是与图 3A所示的变化相比，反应室壁313的表面积有可能增加。对检测应 用来说，增加表面积有利于增加固定分子的量，从而有可能增加检测 的敏感度。在光引发的化学合成过程中，反应性溶液(图3D中未画出) 流过入口流体通道321进入照射室323。当反应性溶液含有光生反应 物前体时，并且当预定的照射室323通过透明视窗351进行曝光时， 反应物生成并向下流入反应室325，在其中反应物与垂直壁313上的 固定分子间发生化学反应。反应物流体通过出口流体通道327流出。
图4A描述了高密度流通多池反应器设备的剖视图，该设备体现 了图2A所示的双层设备构造。图4B示意性描述了图4A所示设备的 横截面。与图3A所示设备结构相比，图4A所示设备结构的反应室 425和照射室423的面积密度更高。入口通道421和出口通道427埋 入微流动模板410的中部，从而可以使微流动模板410的上部和下部 表面积分别完全用于形成反应和照射室。在涉及使用光生反应物的反 应中，含有光生反应物前体的进料溶液431从入口管422流入照射室 423。在照射室423中通过第一视窗板451曝光hν后，产生了活性化 学反应物，并且所得到的反应性溶液432流过连接通道424进入反应 室425。在反应室425中，反应性溶液432分别与微流动模板410顶 部表面413和第二视窗板461内表面462上的固定分子441和442接 触。反应性溶液432中的活性反应物与固定分子441和442间发生化 学反应。然后流出物433经出口管426流入出口通道427。
图5A描述了流通多池反应器设备的剖视图，所述设备体现了图 2C所示的单层设备构造。图5B和图5C示意性描述了图5A所示设备 的横截面。在结合区域515处结合的微流动模板510和视窗板561之 间形成微流动结构。在该实施方案中，曝光和涉及光生反应物(PGRI) 的化学/生化反应在一个组合反应室或池525中进行。入口通道521 和出口通道527均位于微流动模板510的一侧。这种设备构造的优点 是设备结构简单，因此有可能降低制造成本。
图5C示意性描述了固定分子541、542和543在三维反应室或池 525的内表面的全部四个面上的三维附着情况。反应室525由视窗板 561的内表面562、流动模板510顶部表面513的上表面和侧壁512 组成。对微流动设备的检测应用来说，固定分子541、542和543用 做探测分子。与在平面表面上相比，图5C所示的三维附着增加了探 测分子的量，因此增加了检测的敏感度。
在利用光生反应物的反应过程中，含有光生反应物前体的进料溶 液531从入口通道521流入反应室525。当对反应室进行光照时，产 生至少一种活性反应物，然后该反应物与固定分子541、542和543 反应。流出物533流过出口节流孔526进入出口通道527。流动模板 510上的脊514在反应室525的入口和出口侧形成流量限制孔526。
本发明的微流动阵列设备可以通过在如图5D所示的反应室或池 中引入多孔膜543a和543b，以增加的量来产生或固定分子。几种材 料和制造方法可以用于形成所述设备内部的多孔膜，这些材料及制造 方法均是固相合成领域的熟练技术人员所公知的 (“组合化学实用指 南”，(“A Practical Guide to Combinatorial Chemistry”) Czarnik等编，American Chemical Society，1997，此处作为参考 引入)。一种方法是在设备制造过程中，在形成流动模板510的硅晶 片上形成受控多孔玻璃膜。在第一种优选方法中，通过等离子气相沉 积将硼硅酸盐玻璃膜沉积在硅晶片上。对所述晶片进行热退火，形成 分开的硼和硅氧化物区。然后利用酸蚀刻法选择性除去硼，形成多孔 玻璃膜，这种膜对寡核苷酸和其它合成过程来说是优良的基片材料。 在第二种优选方法中，形成聚合物膜，如交聚的聚苯乙烯膜。将含有 线性聚苯乙烯的溶液和UV活化的交联试剂注入到微流动阵列设备 中，随后从中排出，而在所述设备的内表面上留下薄膜涂层。接着将 所述含有不透明罩564来限定反应室区域的设备在紫外光下曝光，从 而活化在反应室区域内的线性聚苯乙烯链之间的交联。接下来用溶剂 洗涤以除去未交联的聚苯乙烯，在图5D所示反应室区域中仅留下交 联聚苯乙烯。对寡核苷酸和其它合成过程来说，交联聚苯乙烯也是优 良的基片材料。
图5E示意性描述了本发明微流动阵列设备芯片500的第一种优 选实施方案。二元流动分布器521a用于将来自入口520的流体均匀 分配给流体通道521。除了侧面流体通道521b以外，所有的流体通 道521优选具有相同的宽度，而侧面流体通道521b优选比中间流体 通道521窄，从而补偿在侧面流体通道521b中减少的体积流量。通 常，流体通道521的横截面积优选明显大于反应室525(图5C)的横截 面积，从而达到沿着流体通道521通过所有反应室525的均匀流量。 所述横截面积比优选为10-10,000。所述比更优选为100-10,000。所 述比甚至更优选为1,000-10,000。另一方面，人们可能会选择适当 小的横截面积比，从而使反应室525的芯片表面积的利用最大化。
对于多种样品的检测应用，可以将多个微流动阵列设备设置在单 个芯片501上。图5F描述了含有两个微流动阵列设备的芯片501。 这种类型的多检测芯片可以用于临床实验室中的诊断应用，以及工业 和研究实验室中的高通量筛选应用。
流体通道可以不必是沿其路径具有均匀宽度的直线。图5G描述 了本发明的微流动阵列设备的第二种优选实施方案，其中具有渐缩流 体通道521。渐缩通道525的侧壁可以不必是沿着通道的直线。当渐 缩形状适当设计时，可以达到沿流体通道521通过所有反应室525的 均匀流量。对于那些本领域熟练技术人员来说，应用流体动力学模拟 方法，可以得到适当的流体通道形状，从而产生所希望的沿着通道通 过反应室的流型。可采用商业计算的流动动力学软件包，如来自 Fluent Inc.New Hampshire，USA的FLUENT及来自CFD Research Corporation，Alabama，USA的CFD-ACE均可得到，并可用于得到通 道形状。
第三种优选的流体通道设计如图5H所示。每对入口和出口流体 通道521c和521d有利于沿着通道仅有一排反应室525的流体流动， 而不是图5G中所示的两排反应室525的情况。这种流体通道设计的 优点在于流体通道内简化了的流体流动，并且排除了通过公用流体通 道相邻反应室间交叉混合的可能性。
对池的最大个数没有特别限制。依据所希望的芯片用途、反应室 的尺寸以及芯片的尺寸，本发明每个芯片上反应池个数的优选范围为 10-1,000,000。更优选的范围为100-100,000。甚至更优选的范围为 900-10,000。优选有至少两个池，更优选为至少10个池。甚至更优 选有至少100个池。甚至进一步优选有至少1,000个池，甚至更优选 有至少10,000个池。
图6A描述了流通多池反应器设备的剖视图，为图2C所示单层设 备构造的另一种实施方案。图6B示意性描述了图6A所示设备的横截 面。支持板651和视窗板661在微流动模板610的结合区域611和 615处与微流动模板610结合。入口通道621和出口通道627位于支 持板651和微流动模板610之间。曝光和涉及光生反应物(PGRI)的化 学/生化反应在反应室或池625中进行，该反应室或池在视窗板661 和微流动模板610之间形成。遮蔽屏664被引入该设备设计中，从而 光学限定在视窗板661上的反应室625。该反应器构造允许微流动模 板610的视窗侧完全用于形成反应室625，并且特别适用于高密度检 测应用。
在利用光生反应物的反应过程中，含有光生反应物前体的进料溶 液631从入口通道621流过入口管624进入反应室或池625。当反应 室被照射时，产生至少一种活性反应物，然后该反应物分别与流动模 板610的顶部表面613和视窗板661的内表面622上的固定分子641 和642反应。流出物633流过出口管614进入出口通道627。
图7A示意性描述了其中在反应室中装有小球的流通多池反应器 的一种变化，其中在所述反应室中发生固相化学反应，是图2B所示 的双层设备构造的另一种实施方案。制造小球741的材料包括 CPG(受控多孔玻璃)、交联聚苯乙烯、以及用于固相合成和分析的各 种树脂，但不局限于此，对于所述树脂在“ 组合化学实用指南”(A Practical Guide to Combinatorial Chemistry)Czarnik等编， American Chemical Society，1997中有大量讨论。在本发明的一个 方面中，在小球741上或其内部形成的化合物被用于检测用途。小球 的多孔或三维结构载带了高负荷量的化合物，从而导致高的检测敏感 度。本发明包括高负荷基片的另一种实施方案如图7B所示。其中用 树脂填料742代替小球。
本发明的一个方面涉及如图2D所示的单入口多出口的反应器系 统。这种反应器系统的一种设备实施方案如图8所示。化学反应物/ 溶剂由入口通道821经照射室823、连接通道824、反应室825a流过 反应池，然后通过出口通道833a流出。化学反应在小球840的表面 发生。该反应器设备的一个示范性的应用是平行合成多种寡核苷酸。 在各反应室825a、825b及其它反应室中，在小球840上合成各寡核 苷酸序列。在出口通道833a、833b和其它出口通道处收集产物寡核 苷酸。
利用上述教导，对本领域的熟练技术人员来说不难构造实施图2D 所示的单入口多出口反应器系统的单层设备构造的设备。
设备的操作
在本发明的一种优选实施方案中，应用如图3C所示的设备构 造，合成用于杂交检测应用的寡核苷酸阵列。微流动模板310由硅制 成。第一视窗板351和第二视窗板361由玻璃制成。微流动模板310 的顶部表面313涂布有二氧化硅。微流动设备的内表面积首先用连接 分子，如N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(可由Gelest Inc.，Tullytown，PA 19007，USA得到)衍生化，从而使含羟基的连 接分子附着于二氧化硅和玻璃表面上。各种固体表面的衍生化对本领 域的熟练技术人员来说是公知的(Beier等， 核酸研究(Nucleic Acids Research)，27，1970(1999)，以及其中引用的参考文献)。 DMT(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-保护的间隔亚磷酰胺，如Glen Research，Sterling，VG 20164，USA提供的间隔亚磷酰胺9，被注 入反应器并与连接分子偶合。已经公知的是利用间隔基对检测的杂交 应用是有利的(Southern等.In  Nature Genetics Supplement，21， 5，(1999))。光生酸前体(PGAP)，例如在CH2Cl2中的鎓盐SSb(来自 Secant Chemicals Inc.，MA 01475，USA)，被注入到反应器中。在 保持PGAP稳定流动的同时，对第一组预定的照射室325进行照射， 从而产生光生酸(PGA)，并且在相应的反应池中发生脱三苯甲基反应 (去除DMT的保护基团)，所述反应池由照射室323、连接通道324和 反应室325组成。将选自dA、dC、dG和dT(可由Glen Research， Sterling，VG 20164，USA得到)的第一种DMT(4，4’-二甲氧基三苯 甲基)-保护的亚磷酰胺单体注入反应器，从而在被照射的反应池中使 所述第一种亚磷酸酰胺单体与间隔基偶合。而在未被照射的反应池中 没有偶合反应发生，这是因为这些池中的间隔基分子仍然受DMT基团 的保护。合成反应利用加帽和氧化反应进行，这对于寡核苷酸合成领 域的熟练技术人员来说是公知的(Gait等，寡核苷酸合成：实用方法 (“Oligonucleotide synthesis：a Practical Approach”)，Oxford， 1984)。然后对第二组预定的照射室进行照射，然后进行第二种亚磷 酸酰胺单体的偶合。进行该过程直到在所有预定的反应池中形成所有 预定序列的寡核苷酸。
可以应用各种公知的方法对预定的照射室进行照射，这些方法包 括以数字微镜设备为基础的光投射、以光掩膜为基础的投射、以及激 光扫射，但不局限于此。照射光的波长应该与PGAP的激励波长相匹 配。例如，当应用SSb PGAP时，中心波长约为366nm的光源是优选 的。有关PGAP的选择、照射条件、以及照射方法的细节，例如在 Gao等的WO09941007A2中有述，该文献作为参考引入。
本发明的一个方面涉及限制合成反应在指定区域内。例如，在图 3C所示反应器设备的检测应用中，固定分子341和342被用作探测 剂，所述固定分子优选只在遮蔽屏364下面的区域内合成。在本发明 的一种优选实施方案中，连接分子首先被固定在反应器设备的内表面 上，光不稳定性基团保护的亚磷酰胺，例如5’-[2-(2-硝基苯基)丙氧 基羰基]胸腺嘧啶脱氧核苷(NPPOC，Beier等， 核酸研究(Nucleic Acids Res.)，28，ell(2000))，与连接分子偶合形成光不稳定性基 团保护的连接中间体。然后对所有的照射室323进行照射，以便从照 射室323内表面上的连接中间体上除去2-(2-硝基苯基)丙氧基羰基 的光不稳定性保护基团。然后将除去的连接中间体用加帽剂(可以由 Glen Research，Sterling，VG20164，USA得到)进行加帽，从而防 止照射室内的寡核苷酸进一步生长。接下来，反应室325通过玻璃第 二视窗361进行充分照射，以除去在第二视窗361内表面362和流动 模板310顶部表面313上的连接中间体上的光不稳定性保护基团。因 此这些表面区域可用于寡核苷酸进一步生长。连接通道324的内表面 未受光照，因而在核苷酸合成过程中，连接中间体上的光不稳定性保 护基团阻止了通道表面积上的任何化学反应。
应该特别注意从反应物输送总管中除去气泡，特别是当流通反应 器系统中含有小尺寸的反应池时。从液相介质中除去气体的各种方法 都可以应用，并且对本领域的熟练技术人员来说是公知的。这些方法 包括应用脱气膜、氦喷射、以及内嵌式气泡阱等，但不局限于此。各 种气体去除设备可以从商业公司如Alltech Associates Inc.， Deerfield，IL 60015，USA获得。
本发明的微流动阵列设备的另一种用途是进行需要各反应池物理 隔离的平行检测。第一种优选操作方法在图9A到图9F中给出。如图 9D所示，所述设备首先注入第一流体934a、934b和934c。所述第一 流体是在反应池隔离后仍保留在反应室925中的一种流体。如果第一 流体是水溶液，则反应室925的内表面优选为亲水性的。例如，固定 有寡DNA分子的表面是亲水性的。如果第一流体是疏水性溶液，则反 应室925的内表面优选为疏水性的。然后将与第一流体不混合并优选 是惰性的第二流体935a通过第一组流体通道921a注入到设备中，同 时保持第二组流体通道927a和927b处于封闭状态，如图9B所示。 在第一流体是水溶液并且反应室925的内表面是亲水性的情况下，第 二流体优选为疏水性液体如液体石蜡、硅油或矿物油。由于表面张力 作用和压力阻力的影响，第二流体935a仅置换第一组流体通道927a 内的第一流体934a，而不置换反应室925中的第一流体934b，如图 9E所示。然后将第三流体935b通过第二组流体通道927a和927b注 入到设备中，同时保持第一组流体通道921a处于封闭状态，如图9C 所示，所述第三流体优选为与第二流体935a相同的液体原料。作为 结果，第二组通道927a和927b中的第一流体934c被第三流体935b 置换，完成反应室925中的第一流体934b的隔离，如图9F所示。本 发明的微流动阵列设备以及在本节中所描述的隔离方法可以用于进行 各种生物、生化和化学检测，这种检测已经在微量滴定或微孔板平台 上得到开发。本发明的主要优点包括明显减小的样品尺寸、明显增加 的检测密度(在每次实验中进行的检测个数)、以及成本的降低。
为了应用上述隔离方法，优选不同于图5E到5H所示来设置流体 分布通道。一个重要的特征是在每个流体通道的末端均有开口，从而 流体可以在不通过反应室的情况下流过通道。例如图9G给出了一种 优选实施方案。在该实施方案中，流体通道921a和927a位于流动模 板的前面或第一侧面。在每个流体通道921a的末端有一个通孔 921b，该孔允许流体流到流动模板的背面或第二侧面。在流动模板的 背面，装有二元流体分布通道921c和出口920a，如图9G中的虚线 所示。微流体学领域的熟练技术人员应该能够按照本发明的教导，设 计和/或构造流动结构的各种变化，从而实现隔离方法。
Gao等在J.Am.Chem.Soc.，120，12698-12699(1998)和 WO09941007A2中公开的内容在此作为参考引入。本发明的方法和装 置可用于制备和检测基片表面上的DNA和RNA寡核苷酸、肽、寡糖、 磷脂和其它生物聚合物及生物样品的极大规模阵列。光引发的芯片平 行合成可以用于在单个芯片上制备高达1,000,000个序列的极大规模 寡核苷酸阵列。
光生反应物前体可以是不同类型的化合物，包括如重氮盐、全卤 代甲基三嗪、卤代二苯基A、邻-硝基苯甲醛、磺酸盐、亚氨基 (imidyl)磺酸酯、二芳基碘鎓盐、锍盐、重氮磺酸盐、二芳基砜、 1，2-重氮酮、重氮酮、芳基氮化物衍生物、苯并碳酸盐或氨基甲酸 酯、二甲氧基安息香基碳酸酯或氨基甲酸酯、邻-硝基苯甲氧基碳酸 酯或氨基甲酸酯、硝基苯亚磺酰基(sulphenyl)及邻-硝基苯胺。
通过以下实施例进一步描述本发明，提供这些实施例只是为了说 明目的，并不打算也不应该使它们以任何方式构成对本发明的限制。 在不偏离本发明的实质和范围的情况下，本领域的熟练技术人员可以 意识到下列实施例的各种变化。
                        实施例I
                   微流动设备的制造
应用硅微加工工艺制造具有图10A所示设备结构的微流动反应器 设备。利用厚度Tr为450-500μm的Si(100)基片。微流动模板1010 包括入口通道1021和出口通道1027、入口节流脊(restriction ridge)1012、曝光室1013A、分隔脊1013B、反应室1013C、以及出 口节流脊1014。通过在结合区域1015将微流动模板1010和玻璃板 (图中未画出)结合在一起，形成封闭的微流动反应器设备。流体流动 方向如图所示。在该设备中，入口通道1021和出口通道具有相同的 尺寸，其深度Dc为约150μm，宽度Wc为约90μm。入口节流脊1012、 分隔脊1013B和出口节流脊1014具有相同宽度Lr1 30μm和相同间隙 Dr1约12μm。照射室1013A的长度Li为120μm，深度Dr约为16μm。反 应室1013C的长度Lr为120μm，深度Dr约为16μm。
由图10B所示的平Si(100)晶片开始制造。将光刻胶(例如 AZ4620，来自Shipley公司，Marlborough，MA 01752，USA)旋转 涂布到晶片表面上。然后使光刻胶膜干燥、曝光、并利用光刻法进行 显影。然后利用感应耦合等离子体(ICP)硅蚀刻机(来自于Surface Technology Systems Limited，UK)将晶片蚀刻约12μm。然后将光刻 胶膜剥离。所得到的结构如图10C所示。将硅基片旋转涂布第二层光 刻胶。然后使所述光刻胶干燥、曝光和显影。然后利用ICP硅蚀刻机 将硅基片蚀刻约4μm，并且剥离光刻胶，所得到的结构如图10D所 示。接着将硅结构表面旋转涂布第三层光刻胶。然后使所述光刻胶干 燥、曝光和显影。然后利用ICP硅蚀刻机将硅基片蚀刻约150μm，并 且剥离光刻胶。所得到的微流动模板如图10E所示。然后利用化学气 相沉积(CVD)法在所述结构表面上涂布一薄层SiO2(约50-200)。 在最后一步中，利用阳极结合法(Wafer Bonding System from EV Group Inc.，Phoenix，AZ 85034，USA)，将硅微流动模板与Pyrex 玻璃晶片(Corning 7740，来自Corning Incorporated，Corning， NY 14831)结合。最终的微流动阵列设备的照片如图10F所示。
                        实施例II
                   寡核苷酸阵列的合成
利用实施例I中制造的微流动反应器设备制备寡核苷酸阵列。利 用HPLC泵将化学反应物输送到反应器中，将DNA合成器(Expedite 8909，由PE Biosystems制造，Foster City，CA94404 USA)或 Brinkman注射器分配器(Brinkmann Instruments，Inc.，Westbury， NY 11590，USA)设置在反应器入口之前，每种均配有内嵌式过滤器。 首先用10ml 95％的乙醇洗涤微流动反应器设备，然后利用95％的乙醇 的1％N-(3-三乙氧基-甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(连接剂)溶液以 0.15ml/min的流量使之衍生化。12小时后，流量增加到3ml/min， 持续4小时。然后利用10ml 95％的乙醇以3ml/min的流量洗涤微流 动反应器设备，然后用N2气进行干燥。将设备在约60℃下设置在室 中，并使N2在设备内部循环4小时，从而熟化连接层。
用标准的亚磷酰胺化学和反应物(合成方案由Expedite 8909 DNA 合成器的操作手册提供(Operation Manual of Expedite 8909 DNA Synthesizer))，进行脱氧寡-TT(胸腺嘧啶核苷酸二聚物)DNA的合 成。在TT合成步骤结束时，微流动反应器设备的整个内表面，包括 反应和照射及反应室(图10A中的1013A和1013C)的内表面，均覆 盖有TT核苷酸二聚物。TT二聚物的末端用酸的不稳定DMT基团保 护。
然后在不同辐射条件下进行包括PGA的亚磷酰胺合成，以证实用 于DMT解保护反应的PGA的活化。包括PGAP的化学反应由Gao等在 WO09941007A2中描述。在该实施例中，所应用的PGAP是一种两组分 的系统，由3％的Rhodorsyl(来自于Secant chemicals Inc.，MA 01475，USA)和CH2Cl2中的2当量Cholo(来自于Aldrich， Milwaukee，WI 53233，USA)组成。PGA溶液的流量为0.05ml/min。 利用计算机控制的数字光投影仪(DLP)来产生用于活化微流动反应器 设备中预定反应池内光化学反应的光刻图案。DLP的构造及操作由 Gao等在WO09941007A2中描述。利用500W的汞灯(来自于Oriel Corporation，Stratford，CT 06497，USA)作为光源，并且利用二 向色滤光片仅使350-450nm之间的波长能够被应用。在预定的照射室 (图10A中的1013A)中，照射长度在1秒到20秒之间变化，而照射 强度在完全强度28mW/cm2的10％到100％之间变化。曝光后，将另外 0.5ml未活化的PGAP溶液注入到微流动反应器设备中，将残余的酸 冲洗出反应器。然后利用4ml 20％吡啶乙腈溶液洗涤反应器。然后 向反应器设备中注入1∶2的二氢荧光素-亚磷酰胺∶T-亚磷酰胺的溶液 混合物，进行二氢荧光素亚磷酰胺偶合反应。通过注入20ml乙醇进 行彻底洗涤。以1ml/min的流量注入5ml 1∶1的乙二胺∶无水乙醇使 二氢荧光素部分被活化。微流动反应器设备用乙醇洗涤并用N2干燥。
在495nm光的激励下进行荧光成像，并用冷却的CCD照相机(来 自Apogee Instruments，Inc.，Tucson，Arizona 85715，USA)进行 记录，该照相机带有525nm为中心的带通滤波器(来自Omega Optical，Inc.，Brattleboro，Vermont 05302，USA)。
图11给出了微流动反应器设备的荧光图像。每个照射/反应室 (图10A中的1013A和1013C)中DMT解保护反应的程度通过二氢荧光 素-亚磷酰胺偶合反应来检测，该反应通过来自照射/反应室的荧光强 度来测量。
                     实施例III
                寡核苷酸阵列的杂交
利用实施例I所述的制造过程制造微流动反应器设备。利用实施 例II所述的过程使设备衍生化。通过实施例II所描述的过程合成预 定序列的寡核苷酸探测剂。探测剂的序列为3’TATGTAGCCTCGGTC 1242a和3’AGTGGTGGAACTTGACTGCGGCGTCTT 1242b。
利用标准的亚磷酰胺化学在DNA合成器(Expedite 8909，由PE Biosystems制造，Foster City，CA94404 USA)上化学合成15个核 苷酸长和探测剂序列5’末端的补体的目标核苷酸。在其5’末端用二 氢荧光素标记目标物。在室温下，用50-100nmol目标物在100微升 6XSSPE缓冲液(0.9M NaCl、60mM Na2HPO4-NaH2PO4(pH 7.2)、以及 6mM EDTA)进行杂交0.5-1.0小时，然后用缓冲液进行洗涤。在杂交 和洗涤过程中，利用微孔管蠕动泵来促使溶液循环通过微流动阵列设 备。
在495nm光的激励下进行荧光成像，并用冷却的CCD照相机(来 自Apogee Instruments，Inc.，Tucson，Arizona 85715，USA)进行 记录，该照相机带有525nm为中心的带通滤波器(来自Omega Optical，Inc.，Brattleboro，Vermont 05302，USA)。图12给出 了杂交后的微流动阵列设备的荧光图像。图示5个反应池包括 3’TATGTAGCCTCGGTC 1242a、3’AGTGGTGGAACTTGACTGCGGCGTCTT 1242b 和三个空白池。
这些实施例是非限定性的。它们描述了本发明，但并不代表或定 义本发明的界限。