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申请号 | JP2003534431 | 申请日 | 2002-10-11 | 公开(公告)号 | JP4387793B2 | 公开(公告)日 | 2009-12-24 |
申请人 | チョンウェ ファーマ コーポレーション; | 发明人 | マサカツ エグチ,; マイケル カーン,; クウァン−ウォン ジェオン,; ジー−ウク チュン,; スン−ホァン ムーン,; スン−チャン リー,; | ||||
摘要 | |||||||
权利要求 | 以下の一般式(I)を有する化合物。 R 7 は、飽和または不飽和C 1 〜 12 アルキルである。 R 7 がメチル基である請求項1に記載の化合物。 R aが、ナフチル基、キノリニル基またはイソキノリニル基であり、そしてR bが、フェニルまたはピリジルであり、これらの全てが、ハライド基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基で置換され得る、請求項 1または 2に記載の化合物。 R aが、ナフチルであり、そしてR bが、フェニルであり、これらが、ハライド基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基で置換され得る、請求項 1または 2に記載の化合物。 請求項 1から4のいずれかに記載の化合物の安全有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。 哺乳動物における腫瘍細胞の成長を阻害するための請求項5に記載の薬学的組成物。 前記腫瘍細胞が、結腸直腸細胞である請求項6に記載の薬学的組成物。 |
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说明书全文 | 本発明は、一般に、逆向ターンミメティック構造体およびそれに関連した化学ライブラリに関する。 本発明はまた、癌疾患を治療する際の適用およびそれらを含有する薬学的組成物に関する。 治療薬としての潜在的な活性について分子をランダムにスクリーニングすることは、長年にわたって行われており、その結果、多数の重要な薬剤が発見されている。 分子生物学および計算機化学の進歩により、「合理的薬剤設計」と称することに関心が高まっているものの、このような技術は、初期に予測された程には、高速ではなく、または信頼できないことが判明している。 それゆえ、最近では、ランダム薬剤スクリーニングに関心が戻っている。 この目的のために、組合せ化学ライブラリの発展に基づく新しい技術および生物学的に活性なメンバーの探索においてこのようなライブラリをスクリーニングすることが特に進歩している。 一般に、組合せ化学ライブラリは、単に、分子の収集物である。 このようなライブラリは、そのライブラリ内の化学種ごとに変わるだけでなく、それらのライブラリメンバーを作成しかつどのメンバーが対象生体標的と相互作用するかを同定するために使用される方法ごとにも、変わる。 この分野は、依然として未成熟であるのに対して、ライブラリを作成しスクリーニングする方法は、既に、極めて多様で精巧になっている。 例えば、種々の組合せ化学ライブラリの最近の概説では、多数のこのような技術を同定しており(Dolle,J.Com.Chem.,2(3):383〜433,2000)、これには、タグ化および未タグ化のライブラリメンバーの使用が挙げられる(Janda,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10779〜10785,1994)。 初期には、組合せ化学ライブラリは、一般に、ペプチドまたはヌクレオチド起源のメンバーに限られていた。 この目的のために、Houghtenらの技術は、「二重規定反復」方法と呼ばれるものの一例を説明しており、この方法は、スプリット合成技術によって、可溶性組合せペプチドライブラリを編集する(Nature(London)354:84〜86,1991;Biotechniques 13:412〜421,1992;Bioorg.Med.Chem.Lett.3:405〜412,1993)。 この技術により、何千万ものメンバーを含む可溶性ペプチドライブラリが得られた。 このようなライブラリは、オピオイドペプチド、例えば、メチオニン−およびロイシン−エンケファリン(Dooley and Houghten,Life Sci.52,1509〜1517,1993)の同定で有効であることが明らかとなっており、また、N−アシル化ペプチドライブラリは、アセタリン(これは、強力なオピオイドアンタゴニストである)を同定するのに使用されている(Dooleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10811〜10815,1993)。 さらに最近では、全てのD−アミノ酸オピオイドペプチドライブラリが構築されており、ミュー(「μ」)オピオイドレセプタに対する鎮痛活性についてスクリーニングされている(Dooleyら、Science 266:2019〜2022,1994)。 ペプチドおよびヌクレオチド起源のメンバーを含む組合せライブラリは、非常に有益であるのに対して、依然として、当該技術分野において、異なる起源のメンバーを含むライブラリが必要とされている。 例えば、伝統的なペプチドライブラリは、大体において、ライブラリメンバーを作成するために、単に、そのアミノ酸配列を変える。 ペプチドの二次構造が生物学的活性に重要であることがよく知られているのに対して、このようなペプチドライブラリは、そのライブラリメンバーに対して、束縛二次構造を与えない。 この目的のために、一部の研究者は、さらに束縛された二次構造を提供しようとして、ジスルフィド架橋でペプチドを環化した(Tumeltyら、J.Chem.Soc.1067−68,1994;Eichlerら、Peptide Res.7:300〜306,1994)。 しかしながら、このような環化ペプチドは、一般に、依然として、極めて可撓性であり、生体利用能に乏しく、それゆえ、成功が限られている。 さらに最近では、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドで見られる逆向ターンの二次構造を非常によく模倣した非ペプチド化合物が開発されている。 例えば、Kahnの米国特許第5,440,013号およびKahnの公開PCT WO94/03494、PCT WO01/00210A1およびPCT WO01/16135A2は、逆向ターンの三次元構造を模倣する立体配置的に束縛された非ペプチド化合物を開示している。 立体配置的に束縛された逆向ターンミメティックの合成および同定は、著しく進歩しているのものの、当該技術分野において、ペプチドの二次構造を模倣する小分子が依然として必要とされている。 また、当該技術分野において、このようなメンバーを含むライブラリだけでなく、生物学的に活性なライブラリメンバーを同定するために、これらのライブラリメンバーを合成し、対象標的(特に、生物標的)に対してスクリーニングする技術が必要とされている。 例えば、Kahnの米国特許第5,929,237号およびその部分継続出願である米国特許第6,013,458号はまた、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質の逆向ターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物を開示している。 立体配置的に束縛された逆向ターンミメティックの合成および同定およびそれらを疾患に適用することは、Obrechtにより、十分に検討されている(Advances in Med.Chem.,4,1〜68,1999)。 本発明はまた、これらの要求を満たし、さらに、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質の逆向ターン領域の二次構造を模倣する立体配置的に束縛された化合物を提供することにより、関連した利点を与える。 Wntシグナル伝達経路は、細胞増殖、発癌および発生を含めた種々のプロセスを調節する(Moonら、1997,Trends Genet.13,157〜162:Millerら、1999,Oncogene 18,7860〜7872:Nusse and Varmus,1992,Cell 69,1073〜1087:Cadigan and Nusse,1997,Genes Dev.11,3286〜3305:Peifer and Polakis,2000 Science 287,1606〜1609:Polakis 2000,Genes Dev.14,1837〜1851)。 Wntシグナル伝達経路は、種々の生物体において、極めてよく研究されている。 Wntシグナル変換によるTCF4/β−カテニン媒介転写の活性化は、その生物学的機能において、重要な役割を果たすことが見出されている(Molenaarら、1996,Cell 86,391〜399:Gatら、1998 Cell 95,605〜614:Orfordら、1999 J.Cell.Biol.146,855〜868)。 Wntシグナルなしでは、癌抑制遺伝子である腺腫様結腸ポリポシス(APC)は、セリンキナーゼグリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)−3βおよびβ−カテニンと同時に相互作用する(Suら、1993,Science 262,1734〜1737:Yostら、1996 Genes Dev.10,1443〜1454:Hayashiら、1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,242〜247:Sakanakaら、1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,3020〜3023:Sakanaka and William,1999,J.Biol.Chem 274,14090〜14093)。 GSK−3βによるAPCのホスホリル化は、APCとβ−カテニンとの相互作用を調節し、これは、順に、β−カテニンのシグナル伝達機能を調節し得る(B.Rubinfeldら、Science 272,1023,1996)。 Wntシグナル伝達は、β−カテニンを安定化し、これにより、それは、核に転位でき、この場所で、リンパ増大因子(LEF1)/T細胞因子(TCF4)ファミリーの転写因子のメンバーと相互作用する(Behrensら、1996 Nature 382,638〜642:Hsuら、1998,Mol.Cell.Biol.18,4807〜4818:Rooseら、1999 Science 285,1923〜1926)。 最近では、c−myc(公知の発癌遺伝子)は、β−カテニン/TCF4−媒介転写の標的遺伝子であることが明らかとなっている(Heら、1998 Science 281 1509〜1512:Kolligsら、1999 Mol.Cell.Biol.19,5696〜5706)。 多くの他の重要な遺伝子は、サイクリンD1およびメタロプロテイナーゼ(これらもまた、発癌に関与している)を含めて、TCF4/β−カテニン転写経路により調節されることが確認されている(Crawfordら、1999,Oncogene 18,2883〜2891:Shtutmanら、1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,11,5522〜5527:Tetsu and McConnick,1999 Nature,398,422〜426)。 さらに、Wntシグナル伝達のいくつかの下流メディエータの過剰発現は、アポトーシスを調節することが発見されている(Morisら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,7950〜7954:Heら、1999,Cell 99,335〜345:Orfordら、1999 J.Cell.Biol.,146,855〜868:Strovel and Sussman,1999,Exp.Cell.Res.,253,637〜648)。 ヒトの結腸直腸癌細胞におけるAPCの過剰発現は、アポトーシスを誘発し(Morisら、1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,7950〜7954)、β−カテニンの異所発現は、細胞外マトリックスへの付着の損失に関連したアポトーシスを阻害した(Orfordら、1999,J.Cell Biol.146,855〜868)。 TCF4の優性ネガティブ変異体の発現によるTCF4/β−カテニン転写の阻害は、Wnt−1媒介の細胞生存を阻止し、細胞をアポトーシス刺激(例えば、抗癌剤)に感受性にした(Shaoqiong Chenら、2001,J.Cell.Biol.,152,1,87〜96)、また、APC変異は、構成的なsurvivinの発現(周知の抗アポトーシスタンパク質)を可能にすることにより、アポトーシスを阻害する(Tao Zhangら、2001,Cancer Research,62,8664〜8667)。 Wnt遺伝子の変異は、ヒトの癌では発見されていないものの、APCまたはβ−カテニンの変異は、大部分の結腸直腸癌の場合と同様に、TCF4の不適当な活性化、c−mycの過剰発現および新生物成長の発生を引き起こす(Bubinfeldら、1997,Science,275,1790〜1792:Morinら、1997,Science,275,1787−1790:Casaら、1999,Cell.Growth.Differ.10,369−376)。 直腸結腸癌の85%では、癌抑制遺伝子(APC)は、失われるか不活性化され、種々の他の癌でも、同様である(Kinzler and Vogelstein,1996,Cell 87,159〜170)。 APCの主要な役割は、Wntシグナル変換カスケードの負の調節因子という役割である。 この経路の中心的な特徴は、大きいAxinベースの複合体(これは、APCを含む)との相互作用によるβ−カテニンの細胞質ゾルプールの安定性および局在性の変調を含む。 この相互作用により、β−カテニンのホスホリル化が起こり、それにより、それを分解について標的化する。 CREB結合タンパク質(CBP)/p300は、初期には、まず、転写因子CREBとの関連によって(Chriviaら、1993,Nature,365,855〜859)、後に、アデノウイルス形質転換タンパク質E1Aとの相互作用によって(Steinら、1990,J.Viol.,64,4421〜4427:Ecknerら、1994,Genes.Dev.,8,869〜884)、タンパク質相互作用アッセイで同定された。 CBPは、転写性活性化補助因子機能を含めた種々の細胞機能に関与している可能性があった(Shikamaら、1997,Trends.Cell.Biol.,7,230〜236:Janknecht and Hunter,1996,Nature,383,22〜23)。 CBP/p300は、siamoisプロモーター(公知のWnt標的)のβ−カテニン媒介活性化を増強する(Hechtら、2000,EMBO J.19,8,1839〜1850)。 β−カテニンは、CBPのCREB結合ドメインと直接相互作用し、そしてβ−カテニンは、CBPと相乗作用して、TCF4/β−カテニンの転写性活性化を刺激する(Ken−Ichi Takemaru and Randall T.Moon,2000 J.Cell.Biol.,149,2,249〜254)。 この背景から、Wnt経路のTCF4/β−カテニンおよびCBP複合体は、細胞増殖、発癌および細胞アポトーシスなどを調節する標的分子として、取り出すことができる。 すなわち、CBPを阻害することにより、TCF4/β−カテニン転写経路を阻止する化合物(従って、これは、癌(特に、結腸直腸癌)の治療に使用できる)が必要とされている。 (発明の開示) 本発明の逆向ターンミメティック構造体は、生物学的に活性な薬剤として有用であり、これには、診断薬、予防薬および/または治療薬としての使用が挙げられる(が、これらに限定されない)。 本発明の逆向ターンミメティック構造体ライブラリは、このような生物学的に活性な薬剤の同定に有用である。 本発明を実施する際に、これらのライブラリは、数十から数百、数千(またはそれ以上)の個々の逆向ターン構造体(これはまた、本明細書中にて、「メンバー」とも呼ぶ)を含有し得る。 本発明の化合物は、以下の一般式(I)を有する: 前記式中、Raは、8〜11員の二環式アリール基であり、該二環式アリール基は、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜3個のヘテロ原子を有し得;R b は、5〜7員の一環式アリール基であり、該一環式アリール基は、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有し得、そして該化合物中のアリール環は、ハライド基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基を有し得; 前記式(I)の化合物のうち、R 7 がメチル基である化合物が好ましい。 このような化合物は、以下の式(VI)で表わすことができる。 前記式中、Raは、8〜11員の二環式アリール基であり、該二環式アリール基は、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜3個のヘテロ原子を有し得;R b は、5〜7員の一環式アリール基であり、該一環式アリール基は、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有し得、そして該化合物中のアリール環は、ハライド基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基を有し得る。 前記式(I)および(VI)の化合物において、R a が、ナフチル基、キノリニル基またはイソキノリニル基であり、そしてR b が、フェニルまたはピリジルであり、これらの全てが、ハライド基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基で置換され得るのが好ましい。 また、前記式(I)および(VI)の化合物において、R a が、ナフチルであり、そしてR b が、フェニルであり、これらが、ハライド基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基で置換され得るのが好ましい。 本発明は、前記式(I)または(VI)の化合物の安全有効量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物である。 前記薬学的組成物は、哺乳動物における腫瘍細胞の成長を阻害するためであるのが好ましい。 また、前記腫瘍細胞が、結腸直腸細胞であるのがさらに好ましい。 本発明はまた、上記式(I)の化合物を含むライブラリだけでなく、このようなライブラリを合成する方法およびそれをスクリーニングして生体活性化合物を同定する方法に関する。 本発明の化合物を含有する組成物もまた、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて、開示されている。 特に、本発明は、それらを含有する薬学的組成物に関し、これは、Wntシグナル伝達経路に関連した癌を含めた障害を治療する。 それは、さらに、Wntシグナル伝達経路に関連した癌を含めた障害を処置する方法に関する。 本発明のこれらの局面および他の局面は、添付の図面および以下の詳細な説明を参照すると、明らかとなる。 この目的のために、本明細書中では、種々の参考文献が述べられており、これらは、特定の手順、化合物および/または組成物をさらに詳細に記述しており、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。 以下では、本発明を詳細に説明する。 本発明の1局面では、以下の式(I)を有する逆向ターンミメティック構造体が開示されている: 前記式中、Raは、8〜11員の二環式アリール基であり、該二環式アリール基は、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜3個のヘテロ原子を有し得;R b は、5〜7員の一環式アリール基であり、該一環式アリール基は、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有し得、そして該化合物中のアリール環は、ハライド基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基を有し得; 本明細書中で使用する「前記化合物の残部」との用語は、R 1 、R 2 、R 5 、R 6 、R 7 、R 8および/またはR 9位置で逆向ターンミメティック構造体に共有結合した任意の部分、試薬、化合物、支持体、分子、リンカー、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質を意味する。 この用語はまた、アミノ酸側鎖部分およびそれらの誘導体を含む。 本明細書中で使用する「アミノ酸側鎖部分」との用語は、天然に生じるタンパク質中で存在しているアミノ酸側鎖部分を表わし、これには、表1で確認した天然に存在するアミノ酸側鎖部分が挙げられるが、これらに限定されない。 本発明の他の天然に存在するアミノ酸側鎖部分には、3,5−ジブロモチロシン、3,5−ジヨードチロシン、ヒドロキシリジン、γ−カルボキシグルタメート、ホスホチロシンおよびホスホセリンが挙げられるが、これらに限定されない。 それに加えて、本発明を実施する際には、グリコシル化アミノ酸側鎖もまた使用され得、これには、グルコシル化スレオニン、セリンおよびアスパラギンが挙げられるが、これらに限定されない。 本明細書中で使用する「低級鎖アルキル部分」は、1〜12個の炭素原子を含有し、「低級鎖アリール部分」は、6〜12個の炭素原子を含有し、そして「低級鎖アラルキル部分」は、7〜12個の炭素原子を含有する。 それゆえ、1実施形態では、このアミノ酸側鎖誘導体は、C 1〜12アルキル、C 6〜12アリールおよびC 7〜12アリールアルキルから選択され、好ましい1実施形態では、C 1〜7アルキル、C 6〜10アリールおよびC 7〜11アリールアルキルから選択される。 本発明のアミノ側鎖誘導体は、さらに、低級鎖アルキル、アリールおよびアリールアルキル部分の置換誘導体を含有し、ここで、この置換基は、以下の化学部分の1個またはそれ以上から選択されるが、これらに限定されない:−OH、−OR、−COOH、−COOR、−CONH 2 、−NH 2 、−NHR、−NRR、−SH、−SR、−SO 2 R、−SO 2 H、−SORおよびハロゲン(F、Cl、BrおよびIを含めて)であって、ここで、Rの各出現例は、別個に、直鎖または分枝、環式または非環式の置換または非置換で飽和または不飽和の低級鎖アルキル、低級鎖アリールおよび低級鎖アラルキル部分から選択される。 さらに、本発明の環式の低級鎖アルキル、低級鎖アリールおよび低級鎖アリールアルキル部分には、ナフタレンだけでなく、複素環化合物(例えば、チオフェン、ピロール、フラン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、3−ピロリン、ピロリジン、ピリジン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリンおよびカルバゾール)が挙げられる。 アミノ酸側鎖部分誘導体には、さらに、低級鎖アルキルおよび低級鎖アラルキル部分のアルキル部分のヘテロアルキル誘導体が挙げられ、これには、アルキルホスホネートおよびアラルキルホスホネートならびにアルキルシランおよびアラルキルシランが挙げられるが、これらに限定されない。 代表的なR 1 、R 2 、R 5 、R 6 、R 7 、R 8およびR 9部分には、具体的には、−OH、−OR、−COR、−COOR、−CONH 2 、−CONR、−CONRR、−NH 2 、−NHR、−NRR、−SO 2 Rおよび−COSRが挙げられるが、これらに限定されず、ここで、Rの各出現例は、上で定義したとおりである。 さらに他の実施形態では、アミノ酸側鎖部分またはその誘導体(またはR 1 、R 2 、R 5 、R 6 、R 7 、R 8およびR 9の場合、その化合物の残部)に加えて、R 1 、R 2 、R 5 、R 6 、R 7 、R 8およびR 9は、この化合物と他の部分または化合物との連結を促進するリンカーであり得る。 例えば、本発明の化合物は、診断アッセイまたはスクリーニングアッセイで使用するために、1種またはそれ以上の公知化合物(例えば、ビオチン)と結合され得る。 さらに、R 1 、R 2 、R 5 、R 6 、R 7 、R 8およびR 9は、その化合物を固体支持体(例えば、固相ペプチド合成で使用される支持体)と接合するリンカーであり得、あるいは、その支持体それ自体であり得る。 この実施形態では、他の部分または化合物との連結または固体支持体との連結は、好ましくは、R 1 、R 2 、R 7およびR 8位置であり、さらに好ましくは、R 1またはR 2位置である。 Aが、−(CHR 3 )−であり、Bが、−(C=O)−であり、Dが、−(CHR 5 )−であり、Eが、−(C=O)−であり、Gが、−(XR 7 ) n −である実施形態において、本発明の逆向ターンミメティック化合物が、以下の一般式(II)を有する: 1 、R 2 、R 3 、R 5 、R 7 、W、Xおよびnは、上で定義したとおりである。 好ましい実施形態では、R 1 、R 2およびR 7は、化合物の残部であり、そしてR 3またはR 5は、アミノ酸側鎖部分から選択される。 Aが、−(C=O)−であり、Bが、−(CHR 4 )−であり、Dが、−(C=O)−であり、Eが、−(ZR 6 )−であり、Gが、−(C=O)−(XR 9 )−である実施形態において、本発明の逆向ターンミメティック化合物が、以下の一般式(III)を有する: 1 、R 2 、R 4 、R 6 、R 9 、WおよびXは、上で定義したとおりであり、そしてZは、窒素またはCHである(ZがCHであるとき、Xは、窒素である)。 好ましい実施形態では、R 1 、R 2 、R 6およびR 9は、化合物の残部であり、そしてR 4は、アミノ酸側鎖部分から選択される。 さらに特定の実施形態では、Aが、−(C=O)−であり、Bが、−(CHR 4 )−であり、Dが、−(C=O)−であり、Eが、−(ZR 6 )−であり、Gが、−(XR 7 ) n −であり、そして本発明の逆向ターンミメティック化合物が、以下の一般式(IV)を有する: 1 、R 2 、R 4 、R 6 、R 7 、W、Xおよびnは、上で定義したとおりであり、そしてZは、窒素またはCHである(Zが窒素であるとき、nは、0であり、そしてZがCHであるとき、Xは、窒素であり、そしてnは、0ではない)。 好ましい実施形態では、R 1 、R 2 、R 6およびR 7は、化合物の残部であり、そしてR 4は、アミノ酸側鎖部分から選択される。 この場合、R 6またはR 7は、ZおよびXがCHのとき、それぞれ、アミノ酸側鎖部分から選択される。 本発明の逆向ターンミメティック構造体は、適当な出発成分分子(以下、「成分片」と呼ぶ)を利用することにより、調製され得る。 要約すると、式(II)を有する逆向ターンミメティック構造体の合成では、第一および第二成分片がカップリングされて、化合第一−第二中間体を形成し、もし必要なら、第三および/または第四成分片がカップリングされて、化合第三−第四中間体を形成し(または、もし市販されているなら、単一の第三中間体が使用され得る)、化合第一−第二中間体および第三−第四中間体(または第三中間体)は、次いで、カップリングされて、例えば、第一−第二−第三−第四中間体(または、第一−第二−第三中間体)を形成し、これは、環化されて、本発明の逆向ターンミメティック構造体が得られる。 あるいは、式(II)の逆向ターンミメティック構造体は、個々の成分片を、溶液中にて段階的に、または固相ペプチド合成で一般的に実施されているような固相合成により、いずれかで連続的にカップリングすることにより、調製され得る。 本発明の状況では、「第一成分片」は、以下の式S1を有する: 2は、上で定義したとおりであり、そしてRは、ペプチド合成で使用するのに適当な保護基である。 適当なR基には、アルキル基が挙げられ、好ましい実施形態では、Rは、メチル基である。 このような第一成分片は、CH(OR) 2 −CHOまたはCH(OR) 2 −CH 2 −Hal(ここで、Halは、ハロゲン原子を意味する)からH 2 N−R 2を置換することによって、還元アミノ化または置換反応により、容易に合成され得る。 本発明の「第二成分片」は、以下の式S2を有する: 1は、カルボキシル活性化基(例えば、ハロゲン原子)であり、R 4は、上で定義したとおりであり、そしてPは、ペプチド合成で使用するのに適当なアミノ保護基である。 好ましい保護基には、t−ブチルジメチルシリル(TBDMS)、t−ブチルオキシカルボニル(BOC)、メチルオキシカルボニル(MOC)、9H−フルオレニルメチルオキシカルボニル(FMOC)およびアリルオキシカルボニル(Alloc)が挙げられる。 Lが−C(O)NHRであるとき、−NHRは、カルボニル保護基であり得る。 N−保護アミノ酸は、市販されている。 例えば、FMOCアミノ酸は、種々の供給源から入手できる。 これらの化合物の本発明の第二成分片への変換は、そのN−保護アミノ酸のカルボン酸基を活性化することにより、容易に達成され得る。 適当な活性化カルボン酸には、酸ハロゲン化物(ここで、Xは、ハロゲン化物(例えば、塩化物または臭化物)である)、酸無水物(例えば、ここで、Xは、アシル基(例えば、アセチル)である)、反応性エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびペンタフルオロフェニルエステル)および他の活性化中間体(例えば、カルボジイミド(例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC))を使用するカップリング反応で形成される活性中間体)が挙げられる。 アミノ酸のアジド誘導体を第二成分片として供する場合、このような化合物は、Zaloomら(J.Org.Chem.46:5173−76,1981)で開示された反応により、対応するアミノ酸から調製され得る。 あるいは、本発明の第一片は、以下の式S1'を有し得る: 2は、脱離基(例えば、ハロゲン原子またはトシル基)であり、そして本発明の第二片は、以下の式S2'を有し得る: 2 、R 3およびPは、上で定義したとおりである。 本発明の「第三成分片」は、以下の式S3aまたはS3bを有する: 1およびL 2は、上で定義したとおりである。 適当な第三成分片は、種々の供給源から市販されているか、または有機化学における任意の公知方法により調製できる。 さらに具体的には、式(II)の本発明の逆向ターンミメティック構造体は、第一成分片を第二成分片と反応させて化合第一−第二中間体を形成することにより、続いて、化合第一−第二中間体を順次に第三成分片と反応させて化合第一−第二−第三−第四中間体を提供することにより、第2成分片2と結合させて、次いで、この中間体を環化して、この逆向ターンミメティック構造体を得ることにより、合成される。 構造I'を有する逆向ターンの一般的な合成は、以下の技術により、合成され得る。 第一成分片1は、以下で図示しているように、カップリング試薬(例えば、ホスゲン)を使用することにより、N−脱保護後、化合第一−第二中間体1−2が得られる: 2 、R 4 、R 7 、Fmoc、MocおよびXは、上で定義したとおりであり、そしてPolは、重合体支持体を表わす。 本発明の代表的な成分片の合成は、調製実施例および加工実施例で記述されている。 式(III)および(IV)の逆向ターンミメティック構造体は、それらの成分片を適当に修飾すること以外は、上で開示したモジュラー成分合成と類似の技術により、製造され得る。 上述のように、Kahnらの米国特許第6,013,458号の逆向ターンミメティックは、生物学的に活性な薬剤(例えば、診断薬、予防薬および/または治療薬)として有用である。 代表的な逆向ターンミメティックのオピエートレセプタ結合活性は、該米国特許第6,013,458号の実施例9で提示されており、ここで、本発明の逆向ターンミメティックは、δおよびμオピエートに対する放射標識エンケファリン誘導体の結合を有効に阻害することが発見され、そのデータは、レセプタアゴニストおよび潜在的鎮痛薬としてのこれらの逆向ターンミメティックの有用性を立証している。 本発明の逆向ターンミメティック構造体は、生物学的に活性な薬剤(例えば、診断薬、予防薬および治療薬)として有用である。 従って、本発明による化合物は、逆向ターンミメティック構造体を有するので、温血動物において細胞シグナル伝達転写因子関連ペプチドを調節するのに有用であり得、これは、この動物に、式(I)の化合物の有効量を投与する工程を包含する。 さらに、本発明の逆向ターンミメティック構造体はまた、温血動物のPTBドメインにペプチドが結合するのを阻害するのに、温血動物のGタンパク質共役レセプタ(GPCR)およびイオンチャンネルを変調するのに、温血動物のサイトカインを変調するのに、有効でもあり得る。 ところで、式(I)の化合物(特に、式(VI)の化合物)は、Wntシグナル伝達経路により変調された疾患(例えば、癌、特に、直腸結腸癌)を阻止または治療するのに有効であることが見出される。 aは、8〜11個の環員を有する二環式アリール基であり、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜3個のヘテロ原子を有し得、そしてR bは、5〜7個の環員を有する一環式アリール基であり、これは、窒素、酸素またはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有し得、その化合物中のアリール環は、ハロゲン化物基、水酸基、シアノ基、低級アルキル基および低級アルコキシ基からなる群から選択される1個以上の置換基を有し得る。 従って、本発明の目的は、一般式(VI)を有する化合物の安全かつ有効な量および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を提供することにあり、Wntシグナル伝達経路(特に、TCF4−β−カテニン−CBP複合体)により変調される障害を処置するのに使用できる。 さらに、本発明は、本発明の上記組成物を使用することにより腫瘍細胞の増殖を阻止する方法;本発明の上記組成物を使用することにより腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する方法;本発明の上記組成物を使用することによりTCF4−β−カテニン−CBP複合体により変調される疾患を処置する方法;ならびに他の抗癌剤(例えば、5−フルオロウラシル(5−FU)、タキソール、シスプラチン、マイトマイシンC、テガフール、ラルチトレキシド、カペシタビンおよびイリノテカンなど)と共に本発明の組成物を投与することにより癌(例えば、直腸結腸癌)を処置する方法を提供することにある。 本発明の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、以下のような(6S,10R)−立体配置を有する: aおよびR bは、上で定義した同じ意味を有する。 本発明の別の局面では、本発明の逆向ターンミメティック構造体を含むライブラリが開示されている。 本発明のライブラリは、一旦、組み立てられると、生体活性を有する個々のメンバーを識別するために、スクリーニングされ得る。 これらのライブラリの生体活性メンバーについてのこのようなスクリーニングは、例えば、そのライブラリのメンバーの結合活性を評価する工程またはライブラリメンバーが機能アッセイに対して有する効果を評価する工程を包含し得る。 スクリーニングは、通常、これらのライブラリメンバー(またはライブラリメンバーのサブセット)を目的の標的(例えば、抗体、酵素、レセプタまたは細胞株)と接触させることにより、達成される。 ライブラリメンバー(これらは、目的の標的と相互作用できる)は、本明細書中にて、「生体活性ライブラリメンバー」または「生体活性ミメティック」と呼ばれている。 例えば、生体活性ミメティックは、抗体またはレセプタに結合できるライブラリメンバーであり得、これは、酵素を阻害できるか、例えば、細胞系に関連した機能応答を誘発またはアンタゴナイズできる。 言い換えれば、本発明のライブラリのスクリーニングは、どのライブラリメンバーが1個以上の目的の生物学的標的と相互作用できるかを決定する。 さらに、相互作用が起こるとき、その生体活性ミメティックは、次いで、それらのライブラリメンバーから同定され得る。 このライブラリから単一(または限定数)の生体活性ミメティックを同定すると、逆向ターンミメティック構造体が得られ、これらは、それ自体、生体活性であり、それゆえ、診断薬、予防薬または治療薬として有用であり、さらに、これらの分野でのリード化合物の同定を著しく促進するのに使用され得る。 本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、本発明の第一、第二および第三成分片と組み合わせて、公知のペプチド合成技術を使用して、達成され得る。 さらに具体的には、立体配置的に束縛された逆向ターンミメティックのN−末端および/またはC−末端には、アミノ酸配列が付加され得る。 この目的のために、これらのミメティックは、固体支持体(例えば、PAM樹脂)上で、公知技術(例えば、John M.Stewart and Janis D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,1984,Pierce Chemical Comp.,Rockford,Ill.を参照)により、またはシリル連結樹脂上にて、アルコール結合(Randolphら、J.Am Chem.Soc.117:5712−14,1995を参照のこと)により、合成され得る。 それに加えて、溶液合成技術および固相合成技術の両方の組合せは、本発明のペプチドミメティックを合成するのに利用され得る。 例えば、固体支持体は、この配列に立体配置的に束縛された逆向ターンを加える点まで、その直鎖ペプチド配列を合成するのに利用され得る。 固相合成技術により以前に合成された適当な立体配置的に束縛された逆向ターンミメティック構造体は、次いで、その固相合成の次の「アミノ酸」として加えられ得る(すなわち、この立体配置的に束縛された逆向ターンミメティックは、N−末端およびC−末端の両方を有するが、その直鎖ペプチドに加えられる次のアミノ酸として、利用され得る)。 この配列に、この立体配置的に束縛された逆向ターンミメティック構造体を取り込むと、次いで、追加アミノ酸が加えられ得、その固体支持体に結合されたペプチドが完成する。 あるいは、これらの直鎖N−末端およびC−末端保護ペプチド配列は、固体支持体上で合成され、その支持体から除去され、次いで、公知の溶液カップリング技術を使用して、溶液中にて、この立体配置的に束縛された逆向ターンミメティック構造体にカップリングされ得る。 本発明の他の局面では、これらのライブラリを構成する方法が開示されている。 伝統的な組合せ化学技術(例えば、Gallopら、J.Med.Chem.37:1233〜1251,1994を参照)により、基本分子足場に試薬を連続的に組み合わせることで、膨大な数の化合物を迅速に調製することが可能となる。 組合せ技術は、天然に生じるアミノ酸から誘導されたペプチドライブラリを構築するのに使用され得る。 例えば、20種の適当に保護した異なるアミノ酸の20種の混合物を取り出すことにより、そして各々を20種のアミノ酸のうちの1種とカップリングすることにより、400種(すなわち、20 2 )のジペプチドのライブラリが作り出される。 この手順を7回繰り返すと、約260億(すなわち、20 8 )のオクタペプチドから構成されるペプチドライブラリが調製される。 具体的には、本発明のライブラリのペプチドミメティックの合成は、公知のペプチド合成技術(例えば、以下のような[4,4,0]逆向ターンミメティックライブラリの一般図式)を使用して、達成され得る: (工程1) (工程2) (工程3) (工程4a(この場合、ヒドラジン酸は、MOCカーバメートである)) (工程4b(この場合、Fmocヒドラジン酸を使用して、イソシアネートによって尿素を製造する)) (工程4c(この場合、Fmocヒドラジン酸を使用して、活性カーバメートによって尿素を製造する)) これらのブロックライブラリを作成するために、調製実施例で説明した手順に従って、重要な中間体ヒドラジン酸を合成した。 表2は、本発明に従って調製できる[4,4,0]逆向ターンミメティックライブラリを示し、その代表的な調製は、実施例4で示す。 (工程1) (工程2) (工程3) (工程4) (工程5) 表3は、本発明に従って調製され得る[4,3,0]逆向ターンミメティックライブラリを示し、その代表的な調製は、実施例5で示す。 [表3] [4,3,0]逆向ターンミメティックライブラリ 以下の表4は、本発明のライブラリから選択された生体活性試験用化合物およびそれらのIC 50値(これらは、実施例6で記述したように、Reporter遺伝子アッセイで測定される)を示す。 [表4] 選択したライブラリ化合物のIC 50 (μM) 本発明の化合物はまた、SW480細胞でのサルビビン発現を阻害でき、従って、癌細胞の発癌活性を阻害できる。 本発明の化合物は、癌細胞を阻害するのに使用でき、それゆえ、細胞増殖を調節するのに有用となる。 このような結果を支持して、本発明の化合物は、さらに、SW480細胞でのカスパーゼ−3活性を誘発でき、従って、細胞においてアポトーシス活性を誘発できることを示す。 本発明の化合物はまた、細胞においてアポトーシスを誘発するのに有利に使用できる。 癌細胞での発癌活性を確認するために、以下の方法により、インビトロMTS細胞毒性アッセイを試験した。 (細胞毒性試験) (成長阻害アッセイ) 選択したライブラリ化合物についての発癌活性の結果を表5に示した。 [表5] 選択したライブラリ化合物についてのMTSまたはSulforhodamine Bアッセイによる発癌活性 これらの目的のために、本発明の化合物は、当該技術分野で公知の手段により、例えば、錠剤、カプセル剤、水性または油性の溶液または懸濁液、(脂質)乳濁液、分散性粉末、座剤、軟膏、クリーム、点滴薬、および無菌で注射可能な水性または油性の溶液または懸濁液の形状に処方され得る。 本発明の適当な薬学的組成物は、単位剤形で経口投与に適切なもの(例えば、約1mg〜約1gの本発明の化合物を含有する錠剤またはカプセル剤)である。 別の局面では、本発明の薬学的組成物は、静脈内注射、皮下注射または筋肉内注射に適当なものである。 患者は、例えば、約1μg/kg〜約1g/kgの本発明の化合物の静脈内用量、皮下用量または筋肉内用量を受け得る。 この静脈内用量、皮下用量および筋肉内用量は、ボーラス注射により、与えられ得る。 あるいは、この静脈内用量は、一定時間にわたる連続注入により、与えられ得る。 あるいは、患者は、毎日非経口用量にほぼ等しい毎日経口用量を受け、その組成物は、1日あたり、1〜4回で、投与される。 以下の表は、ヒトにおける治療用途または予防用途のために、この化合物またはそれらの薬学的に受容可能な塩を含有する代表的な製薬剤形を示す。 本発明の別の局面では、被験体における腫瘍細胞の成長を阻止する方法が開示され、該方法は、腫瘍細胞に、本発明の化合物の安全有効量を投与する工程を包含する。 このような化合物を含有する組成物もまた、腫瘍細胞を阻害するのに使用できる。 それゆえ、この方法は、哺乳動物被験体における癌を処置するのに有用であり得る。 それは、有利なことに、結腸直腸癌を処置するのに使用できる。 本発明の別の局面では、Wntシグナル伝達経路が変調した障害を処置する方法が開示され、該方法は、患者に、一般式(I)を有する化合物(特に、一般式(VI)の化合物)の安全有効量を投与する工程を包含する。 本発明の化合物を含有する薬学的組成物もまた、この目的に使用できる。 このことに関連して、本発明では、一般式(I)を有する化合物(特に、一般式(VI)の化合物)またはそれらを含有する薬学的組成物が、TCF4−β−カテニン−CBP複合体(これは、Wntシグナル伝達経路に関連した癌細胞の過剰発現を開始する原因となると考えられている)が変調した障害を処置するのに使用できる。 それゆえ、一般式(I)を有する化合物(特に、一般式(VI)の化合物)を使用して、TCF4−β−カテニン−CBP複合体が変調した障害を処置する方法を提供することは、本発明の別の局面である。 さらに、癌の治療はまた、被験体において癌細胞のアポトーシスを誘発することに密接に関連しているので、本発明はまた、一般式(I)を有する化合物(特に、一般式(VI)の化合物)を使用して、癌細胞でアポトーシスを誘発する方法に関する。 従来技術から、5−FU[フルオロウラシル;5−フルオロ−2,4(1H,3H)−ピリミジンジオン]は、培養した口腔癌細胞においてアポトーシスを誘発できることが知られている(D.Tongら、Oral Oncology 36,2000 236〜241)。 さらに、直腸癌は、5−FUに感受性であることもまた、知られている(D.Arangoら、Cancer Research 61,2001 4910〜4915)。 従って、本発明では、5−FU(その抗癌活性は立証されている)および本発明の式(I)の化合物(特に、一般式(VI)の化合物)の組合せが調製され、そしてSW480細胞系に対して試験される。 結果として、5−FUと本発明の化合物(特に、TCF4化合物)との組合せは、癌細胞(例えば、SW480)の増殖を阻害するのに著しい効果を有することが発見されている。 従って、癌を治療する方法を提供することは、本発明のさらに他の局面であり、該方法は、被験体に、他の抗癌剤(例えば、5−FU)と共に、請求項1の式(I)を有する化合物(特に、一般式(VI)の化合物)の安全有効量を投与する工程を包含する。 本発明の化合物は、サルビビンの発現を阻害することが明らかとなっている。 Blanc−Brudeら、Nat. Medicine 8:987(2002)は、サルビビンが平滑筋細胞アポトーシスの重要な制御因子であり、これは、病理学的血管壁再構築で重要であることを明らかにしている。 従って、本発明の他の局面は、血管形成術に関連した再狭窄を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明の逆向ターンミメティックの安全有効量を投与する工程を包含する。 1実施形態では、本発明は、再狭窄を治療し、すなわち、再狭窄に罹った被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、再狭窄の重症度、範囲または程度などが少なくなる。 他の実施形態では、本発明は、再狭窄を予防し、すなわち、新規または追加の再狭窄を発症すると予測されている被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、予想される再狭窄の重症度、範囲または程度などが少なくなる。 必要に応じて、この被験体は、哺乳動物被験体である。 本発明の化合物は、TCF/β−カテニン転写を阻害することが明らかとなっている。 Rodovaら、J. Biol. Chem. 277:29577(2002)は、PKD−1プロモータがβ−カテニン/TCF経路の標的であることを明らかにしている。 従って、本発明の他の局面は、腎多嚢胞病を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明の逆向ターンミメティックの安全有効量を投与する工程を包含する。 1実施形態では、本発明は、腎多嚢胞病を治療し、すなわち、腎多嚢胞病に罹った被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、腎多嚢胞病の重症度、範囲または程度などが少なくなる。 他の実施形態では、本発明は、腎多嚢胞病を予防し、すなわち、新規または追加の腎多嚢胞病を発症すると予測されている被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、予想される腎多嚢胞病の重症度、範囲または程度などが少なくなる。 必要に応じて、この被験体は、哺乳動物被験体である。 本発明の化合物は、Wntシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。 Hanaiら、J:Cell Bio. 158:529(2002)は、公知の抗血管原性因子であるエンドスタチンがWntのシグナル伝達を阻害することを明らかにしている。 従って、本発明の他の局面は、異常血管形成疾患を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明の逆向ターンミメティックの安全有効量を投与する工程を包含する。 1実施形態では、本発明は、異常血管形成疾患を治療し、すなわち、異常血管形成疾患に罹った被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、異常血管形成疾患の重症度、範囲または程度などが少なくなる。 他の実施形態では、本発明は、異常血管形成疾患を予防し、すなわち、新規または追加の異常血管形成疾患を発症すると予測されている被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、異常血管形成疾患の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。 必要に応じて、この被験体は、哺乳動物被験体である。 本発明の化合物は、Wntシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。 Senら、P. N. A. S. (USA)97:2791(2000)は、関節リウマチ疾患に罹った哺乳動物がRA滑膜組織においてWntおよびFzの高い発現を示すことを明らかにしている。 従って、本発明の他の局面は、関節リウマチを治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明の逆向ターンミメティックの安全有効量を投与する工程を包含する。 1実施形態では、本発明は、関節リウマチ疾患を治療し、すなわち、関節リウマチ疾患に罹った被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、関節リウマチ疾患の重症度、範囲または程度などが少なくなる。 他の実施形態では、本発明は、関節リウマチ疾患を予防し、すなわち、新規または追加の関節リウマチ疾患を発症すると予測されている被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、関節リウマチ疾患の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。 必要に応じて、この被験体は、哺乳動物被験体である。 本発明の化合物は、Wntシグナル伝達の発現を阻害することが明らかとなっている。 Uthoffら、Int. J. Oncol. 19:803(2001)は、(クローン病患者と比較して)潰瘍性大腸炎では、乱れたおよびfz(Wnt経路分子)の差次的上方制御が起こることを明らかにしている。 従って、本発明の他の局面は、潰瘍性大腸炎を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それが必要な被験体に、本発明の逆向ターンミメティックの安全有効量を投与する工程を包含する。 1実施形態では、本発明は、潰瘍性大腸炎を治療し、すなわち、潰瘍性大腸炎に罹った被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、潰瘍性大腸炎の重症度、範囲または程度などが少なくなる。 他の実施形態では、本発明は、潰瘍性大腸炎を予防し、すなわち、新規または追加の潰瘍性大腸炎を発症すると予測されている被験体に本発明の逆向ターンミメティックを投与すると、潰瘍性大腸炎の予想される重症度、範囲または程度などが少なくなる。 必要に応じて、この被験体は、哺乳動物被験体である。 (発明を実施する最良の形態) (調製実施例1:(N−Fmoc−N'−R 3 −ヒドラジノ)−酢酸の調製) 1Lの二ッ口丸底フラスコに、ガラス製ストッパーおよびカルシウムチューブを取り付けた。 反応混合物のMeOH(300mL)溶液を加え、氷浴中にて磁気攪拌しつつ、滴下漏斗を経由して、濃HCl(30mL、12N)をゆっくりと加え、そして一晩攪拌した。 その混合物をEA(1000mL)で抽出し、その有機層を保持した。 この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧中にて蒸発させた。 その残留物をn−ヘキサンおよびEAで結晶化して精製して、生成物(32.2g、83%)を得た。 2 CO 3 (49g、149mmol)をゆっくりと加えた。 激しく攪拌しつつ、NaI(11g、74mmol)をゆっくりと加えた。 その反応混合物を、還流温度で、1日にわたって攪拌した。 混合物を濾過し、その有機層を酢酸エチル[EA](500mL)で抽出した。 この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧中にて蒸発させた。 その生成物をクロマトグラフィー(これは、ヘキサン:EA=2:1の溶液を使う)で精製して、生成物(19.8g、70%)を得た。 3水溶液(100ml)を加え、その水層をジエチルエーテル(100mL)で洗浄した。 0℃で、濃HClをゆっくりと滴下した(pH2〜3)。 その混合物を抽出し、その有機層を保持した(500mL、MC)。 この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧中にて蒸発させた。 その残留物をn−ヘキサンおよび酢酸エチルで再結晶化して精製して、生成物(12g、72%)を得た。 7 −ヒドラジノ)−酢酸の調製)
(2)[N−R 7 −N'−メトキシカルボニル−ヒドラジノ]−酢酸エチルエステルの調製 3 −ブロマイド(14.1g、0.06mol)をDMF(200ml)に溶解し、その混合物を、50℃で、5時間暖めた。 その反応が完結した後、この混合物を濾過し、そしてEAで希釈し、そしてブラインで洗浄した(3回)。 その粗生成物をクロマトグラフィー(溶離液:ヘキサン/EtOAc=4/1)で精製した。 (3)[N−R 7 −N”−メトキシカルボニル−ヒドラジノ]−酢酸 4で乾燥し、そして蒸発させて、黄色固形物を得た。 (実施例1) (2)1−メトキシカルボニル−2,8−ジベンジル−6−メチル−4,7−ジオキソ−ヘキサヒドロ−ピラジノ[2,1−c][1,2,4]トリアジンの調製 この樹脂に、Fmoc−アラニン(4当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4当量)およびDIEA(4当量)のNMP(Advanced ChemTech)溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、4時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂に、DMF中の20%ピペリジンを加えた。 この反応混合物を、室温で、8分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 上で調製した樹脂に、N β −Moc−N α −ベンジル−ヒドラジノグリシン(4当量)、HOBT[Advanced ChemTech](4当量)およびDIC(4当量)のDMF溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、3時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、MeOHで洗浄した。 この樹脂を、室温で、減圧中にて乾燥した。 この樹脂を、室温で、18時間にわたって、ギ酸(2.5ml)で処理した。 この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。
2 Cl 2 (15ml)中のN−メチルヒドラジンカルボン酸9H−Fluoren−9−イルメチルエステル(107mg、0.4mmol)とNaHCO 3飽和水溶液15mlとの氷冷二相混合物を、単一部分としてトルエン(1.03ml、2mmol)中のホスゲン15mlを加えつつ、迅速に攪拌した。 この反応混合物を30分間攪拌し、その有機相を集め、その水相をCH 2 Cl 2で抽出した。 合わせた有機層をMgSO 4で乾燥し、濾過し、そして減圧下にて濃縮して、泡沫状固形物として、カルバモイルクロライド128mg(97%)を得た。 [注意:ホスゲン蒸気は、非常に毒性である。 フード内で使用すべし]。 この生成物を、さらに精製することなく、以下の固相合成で使用した。 (2)2,5−ジメチル−7−ベンジル−3,6−ジオキソ−ヘキサヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,5−a]ピラジン−1−カルボン酸ベンジルアミンの調製 この樹脂に、Fmoc−アラニン(3当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](3当量)およびDIEA(3当量)のNMP(Advanced ChemTech)溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、4時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂に、DMF中の20%ピペリジンを加えた。 この反応混合物を、室温で、8分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 上で調製した樹脂に、工程(1)で得たN'−Fmoc−N−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライド(5当量)、DIEA(5当量)のDCM溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、4時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂に、DMF(樹脂1gに対して10ml)中の20%ピペリジンを加えた。 この反応混合物を、室温で、8分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂を、室温で、4時間にわたって、DCM中のイソシアン酸ベンジル(4当量)およびDIEA(4当量)の混合物で処理した。 次いで、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、MeOHで洗浄した。 この樹脂を、室温で、減圧中にて乾燥した。 この樹脂を、室温で、14時間にわたって、ギ酸で処理した。 この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。
この樹脂に、Fmoc−Tyr(OBut)−OH(3当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](3当量)およびDIEA(3当量)のNMP(Advanced ChemTech)溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、4時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂に、DMF中の20%ピペリジンを加えた。 この反応混合物を、室温で、8分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 上で調製した樹脂に、N'−Fmoc−N−メチル−ヒドラジノカルボニルクロライド(5当量)、DIEA(5当量)のDCM溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、4時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂に、DMF(樹脂1gに対して10ml)中の20%ピペリジンを加えた。 この反応混合物を、室温で、8分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂を、室温で、4時間にわたって、DCM中のイソシアン酸ベンジル(4当量)およびDIEA(4当量)で処理した。 次いで、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、MeOHで洗浄した。 この樹脂を、室温で、減圧中にて乾燥した。 この樹脂を、室温で、14時間にわたって、ギ酸で処理した。 この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。
この樹脂に、Fmoc−Tyr(OBut)−OH(4当量)、HATU[PerSeptive Biosystems](4当量)およびDIEA(4当量)のNMP(Advanced ChemTech)溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、4時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂に、DMF中の20%ピペリジンを加えた。 この反応混合物を、室温で、8分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 上で調製した樹脂に、N β −Fmoc−N α −ベンジル−ヒドラジノグリシン(4当量)、HOBT[Advanced ChemTech](4当量)およびDIC(4当量)のDMF溶液を加えた。 その反応混合物を、室温で、3時間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMFで洗浄し、次いで、DCMで洗浄した。 この樹脂に、DMF(樹脂1gに対して10ml)中の20%ピペリジンを加えた。 この反応混合物を、室温で、8分間振盪した後、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、DMFで洗浄した。 この樹脂を、室温で、4時間にわたって、DCM中のイソシアン酸ベンジル(4当量)およびDIEA(4当量)で処理した。 次いで、その樹脂を濾過により集め、DMF、DCMで洗浄し、次いで、MeOHで洗浄した。 この樹脂を、減圧中にて、室温で、乾燥し、その樹脂を、室温で、18時間にわたって、ギ酸(2.5ml)で処理した。 この樹脂を濾過で除去した後、その濾液を減圧下にて濃縮して、オイルとして、生成物を得た。
50の測定およびその細胞株での細胞毒性試験についてバイオアッセイを行った:
5個の細胞/ウェル)にプレートした。 4マイクログラム(TOPFlash)および1マイクログラム(pRL−null)のDNAを、無血清培地150μlで希釈し、Superfect(商標)トランスフェクト試薬30μlを加えた。 このDNA−Superfect混合物を、室温で、15分間インキュベートし、次いで、さらに3時間のインキュベーション中にて、この複合体に、10%FBS DMEM(1ml)を加えた。 複合体が形成している間にて、細胞を抗体なしでPBSで2回洗浄した。 このDNA−Superfect(商標)トランスフェクト試薬の複合体を細胞に適用した後、37℃で、5%CO 2で、3時間インキュベートした。 インキュベーション後、10%FBSを有する回収培地を加えて、最終容量を1.18mlにした。 3時間のインキュベーション後、これらの細胞を収集し、そして96ウェルプレート(3×10 4個の細胞/ウェル)に再び播種した。 37℃で、5%CO 2で、一晩インキュベーションした後、これらの細胞を、24時間にわたって、この試験化合物で処理した。 最後に、その活性をルシフェラーゼアッセイ(Promega,E1960)で検査した。 図1は、SW480細胞に対する上記化合物のIC 50の測定結果を図示している。 (スルホローダミンB(SRB)アッセイ) [表6] 実施例4で得た化合物のインビトロ細胞毒性(SRB)アッセイ (産業上の利用可能性) 50値を得るために、実施例4で調製された化合物の種々の濃度で、測定される。 具体的には、該試験化合物によるホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性の阻害の程度を決定した。 結果として、SW480細胞増殖に対する該試験化合物のIC 50は、表4で開示されているように、見出された。 詳細な手順は、実施例6で開示されたものと同じである。 |