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Hiv protease inhibitor
申请号 JP52148597 申请日 1996-12-09 公开(公告)号 JP2000502332A 公开(公告)日 2000-02-29
申请人 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート; 发明人 チ ヒューイ ウォン; デボラ エイチ スリー; カレン ラスロ;
摘要 (57)【要約】 ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤及びＦＩＶプロテアーゼ阻害剤のコンビナトリアルライブラリーは、一方の側に置換ピロリジン、ピペリジン又はアザ糖が隣接し、もう一方の側にフェニルアラニン、チロシン又は置換チロシンが隣接したα−ケトアミド又はヒドロキシエチルアミンコア構造を特徴とする。 該ライブラリーは１段カップリング反応によって合成される。 非常に効能ある薬剤候補は、該ライブラリーについてＨＩＶプロテアーゼ及びＦＩＶプロテアーゼ双方に対する結合活性及び阻害活性をスクリーニングすることにより同定される。 ＨＩＶプロテアーゼ及びＦＩＶプロテアーゼ双方に対して臨床上有効な活性を示す薬剤候補は、ＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対して潜在的に抵抗するものとして同定される。
权利要求
  • 【特許請求の範囲】 1. ＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対して潜在的に抵抗するＨＩＶ プロテアーゼ阻害剤としての薬剤候補を同定する方法であって、 工程Ａ: 該薬剤候補が１μM 未満のＨＩＶプロテアーゼに対して結合活性をも つかを求める工程； 工程Ｂ: 該薬剤候補が１μM 未満のＨＩＶプロテアーゼに対して阻害活性をも つかを求める工程； 工程Ｃ: 該薬剤候補が１μM 未満のＦＩＶプロテアーゼに対して結合活性をも つかを求める工程； 工程Ｄ: 該薬剤候補が１μM 未満のＦＩＶプロテアーゼに対して阻害活性をも つかを求める工程；及び 工程Ｅ: 前記工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにおいて、該薬剤活性が１μM 未満のＨＩ ＶプロテアーゼとＦＩＶプロテアーゼの双方に対して結合活性と阻害活性をも つことが求められる場合には、ＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対 して潜在的に抵抗する該ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として該薬剤候補を選択す る工程 を含む、前記方法。 2. ＨＩＶプロテアーゼを阻害する薬剤候補を合成する方法であって、該薬剤候 補がＮ末端、Ｃ末端、及び該Ｎ末端と該Ｃ末端を結合するα−ケトアミドコア 構造を含み、該Ｎ末端がフェニルアラニン、チロシン及びＯ−置換チロシンか らなる群より選ばれた芳香族アミノ酸残基を含み、該芳香族アミノ酸がα−ケ トアミドコア構造に結合しかつ取込まれるカルボニル基を含み、該Ｃ末端が環 窒素と１個以上の置換基をもつ複素環を含み、該Ｃ末端の該環窒素がα−ケト アミドコア構造に結合しかつ取込まれ、 工程Ａ: 該カルボニル基がα−ヒドロキシル酸基で置き換えられる以外は該Ｎ 末端と同じＮ末端前駆体を供給する工程； 工程Ｂ: 該環窒素が第二アミンを形成する以外は該Ｃ末端と同じＣ末端前駆体 を供給する工程； 工程Ｃ: 前記工程ＡのＮ末端前駆体を前記工程ＢのＣ末端前駆体にカップリン グして該薬剤候補のα−ケトアミドコア構造が該Ｎ末端のカルボニル基と該Ｃ 末端の環窒素を結合しかつ取込むα−ヒドロキシルアミドコア構造によって置 き換えられる以外は薬剤候補と同じ薬剤候補前駆体を形成する工程；及び 工程Ｄ: 該薬剤候補のα−ケトアミドコア構造を形成する前記工程Ｃの薬剤候 補前駆体のα−ヒドロキシルアミドコア構造を酸化する工程 を含む、前記方法。 3. ＨＩＶプロテアーゼを阻害するｎ×ｍ個の薬剤候補のライブラリーを合成す る方法であって、該ｎ×ｍ個の薬剤候補の各々がｎ個のＮ末端（ｎは２以上で ある）より選ばれたＮ末端、ｍ個のＣ末端（ｍは２以上である）より選ばれた Ｃ末端、及び該Ｎ末端と該Ｃ末端を結合するα−ケトアミドコア構造を含み、 該ｎ個のＮ末端の各々がフェニルアラニン、チロシン及びＯ−置換チロシンか らなる群より選ばれた芳香族アミノ酸残基を含み、該芳香族アミノ酸が該α− ケトアミドコア構造に結合しかつ取込まれるカルボニル基を含み、該ｍ個のＣ 末端の各々が環窒素と１個以上の置換基をもつ複素環を含み、該Ｃ末端の環窒 素が該α−ケトアミドコア構造に結合しかつ取込まれ、 工程Ａ: 該Ｎ末端のカルボニル基がＮ末端前駆体内でα−ヒドロキシル酸基に よって置き換えられる以外は構造が該ｎ個のＮ末端と同じｎ個のＮ末端前駆体 を供給する工程； 工程Ｂ: 該Ｃ末端の環窒素がＣ末端前駆体内で第二アミンを形成する以外は構 造が該ｍ個のＣ末端と同じｍ個のＣ末端を供給する工程； 工程Ｃ: ｎ×ｍ個の反応容器を供給する工程； 工程Ｄ: 前記工程Ｃのｍ個の反応容器に該ｎ個のＮ末端前駆体の各々を充填す る工程； 工程Ｅ: Ｎ末端前駆体とＣ末端前駆体のｎ×ｍ個の混合物を形成するために前 記工程Ｄのｎ個の反応容器に該ｍ個のＣ末端前駆体の各々を充填する工程； 工程Ｆ: 前記工程Ｅのｎ×ｍ個の混合物の各々において、該Ｎ末端前駆体を該 Ｃ末端前駆体にカップリングして該ｎ×ｍ個の薬剤候補のα−ケトアミドコア 構造が該Ｎ末端のカルボニル基と該Ｃ末端の環窒素を結合しかつ取込むα−ヒ ドロキシルアミドコア構造によって置き換えられる以外は該ｎ×ｍ個の薬剤候 補と同じｎ×ｍ個の薬剤候補前駆体を形成する工程；及び 工程Ｇ: 該反応容器の各々において、ｎ×ｍ個の薬剤候補の該ライブラリーの α−ケトアミドコア構造を形成する前記工程Ｆのｎ×ｍ個の薬剤候補前駆体の 各々のα−ヒドロキシルアミドコア構造を酸化する工程 を含む、前記方法。 4. ＨＩＶプロテアーゼを阻害するｎ×ｍ個の薬剤候補のライブラリーを合成す る方法であって、該ｎ×ｍ個の薬剤候補の各々がｎ個のＮ末端（ｎは２以上で ある）より選ばれたＮ末端、ｍ個のＣ末端（ｍは２以上である）より選ばれた Ｃ末端、及び該Ｎ末端と該Ｃ末端を結合するヒドロキシエチルアミンコア構造 を含み、該ｎ個のＮ末端の各々がフェニルアラニン、チロシン及びＯ−置換チ ロシンからなる群より選ばれた芳香族アミノ酸残基を含み、該芳香族アミノ酸 が該ヒドロキシエチルアミンコア構造に結合しかつ取込まれるカルボニル基の 代わりにヒドロキシエチル基を含み、該ｍ個のＣ末端の各々が環窒素と１個以 上の置換基をもつ複素環を含み、該Ｃ末端の環窒素が該ヒドロキシエチルアミ ンコア構造に結合しかつ取込まれ、 工程Ａ: 該Ｎ末端のヒドロキシエチル基がＮ末端前駆体内でエポキシド基によ って置き換えられる以外は構造が該ｎ個のＮ末端と同じｎ個のＮ末端前駆体を 供給する工程； 工程Ｂ: 該Ｃ末端の環窒素がＣ末端前駆体内で第二アミンを形成する以外は構 造が該ｍ個のＣ末端と同じｍ個のＣ末端を供給する工程； 工程Ｃ: ｎ×ｍ個の反応容器を供給する工程； 工程Ｄ: 前記工程Ｃのｍ個の反応容器に該ｎ個のＮ末端前駆体の各々を充填す る工程； 工程Ｅ: Ｎ末端前駆体とＣ末端前駆体のｎ×ｍ個の混合物を形成するために前 記工程Ｄのｎ個の反応容器に該ｍ個のＣ末端前駆体の各々を充填する工程；及 び 工程Ｆ: 前記工程Ｅのｎ×ｍ個の混合物の各々において、該ｎ×ｍ個の薬剤候 補のライブラリーを形成するために該Ｎ末端前駆体を該Ｃ末端前駆体にカップ リングする工程 を含む、前記方法。 5. ＨＩＶプロテアーゼを阻害するｎ×ｍ個の薬剤候補のライブラリーであって 該ｎ×ｍ個の薬剤候補の各々がｎ個のＮ末端（ｎは２以上である）より選ばれ たＮ末端、ｍ個のＣ末端（ｍは２以上である）より選ばれたＣ末端、及び該Ｎ 末端と該Ｃ末端を結合するα−ケトアミドコア構造を含み、該ｎ個のＮ末端の 各々がフェニルアラニン、チロシン及びＯ−置換チロシンからなる群より選ば れた芳香族アミノ酸残基を含み、該芳香族アミノ酸が該α−ケトアミドコア構 造に結合しかつ取込まれるカルボニル基を含み、該ｍ個のＣ末端の各々が環窒 素と１個以上の置換基をもつ複素環を含み、該Ｃ末端の環窒素が該α−ケトア ミドコア構造に結合しかつ取込まれる、前記ｎ×ｍ個の薬剤候補のライブラリ ー。 6. ＨＩＶプロテアーゼを阻害するｎ×ｍ個の薬剤候補のライブラリーであって 該ｎ×ｍ個の薬剤候補の各々がｎ個のＮ末端（ｎは２以上である）より選ばれ たＮ末端、ｍ個のＣ末端（ｍは２以上である）より選ばれたＣ末端、及び該Ｎ 末端と該Ｃ末端を結合するヒドロキシエチルアミンコア構造を含み、該ｎ個の Ｎ末端の各々がフェニルアラニン、チロシン及びＯ−置換チロシンからなる群 より選ばれた芳香族アミノ酸残基を含み、該芳香族アミノ酸が該ヒドロキシエ チルアミンコア構造に結合しかつ取込まれるカルボニル基の代わりにヒドロキ シエチル基を含み、該ｍ個のＣ末端の各々が環窒素と１個以上の置換基をもつ 複素環を含み、該Ｃ末端の環窒素が該ヒドロキシエチルアミンコア構造に結合 しかつ取込まれる、前記ｎ×ｍ個の薬剤候補のライブラリー。 7. Ｎ末端、Ｃ末端、及び該Ｎ末端を該末端に結合するコア構造をもつタイプの ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤であっ て、該Ｎ末端が前記コア構造に結合した芳香族アミノ酸残基を含み、該Ｃ末端 が前記コア構造に結合した環窒素を含む複素環を含み、該コア構造がＨＩＶ又 はＦＩＶアルパルチルプロテアーゼ基質の容易に開裂できるアミド結合を有す るアイソスターであり、改良点が 前記コア構造がα−ケトアミドである点、及び 前記Ｎ末端の複素環がカルボン酸及びカルボキシメチルエステル以外の置換 基を少なくとも１個有するピロリジンである点 を含む、前記機序に基づく改良阻害剤。 8. 前記ピロリジンが、下記の構造で表される群より選ばれる、請求項７記載の ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤。 9. Ｎ末端、Ｃ末端、及び該Ｎ末端を該末端に結合するコア構造をもつタイプの ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤であっ て、該Ｎ末端が前記コア構造に結合した芳香族アミノ酸残基を含み、該Ｃ末端 が前記コア構造に結合した環窒素を含む複素環を含み、該コア構造がＨＩＶ又 はＦＩＶアルパルチルプロテアーゼ基質の容易に開裂できるアミド結合を有す るアイソスターであり、改良点が 前記コア構造がα−ケトアミドである点、及び 前記Ｎ末端の複素環がピペラジン又はアザ糖である点 を含む、前記機序に基づく改良阻害剤。 10． 前記ピペラジン又はアザ糖が、下記の構造で表される群より選ばれる、請求 項９記載のＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻 害剤。 11． Ｎ末端、Ｃ末端、及び該Ｎ末端を該末端に結合するコア構造をもつタイプの ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤であっ て、該Ｎ末端が前記コア構造に結合した芳香族アミノ酸残基を含み、該Ｃ末端 が前記コア構造に結合した環窒素を含む複素環を含み、該コア構造がＨＩＶ又 はＦＩＶアルパルチルプロテアーゼ基質の容易に開裂できるアミド結合を有す るアイソスターであり、改良点が 前記コア構造がα−ケトアミドである点、及び 前記Ｃ末端の芳香族アミノ酸が保護アミノをもつチロシン、保護アミノと置 換ヒドロキシルをもつチロシン、及びカルボベンジルオキシで保護された保護 アミノをもつフェニルアラニンからなる群より選ばれる点 を含む、前記機序に基づく改良阻害剤。 12． 下記の構造で表される群より選ばれた請求項11記載のＨＩＶ又はＦＩＶアス パルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤。 （式中、Ｒは水素、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、アルキル (C1-C4)オキシ、 o-メトキシベンジルオキシ、m-メトキシベンジルオキシ、p-メトキシベンジル オキシ、o-メトキシニトロベンジルオキシ、m-メトキシニトロベンジルオキシ 、p-メトキシニトロベンジルオキシ、アセトニド、ベンジリデン、3-オキシメ チルカテコール、4-オキシメチルカテコールからなる群より選ばれ；Ｒ 1はカ ルボベンジルオキシ (CBZ)、tert-ブトキシカルボニル(t-BOC)、アシルからな る群より選ばれ；Ｒ 2は水素、ベンジル、アルキル (C1-C4) 、o-メトキシベン ジル、m-メトキシベンジル、p-メトキシベンジル、o-メトキシニトロベンジル 、m-メトキシニトロベンジル、p-メトキシニトロベンジル、3-メチレンカテコ ール、4-メチレンカテコールからなる群より選ばれる。） 13． Ｎ末端、Ｃ末端、及び該Ｎ末端を該末端に結合するコア構造をもつタイプの ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤であっ て、該Ｎ末端が前記コア構造に結合した芳香族アミノ酸残基を含み、該Ｃ末端 が前記コア構造に結合した環窒素を含む複素環を含み、該コア構造がＨＩＶ又 はＦＩＶアルパルチルプロテアーゼ基質の容易に開裂できるアミド結合を有す るアイソスターであり、改良点が 前記コア構造がヒドロキシエチルアミンである点、及び 前記Ｎ末端の複素環がカルボン酸及びカルボキシメチルエステル以外の置換 基を少なくとも１個有するピロリジンである点 を含む、前記機序に基づく改良阻害剤。 14． 前記ピロリジンが、下記の構造で表される群より選ばれる、請求項13記載の ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤。 15． Ｎ末端、Ｃ末端、及び該Ｎ末端を該末端に結合するコア構造をもつタイプの ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤であっ て、該Ｎ末端が前記コア構造に結合した芳香族アミノ酸残基を含み、該Ｃ末端 が前記コア構造に結合した環窒素を含む複素環を含み、該コア構造がＨＩＶ又 はＦＩＶアルパルチルプロテアーゼ基質の容易に開裂できるアミド結合を有す るアイソスターであり、改良点が 前記コア構造がヒドロキシエチルアミンである点、及び 前記Ｎ末端の複素環がピペラジン又はアザ糖である点 を含む、前記機序に基づく改良阻害剤。 16． 前記ピペラジン又はアザ糖が、下記の構造で表される群より選ばれる、請求 項15記載のＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻 害剤。 17． Ｎ末端、Ｃ末端、及び該Ｎ末端を該末端に結合するコア構造をもつタイプの ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤であっ て、該Ｎ末端が前記コア構造に結合した芳香族アミノ酸残基を含み、該Ｃ末端 が前記コア構造に結合した環窒素を含む複素環を含み、該コア構造がＨＩＶ又 はＦＩＶアルパルチルプロテアーゼ基質の容易に開裂できるアミド結合を有す るアイソスターであり、改良点が 前記コア構造がヒドロキシエチルアミンである点、及び 前記Ｃ末端の芳香族アミノ酸が、保護アミノを有するチロシン、保護アミノ と置換ヒドロキシルを有するチロシン、及びカルボベンジルオキシによって保 護された保護アミノを有するフェニルアラニンからなる群より選ばれる点 を含む、前記機序に基づく改良阻害剤。 18． 下記の構造で表される群より選ばれた請求項17記載のＨＩＶ又はＦＩＶアス パルチルプロテアーゼの機序に基づく改良阻害剤。 （式中、Ｒは水素、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、アルキル (C1-C4)オキシ、 o-メトキシベンジルオキシ、m-メトキシベンジルオキシ、p-メトキシベンジル オキシ、o-メトキシニトロベンジルオキシ、m-メトキシニトロベンジルオキシ 、p-メトキシニトロベンジルオキシ、アセトニド、ベンジリデン、3-オキシメ チルカテコール、4-オキシメチルカテコールからなる群より選ばれ；Ｒ 1はカ ルボベンジルオキシ (CBZ)、 tert-ブトキシカルボニル（t-BOC）、アシルか らなる群より選ばれ；Ｒ 2は水素、ベンジル、アルキル (C1-C4) 、o-メトキシ ベンジル、m-メトキシベンジル、p-メトキシベンジル、o-メトキシニトロベン ジル、m-メトキシニトロベンジル、p-メトキシニトロベンジル、3-メチレンカ テコール、4-メチレンカテコールからなる群より選ばれる。）
    • 说明书全文

    【発明の詳細な説明】 ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤発明の分野 ： 本発明は、ＨＩＶ及びＦＩＶプロテアーゼ阻害剤に関する。 更に詳細には、本発明は、一方の側に置換ピロリジン、ピペリジン又はアザ糖が隣接し、もう一方の側にフェニルアラニン、チロシン又は置換チロシンが隣接したα−ケトアミド又はヒドロキシエチルアミンコア構造を特徴とするＨＩＶ及びＦＩＶプロテアーゼ阻害剤のコンビナトリアルライブラリーに関する。 本発明は、また、かかるライブラリーの作製方法、かかる方法によって作製された開示化合物、及び臨床的に有効な活性をもちかつＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対して潜在的に抵抗する候補薬剤を同定するためにかかるライブラリーをスクリーニングする方法に関する。 政府所有権の供述 ： 本発明は、国立予防衛生研究所助成金第GM 48870号及び同第GM 44154号及び N CI，DHHS，契約書第NO1-CO-46000号に基づく政府援助によって行われた。 合衆国政府は、ある一定の権利を所有する。 背景 ： ヒト免疫不全ウイルスプロテアーゼ(HIV PR)は、ウイルス複製を阻害する重要な標的である。 多くの強力な試験管内阻害剤が開発されたが、ほとんどが生体内で不活性であるか又は毒性があり、耐性のあるウイルスの突然変異体も出現する。 (JH Condraら, Nature (1995): vol. 374, 569-571; M. Markowitzら,JV irol. (1995): vol. 69, 701; DJKempfら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995): vol. 92, 2484-2488; AK Ghosh, et al., J.Med.Chem. (1994):vol.37, 2506- 2508; PY LaJn, et al., Science (1994): vol.263, 380-384;NA Robertsら, Science (1990): vol. 248, 358; EE Kim ら, J. Am.Chem.Soc. (1995): vo l. 117, 1181-1182を参照されたい。) 阻害剤の効能を試験する動物系の不足は、薬剤の開発過程を更に遅らせる。 最近、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）の生活環において類似のプロテアーゼが同定された。 （RL Ta1bottら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989): vol. 86,5 743-5747; NCPedersen らScience (1987): vol. 235, 790-793.）ＦＩＶは、 ヒト後天性免疫不全症候群（エイズ）に見られるものと同じような臨床症状を生じるウイルスである。 米国及びカナダにおいて調査したネコの１４％までがＦＩ Ｖに感染していることがわかった。 （JK Yamamotoら，JAVMA (1989): vol. 19 4,213-220.）日本では２８.９％である。 （T. Ishidaら，JAVMA (1989): vol. 1 94,221-225.） ＨＩＶの薬剤耐性変異体においては少なくとも６例があり、HIV PR残基がFIVP Rに見られる構造的に配列した残基に突然変異する。 HIV PRのアミノ酸変化はV32 I(I37-FIV)、L90M(M107-FIV)、N88D(D105-FIV)、150V(V59′-FIV)、K20I(I25-FI V)及びQ29K(K109-FIV)である。 耐性HIV PR変異体の表は、JW Mellorsらによって開示されている。 （International Antiviral News (1995): vol. 3, 8-13.） 構造アラインメントは、A. Wlodawer(36 参照）によって解明されたFIVPRのＸ線結晶構造に由来する。 Ｘ線構造に基づく２つのプロテアーゼを重ね合わせると２ つのプロテアーゼと薬剤耐性ＨＩＶプロテアーゼ間の類似性が示される。 HIV PRは、ホモ二量体として機能する９９アミノ酸アスパルチルプロテアーゼである。 (MA Naviaら，Nature (1989): vol. 337, 615-620; DD Loeb,Virol . (1989): vol.63, 111-121.）FIV PRは、また、１１６アミノ酸残基からなるホモ二量体アスパルチルプロテアーゼである。 （JH．Elder，InfectiousAgentsan d Disease(1994): vol．2，361-374.）ＨＩＶプロテアーゼとＦＩＶプロテアーゼは共に、ウイルスｇａｇ及びｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質を完全な感染性ビリオンの正しいアセンブリーと成熟に不可欠な構造タンパク質と酵素へのプロセシングに関与する。 （SK Thompson, Bioorg. Med. Chem. Lett.(1994): vol. 4, 2441-2446.）特に、ＨＩＶプロテアーゼとＦＩＶプロテアーゼは、特異性が哺乳動物細胞プロテアーゼによって示されてなくプロリン窒素を含むペプチド結合を効率よく加水分解することが知られていないｇａｇ−ｐｏｌポリタンパク質のマトリックス−カプシドドメイン内のチロシン／フェニルアラニン−プロリンアミド結合の選択的切断に高特異性を示す。 (C. Debouck, Aids Research and Human Retroviruses(1992): vol. 8, 153-164; and JH Elder,J . Virol. (1993): vol. 67, 1869-1876.)HIV PRを阻害について魅力のある標的にするのはこの特異性である。 ＨＩＶとＦＩＶ双方のマトリックスカプシド切断部位（チロシン〜プロリン結合）前後のアミノ酸配列の比較を下記に示す。 わかるように切断部位前後の残基は、４つの位置、Ｐ 3 、Ｐ 1 、Ｐ 1'及びP 2'が同じである。 これらの類似性に基づきある種のHIV PR阻害剤がFIV PRを阻害することがその中に開示されている。 P 4 P 3 P 2 P 1 P 1' P 2' P 3' P 4' HIVPR Ser Gln Asn Tyr 〜 Pro Ile Val Gln FIVPR Pro Gln Ala Tyr 〜 Pro Ile Gln Thr 一般に、活性ケトンはほとんどの種類のプロテアーゼを阻害することがわかった(Barrettら, Proteinase Inhibitors; Research monographs in cell andtiss ue physiology; Dingle, JT, Gordon, JL, General Eds.; ElsevierScienc e Publishers; Amsterdam, 1986)。 特に、最近の研究にはアスパルチルプロテアーゼ、レニンを阻害する３種類の活性ケトンの設計が示されている。 これらの強力な類縁体は、ＩＣ 50値４０００〜４.１nMを示し、活性ケトン官能性として１, １,１−トリフルオロメチルケトン、α−ケトエステル及びα−ジケトンが含まれている。 (Patelら J. MedChem. 1993, 36, 2431). α−ケトアミドコア構造は、活性ケトンにアイソスター的に似ているが機序に基づくアイソスターコア構造であるヒドロキシエチルアミン又はホスフィン酸Ｈ ＩＶプロテアーゼ阻害剤の報告されたものより強力である。 α−ケトアミドコア構造は、セリン及びシステインプロテアーゼ、ヒドロラーゼ及びアミノペプチダーゼを含む種々の酵素の阻害剤に用いられた。 一例として、一連のジペプチジル及びトリペプチジルα−ケトアミドが合成され、酵素カルパインＩ、カルパインII、カテプシンＢ及びパパインを含むシステインプロテアーゼの強力な阻害剤として評価された(Liら J. Med. Chem. 1993, 36, 3472)。 他の研究によりエポキシドヒドロラーゼの阻害剤としてα−ケトアミド類縁体が同定された（Wongら J. Med. Chem. 1993, 36, 211）。 更に、３−アミノ−２− オキソ−４−フェニルブタン酸アミドから誘導されるα−ケトアミド類縁体からアルギニルアミノペプチダーゼ(Ｋ i ＝１.５μM)、細胞質ゾルアミノペプチダーゼ(Ｋ i ＝１.０μM)及びミクロソームアミノペプチダーゼ（Ｋ i ＝２.５μM)の阻害が認められた。 (Richら J. Med Chem. 1992, 35, 451) ジペプチドアイソスターの活性は、アミノ酸残基をアイソスターのＮ末端とＣ 末端の両方に付加して活性部位での結合を改善することによりしばしば高められる。 従来技術により、レニン、アスパルチルプロテアーゼ及びプロシンペプシン阻害剤を含むかかる阻害剤の例が示されている。 (Rich ら J. Med Chem. 1992,3 5, 451). 得られた阻害剤は、一般に、ＨＩＶプロテアーゼに対して高結台親和性を示している。 しかしながら、不安定性及び／又は不十分な経口生体利用可能性を示す。 関連技術により、分子内に無置換プロリン部分を含むアミノペプチダーゼのα −ケトアミド阻害剤の例が示された。 特に、Gordonと共同研究者らによってメタロプロテアーゼアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の無置換プロリン環を有するα−ケトアミド阻害剤が述べられた。 (Gordonら Biochem. Biophys. Res.Comm un. 1984, 124, 141). 更に、Araiら(Chem. Pharm. Bull. 41, 9, 1583)によって、プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）阻害剤（Ｎ−［Ｎ−（４−フェニルブタノイル）−Ｌ−プロリル］ピロリジン）による強力な阻害活性が報告された。 ＨＩＶ及びＦＩＶプロテアーゼ阻害剤のコンビナトリアルライブラリー及びそれを作製する簡便な合成方法が求められている。 酵素とその阻害剤間の結合を改善するためにＰ 1とＰ 1'位の変異性の可能性を高めたＨＩＶ及びＦＩＶプロテアーゼ阻害剤の化合物が求められている。 臨床的に有効な阻害活性及びＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対する潜在的抵抗性の双方を有する候補を同定するためにＨＩＶ及びＦＩＶプロテアーゼ阻害剤のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法が求められている。 臨床的に有効な阻害活性及びＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対する抵抗性を有する新規なＨＩＶ及びＦＩＶプロテアーゼ阻害剤が求められている。 要約 : FIV PRがレトロウイルスプロテアーゼにおける薬剤耐性の良好なモデルとなることが本明細書に開示される。 ＨＩＶプロテアーゼ及びＦＩＶプロテアーゼ双方に対する阻害活性について候補薬剤を試験すると共にこれらの機械論的に同一のプロテアーゼの双方に対して阻害剤が同時に効能があることを求めると潜在的に耐性が生じにくいＨＩＶプロテアーゼの阻害剤が同定される。 次に、試験管内で巧くスクリーニングされる候補薬剤が、生体内でHIV PR阻害剤を試験するモデル系としてネコにおいて試験される。 従って、本発明の態様は、ＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対して潜在的に抵抗するＨＩＶプロテアーゼ阻害剤としての薬剤候補を同定する方法に関する。 本方法は、下記の工程を用いる。 工程Ａ： 薬剤候補が１μM末満のＨＩＶプロテアーゼに対して結合活性をもつかを求める工程； 工程Ｂ： 薬剤候補が１μM未満のＨＩＶプロテアーゼに対して阻害活性をもつかを求める工程； 工程Ｃ： 薬剤候補が１μM末満のＦＩＶプロテアーゼに対して結台活性をもつかを求める工程；及び工程Ｄ： 薬剤候補が１μM未満のＦＩＶプロテアーゼに対して阻害活性をもつかを求める工程。 薬剤候補が上記工程の各々において１μM末満のＨＩＶプロテアーゼとＦＩＶ プロテアーゼ双方に対して結合活性と阻害活性をもつことが求められる場合には、薬剤候補はＨＩＶ耐性株の出現による阻害活性の消失に対して潜在的に抵抗するＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として選ばれる。 上記の方法は、個々の薬剤候補或いは薬剤候補ライブラリーに適用される。 本発明の他の態様は、ＨＩＶプロテアーゼを潜在的に阻害する薬剤候補を合成する方法に関する。 更に詳細には、薬剤候補は、Ｎ末端、Ｃ末端、及びＮ末端とＣ末端を結台するα−ケトアミドコア構造を含むタイプを有する。 Ｎ末端としては、フェニルアラニン、チロシン及びＯ−置換チロシンからなる群より選ばれた芳香族アミノ酸残基が含まれる。 芳香族アミノ酸としては、α−ケトアミドコア構造に結合しかつ取込まれるカルボニル基が含まれる。 Ｃ末端としては、環窒素及び１個以上の置換基を有する複素環が含まれる。 Ｃ末端の環窒素は、α−ケトアミドコア構造に結合されかつ取込まれる。 合成法としては、下記の工程が含まれる。 工程Ａ： カルボニル基がα−ヒドロキシル酸基によって置き換えられる以外はＮ末端と同じＮ末端前駆体を供給する工程； 工程Ｂ： 環窒素が第二アミンを形成する以外はＣ末端と同じＣ末端前駆体を供給する工程； 工程Ｃ： 工程ＡのＮ末端前駆体を工程ＢのＣ末端前駆体にカップリングして薬剤候補のα−ケトアミドコア構造がα−ヒドロキシルアミドコア構造結合によって置き換えられる以外は薬剤候補と同じ薬剤候補前駆体を形成しかつＮ末端のカルボニル基及びＣ末端の環窒素を取込む工程；及び工程Ｄ： 薬剤候補のα−ケトアミドコア構造を形成するために工程Ｃの薬剤候補前駆体のα−ヒドロキシルアミドコア構造を酸化する工程。 上記の合成法は、ｎ×ｍ個の薬剤候補を含むＨＩＶプロテアーゼ阻害剤及びＦ ＩＶプロテアーゼ阻害剤のコンビナトリアルライブラリーを合成するために適応される。 上記合成法は、ｎ×ｍ個の反応容器を供給し、ｎ個のＮ末端前駆体の各々をｍ個の反応容器に充填し、次に、ｍ個のＣ末端前駆体の各々をｎ個の反応容器に充填してＮ末端前駆体とＣ末端前駆体のｎ×ｍ個の混合物を形成することにより修飾される。 次に、ｎ×ｍ個の混合物の各々がカップリング反応を受け、Ｎ 末端前駆体がＣ末端前駆体にカップリングしてｎ×ｍ個の薬剤前駆体を形成する。 薬剤前駆体候補は、ｎ×ｍ個の薬剤候補のα−ケトアミドコア構造がＮ末端のカルボニル基及びＣ末端の環窒素を結合しかつ取込むα−ヒドロキシルアミドコア構造によって置き換えられる以外はｎ×ｍ個の薬剤候補と同じである。 最後に、ｎ×ｍ個の薬剤候補前駆体の各々のα−ヒドロキシルアミドコア構造を酸化して所望の薬剤候補のα−ケトアミドコア構造を形成する。 本発明の他の態様は、α−ケトアミドコア構造及びＨＩＶプロテアーゼに対する潜在的阻害活性をもつことを特徴とするｎ×ｍ個の薬剤候補のコンビナトリアルライブラリーに関する。 薬剤候補は、ｎ個のＮ末端（ｎは２以上である）より選ばれたＮ末端、ｍ個のＣ末端（ｍは２以上である）より選ばれたＣ末端、及びＮ末端をＣ末端に結合するα−ケトアミドコア構造をもつことを特徴とする。 各ｎ個Ｎ末端としては、フェニルアラニン、チロシン、及びＯ−置換チロシンからなる群より選ばれた芳香族アミノ酸残基が含まれる。 芳香族アミノ酸としては、 α−ケトアミドコア構造に結合しかつ取込まれるカルボニル基の代わりにヒドロキシエチル基が含まれる。 各ｍ個Ｃ末端としては、環窒素及び１個以上の置換基を有する複素環が含まれる。 Ｃ末端の環窒素は、α−ケトアミドコア構造に結合しかつ取込まれる。 本発明の別の態様は、ヒドロキシエチルアミンコア構造及びＨＩＶプロテアーゼに対して潜在的阻害活性を有するヒドロキシエチルアミンコア構造をもつことを特徴とするｎ×ｍ個の薬剤候補のコンビナトリアルライブラリーに関する。 薬剤候補は、ｎ個のＮ末端（ｎは２以上である）より選ばれたＮ末端、ｍ個のＣ末端（ｍは２以上である）より選ばれたＣ末端、及びＮ末端をＣ末端に結合するヒドロキシエチルアミンコア構造をもつことを特徴とする。 各ｎ個Ｎ末端としては、フェニルアラニン、チロシン及びＯ−置換チロシンからなる群より選ばれた芳香族アミノ酸残基が含まれる。 芳香族アミノ酸としては、ヒドロキシエチルアミンコア構造に結合しかつ取込まれるカルボニル基の代わりにヒドロキシエチル基が含まれる。 各ｍ個Ｃ末端としては、環窒素及び１個以上の置換基を有する複素環が含まれる。 Ｃ末端の環窒素は、ヒドロキシエチルアミンコア構造に結合しかつ取込まれる。 本発明の別の態様は、ＨＩＶ又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼの一連の機序に基づく改良阻害剤に関する。 機序に基づく改良阻害剤の各々は、Ｎ末端、Ｃ 末端、及びＮ末端をＣ末端に結合するコア構造をもつタイプのものである。 Ｎ末端としては、コア構造に結合した芳香族アミノ酸残基が含まれる。 Ｃ末端としては、コア構造に結合した環窒素を有する複素環が含まれる。 コア構造は、ＨＩＶ 又はＦＩＶアスパルチルプロテアーゼ基質の容易に開裂できるアミド結合を有するアイソスターである。 機序に基づく阻害剤の第１実施態様においては、コア構造はα−ケトアミドであり、Ｎ末端の複素環はカルボン酸及びカルボキシメチルエステル以外の置換基を少なくとも１種有するピロリジンである。 この機序に基づく阻害剤の第１実施態様の例を下記に示す。

    機序に基づく改良阻害剤の第２実施態様においては、コア構造はα−ケトアミドであり、Ｎ末端の複素環はピペラジン又はアザ糖である。 この機序に基づく改良阻害剤の第２実施態様に用いられるピペラジン及びアザ糖の例を下記に示す。 機序に基づく改良阻害剤の第３実施態様においては、コア構造はα−ケトアミドであり、Ｃ末端の芳香族アミノ酸は保護アミノを有するチロシン、保護アミノと置換ヒドロキシを有するチロシン、及びカルボベンジルオキシによって保護された保護アミノを有するフェニルアラニンからなる群より選ばれる。 この機序に基づく改良阻害剤の第３実施態様の例を下記に示す。 式中、Ｒは水素、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、アルキル

    (C1-C4)オキシ、o-メトキシベンジルオキシ、m-メトキシベンジルオキシ、p-メトキシベンジルオキシ、o-メトキシニトロベンジルオキシ、m-メトキシニトロベンジルオキシ、p-メトキシニトロベンジルオキシ、アセトニド、ベンジリデン、3-オキシメチルカテコール、４−オキシメチルカテコールからなる群より選ばれ；Ｒ

    1はカルボベンジルオキシ（CBZ）、tert-ブトキシカルボニル（t-BOC）、アシルからなる群よりえらばれ；Ｒ

    2は水素、ベンジル、アルキル

    (c1-c4) 、o-メトキシベンジル、m-メトキシベンジル、p-メトキシベンジル、o-メトキシニトロベンジル、m-メトキシニトロベンジル、p-メトキシニトロベンジル、3-メチレンカテコール、4-メチレンカテコールからなる群より選ばれる。 機序に基づく改良阻害剤の第４実施態様においては、コア構造はヒドロキシエチルアミンであり、Ｎ末端の複素環はカルボン酸及びカルボキシメチルエステル以外の置換基を少なくとも１種有するピロリジンである。 この機序に基づく改良阻害剤の第４実施態様の例を下記に示す。 機序に基づく改良阻害剤の第５実施態様においては、コア構造はヒドロキシエチルアミンであり、Ｎ末端の複素環はピペラジン又はアザ糖である。 この機序に基づく改良阻害剤の第５実施態様に用いられるピペラジン及びアザ糖の例を下記に示す。 機序に基づく改良阻害剤の第６実施態様においては、コア構造はヒドロキシエチルアミンであり、Ｃ末端の芳香族アミノ酸は保護アミノを有するチロシン、保護アミノと置換ヒドロキシルを有するチロシン、及びカルボベンジルオキシによって保護された保護アミノを有するフェニルアラニンからなる群より選ばれる。 この機序に基づく改良阻害剤の第６実施態様の例は、下記の通りである。 式中、Ｒは水素、ヒドロキシ、ベンジルオキシ、アルキル

    (C1-C4)オキシ、o-メトキシベンジルオキシ、m-メトキシベンジルオキシ、p-メトキシベンジルオキシ、 o-メトキシニトロベンジルオキシ、m-メトキシニトロベンジルオキシ、p-メトキシニトロベンジルオキシ、アセトニド、ベンジリデン、3-オキシメチルカテコール、4-オキシメチルカテコールからなる群より選ばれ；Ｒ

    1はカルボベンジルオキシ（CBZ）、tert-ブトキシカルボニル（t-BOC）、アシルからなる群より選ばれ；Ｒ

    2は水素、ベンジル、アルキル

    (C1-C4) 、o-メトキシベンジル、m-メトキシベンジル、p-メトキシベンジル、o-メトキシニトロベンジル、m-メトキシニトロベンジル、p-メトキシニトロベンジル、3-メチレンカテコール、4-メチレンカテコールからなる群より選ばれる。

    図面の説明図１は酵素の最大阻害を与える'プロリン'部分の保護基と理想的な置換パターンを求めるためにＨＩＶプロテアーゼ及び／又はＦＩＶプロテアーゼの多数の潜在的阻害剤を速やかに入手する方法を示す図である。 図２は、α−ケトアミドコア構造と他のアイソスター構造との比較を示す図である。 化合物の活性が表示されている。 図３は、Ｘ線結晶学から観測されたヒドロキシエチルアミンアイソスターとHI V PRの活性部位間の水素結合の相互作用を示す図である。 図４は、阻害剤２とHIV PRアスパラギン酸基との相互作用の一般酸塩基機構を示す図である。 図５は、HIV PRに対する様々に置換されたピロリジン類縁体の阻害活性を示す図である。 図６は、化合物11の合成を示す図である。 表示した工程は次の通りである。 (i )t-BuLi, エチルビニルエーテル, MgBr

    2 , THF; (ii) O

    3 , CH

    2 Cl

    2 ; (iii) 0.17NL iOH, MeOH/H

    2 O, 2:1, 98％。 図７は、化合物２の合成を示す図である。 表示した工程は次の通りである。 (i )NaBH

    4 , MeOH, 0℃, 95%; (ii) 0.17 N LiOH, MeOH/H

    2 0, 2:1, 98%; (iii) EDC, HOBT, DIEA, DMF/CH

    3 CN, (1:1), 84%; (iv) デス・マルチンペリオジナン,CH

    2 Cl

    2 , 95%。 図８は、化合物３の合成を示す図である。 表示した工程は次の通りである。 (i )EDC, HOBT, DIEA, DMF/CH

    3 CN, (1:1), 80%; (ii)デス・マルチンペリオジナン， CH

    2 Cl

    2 , 定量的。 図９は、表示した基質と試薬による化台物31と32の合成を示す図である。 図10は、表示した基質と試薬による化合物35の合成を示す図である。 図11は、エポキシド21から出発しかつ表示したピロリジンを用いてヒドロキシエチルアミン化合物を生成するカップリング一般手順を示す図である。 手順は次の通りである。 (i)メタノール, Et

    3 N, 還流, 24時間, 40-60%。 図12は、カルボキシ酸15から出発しかつ表示したピロリジンを用いてα−ケトアミド化合物を生成するカップリング一般手順を示す図である。 ２工程の手順は次の通りである。 (i) EDC, HOBT, DIEA, DMF/CH

    3 CN, (1:1); (ii)デス・マルチンペリオジナン酸化, CH

    2 Cl

    2 , 定量的。 図13は、カルボキシ酸15から出発しかつ表示した置換ピロリジンを用いてα− ケトアミド化合物を生成するカップリング一般手順を示す図である。 ２工程の手順は次の通りである。 (i) EDC, HOBT, DIEA, DMF/CH

    3 CN, (1:1); (ii) デス・マルチンペリオジナン酸化, CH

    2 Cl

    2 , 定量的。 図14は、エポキシド21から出発しかつ表示した置換ピペリジンを用いてヒドロキシエチルアミン化合物を生成するカップリング一般手順を示す図である。 手順は次の通りである。 (i) メタノール, Et

    3 N, 還流, 24時間, 40-60%。 図15は、表示した基質と試薬によるピロリジン46、47及び48の合成を示す図である。 図16は、表示した基質と試薬によるピロリジン52、53及び54の合成を示す図である。 図17は、表示した基質と試薬によるピロリジン44の合成を示す図である。 図18は、次の工程によるピロリジン40の合成を示す図である。 (i) CBZ-Cl, 塩化メチレン; (ii) TBDPSCl, Et

    3 N, DMF; (iii)ヨウ化メチル, 水素化ナトリウム,DMF; (iv) TBAF, THF;(v) 1.5 MH

    2 SO

    4 , CrO

    3 , acetone; (vi) H

    2 N

    t Bu, EDC, 塩化メチレン; (vii) H

    2 , Pd(OH)

    2 /炭素, MeOH。 図19は、次の工程によるピロリジン42の合成を示す図である。 (i) BOC-ON, 塩化メチレン; (ii) TBDPSCl, Et

    3 N, DMF; (iii)臭化ベンジル, 水素化ナトリウム,DMF; (iv) TBAF, THF;(v) 1.5 MH

    2 SO

    4 , CrO

    3 , アセトン; (vi) H

    2 N

    t Bu, EDC, 塩化メチレン; (vii) H

    2 , Pd(OH)

    2 /炭素, MeOH。 図20は、次の工程によるピロリジン58、59、60、64、65及び66の合成を示す図である。 化合物58、59、60については(i) CBZ-Cl, 塩化メチレン; (ii) TBDMSCl ,Et

    3 N, DMF; (iii) H

    2 N

    t Bu，EDC,塩化メチレン; (iv) TBAF, THF; (v) “光延”法:PPh

    3 , DEAD(ジエチルアザオジカルボキシレート), ClCH

    2 CO

    2 H, 次に、水,p H 6.7までピリジン; (vi)59については臭化ベンジル又は60についてはヨウ化メチル, 水素化ナトリウム, DMF(58についてはこの工程を省略) (vii) H

    2 ,Pd(OH)

    2

    /炭素，MeOH。 化合物64、65及び66については工程(v)“光延”法を除いて上記と同じ条件。 図21は、次の工程によるピペリジン86及び87の合成を示す図である。 (i) CBZ- Cl又はBOC-ON, 塩化メチレン; (ii) TBDPSCl, Et

    3 N, DMF; (iii) 87については臭化ベンジル又は86についてはヨウ化メチル, 水素化ナトリウム, DMF (iv) TBA F, THF; (v) 1.5 MH

    2 SO

    4 , CrO

    3 ,アセトン; (vi) H

    2 N

    t Bu, EDC, 塩化メチレン; (vii) H

    2 , Pd(OH)

    2 /炭素, MeOH。 図22は、次の工程によるピペリジン85の合成を示す図である。 (i) CBZ-Cl又はBOC-ON, 塩化メチレン; TBDPSCl, Et

    3 N, DMF; (ii)酢酸無水物, トリエチルアミン, DMF (iii) TBAF, THF; (iv) 1.5 MH

    2 SO

    4 , CrO

    3 ,アセトン; (v)H

    2 N

    t Bu, ED C,塩化メチレン; (vi) NaOMe, MeOH; (vii) H2, Pd(OH)

    2 /炭素, MeOH。 図23は、ＦＩＶプロテアーゼ及びＨＩＶプロテアーゼの選択性をプローブするピロリジン又はピペリジン含有α−ケトアミド及びヒドロキシエチルアミンコア構造のチロシン誘導体を示す図である。 図24は、コンビナトリアル法を用いて評価されるコア構造に関する標的可変部位を示す図である。 HIV PRとFIV PRに対して２／３／４量体基質が可能である。 候補分子は、HIV PR或いはFIV PRのプロテアーゼの切断によって活性を表す。 次に、候補分子を容易に開裂できるアミド結合をα−ケトアミド又はヒドロキシエチルアミンに置き換えることによって再誘導して、更に潜在的阻害剤を得る。 合成戦略は、追加残基の溶液相カップリング (標準カップリング条件, EDC HOBT,C H

    2 Cl

    2又はDMF)を含み、ジ／トリ／テトラペプチドを得る。 酸及び塩基で簡単に洗浄して精製せずにきれいに所望のペプチドを得る。 次に、化合物を最少量のDM SOに溶解し、96ウェルマイクロタイタープレートに配置したバッファー溶液に加える。 酵素を加え、次に質量スペクトル分析に供してヒットとして切断した基質を同定する。 次に、これらの分子をα−ケトアミド又はヒドロキシエチルアミンコア単位で再誘導し、阻害活性を試験する。 図25は、設計した機序に基づくコア構造に結合した新しい相補的結合部位の全探索を用いて非線状プロテアーゼ阻害剤の創製を示す図である。 図26は、種々のα−ケトアミドとヒドロキシエチルＨＩＶプロテアーゼ阻害剤を示す図である。 図27は、表示した基質と試薬によるα−ケトアミド化台物1050の合成を示す図である。 図28は、表示した基質と試薬によるヒドロキシエチルアミン化合物1051の合成を示す図である。 図29は、表示した基質と試薬によるα−ケトアミド化合物1053の合成を示す図である。 図30は、表示した基質と試薬によるα−ケトアミド化合物1054、1059及び1060 の合成を示す図である。 図31は、表示した基質と試薬によるα−ケトアミド化合物1055の合成を示す図である。 図32は、表示した基質と試薬によるα−ケトアミド化合物1056の台成を示す図である。 図33は、表示した基質と試薬によるα−ケトアミド化合物1057の合成を示す図である。 図34は、表示した基質と試薬によるα−ケトアミド化合物1058の合成を示す図である。

    詳細な説明 : 本発明の態様は、HIV/FIV PR阻害剤、即ち、α−ケトアミド阻害剤の新規な化合物に関する。 α−ケトアミド阻害剤の作用機序は、耐性の課題を克服する密着結合阻害剤の開発をもたらすことができる新しいタイプの機序に基づく酵素阻害を表すので特に興味深い。 HIV PRに対して分析した場合、新規なα−ケトアミド１（図３）のK

    iは６μM であることがわかった。 それ以後の研究からＮ末端とＣ末端の保護基を簡単に修飾して２（図３）を得るとHIV PRに対するこのコアアイソスターの効力が高められK

    i 214nMを得ることがわかった。 化合物２の活性の増大は、保護基（即ち、Cbz保護基及びt-Bu基）とHIV PRの活性部位間の好ましい疎水性相互作用によるものである。 Boc保護基も疎水性であるが短くて立体的にかさばっており、不安定にして適切な疎水結合ポケットへ効果的に伸長させる。 この結果から、コアアイソスターの簡単な修飾がどのように効力を著しく改善することができるかが証明される。 α−ケトアミド２の効力は、プロリン環部分に追加の相補基を導入することにより改善されることが開示される。 コンピュータモデリング（洞察／発見）からプロリン環部分への疎水基の付着が結合を高めることが示される。 cis-ベンジルエーテルをプロリン部分のC-4に付加すると結合が３倍に増大する（K

    i = 65nM）。 次に、アイソスター２の活性が同一的に置換されたα−ヒドロキシアミド前駆体23と24と比較される。 Ｓジアステレオマー24(IC

    50 = 2μM)はＲジアステレオマー23(IC

    50 = 300μM)より強力であるが２より活性が小さいことが開示される。 α−ヒドロキシアミド24の高い効力は、ヒドロキシエチルアミン阻害剤酵素複合体のＸ線構造に見られるものと同様にヒドロキシル基が化合物23より効果的にHIV PRの触媒カルボン酸基と水素結合することを意味する（図４）。 アイソスター23と24の立体化学は、Ｓ−α−ヒドロキシエステル19から誘導されたＲ及びＳ モシャーエステルに対する

    1 H NMR実験によって求めた。 αケトアミド２のケトン部分は、水和されることが開示され、化台物23と同様の方法で水素結合している。 しかしながらこの場合、重水素置換のDMSO/D

    2 O (5: 1)中化合物２に対する

    13 C NMRの実験は、水の存在下にα−ケトアミドのケトン部分が２４時間インキュベートした後でさえ水和されていないことを意味する（ 図５）。 これは、２のケトン部分が水の存在下に安定であり、よって触媒の不在下に水和しにくいことを意味する。 ケトン部分の水和が図６に示されるようにHI V PRの活性部位内で起こり、得られた水和物が酵素のアスパラギン酸残基と水素結合相互作用によって安定であると思われる。 ２の水和形は、図６に示されたモデルに基づき良好な遷移状態ミミックにあると考えられる。 時間依存性分析は時間依存性阻害を示さず、α−ケトアミド２の活性形が実際に水和物である場合には水和工程が迅速であるに違いないか又は２自体が活性形であることが示される。 更に作用機序を調べるために、α−ケトアミド２とHIVP R間の複合体のＸ線構造を求め、結果からα−ケトアミドが水和されることが示され、酵素援助水和機序が支持された（図７）。 電子密度地図に見られるように、阻害剤は水和状態でHIV PRの活性部位に結台する（図７）。 ２つのヒドロキシルの一方が２つのアスパラギン酸塩間に位置し、その双方と水素結合をつくり、もう一方のヒドロキシルは１つのアスパラギン酸基とのみ相互作用する。 ケト基は、また、触媒アスパラギン酸塩に水素結合する。 フェニルアラニンとプロリンの側鎖は、適当なS

    1及びS

    1 ' ポケットを占有し、他の構造に見られるものと同様の相互作用する。 阻害剤のＮ末端に対するカルボキシベンジル基及びＣ末端に対するtert−ブチルアミドのtert−ブチル基は、 各々ほぼS

    2及びS

    2 'ポケット内にある。 阻害剤と酵素の２つの垂れ下がり間に水素結合を形成する保存水(Wat-301)が明らかに認められる。 その位置は、他の大多数の阻害剤複合体の場合と異なりむしろ非対称である。 P

    2 CO基にミミックなカルボニル酸素とWat-301間の距離は、2.5Åであり、P

    1 'COまでの距離は3.2Åである。 化合物２の中心とＣ末端部分及び阻害剤KNI-272の同様の部分の結合方法に顕著な類似性が見られる。 HIV PRと化合物２の複合体の中心部分に余分な水素結合が存在するにもかかわらず結合定数の差は非常に顕著である(KNI-272のK

    iは２のK

    iの１／５に近い）。 従って、KNI-272の効力の増大は、嵩張った５−イソキノリルオキシアセチル(IQoa)部分を有するＮ末端の伸長によらなければならない。 一方のモノマーにPhe-53及びもう一方にPro-81を含むこの基と相互作用するタンパク質の領域は、阻害剤の方へ著しく移動し、IQoaと広範囲に疎水性接触する。 α−ケトアミド２をFIV PRに対して試験した場合、７０mMまでの濃度で加えると阻害効果がないことがわかった。 この結果は、以前に示したマトリックス／キャプシド切断部位に隣接するＨＩＶとＦＩＶプロテアーゼの天然基質間の類似性に基づき驚くべきことであった。 FIV PRは、基質としてコアアイソスター２を認識することができる前に、HIV PRよりP

    4 - P

    4 '部位間に特定の残基を必要とすると思われる。 このことは、また、HIV PRが配列Gln-Ala-Tyr〜Pro-Ile-Glnのアセチル−（

    ６残基）ペプチド基質を切断し、切断することが既知である最小ペプチドのFIV PRが配列Pro-Gln-Ala-Tyr〜Pro-Ile-Gln-Thrのアセチル−（

    ８残基）ペプチドであるという所見によって支持される。 対応する保護ジペプチド（Cbz-Ph e-Pro-NBu

    t ）は標準分析条件下でＨＩＶ又はＦＩＶプロテアーゼによって切断されなかった。 FIV PRの阻害剤を開発する努力において、FIV PRのP

    2 'とP３'部位とだけ相互作用する適切な残基の追加が適度の阻害に十分であることがわかった。 FIV PRに特異的な側鎖を２のＣ末端にカップリングすると４が得られる（図８）。 この伸長アイソスター４のIC

    50は25μMでありK

    iはFIV PRに対して29μMでありHIVPRに対する活性はわずかに増大する(K

    i 154nM) ことがわかった。 HIV PR阻害剤のアイソスターコア構造はFIV PRに強固に結合せず、結合を増強するために追加の相補基を必要とすると思われる。 この差は、他の既知のHIV PR阻害剤の分析においても認められる。 例えば、強力なサイクリック尿素系HIV PR阻害剤DMP 323(IC

    50

    = 36nM, K

    i = 0.27nM) はFIV PRの極めて不十分な阻害剤(IC

    50 = 7.3mM)であることもわかった。 モノメチル化誘導体７の活性をジメチル化誘導体５と比較すると、C-5位の疎水性部分がアイソスターの効力を減少させ、同様の疎水性置換が化合物６のようにC-3とC-4の位置で行われると活性が増大することがわかる。 完全メチル化ピロリジン誘導体６は５〜７系列の最も強力な誘導体であるが、メチル化誘導体５〜 ７の活性を化合物８と比較することによりわかるようにC-1のアミド結合の不在により顕著な活性が消失した。 C-4置換ピロリジン誘導体９〜11は、８より強力であることがわかり、trans-C-4メトキシ誘導体10は最良であった (IC

    50 =2.9μ M)。 完全メチル化α−ケトアミド誘導体12 (図10) を比較のために合成し、HIV PR に対して対応するヒドロキシエチルアミンアイソスター６より強力であるが最初のアイソスター２より効力がかなり低い(Ki = 20μM)ことがわかった。 この結果は、また、ピロリジン誘導体のC-1のアミド結合の重要性を示すものである。 要するに、ピロリジン含有α−ケトアミドとヒドロキシエチルアミンのコア構造を有するＨＩＶとＦＩＶのプロテアーゼの機序に基づく阻害剤の新規な化合物が開示される。 これらのα−ケトアミドコア構造２は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤として対応するヒドロキシエチルアミンアイソスター構造より約３00倍良好でありかつ対応するホスフィン酸誘導体より1300倍良好であることが開示される。 しかしながら、α−ケトアミドは、NMR実験及Ｘ線構造解析によって示されるようにＨＩＶプロテアーゼに結合するまで水和されない。 更に、修飾したピロリジン誘導体を含むヒドロキシエチルアミンの阻害活性の分析により、ピロリジンのC-4のcis-メトキシ基が結合を５倍及びtrans-異性体については25倍改善することが開示された。 この戦略をα−ケトアミドアイソスターにあてはめるとC-4のc is-ベンジルエーテルが結台を３倍増強することがわかった。 ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤として調製されたコア構造はいずれも機械論的に同一のＦＩＶプロテアーゼに対して顕著な阻害活性を示さず、阻害を改善するために追加の相補基を必要とする。 本発明の別の態様は、HIV PR阻害剤の創製及び薬剤耐性の実験のモデルとしてのFIV PRの使用に関する。 この開示は、本明細書に示されたデータ及びいくつかの追加所見によって支持される。 第１に、両酵素は機械論的に同一である。 第２ に、２つの酵素の構造に基づくアラインメントはその構造類似性を示す（図11及び図12）。 第３に、HIV PRのほとんどの強力な非共有結合阻害剤はFIV PRの良好な阻害剤でなく、FIV PR阻害剤はたいてい良好なHIV PR阻害剤である。 従って、 FIV PRの良好な低分子量阻害剤がHIV PRに対して良好であることが開示される。 第４に、阻害剤耐性変異体から単離したHIV PRは、FIV PRの対応する位置に見られる突然変異を含む。 図12に示される６個のハイライトはFIV PRで同じ位置に見られるものと同一のHIV PR阻害剤に耐性のある変異体から単離したHIV PRに見られる変化したアミノ酸を表す。 従って、FIV PRは耐性問題のないHIV PR阻害剤の開発の良好なモデルであることが開示される。 例えば、合成プロテアーゼ阻害剤に耐性のある変異体から単離したHIV PRはI50V突然変異を含み、変異体プロテアーゼは同様の阻害剤によって80倍まで阻害されない。 表Ｉ． HIV PR及び／又はFIV PRに対する阻害活性。 これらの関連ウイルスプロテアーゼに対する二重スクリーニング法を示すHIV PR及び／又はFIV PRに対する種々のアミノ酸の阻害活性を下記の表Ｉに示す。 表Ｉ． HIV PR及び／又はFIV PRに対する阻害活性

    合成法 1)生物学的分析 HIV PRプロテアーゼのIC

    50値を求めるために、全化学合成（Kentら Science19 92, 256, 221）によって調製したバックボーン操作 HIV-1プロテアーゼの最終濃度450nMを、阻害剤、28μMの発蛍光団ペプチド基質（配列Abz-Thr-Ile-Nle-Phe- (p-NO

    2 )-Gln-Arg-NH

    2 (Tothら, Int. J. Peptide Res. 1990, 36, 544))及び1.8 %ジメチルスルホキシドの分析バッファー: 0.5mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン、 酵素を安定化するために脂肪酸、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼを含まない) を含有する100mM MESバッファー、pH 5.5を含有する溶液(最終容量152μl)に加えた。 その溶液を混合し、５分間インキュベートし、その間に基質切断速度を分析溶液の蛍光の変化を連続して記録することによりモニターした。 325nmの励起フィルター及び420nmの発光フィルターを用いた。 このデータを１分問に切断した基質のμMに変換し、切断基質の濃度に対する蛍光の変化の所定の標準検定曲線を用いた。 ＨＩＶプロテアーゼのK

    iの定量を次の変更をして同様に行った。 使用した基質濃度は57, 43, 28及び14μMとした。 他の濃度は全て上記の通りとした。 データに合った曲線を求め、それ以後のK

    iを密着結合阻害剤に対するMorrisonらBioChi m. Biophys. ACTA 1969, 185, 269の式に基づくコンピュータプログラムを用いて誘導した。 ＦＩＶプロテアーゼのK

    iとIC

    50を求めるために、0.125μgの酵素を阻害剤、56 0μMペプチド基質（配列 Gly-Lys-Glu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Ala-Tyr〜Pro-Ile- Gln-Thr-Val-Asn-Gly)及び2%ジメチルスルホキシドの分析バッファー（上記）と4MのNaCl

    aq.溶液の1:3混合液に加えた。 その溶液を混合し、37℃で10分間インキュベートし、0.2M酢酸ナトリウムを含む8MグアニジンHCl溶液、pH4.2(100μl) を加えることにより反応液を急冷した。 切断生成物と基質を逆相HPLCで分離した。 215nmの吸光度を測定し、ピーク面積を求め、相対ピーク面積を用いて生成物に対する転化率を計算した。 データを阻害剤濃度に対する1/V(V = 基質が切断される速度ナノモル／分）としてプロットし、得られた線が1/Vm

    max (V

    max = 6.85 ナノモル／分) と交差する点として-K

    iを求めた。 IC

    50を50%阻害の阻害剤濃度として求めた。 ＦＩＶプロテアーゼのVm

    max (6.85±0.7ナノモルmi n

    -1 ) とK

    m (707±70μM)を1/[S]([S]=基質濃度ナノモル) に対する1/V(V= 速度ナノモル／分）のプロットから求めた。 使用したデータを次のように変更してK

    iと同様に生成した。 使用した基質濃度は、阻害剤の存在しないときの560、448、 336、224、111 及び56μMとした。 ＦＩＶプロテアーゼの精製: ＦＩＶプロテアーゼのコード配列を含む503塩基対のEco R1-Bam H1断片をFIV-34TF10(Talbottら Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 1989, 5743)からpT7-7ベクター(Taborら Proc. Natl. Acad. Sci USA 821985， 1074）にクローン化した。 挿入断片の5'端をNde1アダプターを加えることにより修飾し、後者の部位でコード化したメチオニンから翻訳を開始する正しい読み枠を与えた。 翻訳により18.6kDa前駆体の生産がもたらされ、13.2 kDa FIVPRと各々3.6kDaと1.8kDaのＮ末端断片とＣ末端断片へ自動処理した。 構築物をE.コリ株BL21.DE3，lys S (Studierら Meth.Enzymol. 1990, 185, 60)に形質転換し、一夜培養を用いて播種し、15リットル発酵を37℃でサークレグロー培地(Bio 101) と100μlのアンピシリン、20μMのクロラムフェニコールを用いて行った。 細胞を中問対数期に達してから温度を24℃に下げ、IPTG（イソプロピルβチオガラクトピラノシド）を最終濃度１mMに加えた。 発酵を１６時間進行させ、細胞を遠心分離により回収し、将来の使用のために１００ｇの分割量で−７０℃において凍結した。 凍結沈降物に60Omlの50mMトリス-HCl、pH８、５mM EDTA及び２mM２−メルカプトエタノールを加えることにより細胞(100ｇ) を溶解した。 解凍時に溶解した細胞及び粘性混合液をワーリングブレンダーで４℃において２分間ホモジェナイズした。 試料を8,000×ｇで20分間遠心分離し、沈降物を捨てた。 試料を１リットルに希釈してから300K区分膜(Filtron)に対する接面流に供し、５リットルの同様のバッファーを用いて洗浄した。 保持物質を捨て、フロースルー上清を10K区分膜に対する接面流によって濃縮した。 保持物質は同じバッファーで平衡化したDE52陰イオン交換カラム(5ｘ20cm)を通過した。 このカラムからのフロースルーは同じバッファーでpH 8に平衡化したS-セファロース高速流動マトリックス(2.5 ｘ20cm カラム, Pharmacia)を通過した。 S-セファロースからのフロースルーを硫酸アンモニウムで1Mにし、フェニルセファロースカラム(Pharmacia, 1.5 ×10cm)に加え、1M硫酸アンモニウムを含む溶解バッファーで洗浄し、100-0%硫酸アンモニウム直線勾配で溶離した。 PRを含むピーク画分をプールし、セントリプレプ(Amicon)を用いて濃縮し、10mMトリス-HCl、pH８、５mM EDTA、2mM 2-メルカプトエタノールに対して透析した。 試料をMOPSで10mMにし、HClでpH5.5に調整し、10mMトリス-MOPS，pH5.5, ５mM EDTA及び2mM 2-メルカプトエタノールで平衡化したリソースSカラム(Pharmacia)に加えた。 同じバッファー中0-300mM Na Cl直線勾配を用いてPRを溶離した。 ピーク画分をプールし、濃縮し、以後の実験のために-20℃で分割量として貯蔵した。 単離したFIV PRの多能性をイオン噴霧質量分析法によって確認した。 2)

    化学合成全ての操作を不活性雰囲気（アルゴン又は窒素）下で行った。 溶媒は全て試薬グレードとした。 無水エーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びトルエンは、ナトリウム及び／又はべンゾフェニンケチルから蒸留した。 ジクロロメタン(C H

    2 Cl

    2 )を水素化カルシウム(CaH

    2 )から蒸着した。 N, N, ジメチルホルムアミド(D MF)及びアセトニトリルを五酸化リンと水素化カルシウムから蒸留した。 メタノールをマグネシウムとヨウ素から蒸留した。 有機酸と塩基を試薬グレードとした。 他の試薬は全て最高純度の市販化合物とした。 分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)をメルクシリカゲル(60F-254)プレート(0.25mm) 上で行った。 特にことわらない限り標準法を用いて可視化を行った。 フラッシュカラムクロマトグラフィーはメルクシリカゲル60粒径(0.040-0.063mm，230-400メッシュ）上で行った。 融点は、トーマス・フーバー毛管融点装置で求め、補正していない。 プロトン及び炭素磁気共鳴スペクトル(

    1 H-NMR,

    13 C-NMR) をブルカーAM-500, AMX-400或いはAC250MHzフーリエトランスフォーム分光計で記録した。 結合定数(J)はヘルツで示し、化学シフトを内部標準としてテトラメチルシラン(TMS, ０ppm)、MeOH(

    1

    H3.30ppm及び

    13 C 49.0ppm) 又はCHCl

    3 (

    1 H 7.24ppm及び

    13 C 77.0ppm) に相対する100万部に対する部数（δ）で示す。 赤外スペクトル(IR)をパーキン・エルマー1 600系FT-IR分光光度計で記録した。 吸収を波数(cm

    -1 )で示す。 本明細書に記載されるペプチド断片は、伝統的なペプチドカップリング法［ED C (1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドHCl)、HOBt (1-ヒドロキシベンゾトリアゾール) 及びDIEA (ジイソプロピルエチルアミン)]を用いて合成した。 エステルを塩基 (メチルエステルについてはLiOH) 又は酸 (t-ブチルエステルについてはTFA)で加水分解した。 図６に示される化合物10の合成 化合物10:α−ケトエステル10をAngelastroらJ. Org. Chem. 1989, 54,3913-391 6に記載される方法に従って合成した。 α−ケトエステルを他の方法、Wasserman らJ. Org. Chem. 1994, 59, 4364-4366(43); Wongら J. Med. Chem1993, 36, 21 1-220によって合成することも可能であるが、使用した経路は最も簡潔で高収率であることがわかった。 図１に示されAngelastroによって記載された方法は次の通りである。 (i) t-BuLi, エチルビニルエーテル, MgBr

    2 , THF;(ii) O

    3 , CH

    2 Cl

    2

    。 図６、工程(iii)に示される化合物11の合成 化合物11. メタノール／水（0.10モル）中化合物10の2:1溶液に0.17N LiOH水溶液を加え、反応液を０℃で２時間攪拌した。 次に、混合液を逆相クロマトグラフィーで精製し、化台物11を全収率98%で得た。 図７に示される(2R, 3S)及び(2S, 3S)Ｎ− (ベンジルオキシカルボニル) −AHAP − (３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸) エチルエステル12及び13の合成 図７、工程ｉに示されるように、基質10(600mg，1.7ミリモル) をメタノール(10 ml)に溶解し、０℃に冷却した。 次に、水素化ホウ素ナトリウム（70.3mg,1.9ミリモル）を加えた。 20分後、飽和塩化アンモニウム

    (aq.) （10ml）を加えることより反応液を急冷した。 反応混合液を減圧下で濃縮してメタノールのほとんどを除去した。 次に、水性残留物を酢酸エチル（3×20ml）で抽出し、食塩水（10ml ）で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、減圧下で濃縮して粗生成物をジアステレオマーの混合物として得た。 アルコールをヘキサン中15%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで分離してアルコールを3:4の割合で得た, 12 &13（590mg , 97%）。 各Rf=0.54及び0.40(EtOAC／ヘキサン，1:2): 12(2R, 3S-無色の油状物);

    1 H NMR（500MHz, CDCl

    3 ）δ 7.34-7.18(10H, m), 5.17(1H, d,Ｊ 9.5), 5.04 (2H, s), 4.43-4.38（1H, m), 4.33(1H, dd, Ｊ 4.5, 2.0), 4.15-4.08(1H, m), 3.98-3.92(1H, m), 3.28(1H, d, Ｊ 5.0); IR(NaCl)ν

    max 3368,3030, 2981, 1 731, 1520, 1455, 1246, 1104, 1055, 748, 699 cm

    -1 ; FABHRMS(NBA) m/e 358. 1659([M+H]

    + , C

    20 H

    23 NO

    5の計算値358.1654);(実測値: C,67.30; H, 6.50; N, 3. 99. C

    20 H

    23 NO

    5の計算値C, 67.21; H, 6.49; N, 3.92%).13(2S, 3S-結晶);

    1 H NM R(500MHz, CDCl

    3 )δ7.34-7.18(10H, m), 5.17(1H,d, Ｊ 9.5), 5.04(2H, s), 4. 43-4.38(1H, m), 4.33(1H, dd, Ｊ 4.5, 2.0),4.15-4.08 (1H, m), 3.98-3.92 ( 1H, m), 3.28 (1H, d, Ｊ 5.0); IR (NaCl)ν

    max 3368, 3030, 2980, 1731, 152 0, 1455, 1246, 1104, 1055, 748, 699cm

    -1 ; FABHRMS (NBA) m/e 358.1661 ((M+ + H), C

    20 H

    23 NO

    5の計算値358.1654);(実測値: C, 67.22; H, 6.57; N, 3.90. C

    20 H

    23 NO

    5の計算値C, 67.21; H,6.49; N, 3.92%). mp 88-89℃ 図７に示される各(2R, 3S)及び(2S, 3S)Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−３ −アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸14 & 15の合成 図７、工程iiに示されるように、基質 (12又は13) (250mg, 0.70ミリモル) をメタノール／水, 2:1(5ml)中0.25N LiOHに溶解し、周囲温度で30分間攪拌した。 反応液を1N HCIl

    (aq.)でpH7.0に調整し、減圧下でメタノールを除去した。 次に水性残留物を1N HCl

    (aq.)でpH2.0に酸性にし、酢酸エチル（3×30ml）で抽出した。 合わせた有機抽出液を水(1Oml)、食塩水(1Oml)で洗浄し、乾燥 (MgSO

    4 )した後に減圧下で濃縮して所望の酸（14又は15）を白色固形物(212mg, 92%) として得た。 酸を熱エタノールから再結晶して精製した。 14 (2R, 3S);

    1 H NMR(500MHz, CD

    3 OD) δ7.31-7.18 (10H, m), 6.87 (1H, d, Ｊ 9.5), 5.00 (1H, d,Ｊ 10.0), 4.96 (1H, d, Ｊ 10.0), 4.31-4.23 (1H, M), 4.07 (1H, d, Ｊ 2.5),2.93 (1H , dd, Ｊ 13.5, 7.5), 2.83 (1H, dd, Ｊ 13.5, 8.0);

    13 C NMR (125MHz,CD

    3 OD) δ 176.6 (C=0), 158.5 (C=0), 139.8 (C), 138.5 (C), 130.7 (2×CH),129.8 ( 2×CH), 129.7 (2×CH), 129.7 (CH), 129.1 (CH), 128.8 (CH), 127.8(CH), 67 .6 (CH), 57.1 (CH

    2 ), 57.0 (CH

    2 ), 39.3 (CH); FABHRMS (NBA) m/e330.1353([M +H］

    + , C

    18 H

    19 NO

    5の計算値330.1341); mp 209-210（分解）． 15(2S, 3S);

    1 H NMR (500MHz, CD3OD) δ7.28-7.18 (10H, m), 7.09 (1H, d, Ｊ12.5), 4.97 (1H , d, Ｊ 12.5), 4.92 (1H, d, Ｊ 12.5), 4.26 (1H, d, Ｊ 4.0),4.25-4.20 (1H , m), 2.81 (1H, dd, Ｊ 14.0, 4.0), 2.76 (1H, dd, Ｊ 14.0, 4.0);

    13 C NMR ( 125MHz, CD

    3 OD)δ175.9 (C=0), 158.5 (C=0), 140.0 (C), 138.6 (C),130.6(3× CH), 129.6 (CH), 129.5 (3× CH), 129.0 (CH), 128.8 (CH),127.6 (CH), 74. 3 (CH), 67.4 (CH

    2 ), 57.1 (CH), 36.5(CH

    2 ); FABHRMS (NBA/Nal) m/e 352.1174 ([M+Na]

    + , C

    18 H

    19 NO

    5の計算値352.1161);(実測値: C,65.34; H, 5.75; N, 4.33 . C

    18 H

    19 NO

    5の計算値C, 65.64; H, 5.82; N, 4.25%); mp． 173-174℃（分解）． Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド16（スキーム７）の合成 シグマから市販されている基質Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリン（ 3.O g，13.9ミリモル）を乾燥CH

    2 Cl

    2 （20ml）に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（2.07 g，15.3ミリモル）、EDC，1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド（2.93 g，15.3ミリモル）及び tert-ブチルアミン（1.6ml，15.3ミリモル）を加え、混合液を周囲温度で18時間攪拌した。 反応液を酢酸エチル(100ml)で希釈し、水（2×20ml）、1 N HCl

    (ap.) (10ml) 、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (ap.) （10ml）、水(10ml)、食塩水(10ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後に粗生成物を得た。 ヘキサン中33％ EtOAcで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製してＮ−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミドを無色の油状物（1.53 mg，40%）として得た。 Rf =0. 46（EtOAc／ヘキサン，1:1）．

    1 H NMRシグナルは回転異性体により幅広くなった。

    1 H NMR（500MHz，CDCl

    3 ）δ7.31-7.25(5H，m)，6.35(1H，br s)，4.60-4.15(3 H，m)，3.55-3.22(2H，m)，2.41-1.70(4H，m)，1.60-1.18(9H，br s);IR（NaCl ）ν

    max 3298，3086，2976，1698，1660，1531，1398，1162 cm

    -1 ; FABHRMS(NBA/ NaI)m/e 293.1832([M＋Na]

    + ，C

    14 H

    26 N

    2 O

    3の測定値 293.1841)． Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミドを次のように行った。 Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド(600 mg ，2.22ミリモル)を CH

    2 Cl

    2 （10ml）に溶解し、０℃に冷却した。 次に、その溶液にTFA,トリフルオロ酢酸(10ml)を加えた。 ０℃で１時間後、反応液を減圧下で濃縮し（高真空中で残りの TFAを除去した）所望のアミン16のトリフルオロ酢酸塩を無色の油状物(800mg，95％)を得た。 そのアミンを精製せずに次のカップリングに用いた。

    1 H NMR(500MHz，CDCl

    3 )δ7.30(1H，br s)，6.90(1H，br s)，4.5 2(1H，br s)，3.35(2H，br s)，2.49-2.34(1H，m),2.08-1.97(3H，m),1.34(9H， s);

    13 C NMR(125MHz，CDCl

    3 )δ 167.4(C=O)，59.6(CH)，52.3(C)，46.6(CH

    2 )，3 0.4(CH

    2 )，28.2(3 ×CH

    3 )，24.6(CH

    2 ); FABHRMS(NBA)m/e171.1500([M＋H］

    + ，C

    9

    H

    18 N

    20の計算値 171.1497).

    図７に示される一般ペプチドカップリング法: (2S，3R)及び(2S，3S)３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド17及び18の合成 図７、工程 iiiに示されるように、基質14又は15（70mg，0.213ミリモル）を乾燥DMF(3 ml)に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(31 mg, 0.22ミリモル)、EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルアルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン(122μ l，0.703ミリモル)を加え、混合液を室温で30分間攪拌した。 第二アミン16をその TFA塩(73 mg，0.255 ミリモル)として加え、反応液を18時間攪拌した。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)を加えた。 水相を酢酸エチル(3 ×10ml)で抽出した。 次に、合わせた有機相を水(2 ｘ5ml) 、1 N HCl

    (aq.) (5 m1)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 ml)、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 酢酸エチル／ヘキサン1:1 で溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物17又は18を無色の油状物(74 mg，72%)として得た。 各Rf = 0.33 & 0.28(EtOAc:ヘキサン，1:1)． 17(2R，3S);

    1 H NMR（500MHz ，CDCl

    3 ）δ 7.37-7.23(10H，m)，6.44(1H，s)，5.16(1H，d，J 9.5)，5.03(2H ，s)，4.24-4.18(1H，m)，4.11(1H，d，J 5.5)，3.97-3.90(2H，m)，3.28-3.23( 1H，m)，3.12-3.06(1H,m)，2.99-2.90(2H，m)，2.18-2.12(1H，m)，2.01-1.96(1 H，m)，1.89-1.83(1H，m)，1.83-1.76(1H，m)，1.27(9H，s)；

    13 C NMR（100MHz ，CDCl

    3 ）δ 171.4(C=0)，169.9(C=0)，156.0(C=0)，137.4(C)，136.7(C)，129. 2(2× CH)，128.7(2× CH)，128.4(2× CH)，128.0(CH)，127.9(2× CH)，126.9 (CH)，68.6(CH)，66.7(CH

    2 )，61.7(CH)，52.8(CH)，51.1(C)，46.1(CH

    2 )，38.4( CH

    2 )，28.6(3 × CH

    3 )，27.4(CH

    2 )，24.7(CH

    2 ); IR（NaCl）ν

    max 3318，2966， 1714，1667，1537,1454，1366,1041 cm

    -1 ;FABHRMS（NBA）m/e 482.2677([M＋H ]

    + ，C

    27 H

    35 N

    3 O

    5の計算値482.2655);(実測値:Ｃ，67.22; H，7.32; N，8.80．C

    27

    H

    35 N

    3 0

    5の計算値 C,67.34; H，7.33; N，8.73％)． 18(2S，3S);(主要回転異性体のみ)

    1 H NMR（400MHz,CDCl

    3 ）δ7.33-7.17(10H，m)，6.45(1H，s)，5.21(1H，d ，J 8.8)，4.99(2H，s)，4.60(1H，dd，J 6.8，2.1)，4.52-4.47(1H，m)，4.21- 4.13(1H，m)，3.81-3.66(3，m)，2.75-2.60(2H，m)2.41-2.30(1H，m)，2.25−2. 09(1H，m)，2.05-1.90(2H，m)，1.30(9H，s);

    13 C NMR(100MHz，CDCl

    3 )δ171.3( C=0)，169.6(C=0)，156.0(C=0)，137.3(2 ×C)，129.1(2×CH)，128.5(2×CH)， 128.4(2 ×CH)，128.0(CH)，127.8(2 ×CH)，126.5(CH)，71.3(CH)，6.6(CH

    2 )， 61.1(CH)，54.3(CH)，51.3(C)，47.5(CH

    2 )，33.8(CH

    2 )，28.6(3×CH

    3 )，26.9(CH

    2 )，25.4(CH

    2 ); IR(NaCl)ニュー

    max 3318，2966，1714，1667，1537，1454，1366 ，1041 cm

    -1 ; FABHRMS（NBA/Csl）・/e614.1645([M＋Cs]

    + ，C

    27 H

    35 N

    3 O

    5の計算値 614.1631);(実測値: C，67.20; H，7.66; N，8.54．C

    27 H

    25 N

    3 O

    5の計算値 C， 67.34; H，7.33; N，8.73％).

    図７に示されるデス・マルチン酸化の一般手順 (3S)及び(3R)３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ケト−４−フェニルブチリル−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド２の合成． 図７、工程ivに示されるように、基質17（21 mg，0.044ミリモル）を乾燥CH

    2 C l

    2 (2 ml)に溶解し、デス・マルチンペリオジナン(26 mg，0.088ミリモル）を加えた。 反応混合液を周囲温度で24時間攪拌してから酢酸エチル(10 ml)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム

    (aq.) (5 ml)及ひチオ硫酸ナトリウムで希釈した。 水相を酢酸エチル(3×20ml)で抽出した。 合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(1 0 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 ヘキサン中30% 酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物２をジアステレオマーの３：１混合物(無色の油状物)(20 mg，95%)として得た。 Rf = 0.47(EtOAC／ヘキサン，1:2)． 混合物に関するスペクトルデータ:

    1 HN MR（400MHz，DMSO)δ 7.86(1H，d，J 7.8)，7.71(1H，d，J 8.3)，7.64(1H，s) ，7.53(1H,s)，7.37-7.10(20 H，m)，5.10(1H，ddd，J 11.0，8.3，2.4)，5.01( 1H，d，J 12.6)，4.95（1H，d，J 12.6)，4.95(1H，d，J16.3)，4.88(1H，d，J 16.3)，4.79-4.73(1H，m)，4.66(1H dd，J 7.8，4.2)，4.26(1H，dd，J 7.8，4. 5)，3.60-3.37(3H，m)，3.33-3.24(1H，m)，3.18(1H，dd，J 14.7，2.4)，3.13( 1H，dd，J 10.2，3.9)，2.79(1H，dd，J 13.7，10.2)，2.46(1H，dd，J 14.7，1 1.0)，2.23-2.17(1H，m)，2.04-1.97(1H，m)，1.90-1.60(6H，m)，1.24(9H，s) ，1.22(9H，s):

    13 C NMR(100MHz，CDCl3)δ198.91 (C=O)，196.7(C=O)，170.7(C =O)，169.9(C=O)，162.6(C=O)，162.2(C=O)，156.1 (C=O)，155.9(C=O)，138.5( C)，137.6(C)，136.9(C)，136.9(C)，129.0(CH×2)，128.8(CH ×2)，128.4(CH ×8)，127.8(CH ×2),127.6(CH ×2)，127.6(CH ×2)，126.5(CH)，126.4(CH)， 65.6(CH

    2 )，65.3 (CH

    2 )，60.3(CH)，59.7(CH)，59.2(CH)，58.2(CH)，50.3(C)，50.1(C)，47.6(CH

    2 )，47.4(CH

    2 )，34.8(CH

    2 )，34.1(CH

    2 )，32.5(CH

    2 )，29.1(CH

    2 )，28.5(CH

    3 × 3 )，28.4(CH

    3 × 3)，24.5(CH

    2 )，21.7(CH

    2 ); IR(NaCl)ν

    max 3325，2966，1715， 1670，1634，1531，1454，1258，1051，738，699; FABHRMS(NBA/Nal)m/e 502.2 295 ([M＋Na]

    + ，C

    27 H

    33 N

    3 O

    5の計算値502.2318);（実測値: C，67.62; H，7.05; N，8.96. C

    27 H

    33 N

    3 O

    5の計算値 C，67.62; H，6.94;N，8.76%). 図８に示されるＬ−プロリル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミン−tert−ブチ−アミド19の合成 図８に示されるように、シグマ（3.0g，13.9 ミリモル）から市販されている基質、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｌ−プロリンを乾燥CH

    2 C(20 ml)に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(2.07 g，15.3 ミリモル)、E DC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（2.93 g ,15.3ミリモル）及びNH-Ile-Gln-OBu（1.6ml，15.3ミリモル; ペプチド断片を伝統的なペプチドカップリング法: EDC,HOBT，DIEA，Ile，Glnを用いて合成し、te rt−ブチルエステルとして保護した）を加え、混合液を周囲温度で18時間攪拌した。 反応液を酢酸エチル(100 ml)で希釈し、水(2× 20ml)、1 N HCl

    (aq.) (10 ml )、重炭酸飽和溶液

    (ap.) (10ml)、水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgS O

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 ヘキサン中 33％EtOAc で溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製してNH-Ile-Gln-OBu−Ｌ−プロリル−te rt−ブチルアミド19を無色の油状物(1.53mg，40%)として得た。 Rf = O.46(EtOAc ／ヘキサン，1:1)．

    1 H NMRシグナルは回転異性体のために幅広くなった: スペクトルデータ:

    1 H NMR(400MHz，CD,OD)δ 4.35-4.30(1H，m)，4.31(1H，dd，J 9.3 ，5.O)，4.21(1H，d，J 7.8)，3.41-3.26(2H，m)，2.48− 2.36(1H，m)，2.36-2.22(2H，m)，2.20-1.79(6H，m)，1.67-1.54(1H，m)，1.46( 9H，s)，1.32-1.17(1H，m)，0.99(3H，d，J 6.8)，0.93(3H，t，J 7.4); C

    13 NMR（100MHz，CD

    3 OD）δ 173.3(C=O)，172.O(C=O)，170.1(C=O)，167.7(C=O) ，83.0(C)，60.7(CH)，59.9(CH)，54.O(CH)，47.4(CH

    2 )，37.9(CH)，32.5(CH

    2 ), 31.2(CH

    2 ),28.4(CH

    2 )，28.2(3 × CH

    3 )，26.O(CH2)，25.O(CH

    2 )，15.9(CH

    3 )，11 .4(CH

    3 ); FABHRMS(NBA)/e435.2575([M＋Na］

    + ，C

    20 H

    36 N

    4 O

    5の計算値 435.2583) ． 図８に示される(2S，3S)３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミン−tert−ブチルアミド20の合成 図８、工程ｉに示されるように、ペプチドカップリング一般手順を用いて酸15のアミド19へのカップリングを行った。 代表的な合成は次の通りである。 基質15（ 70mg，0.213ミリモル）を乾燥DMF(3ml)に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(31mg，0.22ミリモル)、EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド(43mg，0.224ミリモル）、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン(122μ1，0.703ミリモル)を加え、混合液を室温で30分間攪拌した。 第二アミン19をそのTFA塩(73 mg，0.255ミリモル）として加え、反応液を18時間攪拌した。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加えた。 水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出した。 次に、合わせた有機相を水(2× 5ml)、1 N HCI

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq

    .) (50 ml)、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 酢酸エチル／へキサン，1:1 で溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物20を無色の油状物(74mg，7 2%)として得た。 各Rf = 0.33 & 0.28（EtOAc:ヘキサン，1:1）ジクロロメタン中5％メタノールで溶離するフラッシュクロマトグラフィー処理して所望の生成物20を無色の油状物として得た。

    1 H NMR（400MHz，CDCl

    3 ）（主要回転異性体のみ）δ 7.42-7.12(11H，m)，6.95(1H，d，J 8.6)，6.79(1H，s)，6.0 7(1H，s)，5.95(1H，d，J 8.3)，5.03(1H，d，J 12.4)，4.96(1H，d，Ｊ12.4)， 4.65（1H，d，J 4.5)，4.51（1H，dd，J 8.0，5.2)，4.49-4.35(2H，m)，4.32(1 H，d，J 7.8)，3.99-3.94(1H，m)，3.70-3.50(2H，m)，2.91-2.83(2H，m)，2.28 -2.21（1H，m)，2.21-2.10(3H，m)，2.02-1.75（5H，m)，1.43(9H，s)，1.14-1. 06（1H，m)，0.86(3H，d，J 6.4)，0.78(3H，t，J 7.6); C

    13 NMR(100MHz，CDCl

    3 )δ 175.5(C=O)，172.2(C=O)，171.5(2 ×C=O)，170.4(C:O)，156.3(C=O)，137 .9(C)，136.3(C)，129.1 (2 ×CH)，128.4(4 ×CH)，128.0(CH)，127.6(2×CH) ，126.4(CH)，82.4(C)，71.4(CH)，66.5(CH2)，61.2(CH)，57.8(CH)，55.5(CH) ，52.3(CH),47.7(2×CH

    2 )，37.0(CH)，33.8(CH

    2 )，31.48(CH

    2 )，28.76(CH

    2 )，27 .9(3×CH

    3 )，25.3(CH

    2 )，24.8(CH

    2 )，15.3(CH

    3 )，11.0(CH

    3 ); FABHRMS(NBA/CsI) m/e 856.288([M+Cs]

    + ，C

    38 H

    53 N

    5 O

    9の計算値 856.2898)． 図８に示される(3S)及び(3R)３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル（アミノ−２ −ケト−４−フェニルブチリル−Ｌ−プロリル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−グルタミン−tert−ブチルアミド３ 図８に示されるように、上記のデス・マルチン酸化の一般手順を用いて20の酸化を行った。 ジクロロメタン中5%メタノールで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のα−ケトアミド3(S)(2:1の異性体混合物）を無色の油状物(37 mg，定量的）として得た。 代表的な合成は次の通りである。 基質20(21 mg ,0.044 ミリモル）を乾燥CH

    2 CI

    2 （2 ml）に溶解し、デス・マルチンペリオジナン(26mg，0.088 ミリモル）を加えた。 反応混合液を周囲温度で24時間攪拌してから酢酸エチル(10ml)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム

    (aq.) (5ml)及びチオ硫酸ナトリウムを加えることにより急冷した。 水相を酢酸エチル(3×20ml)で抽出した。 合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(10ml)で洗浄し、乾燥(MgS0

    4 )し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 ヘキサン中30%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで処理して所望の生成物３を 3:1のジアステレオマー混合物(無色の油状物)(20 mg，95％)として得た。 （S）異性体: Rf＝0.24(EtOAC)．

    1

    H NMR(400MHz，CDCl

    3 )δ 7.38-7.16(11H，m)，6.98(1H，d，J 8.5)，6.80(1H，s )，6.64(1H，s)，5.64(1H，d，J 8.3)，5.09(1H，d，J12.2)，5.02(1H，d，J 12 .2)，4.46(1H，dd，J 8.2，3.4)，4.21(1H，t，Ｊ8.1)，3.67-3.60(1H，m),3.59 -3.45(1H，m)，3.70-3.50(2H，m)，3.25(1H，dd，J 14.1，5.5)，3.09(1H，dd， J 14.1，8.5)，2.29-2.12(4H，m)，2.12−1.78(6H，m)，1.46(9H，s)Ｄ1.20-1.0 5(1H，m)，0.93-0.83(6H，m，2×CH3);C

    13 NMR(100MHzＤCDCl

    3 )δ 197.1 (C=O) ，175.1 (C=0)，171.1(C=O)，170.5(2× C=O)，162.9(C=0)，156.3(C=0)，135.7 (2 ×C)，129.1(2× CH)，128.7(2× CH)，128.5(2× CH)，128.5(CH)，127.5(2 × CH)，126.9(CH)，82.4(C)，77.2(CH)，67.3(CH

    2 )，61.0(CH)，58.0(CH)，52. 3(CH)，48.0(2×CH

    2 )，37.0(CH)，31.5(CH

    2 ),29.7(CH

    2 ),28.2(CH

    2 )，27.9(3× C H

    3 )，25.0(CH

    2 )，24.8(CH

    2 )，15.5(CH

    3 )，10.8(CH

    3 )． (3R)異性体:

    1 H NMR(400M Hz，CDCl

    3 ）δ7.38-7.16(11H，m)，6.84(1H，d，J 8.0)，6.21(1H，s)，5.54(1H ，s)，5.51(1H，d，J 8.3)，5.11-4.98(1H，m)，5.09(1H，d，J12.5)，4.80(1H ，d，J 12.5)，4.75-4.61(1H，m)，4.59(1H，d，J 5.8)，4.50-4.29(2H,m)，3.5 9-3.45(1H,m)，3.29(1H，dd,J 14.，3.9)，2.85(1H，dd，J 14.0，10.0)，2.29- 2.12(4H，m)，2.12-1.78(6H，m)，1.46(9H，s)，1.20-1.05(1H，m)，0.93-0.83( 6H，m，2×CH

    3 )． IR(NaCl)ν

    max 3290，2925，1728，1648，1537，1452，1367，1 247，1157; FABHRMS(NBA/Csl)m/e854.2775([M＋Cs］

    + ，C

    38 H

    51 N

    5 O

    9の計算値854. 2741)， 図12に示される2(R)，5(R)−ビス（メトキシメチル）−3(R)，4(S)(ジメトキシ) Nピロリジン 23 図11及び12に示されるように、H

    2 O(25 ml)中2(R)，5(R)−ビス（ヒドロキシメチル）−3(R),4(S)-ジヒドロキシピロリジン(806 mg，4.95 ミリモル; Wongら J． Org．Chem．1991，56，6280)を氷浴中で０℃に冷却し、Na

    2 CO

    3溶液(0.3M)でpH9 −10に調整した。 塩化ベンジルオキシカルボニル(1.4ml，9.9ミリモル，2 eq.) を滴下し、その溶液を０℃で１時間、次に周囲温度で１時問攪拌した。 溶媒を減圧下で除去し、残留物を EtOAcに溶解し、ろ過し、減圧下で濃縮した。 最初にヘキサン中 50％酢酸エチル、次に100%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して 2(R),5(R)−ビス（ヒドロキシメチル）−3(R)，4(S)−ジヒドロキシ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン生成物を薄黄色の油状物(1.1g,81%)として得た。 Rf = 0.27（EtOAc）

    1 HNMR(400MHz,CD

    3 OD)δ 7.37-7 .33(5H，m)，5.13(2H，s)，4.20-4.19(1H，m)，4.13-4.10(1H，m)，4.00(1H，br s)，3.95-3.55(5H，m);

    13 C NMR(100MHz，CD

    3 OD)(２つの回転異性体)δ 137.8 ，129.6，129.2，129.0，77.8，77.1，68.4，67.4，66.7，63.2，62.2,61.7，61 .6，61.1; FABHRMS（NBA）m/e 320.1121([M＋Na]+C

    14 H

    19 NO

    6の計算値 320.1110 ). 乾燥THF(1ml)中上で台成した2(R)，5(R)−ビス（ヒドロキシメチル）−3(R)， 4(S)−ジヒドロキシ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン(35 mg，0. 117 ミリモル）に CH

    3 Ｉ（116μl，1.86 ミリモル，16 eq.）、次にNaH(鉱油中6 0%分散液)(28.1mg，6 eq.)を加えた。 反応混合液を周囲温度で20時間攪拌し、減圧下で濃縮した。 ヘキサン中 12%〜20%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して2(R)，5(R)−ビス（メトキシメチル）−3(R)，4(S)−ジメトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジンを無色の油状物(40mg ，97％)として得た。 Rf = 0.6（ヘキサン中50%EtOAc）

    1 H NMR(400MHz，CD，OD) δ 7.29-7.23(5H，m)，5.04(2H，br s)，4.10(1H，br s)，3.74(3H，br，s)， 3.44-3.42(4H，m)，3.34(3H，br s)，3.31(3H，br s)，3.23(6H，br s); FABHRM S（NBA）m/e 376.1722([M＋Na]

    + C

    18 H

    27 NO

    6の計算値 376.1736)． メタノール(2 ml)中上で合成した2(R)，5(R)−ビス（メトキシメチル）−3(R) ，4(S)−ジメトキシ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン(40 mg，0. 181 ミリモル）にPd/C(10mg)を加えた。 混合液をH

    2バルーン下で３時間攪拌した。 セライトでろ過し、減圧下で濃縮して所望の生成物23を薄黄色油状物(25mg， 定量的)を得た。

    1 H NMR(250MHz，CDCl

    3 )δ 5.19(1H，br s)3.8-3.55(8H，m)，3. 54-3.35(12H，m);

    13 C NMR(62MHz，CDCl3)84.7，83.7，71.9，69.1，62.4，59.9 ，59.1，59.0，57.6，57.5; FABHRMS（NBA）m/e 220.1543([M＋H]

    + C

    10 H

    21 NO

    4の計算値 220.1549)． 図12に示された(3S)及び(3R)３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２ −ケト−４−フェニルブチリル−[2'(R),5'(R)−ビス（メトキシメチル）−3'(R )，4'(S)−ジメトキシピロリジン］900の合成 図12，工程i-iiに示されるように、基質 15（70 mg，0.213ミリモル）を乾燥D MF(3 ml)に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（31 mg，0 .22ミリモル）、EDC,１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン（122 μl，0.703ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌した。 第二アミン23をその TFA塩（73 mg，0.255ミリモル）として加え、反応混合液を18時間攪拌した。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加えた。 水相を酢酸エチル（3 ×1Om1）で抽出した。 次に、合わせた有機相を水(2 ×5 ml)、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (5 ml)、水(5 m l)、食塩水(5ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 酢酸エチル／ヘキサン，1:1で溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物26を無色の油状物として得た。 続いて反応液を、上記化合物２について示したデス・マルチン酸化一般手順を用いて酸化して所望の生成物 900を得た。 へキサン中 20%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製してα−ケトアミド900(20 mg,定量的)を得た。 Rf = 0.63（ヘキサン中50%EtOAc)． 分析は全て異性体の混合物について行った: NMR 主要異性体:

    1 H NMR(400MHz，CDCl

    3 )δ 7.32-7.17(10H，m)，5.75(1H，d，J 8.7)，5.16-5.1 2(1H，m)，5.09(1H，d，J 12.4)，5.04(1H，d，J 12.4)，4.39(1H，dt，J 3.9， 8.3)，3.98-3.96(1H，m),3.92(1H，t，J 6.0)，3.82-3.77(1H，m)，3.73(1H，dd ，J 10.0，5.0)，3.55(1H，dd，J 10.0，2.8)，3.47-3.17(3H，m)，3.45(3H，s) ，3.40(3H，s)，3.26(3H，s)，3.19(3H，s)，3.11(1H，dd，J 14.1，6.92); C

    13

    NMR(100MHz，CDCl

    3 )δ 197.62(C=O)，164.7(C=O)，155.7(C=O)，136.4(C)，129. 7(2× CH)，128.4(2× CH)，128.3(4× CH)，127.9(CH)，126.7(CH)，84.6(CH) ，83.6(CH)，70.7(CH

    2 )，69.7(CH

    2 )，66.8(CH

    2 )，60.7(CH)，58.9(CH)，58.7(OC H

    3 )，58.7(OCH

    3 )，58.4(OCH

    3 )，58.4(OCH

    3 )，56.7(CH)，37.3(CH

    2 )少量異性体:

    1 H NMR(400MHz，CDCl

    3 )δ7.32-7.17(10H，m)，5.46（1H，d，J 9.0)，5.11-4.87 (3H，m)，4.56-3.17(10H，m)，3.45(3H，s)，3.38(3H，s)，3.31(3H，s)，3.21( 3H，s)． IR(NaCl)ν

    max 2930，1717，1635，1506，1456，1110; FABHRMS（NBA/Cs I）m/e661.1550（[M＋C]

    + ，C

    28 H

    36 N

    2 O

    8の計算値 661.1526)．

    図12に示されるピロリジンからα−ケトアミドを形成するペプチドカップリング

    の一般手順 ： 図12，工程i-iiに示されるように、基質15（70 mg，0.213ミリモル）を乾燥DMF( 3 ml)に溶解する。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(31mg，0.22ミリモル）、EDC,１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（43mg，0.224ミリモル）、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン(122μl，0.70 3 ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間撹拌する。 第二アミン22; 23;24; 1 6; 25; 36; 37; 40; 42; 44; 46; 47; 48; 52; 53; 54; 58; 59; 60; 64;65; 66 ; 100; 101; 102 又は103 をその TFA塩として（73mg，0.255ミリモル）加え、 反応液を18時間攪拌する。 反応混合液を酢酸エチル(20ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加える。 水相を酢酸エチル（3 ｘ 10ml）で抽出する。 次に、合わせた有機相を水（2 ×5ml）、1 N HCl

    (aq.) (5ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 ml)、水(5ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1の酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得、これを直接次のような第二アルコールの酸化の工程に続ける。 第二アルコール（21 m g，0.044ミリモル）を乾燥CH

    2 Cl

    2 (2 ml)に溶解し、デス・マルチンペリオジナン（26 mg，0.088ミリモル）を加える。 反応混合液を周囲温度で24時間攪拌してから酢酸エチル(10 ml)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム

    (aq.) (5ml）とチオ硫酸ナトリウムを加えることにより急冷する。 水相を酢酸エチル(3×20 ml)で抽出する。 合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、 減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 ヘキサン中 30％酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して各生成物 70;900;71;2;73;74;75;76;77;78 ;79a;80a;81a;79b;80b;81b;82a;83a;84a;82b;83b;84b;1c;107;108 又は 109を 3 :1混合物（無色の油状物）(20 mg，95%)を無色の油状物として得る。 図11及び図14に示されるエポキシドの21の合成 化合物21: 0℃においてメタノール:THF(O.10 M;1:2)中化合物15の溶液に溶液のボランジメチルスルフィド(5 当量; 1.0M)を加え、一晩攪拌する。 次に、溶媒を除去し、混合液を塩化メチレン(0.10M)に再懸濁し、1.2当量のトリエチルアミンを０℃で加え、１時間攪拌する。 次に、 1.1当量の塩化トシルを加え、０℃で更に１時間攪拌する。 次に、反応混合液を水で急冷し、100%酢酸エチルで抽出し、重炭酸塩、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。 粗化合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。 次に、その化合物を０℃でMeOHに再懸濁し、10当量のKCO

    3を加え、１時間攪拌する。 次に、反応混合液をセライトでろ過し、水で急冷し、100%酢酸エチルで抽出し、重炭酸塩、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。 粗化合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化台物21を得る。 図11に示されるエポキシドのプロリンへのカップリングの一般手順 ピロリジン誘導体22; 23; 24; 16; 25; 36; 37; 40; 42; 44; 46; 47; 48; 52 ;53; 54; 58; 59; 60; 64; 65; 66; 100; 101; 102 又は103（20 mg，0.091ミリモル）に乾燥メタノール(2 ml)、Cbz-フェニルアラニルエポキシド 21(27 mg,0. 091 ミリモル，1.0 eq.)及びトリエチルアミン(14μl，0.100ミリモル，1.1eq.) を加えた。 この溶液を32時間還流してから減圧下で濃縮した。 酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を透明な油状物として得、各々ヒドロキシルエチルアミン誘導体: 400; 500; 600; 700; 800;38; 39 ; 41; 43; 45; 49; 50; 51; 55; 56; 57; 61; 62; 63; 67; 68; 69; 1b;104; 10 5; 106を得た。 図11に示されるＮ−［１−フェニル−２(S)−[(ベンジルオキシカルボニル)アミノ］−3(R)−ヒドロキシブタン−４−[2'(R)メトキシメチル］−ピロリジン600 の合成 化合物 600: ピロリジン誘導体 24 を一般手順に記載されるようにエポキシド21 にカップリングして 600を得た。 酢酸エチルで溶離するフラシュクロマトグラフイー処理して所望の生成物を透明な油状物(40 mg，56%)として得た。 R

    f = 0.15 (EtOAC)．

    1 H NMR（400MHz，CD

    3 OD）δ 7.29-7.16(10H，m)，4.97(1H，d，J12.7) ，4.92(1H，d，J 12.7)，3.85-3.81(1H，m)，3.77-3.73(1H，m)，3.42−3.25(3H ，m)，3.31(3H，s)，3.25-3.02(2H，m)，2.89(1H，m)，2.64(1H，dd，J 13.8，1 0.5)，2.61-2.52(2H，m)，1.95-1.87(1H，m)，1.84-1.77(2H，m)，1.61-1.55(1H ,m); C

    13 NMR(100MHz，CD

    3 0D)δ158.5(C=O)，140.3(2 ×C)，130.5(3×CH)，129. 4(CH)，129.2(3 ×CH)，128.8(CH)，128.5(CH)，127.2(CH)，73.O(CH)，67.1 (2 ×CH

    2 )，59.9(CH

    2 )，59.3(2 ×CH

    2 )，57.5(OCH

    3 )，57.2(CH

    2 )，36.8(CH

    2 )，28.5 (CH

    2 )，24.2(CH

    5 ); IR(NaCl)ν

    max 3330，2939，1699，1538，1454，1252，1203 ，1134，699; FABHRMS（NBA/NaI）m/e413.2458([M＋H]

    + ，C

    24 H

    32 N

    2 O

    4の計算値 4 13.2440)． 図11に示されるＮ−［１フェニル−２(S)−[(ベンジルオキシカルボニル)アミノ］−3(R)−ヒドロキシブタン−４−[2'(R)，5'(R)−ビス（メトキシメチル)]ピロリジン400 の合成 化合物 400: ピロリジン誘導体22(Cignarella，G.: Nathansohn，GJ．Org.Chem ．1960，26，1500-1502)を上記の条件に従ってエポシキド21にカップリングして 400を得た。 ヘキサン中 30〜50％ の酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を透明な油状物(35mg，40%)として得た。 Rf = O.47(EtOAc／ヘキサン，1:1)．

    1 H NMR(400MHz，CDCl

    3 )δ 7.33-7.17(10H， m)，5.02(2H，dd,J 20.4，12.1)，3.89(1H,m)，3.50(1H，m)，3.37(3H，s)，3.3 1 (2H，d，J 1.1)，3.24(3H，s)，3.20-3.18(2H，m)，2.95-2.89(4H，m)，2.85- 2.75(2H，m)，1.87-1.83(2H，m)，1.54-1.52(2H，m);

    13 C NMR(100MHz，CDCl

    3 )1 37.9，129.6，128.4，128.2，127.9，127.8，126.2，77.5,76.8，71.2，66.6，6 6.3，60.4，59.0，58.8，54.9，36.2，29.6; FABHRMS（NBA） m/e 457.2689([M＋H]

    + C

    26 H

    36 N

    2 O

    5の計算値 457.2702) 図11に示されるＮ−[1−フェニル−2(S)−[(ベンジルオキシカルボニル)アミノ］−3(R)−ヒドロキシブタン-4-[2'(R)，5'(R)−ビス（メトキシメチル）−3'(R )，4'(S)−ジメトキシ］ピロリジン500 の合成． 化合物 500: 上記のようにピロリジン誘導体 23 をエポキシド 21 にカップリングした。 ヘキサン中 50%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物 500を薄黄色油状物(20mg，42%)として得た。 Rf = 0.37(E tOAc／ヘキサン，1:1)．

    1 H NMR,(400MHz，CDCl

    3 )δ 7.33-7.19(10H，m)，5.02(2H，dd，J 12.3，20.6)， 4.09(1H，br s)3.90(1H，m)，3.70(1H，d，J 3.7)，3.58(1H，dd，J 6.4，9.3) ，3.54(2H，m)，3.37(3H，s)，3.36(3H，s)，3.35(3H，s)，3.40-3.28(5H,m)，3 .28(3H，s)，3.25-3.17（1H，m)，2.95-2.85(2H，m)，2.82-2.77(2H，m);

    13 CN MR(100MHz，CDCl

    3 )δ155.9，137.9，129.7，128.4，128.3，127.9，127.8，126. 3，84.8，83.9，75.1，72.2，70.6，69.9，66.9，66.4，61.0，59.0，58.9，58. 0，57.1，54.9，29.7; FABHRMS（NBA）m/e 517.2932([M＋H]

    + C

    28 H

    40 N

    2 O

    7の計算値 517.2914)． 図11に示されるＮ−[1−フェニル−2(S)−[(ベンジルオキシカルボニル］−3(R) −ヒドロキシブタン−４−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド 700の合成 化合物 700: Ｌ−プロリンtert−ブチルアミド 16（上で合成した）を上記条件に従ってエポキシド21にカップリングして 700を得た。 ヘキサン中100%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を無色の油状物(70mg，48%)として得た。 Rf

    = 0.17(EtOAc／ヘキサン，1:1)．

    1 H NMR(400MHz，CDCl

    3 )δ 7.33-7.14(10H，m)，7.02(1H，br s)，5.26(1H，br s )，5.06(2H，s)，3.93-3.86(1H，m)，3.67-3.65(1H，m)，3.29-3.16(1H，m)，2. 90-2.75(3H，m)，2.67(1H，d，J 1.7)，2.48(1H，dd，J 4.8，2.5)，2.20-2.05( 1H，m)，1.95-1.65(3H，m)，1.30(9H，s);

    13 C NMR(63MHz，CDCl

    3 )δ175.7，174 .4，137.5，129.2，128.5，128.4，128.0，127.9，126.5，72.1，68.9，66.7，5 9.8，56.1，55.5，50.4，35.4，30.9，29.6，28.6，24.3;FABHRMS（NBA）m/e 46 8.2810([M＋H]

    + C

    27 H

    37 N

    3 O

    4の計算値 467.2862). 図11に示されるＮ−［１−フェニル−２(S)−[(ベンジルオキシカルボニル)アミノ］−3(R)−ヒドキシブタン−４−[2'(R)−（tert−ブチルアミド）−4'(S)メトキシ］ピロリジン800 の合成． 化合物 800: ピロリジン誘導体 25（cis−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）を上記のようにエポキシド21にカップリングした。 ヘキサン中 50%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物 800を薄黄色油状物(40mg，60%)として得た。 Rf = O.23(EtOAc)．

    1 H NMR(250MHz，CDCl

    3 )δ7.34−7. 14(10H，m)，7.04(1H，br s)，5.01(2H，br s,)，4.81(1H，d，J 8.8)，3.98-3. 85(1H，m)，3.84(1H，t，J 3.7)，3.58(1H，dd，J 6.0，6.1)，3.35-3.25(1H，m )，3.28(3H，s)，3.20-3.12(1H，m)，3.00-2.90(2H，m)，2.85(1H，dd，J 13.3 ，8.1)，2.71 (1H，d，J 12.4)，2.66(1H，d，J 12.4)，2.56(1H，dd，J 10.3， 3.1)，2.30-2.10(1H，m)，2.05-1.95(1H，m)，1.33(9H，s);

    13 C NMR(100MHz，CD Cl

    3 ) 174.7(C=O)，172.0(C=O)，137.5(C)，129.5(2×CH)，129.3(C)，128.5(3 × CH)，128.4(2× CH)，128.0(CH)，127.9(CH)，126.5(CH)，79.9(CH)，71.4(C H)，68.3(CH)，66.6(C)，60.6(CH

    2 )，59.7(CH

    2 )，56.0(CH

    3 O)，55.0(CH)，50.3( CH

    2 )，35.8(CH

    2 )，29.7(CH

    2 )，28.6(3× CH

    3 ); FABHRMS（NBA/CsI）m/e 630.19 70([M＋Cs]

    + ＋C

    28 H

    39 N

    3 O

    5の計算値630.1944). 図11に示されるＮ−[1−フェニル−2(S)−[(ベンジルオキシカルボニル)アミノ］−3(R)−ヒドロキシブタン−４−[2'−(S)−（tert−ブチルアミド）−4'(R) ーメトキシ］ピロリジン38の合成． 化合物38: ピロリジン誘導体36(trans４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンから誘導した)を上記のようにエポキシド21にカップリングした。 ヘキサン中 75%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して薄黄色油状物(45mg，40% )として所望の生成物38を得た。 Rf = 0.20（EtOAc／ヘキサン，4:1)．

    1 H NMR(400MHz，CDCl

    3 )δ 7.33-7.13(10H，m)，6.79(1H，br s)，5.02(2H，s)， 4.89(1H，d,J 7.5)，3.88-3.85(2H，m)，3.72-3.61(1H，m)，3.49-3.33 (1H，m)，3.29(3H，s)，3.20(1H，t,J 8.0),2.97-2.57(5H，m)，2.29-2.22(１H ，m)，1.95-1.88(1H，m)，1.67(1H，br s)，1.31(9H，s);

    13 C NMR(100NHz，CDC l

    3 ）173.6，156.5，137.7，136.3，128.9，128.3，127.7，127.6，126.4，79.7 ，72.0，68.0，65.8，60.2，59.9，56.6，55.5，50.5，36.8，35.3，28.6;IR（N aCl）ν

    max 3307，2968，2932，2357，1749，1713，1652，1531，1455，1365，1 258，1230，1095，1027，734，698; FABHRMS（NBA）m/e 498.2955（[M+H]

    + C

    28 H

    39 N

    3 O

    5の計算値 498.2968); 実測値: C，67.36; H，8.30; N8.49． C28H

    39 N

    3 O

    5の計算値 C，67.57; H，7.90; N，8.45)． 図11に示されるＮ−[1−フェニル−2(S)−[(ベンジオキシカルボニル)アミノ］ −3(R)−ヒドロキシブタン−４−[2'(S)−（tert−ブチルアミド−4'(R)−ベンジルオキシ］ピロリジン39． 化合物39: ピロリジン誘導体 37(trans 4−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンから誘導した)を上記のようにエポキシド21にカップリングした。 ヘキサン中50%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物39を無色の油状物(28mg，53%)として得た。 Rf = O.20(EtOAc／ヘキサン，1:1)．

    1 H NMR(400 MHz，CDCl

    3 )7.34-7.16(15H，m)，6.76(1H，brs)，5.01(2H，s)，4.85(1H，d，J 8.2),4.51(1H，d,J 11.7)，4.43(1H，d，J 11.7)，4.13-4.07(1H,，m)，3.90-3. 80(1H,m)，3.70-3.62(1H,m)，3.50-3.35(2H，m)，3.24(1H，t，J 8.0)，2.92-2. 68(4H，m)，2.35-2.29(1H，m)，1.99-1.93(1H，m)，1.63(1H，br s)，1.30(9H， s);

    13 C NMR(100MHz，CDCl

    3 )137.5，129.3，128.6，128.5，128.4，128.1，127 .9，127.8，127.7，126.6，80.1，77.9，71.1，68.2，60.8，60.1，55.7，37.4 ，35.9，29.7，28.6; IR（NaCl）ν

    max 3307，2923，1713，1652，1532，1455， 1365，1263，1229，1097，1028，733，699; FABHRMS (NBA) m/e706.2288([M＋Cs]

    + C

    34 H

    43 N

    3 O

    5の計算値 706.2257)． 図11に示される化合物24の合成；12 化合物24: メタノール:THF(0.10 M; 1:2)，０℃中L-プロリンの溶液に溶液のボランジメチルスルフィド(5当量; 1.0 M)を加え、一晩攪拌する。 次に、溶媒を除去し、混合液を塩化メチレン(0.10 M)に再懸濁し、1.2 当量のNaH(30％)を０℃ で加え、１時間攪拌する。 次に、1.1当量のヨウ化メチルを加え、０℃で更に１ 時間撹拌する。 次に、反応混合液を水で急冷し、100%酢酸エチルで抽出し、重炭酸塩、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。 粗化合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物24を得る。 図11に示される化合物25の合成;12 化合物25: シグマから市販されている基質cis4−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン(3.0 g，13.9 ミリモル)を乾燥 C

    2 Cl

    2 (20 ml)に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（2.07 g，15.3ミリモル）、EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（2.93g，15.3ミリモル）及びtert−ブチルアミン(1.6 ml，15.3 ミリモル）を加え、混合液を周囲温度で18時間攪拌した。 反応液を酢酸エチル(100ml)で希釈し、水(2×20ml)，1 N HCl

    (aq.) (10 mL) 、重炭酸ナトリウム溶液

    (aq.) (10 mL)、水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 ヘキサン中33%EtOAcで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製してＮ−tert−ブトキシカルボニル−cis −４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミドを無色の油状物として得た。 次に、化合物を塩化メチレン(0.10 M)に再懸濁し、1.2 当量の NaH(30％)を０℃で加え、１時間撹拌した。 次に、1.1当量の塩化メチレンを加え、０℃で更に1時間攪拌した。 次に、反応混合液を水で急冷し、100%酢酸エチルで抽出し、重炭酸塩、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。 粗化合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物25を得た。 図11に示される化合物36の合成；12 化合物 36: シグマから市販されている基質 trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン(3.0g，13.9ミリモル)を乾燥 CH

    2 Cl

    2 (20 ml)に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(2.07 g，15.3 mmol)，EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（2.93g，15.3ミリモル）及びtert −ブチルアミン(1.6ml，15.3 ミリモル)を加え、混合液を周囲温度で18時間攪拌した。 反応液を酢酸エチル(100 ml)で希釈し、水(2 ×20 ml)、1N HCl

    (aq.) (10 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (10 mL)、水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 ヘキサン中 33% EtOAcで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製してＮ−tert−ブトキシカルボニル−trans −４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミドを無色の油状物として得た。 次に、この化合物を塩化メチレン(0.10M)に再懸濁し、1 .2当量のNaH(30%)を０℃で加え、１時間攪拌した。 次に、1.1当量のヨウ化メチルを加え、０℃で更に１時間攪拌した。 次に、反応混合液を水で急冷し、100%, 酢酸エチルで抽出し、重炭酸塩、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。 粗化合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物36を得る。 図11に示される化合物37の合成；12 化合物37: シグマから市販されている基質 trans−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン(3.0g，13.9ミリモル)を乾燥CH

    2 Cl

    2 (20 ml)に溶解した。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（2.07 g，15.3ミリモル）、EDC,１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（2.93 g，15.3ミリモル）及びte rt−ブチルアミン（1.6 ml，15.3ミリモル）を加え、混合液を周囲温度で18時間攪拌した。 反応液を酢酸エチル(100 ml)で希釈し、水(2×20 ml)、1 N HCl

    (aq.)

    (10 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (10 mL)、水(10 ml)、食塩水(10 ml) で洗浄、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 ヘキサン中 33 % EtOAcで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製してＮ−tert−ブトキシカルボニル−trans −４−ヒドロキシ−Ｌ−tert−ブチルアミドを無色の油状物として得た。 次に、その化合物を塩化メチレン(0.10 M)に再懸濁し、1.2当量のNaH(30%)を０℃で加え、１時間攪拌した。 次に、1.1当量の臭化べンジルを加え、０℃で更に1時間攪拌する。 次に、反応混合液を水で急冷し、100%酢酸エチルで抽出し、重炭酸塩、食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。 粗化合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物37を得る。 化合物27の合成（化合物は図９及び10に図示されている） 化合物27: アセトニトリル（0.10モル）中フェニルアラニン(1.0当量)の溶液に1 .2 当量の市販の BOC-ON［2−（tert−ブトキシカルボニルオキシイミノ）−２ −フェニルアセトニトリル］を加え、混合液を２５℃で１２時間攪拌した。 次に、 溶媒を蒸発し、粗化合物27を次の工程に続けた。 図９に示される化合物28の合成 化合物28: 基質27(70 mg，0.213ミリモル)を乾燥 DMF(3 ml)に溶解した。 HOBT， 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(31 mg，0.22ミリモル）、EDC，1−（３ −ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン(122μl，0.703ミリモル)を加え、混合液を室温で30分間攪拌した。 市販のN-メトキシメチルアミン塩酸塩(73 mg,0.2 55 ミリモル; Aldrich)を加え、反応液を18時間撹拌した。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加えた。 水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出した。 次に、合わせた有機相を水(2 x 5ml)、1 N HCl

    (aq.) ( 5ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 mL)、水(5 ml)、食塩水(5ml）で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。 酢酸エチル／ヘキサン，1:1 で溶離するフラッシュクロマトグラフィー処理して所望のカップリング生成物28を無色の油状物(94%)として得た。 図９に示される3(S)−1,4−ジフェニル−２−オキソ−３−アミノ−Ｎ−Ｂｏｃ −ブタン(29)の合成 3(S)−1,4−ジフェニル−２−オキソ−３−アミノ−Ｎ−Ｂｏｃ−ブタン(29):N

    2

    下に０℃で無水 THF(50ml)中Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン−Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド(28)(5.0g，14.5ミリモル）の攪拌溶液に THF中2.0M 塩化ベンジルマグネシウム(21.7 ml，43.5ミリモル）を加えた。 混合液を室温で徐々に加温し、更に３時間攪拌した。 次に、反応混合液を1 N HCl(25 ml)に注入した。 有機層を分離し、水層をエーテル(3×35 ml)で抽出した。 合わせた有機層を乾燥(MgSO

    4 )し、濃縮して粗生成物を得た。 粗物質をフラッシュクロマトグラフィー(EA:H;1:4)で精製して29に対する Boc保護中間体を白色固形物(4.8 g，98 %)として得た。 Rf 0.3(EA:H;1:4); mp 86-87℃;［α］

    25D +31.22゜(c 2.21，CH

    2

    C1

    2 ); IR 3485，2978，1709，1704，1490，1363，1250 cm

    -1 ;

    1 H NMR(CDCl

    3 ) 1. 14(s，9H)，2.9-3.15（m，2H)，3.65(q,2H,J=11.6Hz)，4.61(d，1H，J=6.9Hz)， 5.1（bs，1H)，7.0-7.2(m，10H)ppm;

    13 C NMR(CDCl

    3 )28.3，37.8，47.8，59.5 ，79.9，127.0，127.1，128.8，129.2，129.2，129.6，133.1，135.2，155.1，2 06.5ppm.HRMS:472.0880，C

    21 H

    25 NO

    3 ＋Cs

    +の計算値：472.0889． 3(S)−1,4−ジフェニル−２−オキソ−３−アミノブタンHCl(29):エーテル（10 ml）中3(S)−1,4−ジフェニル−２−オキソ−３−アミノ−Ｎ−Ｂｏｃ−ブタン( 29に対するＢｏｃ保護中間体)(1.4 g，4.12 ミリモル)の溶液に HCl(g)/エーテル(20 ml)を加えた。 ３時間後、沈殿をろ過して粗白色固形物を得た。 再結晶(Me OH/エーテル)して29を白色固形物(0.96 g，85%)として得た。

    1 H NMR(300 MHz，C D

    3 OD)2.96(dd，1H，J=8.2Hz)，3.24(dd，1H，J=6.2，14.3Hz)，3.73(q，2H，J=1 6.9Hz)，4.41（dd，1H，J=2.0，8.2 Hz）ppm． HRMS:240.1388 C

    16 H

    18 NO＋H

    + ： 2 40.1388. 図９に示される化合物30の合成 化合物 30: CH

    2 Cl

    2 (10 ml)中 29（O.032 g，0.12ミリモル）の溶液にO-ベンジル-N-Boc-L-Ser-Leu-Asn(0.075g，0.15 ミリモル）、EDC（0.032 g，0.17ミリモル）、HOBt(0.045 g，0.33ミリモル）及びDMAP(cat.)を加えた。 24時間後、反応混合液を飽和 NaHCO

    3 （2×5 ml）、1 N HCl (2×5 ml)、sat． NaCl（2×5 ml ）で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、濃縮して粗固形物を得た。 MeOH／エーテルから再結晶して30に対する中間体 N-Boc保護化合物を白色固形物（0.05g，％収率）として得た。

    1 H NMR（300 MHz，DMSO-d

    6 ) 0.72-0.85(m，6H)，1.35(s，9H)，1.50- 1.72(m，1H)，2.30-2.45(m，1H），2.80-2.90(m，1H)，3.05(dd，1H，J=5.1，13 .9Hz)，3.5-3.63(m，2H)，3.69(d，1H)，J=17.0 Hz)，3.86(d，1H，J=17.3Hz)， 4.20-4.30(m，1H)，4.30-4.45(m，1H)，4.46(s,2H)，4.48-4.51(m，1H)，6.80-7 .42(m，15H)ppm． HRMS: 876.2955 C

    41 N

    53 N

    5 O

    8 + CS

    +の計算値：876.2948． 分析C

    4 H

    53 N

    5 O

    8の計算値: C 60.20％，H 5.615，N 7.18%，S9.41%． 実測値 C 65.99% ，H 7.22%，N 9.61%． CH

    2 Cl

    2中中間体 N-Boc保護化合物（0.12 g，0.16ミリモル）の溶液に305 TFA/CH

    2 C1

    2の溶液を加えた。 ２４時間後、混合液を濃縮して粗白色固形物を得、再結晶(MeOH/エーテル)した後、標記化合物30を白色固形物(0.09g，75%)として得た。

    1

    H NMR(300 MHz，CD

    3 OD) 0.71-0.85(m，6H)，1.40-1.60(m，3H)，2.40−2.262(m ，2H)，2.70-2.291(m，1H)，2.91-3.01(m，1H)，3.50-3.58(m，1H)，3.60-3.72( m，2H)，3.75-3.82(m，1H)，3.88-4.00(m，1H)，4.20-4.30(m，1H)，4.44-4.61( m，2H)，6.93-7.45（m，15H）ppm． HRMS: 644.3448 C

    36 H

    46 N

    5 O

    6

    + H

    +の計算値: 644.3448. 図９に示される化合物31の合成 化合物 31: Pd(OH)

    2 /C(cat.)を含む氷酢酸(10 ml)中30（80 mg，0.11 ミリモル）の溶液を50 psiのH

    2雰囲気下に置いた。 12時間後、この溶液をろ過し、粗固形物をMeOH／エーテルから再結晶して標記化合物(15 mg，22%)を得た。

    1 H NMR(300 MHz，CD

    3 OD) O.82(t，6H，J=6.6 Hz)，1.39(t，2H，J=7.2Hz)，1.50 -1.60(m，1H)，2.36(dd，1H，J=8.1，15.6Hz)，2.44-2.50(m，1H)，2.38(dd，1H ，J=4.5，13.9Hz)，3.05(dd，1H，J=4.9，13.9Hz)，3.69(d，1H，J=17.3Hz)，3. 85(dd，1H，J=17.2Hz)，4.28-4.32(m，1H)，4.35-4.42(m，1H)，4.48-4.53(m，1 H)，6.80-7.35(m，10H)ppm． HRMS: 686.1961 C

    31 H

    43 N

    5 O

    8 + CS

    + ：686.1955． 図９に示される化合物32の合成 化合物 32: DMF(5 ml)中29（0.17g，0.62ミリモル）の溶液に HOBt(0.17，1.2 ミリモル)、DMAP(cat.)、EDC（0.12g，0.62ミリモル）、Et

    3 N（0.06 g，0.09 ml ，0.62 ミリモル）及びキノリン-Asn（g，0.52 ミリモル）を加えた。 12時間後、反応混合液を EA(50 ml)に溶解した。 有機層を乾燥(MgSO

    4 )し、濃縮して粗褐色固形物を得た。 MeOH／エーテルから再結晶して白色固形物を32(0.12g，43%)として得た。

    1 H NMR（300 MHz，DMSO-d

    6 ）2.62(dd，1H，J=4.9，15.3Hz)，2.75(dd ，1H，J=6.9，15.5Hz)，2.84(dd，1H，J=14.3，23.4Hz)，3.06(dd，1H，J=4.6， 13.7Hz)，3.76(d，1H，J=17.0Hz)，3.91 (d，1H，J=17.0Hz)，4.51 (q，1H,J:7. 7Hz)，4.82(q，1H，J=6.8Hz)，6.95-7.32(m，11H)，7.48(s,1H)，7.73(t，1H，J =7.1Hz)，7.89(t，1H，J=8.3Hz)，8.13(q，eH，J=8.7 Hz)，8.58(t，2H，J=6.7H z)pp． HRMS: 641.1166 C

    3 0 H

    28 NO

    4 + Cs

    + ：641.1165． 図10に示される化合物34の合成 化合物 34: CH

    2 Cl

    2 (10 ml)中 27 から調製した(Yuan，W.; Munoz，B.; Wong，C .-H.; Haeggstrom，JZ; Wetterholm，A.; Samuelsson，B．J．Med．Chem．199 3，36，211)化合物 33（7:3混合物)(0.21 g，0.71ミリモル）にL-プロリンメチルエステルHCl(0.18g，1.1 ミリモル）、EDC(0.16g，0.85ミリモル）、HOBt(0.2 1g，1.56 ミリモル）及びDMAP(cat.)を加えた。 24時間後、反応混合液を飽和NaH CO

    3 (2×2 ml)、1N HCl(2×2 ml)及び飽和NaCl(1×1ml)で洗浄した。 有機層を乾燥(MgSO

    4 )し、ろ過し、濃縮して粗固形物を得た。 フラッシュクロマトグラフィー(EA:H; 1:4)で精製して白色固体化合物34を単一の(2R，3S)(0.23 g，80%)として得た。 Rf=0.20(EA:H;1:4);

    1 H NMR(300 MHz，CDCl

    3 )1.34(s，9H)，1.90-2.11( m，4H)，2.88-2.91(m，2H)，3.11-3.20(m，1H)，3.36(q，1H，J=7.6 Hz)，3.65( s，3H)，3.89(d，1H，J:5.1 Hz)，4.08(d，1H，J=5.7 Hz)，4.15(q，1H，J=9.7 Hz)，4.39(d，1H，J=7.4 Hz)，4.89(d，1H，J=9.9 Hz)，7.10-7.35(m，5H)ppm． HRMS: 539.1169 C

    21 H

    30 N

    2 O

    6 ＋Cs

    + ：539.1158. 図10に示される化合物35の合成 化合物 35: 室温でN

    2下無水CH

    2 Cl

    2中化合物34(0.062 g，O.15 ミリモル）の溶液にデス・マルチン試薬(0.078 g，0.18ミリモル）を加えた。 12時間後、反応液を飽和NaHCO

    3 (4 ml)及び飽和 Na

    2 S

    2 O

    3 (4ml)で急冷した。 反応液にエーテル（40 ml）を加えてから10分間撹拌した。 反応混合液を飽和 NaCl(2 ×10ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、ろ過し、濃縮して粗油状物を得た。 フラシュクロマトグラフィー(EA:H; 1:3)で精製して化合物 35を1:0.8 混合物の油状物(0.030 g，65％) として得た。

    1 H NMR(300 MHz,CDCl

    3 ) 1.35;1.35(s;s，9H)，1.91-2.01(m，3H)， 2.15-2.23(m，1H),3.09-3.41(m，1H)，3.51-3.70(m，2H)，3.70(m，2H)，3.70(q ，3H，J=6.3，7.8Hz)，4.40-4.49(m，1H)，4.72d-4.85(m，1H)，4.93-5.00(m，1 H)，5.10-5.23(m，1H)，7.05-7.35(m，5H)ppm.HRMS: 537.1002C

    21 H

    28 N

    2 O

    6 + CS

    +の計算値：537.1002.

    図13に示されるピペリジンからα−ケトアミドを形成するペプチドカップリング

    の一般手順:図13、工程i-iiに示されるように、基質15（70mg，0.213ミリモル）を乾燥DMF(3 ml)に溶解する。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(31 mg，0.22ミリモル）、EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド(43 mg，0.224 ミリモル）、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン(122μl，0.7 03 ミリモル）を加え、混合液を室温で30分問攪拌する。 第二アミン85;86;87;88 ;89;90;91;92;93;94;95;96又は97をそのTFA 塩(73 mg，0.255 ミリモル）として加え、反応液を18時間攪拌する。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加える。 水相を酢酸エチル(3 ×10ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水(2×5 ml)、1N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 ml)、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1の酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得、これを次のような第二アルコールの酸化工程に直接続ける。 第二アルコール（21 mg，0 .044ミリモル）を乾燥CH

    2 Cl

    2 (2 ml)に溶解し、デス・マルチンペリオジナン（26 mg，0.088ミリモル）を加える。 反応混合液を周囲温度で24時間攪拌してから酢酸エチル(10 ml)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム

    (aq.) (5 mL)及びチオ硫酸ナトリウムを加えることにより急冷する。 水相を酢酸エチル(3×20ml）で抽出する。 合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 ヘキサン中 30％酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して各生成物 98; 99; 120;121 ; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 129 又は 130をジアステレオマーの混合物(無色の油状物)(20 mg，95％)を無色の油状物として得る。 図14に示されるエポキシドのプロリン誘導体へのカップリングの一般手順 ピロリジン誘導体 85;86;87;88;89;90;91;92;93;94;95;96又は97（20 mg，0.0 91 ミリモル）に乾燥メタノール(2 ml)、Cbz-フェニルアラニルエポキシド21(27 mg，0.091 ミリモル，1.0eq.)及びトリエチルアミン（14μl，0.100ミリモル， 1.leq.）を加えた。 この溶液を32時間還流してから減圧下で濃縮した。 酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を透明な油状物として得、各ヒドロキシルエチルアミン誘導体: 131; 132; 133; 134;135; 136; 137; 138; 139; 140; 141; 142又は 143を得る。 図15に示される化合物1001の合成: 典型的なアシル化は次の通りである: 化合物1000(0.16ミリモル; アルドリッヒ製のcis-ジヒドロキシメチルピロリジンに続いて標準 BOC保護; 上記参照）、酢酸ビニル(0.05 ml; A1drich)、DMF(0.2ml;塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、tert−ブチルアルコール、３−メチル−３−ペンタノール、DMSO及び THFのような他の溶媒も用いられる）、H

    2 O( 0.005 ml)、トリエチルアミン(0.005 ml)及びサブチリシン BPN' 又はサブチリシンカールスバーグ(5 mg，50U)を37℃で36時間攪拌する。 EtOAcを加え反応混合液をセライトでろ過することにより反応液を処理する。 ろ液をNaHCO

    3飽和溶液、 次に、食塩水で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得る。 できるならばこの段階でジイソプロピルエーテルを加えることにより生成物のいくらかを結晶化する。 次に、母液をクロマトグラフィー処理(SiO

    2 ,ヘキサン/EtOAc， 9/1-1/1)して生成物1001を得る。 図15に示される化合物1002の合成: 化合物1002を0.10モルのアセトン溶液に溶解してから1.5M硫酸を０℃で加えた。 次に、酸化クロム(VI)(1.1当量; Aldrich)を加え、混合液を２時間攪拌した。 EtOAcを加えることにより反応液を処理し、NaH CO

    3飽和溶液、次に、食塩水で洗浄し、MgS0

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得る。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1002を得る。 図15に示される化合物1003の合成: 基質1002（70mg，0.213ミリモル）を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３− エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert−ブチルアミン（73 mg，0.255ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌する。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム( 30 ml)に加える。 水相を酢酸エチル(3×10ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水(2×5ml)、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 ml) 、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1 酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。 図15に示される化合物1004の合成: 化合物1003を0.10モルメタノール溶液に溶解してから0.10当量のナトリウムメトキシドを０℃で加え、混合液を２時間攪拌した。 反応液を減圧下で濃縮して油状物を得る。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1004を得る。 図15に示される化合物1005の合成: アルゴン下に０℃で、塩化メチレン(2 ml)中化合物1004(290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)にNaH(鉱油中 60%分散液)(96 mg， 2.40ミリモル，2.2 eq.)を加えた。 混合液を20分間攪拌してから臭化ベンジルかヨウ化合物メチル(0.14 ml，1.20ミリモル，1.1 eq.)を加えた。 混合液を０℃で1時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHCO

    3飽和溶液を加え(10 ml)、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を1N HClでpH 2に酸性にし、酢酸エチル(3×20 m1)で抽出し、乾燥 MgSO

    4し、濃縮して黄色油状物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1005を得た。 図15に示される化合物 46;47又は48の合成: 化合物46;47又は48: MeOH(2 ml)中C BZ-保護アミン(0.092ミリモル）の溶液に 20%水酸化パラジウム／炭素(10 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応液が完結したことをTLC が示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成物を得た。 図16に示される化合物1007の合成: 典型的なアシル化は次の通りである: 化合物1006（0.16ミリモル; アルドリッヒ製のtrans-ジヒドロキシメチルピロリジンに続いて標準 BOC保護tection;上記参照）、酢酸ビニル(0.05 ml; Aldrich)、DM F(0.2 ml; 塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリル、tert−ブチルアルコール、３−メチル−３−ペンタノール、DMSO及び THFのような他の溶媒も用いられる）、H

    2 O(0.005 ml)、トリエチルアミン(0.005 ml)及びサブチリシン BPN'又はサブチリシンカールスバーグ(5 mg，50U)を37℃で36時間攪拌する。 EtOAcを加え反応混合液をセライトでろ過することにより反応液を処理する。 ろ液をNaHCO

    3

    飽和溶液、次に、食塩水で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得る。 できるならばこの段階で生成物のいくらかをジイソプロピルエーテルを加えることにより結晶化する。 次に、母液をクロマトグラフィー(SiO

    2 ，ヘキサン／EtOAc，9/1-1/1)処理して生成物1007を得る。 図16に示される化合物1008の合成: 化合物1008を0.10モルアセトン溶液に溶解してから1.5 M 硫酸を０℃で加えた。 次に、酸化クロム(VI)(1.1当量; Aldrich)を加え、混合液を２時間撹拌した。 EtOAcを加えることにより反応液を処理し、NaH CO

    3飽和溶液、次に食塩水で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得る。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1008を得る。 図16に示される化合物1009の合成: 基質1008(70 mg，0.213ミリモル）を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３− エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert−ブチルアミン（73 mg，0.255ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌する。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム( 30 ml)に加える。 水層を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水(2 ×5 ml)、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 m l)、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。 図16に示される化合物1010の合成: 化合物1009を0.10モルメタノール溶液に溶解してから0.10当量のナトリウムメトキシドを０℃で加え、混合液を２時間撹拌した。 反応液を減圧下で濃縮して油状物を得る。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1010を得る。 図16に示される（±）化合物1011の合成:アルゴン下に０℃で塩化メチレン(2 ml）中化合物1010(290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)にNaH(鉱油中 60%分散液)(9 6 mg，2.40ミリモル，2.2 eq.)を加えた。 混合液を20分間攪拌してから臭化ベンジル又はヨウ化メチル(0.14 ml，1.20ミリモル，1.1 eq.)を加えた。 混合液を０ ℃で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHCO

    3飽和溶液(10 ml)を加え、 水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を1N HClでpH 2まで酸性にし、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1011を得る。 図16に示される化合物 52; 53又は 54の合成: 化合物 52; 53又は 54: MeOH(2 m l)中CBZ-保護アミン（ 0.092ミリモル）の溶液に 20%水酸化パラジウム／炭素(1 0 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、 反応液が完結したことをTLC が示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成物を得た。 図17に示される化合物1013の合成: アルゴン下に０℃で塩化メチレン化合物1012 (0.10 モル)(290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)に水酸化ナトリウム（0.10当量） 、次に、CBZ-Cl (1.1 当量; Aldrich)を加え、混合液を０℃で20分間攪拌してから数滴の水で冷却した。 塩化アンモニウム飽和溶液を加え(10 ml)、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を重炭酸飽和溶液で中和し、酢酸エチル(3× 20ml）で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1013を得る。 図17に示される化合物1014の合成: 無水物 DMF(5 ml)中基質1013（0.5 ミリモル）の溶液にTBDPSCl (1.05eq: Aldrich)，Et

    3 N(1.1 eq)及び触媒量のイミダゾールを加えた。 溶液を周囲温度で15時間攪拌してからEtOAc(60 ml)とH

    2 0(30 ml)に分配した。 次に、有機層をNH

    4 Cl

    (aq.)飽和溶液(2×30 ml)、水(30 ml)、食塩水( 30 ml)で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1014を得る。 図17に示される化合物1015の合成: 無水ピリジン(5 ml)中基質1014(0.5ミリモル)の溶液に酢酸無水物(1.05eq: Aldrich)を加えた。 この溶液を周囲温度で15時間撹拌してからEtOAc(60 ml)とH

    2 O(30 ml)に分配した。 次に、有機層をNH

    4 Cl

    (aq.)

    飽和溶液(2×30 ml)、水(30 ml)、食塩水(30 ml)で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、 減圧下で濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1015を得る。 図17に示された化合物1016の合成: 基質を THFに溶解し、０℃に冷却した。 TBAF （THF中 1.0M 溶液）を加え(1.05eq.)、反応液を TLCでモニターした。 ０℃で30 分後、反応が完結し、溶媒を減圧下で蒸発した。 粗物質をショートカラムのシリカゲルに加え、溶離して生成物を得た。 図17に示される化合物1017の合成: 化合物1016を0.10モルアセトン溶液に溶解してから1.5M硫酸を０℃で加えた。 次に、酸化クロム(VI)(1.1当量; Aldrich)を加え、混合液を２時間攪拌した。 EtOAcを加えることにより反応液を処理し、NaHCO

    3飽和溶液、次に、食塩水で洗浄し、MgSO,

    4乾燥し、濃縮して油状物を得る。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1017を得る。 図17に示される化合物1018の合成: 基質1017(70 mg，0.213ミリモル）を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３− エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert−ブチルアミン（73 mg，0.255ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌する。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム( 30 ml)に加える。 水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水(2×5 ml)、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 ml )、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。 図17に示される化合物44の合成: 工程(1)化台物1018を0.10モルメタノール溶液に溶解してから0.10当量のナトリウムメトキシドを０℃で加え、混合液を２時間攪拌した。 反応液を減圧下で濃縮して油状物を得る。 次に、母液をクロマトグラフィー処理してCBZ−保護アミンを得る。 工程(2)メタノール(2 ml)中CBZ-保護アミン(0.092ミリモル)の溶液に 20%水酸化パラジウム／炭素(10 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことをTLC が示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成化合物44を得た。 図18に示される化合物1019の合成: アルゴン下に０℃で塩化メチレン(O.10 モル）中化合物1012（290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)に水酸化ナトリウム（0.10当量）に続いてCBZ-Cl(1.1 当量; Aldrich)を加え、混合液を０℃で20分間攪拌してから数滴の水で冷却した。 塩化アンモニウム飽和溶液を加え(10 l)、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1019を得る。 図18に示される化合物1020の合成: 無水 DMF(5 ml)中基質1019（0.5ミリモル） の溶液にTBDPSCl（1.05eq: Aldrich）、Et3N（1.1 eq）及び触媒量のイミダゾールを加えた。 この溶液を周囲温度で15時間撹拌してからEtOAc(60 ml)とH

    2 O（30m l）に分配した。 次に、有機層を NH

    4 Cl

    (aq.)飽和溶液(2 ×30 ml)、水(30 ml)、 食塩水(30 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、減圧下で濃縮して生成物1020を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1020を得る。 図18に示される化合物1021の合成: アルゴン下、無 DMF(2 ml)中基質(0.2ミリモル)の氷冷溶液にNaH(鉱油中 60%分散液)(2.2 eq.)を加えた。 混合液を20分間攪拌してからヨウ化メチルか臭化ベンジル(1.1 eq.)を加えた。 混合液を０℃で1時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHC0

    3飽和溶液を加え(10 ml)、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を1N HClでpH 2まで酸性にし、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgS0

    4で乾燥し、濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1021を得る。 図18に示された化合物1022の合成: 基質を THFに溶解し、０℃まで冷却した。 TB AF(THF中1.0 M 溶液）を加え(1.05 eq.)、反応を TLCでモニターした。 ０℃で30 分後、反応が完結し、溶媒を減圧下で蒸発した。 粗物質をショートカラムのシリカゲルに加え、溶離して生成物を得た。 図18に示された化合物1023の合成: 化合物1022を0.10モルアセトン溶液に溶解してから1.5 M 硫酸を０℃で加えた。 次に、酸化クロム(VI)(1.1当量; Aldrich)を加え、混台液を２時間攪拌した。 EtOAcを加えることにより反応液を処理し、NaH CO

    3飽和溶液、次に、食塩水で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得る。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1023を得る。 図18に示される化合物1024の合成: 基質1023（70 mg，0.213ミリモル）を塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert−ブチルアミン（73mg，0.255 ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌する。 反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30m1 ）に加える。 水層を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水（2×5 ml）、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml ）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥（MgSO

    4 ）した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1の酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。 図18に示される化合物40の合成: CBZ-保護アミン1024(0.092ミリモル）をMeOH(2 m1)に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素(10 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことを TLCが示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成化合物40を得た。 図19に示される化合物1025の合成: アルゴン下に０℃で塩化メチレン（0.10モル）中化合物1025（290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)にBOC-ON(1.1 当量; Aldrich )を加え、混台液を０℃で20分間攪拌してから数滴の水で冷却した。 塩化アンモニウム飽和溶液を加え(10 m1)、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4

    で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1025を得る。 図19に示される化合物1026の合成: 無水DMF(5 ml)中基質1025（0.5 ミリモル） の溶液に TBDPSCl（1.05eq: Aldrich）、Et

    3 N（1.1 eq）及び触媒量のイミダゾールを加えた。 この溶液を周囲温度で15時間攪拌してからEtOAc(60 ml)とH

    2 O（3 0ml）に分配した。 次に、有機層を NH

    4 Cl

    (aq.)溶液(2×30 ml)、水（30 ml）、 食塩水（30 ml）で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1026を得た。 図19に示される化合物1027の合成: アルゴン下、無水 DMF(2 ml)中基質(0.2ミリモル)の氷冷溶液にNaH(鉱油中60 %分散液)(2.2 eq.)を加えた。 混合液を20分間攪拌してからヨウ化メチル又は臭化べンジル(1.1 eq.)を加えた。 混合液を０℃ で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHCO

    3飽和溶液を加え(10 ml)、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を1N HClでpH 2まで酸性にし、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1027を得る。 図19に示される化合物1028の合成: 基質を THFに溶解し、０℃に冷却した。 TBAF （THF中 1.0 M溶液）を加え(1.05 eq.)、反応を TLCでモニターした。 ０℃で30 分後、反応が完結し、溶媒を減圧下で蒸発した。 粗物質をショートカラムのシリカゲルに加え、溶離して生成物を得た。 図19に示される化合物1029の合成: 化合物1028を0.10モルアセトン溶液に溶解してから1.5 M 硫酸を０℃で加えた。 次に、酸化クロム(VI)(1.1当量; Aldrich)を加え、混合液を２時間攪拌した。 EtOAcを加えることにより反応液を処理し、NaH CO

    3飽和溶液、次に、食塩水で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1029を得る。 図19に示される化合物1030の合成: 基質1029（70 mg，0.213ミリモル）を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ −エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert−ブチルアミン（73 mg，0.255ミリモル）を加え、反応液を18 時間攪拌する。 反応混台液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム（30 ml）に加える。 水層を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水（2×5 ml）、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq

    .) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／へキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。 図19に示される化合物42の合成: CBZ-保護アミン1030(0.092ミリモル）をMeOH（ 2ml）に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素（10 mg）を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことを TLCが示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成化合物42を得た。 図20に示される化合物1032の合成: アルゴン下に０℃で塩化メチレン(0.10モル) 中化合物1031(290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)にCBZ-Cl (1.1 当量; Aldrich) を加え、０℃で20分間攪拌してから数滴の水で冷却した。 塩化アンモニウム飽和溶液を加え(10 ml)、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、 濃縮して黄色の油状物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物を得る。 次に、無水 DMF(5 ml)中基質(0.5ミリモル）の溶液にTBDMSCl(1.05eq:A ldrich)、Et

    3 N(1.1 eq)及び触媒量のイミダゾールを加えた。 この溶液を周囲温度で15時間攪拌してからEtOAc(60 ml)とH

    2 O(30 ml)に分配した。 次に、有機層をNH

    4 Cl

    (aq.)飽和溶液(2×30 ml)、水(30 ml)、食塩水（30 ml）で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1032を得る。 図20に示される化合物1033の合成: 基質1032(70 mg，0.213 mmol)を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分問攪拌する。 tert−ブチルアミン（73 mg，0.255 ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌する。 反応混合液を酢酸エチル（20 ml）で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30ml）に加える。 水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水（2×5 ml）、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.)

    （50ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。 図20に示される化合物1034の合成: 基質を THFに溶解し、０℃に冷却した。 TBAF （THF中1.0 M 溶液）を加え(1.05 eq.)、反応を TLCでモニターした。 ０℃で30 分後、反応が完結し、溶媒を減圧下で蒸発した。 粗物質をショートカラムのシリカゲルに加え、溶離して生成物を得た。 図20に示される化合物1038の合成: Saiahら Tet． Lett． 1992，33，4317;Johns on らJ． Am． Chem． Soc． 1964，86，118に発表された条件を用いて光延変換によって合成を行った。 次に、反応混合液を酢酸エチル（20 ml）で希釈することにより処理し、飽和塩化アンモニウム（30 ml）に加える。 水相を酢酸エチル(3 ×10 ml)で抽出する。 次に、合わせた有機相を水（2 ×5 ml）、1 N HCI

    (aq.) ( 5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1 の酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。 図20に示される化合物58の合成: CBZ-保護アミン（0.092ミリモル）をMeOH(2 ml )に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素（10 mg）を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことを TLCが示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成物を得た。 図20に示された化合物59の合成: CBZ-保護アミン1038（0.092ミリモル）をMe0H （2ml）に溶解し、20%水酸化ナトリウム／炭素（10 mg）を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことを TLCが示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成物を得た。 次に、アルゴン下に無水DMF（2 ml）中基質(0.2ミリモル）の氷冷溶液にNaH(鉱油中 60%分散液)(2.2 eq.)を加えた。 混合液を20分間攪拌してから臭化ベンジル(1 .1 eq.)を加えた。 混合液を０℃で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaH CO

    3飽和溶液を加え（10 ml）、水層をエチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を1N HClでpH 2まで酸性にし、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、 濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物58を得る。 図20に示される化合物60の合成: アルゴン下、無水物DMF(2 ml)中基質1038(0.2ミリモル）の氷冷溶液にNaH(鉱油中 60%分散液)(2.2 eq.)を加えた。 混合液を20分間攪拌し、ヨウ化メチル（1.1e q.)を加えた。 混合液を０℃で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHCO

    3

    飽和溶液を加え（10 ml）、エチルエーテルで洗浄した。 次に、水層を1N HClでp H2 まで酸性にし、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して生成物を得た。 次に、母液をクロマトグラフィー処理して中間生成物を得る。 次に、CBZ-保護アミン(0.092ミリモル）をMeOH(2 ml)に溶解し、20%水酸化ナトリウム／炭素（10 mg）を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 5分後、反応が完結したことを TLCが示した。 懸濁液をセライトパッドでろ過し、 減圧下で濃縮して生成物を得た。図20に示される化合物64の合成: CBZ-保護アミン1034(0.092 ミリモル）をMeOH( 2 ml)に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素（10 mg）を加え、懸濁液を水素バルーン下周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことをTLC が示した。懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成物を得た。図20に示される化合物65の合成: CBZ-保護アミン1034(0.092ミリモル）をMeOH（ 2ml）に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素(10 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことを TLCが示した。懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成物を得た。次に、 アルゴン下、無水 DMF(2 ml)中基質(0.2ミリモル）の氷冷溶液にNaH(鉱油中60% 分散液)(2.2 eq.)を加えた。混合液を20分間攪拌してから臭化べンジル(1.1 eq. )を加えた。混合液を０℃で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHCO

    3飽和溶液を加え（10 ml）、水層をエチルエーテルで洗浄した。次に、水層を1N HC lでpH 2まで酸性にし、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して生成物を得た。次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物65を得る。図20に示される化合物66の合成: アルゴン下、無水 DMF(2 ml)中基質1034(0.2ミリモル）の氷冷溶液にNaH(鉱油中 60%分散液)(2.2 eq.)を加えた。混合液を20分間攪拌してからヨウ化メチル(1.1 eq.)を加えた。混合液を０℃で１時間撹拌してから数滴の水で急冷した。 NaHCO

    3飽和溶液を加え（10 ml）、水層をエチルエーテルで洗浄した。次に、水層を1N HClでpH 2まで酸性にし、酢酸エチル（3 × 20ml）で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して生成物を得た。次に、母液をクロマトグラフィー処理して中間生成物を得る。次に、CBZ-保護アミン(0.092ミリモル）をMeOH(2 ml)に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素（10 mg）を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく撹拌した。 ５分後、反応が完結したことをTLC が示した。懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して生成物を得た。図21に示される化合物1040の合成: アルゴン下に０℃で塩化メチレン(0.10 モル）中ピペリジン化合物1039(290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)にCBZ-Cl(1.1当量; Aldrich)を加え、混合液を０℃で20分間攪拌してから数滴の水で急冷した。塩化アンモニウム飽和溶液を加え(10 ml)、水層をエチルエーテルで洗浄した。次に、 水層を重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、Mg SO

    4で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物を得る。図21に示される化合物1041の合成: 無水物 DMF(5 ml)中基質（0.5ミリモル）の溶液にTBDPSCl(1.05eq: Aldrich)、Et

    3 N(1.1 eq)及び触媒量のイミダゾールを加えた。この溶液を周囲温度で15時間攪拌してからEtOAc(60 ml)とH

    2 O(30 ml)に分配した。次に、有機層を NH

    4 Cl

    (ap.)飽和溶液(2×30 ml)、水（30 ml）、食塩水（30 ml）で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して生成物を得た。次に、 母液をクロマトグラフィー処理して生成物1041を得る。図21に示される化合物1042の合成: アルゴン下、無水DMF（2 ml）中基質（0.2ミリモル）の氷冷溶液にNaH(鉱油中 60%分散液)(2.2 eq.)を加えた。混合液を20分間攪拌してからヨウ化メチル又は臭化ベンジル（1.1 eq.）を加えた。混合液を０℃で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHCO

    3飽和溶液を加え(10 ml) 、水層をエチルエーテルで洗浄した。次に、水層を1N HClでpH 2まで酸性にし、 酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して生成物を得た。次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1042を得る。図21に示される化合物1043の合成: 基質を THFに溶解し、０℃に冷却した。 TBAF （THF中1.0 M 溶液）を加え(1.05 eq.)、反応を TLCでモニターした。 ０℃で30 分後、反応が完結し、溶媒を減圧下でで蒸発した。粗物質をショートカラムのシリカゲルに加え、溶離して生成物を得た。図21に示される化合物1044の合成: 化合物1043を0.10モルアセトン溶液に溶解してから1.5 M 硫酸を０℃で加えた。次に、酸化クロム(VI)(1.1当量; Aldrich)を加え、混合液を２時間攪拌した。 EtOAcを加えることにより反応液を処理し、NaH CO

    3飽和溶液、次に、食塩水で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得る。次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物1044を得る。図21に示される化合物1045の合成: 基質 1044（70 mg，0.213 ミリモル）を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）− ３−エチルカルボジイミド（43 mg，0.224 ミリモル）を加え、混合液を室温で3 0分間攪拌する。 tert−ブチルアミン（73 mg，0.255 ミリモル）を加え、反応液を18 時間攪拌する。反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム（30 ml）に加える。水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。合わせた有機相を水（2×5 ml）、1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥（MgSO

    4 ）した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。図21に示される化合物86又は87の合成: CBZ-保護アミン1045（0.092ミリモル） をMeOH(2 ml)に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素(10 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことを TLC が示した。懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮してべンジル又はメチルかによって化合物86か87を得た。図22に示される化合物1046の合成: アルゴン下に０℃で塩化メチレン（0.10モル）中ピペリジン化合物1041(290 mg，1.09ミリモル; Aldrich)に酢酸無水物(3.3 当量; Aldrich)、トリエチルアミン（3.3当量）を加え、混合液を０℃で20分間攪拌してから数滴の水で冷却した。塩化アンモニウム飽和溶液を加え(10 ml)、 水相をエチルエーテルで洗浄した。次に、水層を重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物を得る。図22に示される化合物1047の合成: 基質を THFに溶解し、０℃に冷却した。 TBAF （THF中1.0 M 溶液）を加え(1.05 eq.)、反応を TLCでモニターした。 ０℃で30 分後、反応が完結し、溶媒を減圧下で蒸発した。粗物質をショートカラムのシリカゲルに加え、生成物を得た。図22に示される化合物1048の合成: 化合物1047を0.10モルアセトン溶液に溶解してから1.5 M 硫酸を０℃で加えた。次に、酸化クロム(VI)(1.1当量; Aldrich)を加え、混合液を２時間攪拌した。 EtOAcを加えることにより反応液を処理し、NaH CO

    3飽和溶液、次に、食塩水で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して油状物を得る。次に、母液をクロマトグラフィー処理して生成物を得る。図22に示される化合物1049の合成: 基質1048（70 mg，0.213ミリモル）を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ − エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert−ブチルアミン(73 mg，0.255 ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌攪拌する。反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、塩化アンモニウム( 30 ml)に加えた。水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。次に、合わせた有機相を水(2×5 ml)，1 N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 ml )、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。この化台物を乾燥メタノール(3 ml)に再溶解し、ナトリウムメトキシド(0.30 当量)を加え、混合液を18時間還流攪拌する。これを減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望生成物1049を得る。図22に示される化合物88の合成: CBZ-保護アミン1049(0.092ミリモル)をMeOH(2m l)に溶解し、20%水酸化パラジウム／炭素(10 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に周囲温度で激しく攪拌した。 ５分後、反応が完結したことを TLCが示した。懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して化合物88を得た。図27に示される化合物1050A の合成工程 1）市販の trans−３−ヒドロキシプロリンの溶液に1:1v/v水／ジオキサン溶液中 1.1当量の BOC-0N(Aldrich)及び NaOH（1N 溶液）を加え、０℃で12時間攪拌する。次に、合わせた有機相を水（2 ×5 ml）、1N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥（MgSO

    4 ）した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の保護生成物を得る。工程 2）図27に示されるように、基質(70 mg，0.213 ミリモル; 上記参照)を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）− ３−エチルカルボジイミド(43 mg，0.224 ミリモル)を加え、混合液を室温で30 分間攪拌する。 tert−ブチルアミン(73 mg，0.255 ミリモル)を加え、反応液を1 8時間攪拌する。反応混合液をエチルエーテル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加える。水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。次に、合わせた有機相を水（2 ×5 ml）、1N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／へキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物 1050Aを得る。図27に示される化合物 1050Bの合成工程 1）アルゴン下、無水 DMF(2 ml)中Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−ci s −3'−ヒドロキシプロリン(290 mg，1.09 ミリモル; 上記参照）にNaH(鉱油中 60%分散液)(96 mg，2.40 ミリモル，2.2 eq.)を加えた。混合液を20分間攪拌してから臭化ベンジル(0.14 ml，1.20ミリモル，1.1 eq.)を加えた。混合液を０℃ で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。 NaHC0

    3 。飽和溶液を加え(10 ml)、 水層をエチルエーテルで洗浄した。次に、水層を1N HClでpH 2まで酸性にし、 酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。 （205 mg，53%）粗物質を精製せずに続けた。工程 2）粗黄色油状物(0.982ミリモル)にTBAF(THF中1M)(1.9 ml，1.9ミリモル， 2 eq.)を加え、この溶液を周囲温度で２時間攪拌した。この溶液を減圧下で濃縮し、ヘキサン中 33%酢酸エチルで溶離するショートシリカゲルカラムに直接加えた。生成物を白色泡状物(443 mg，95%)として単離した。図27に示される化合物1050の合成図13、工程i-iiに示されるように、基質11(70 mg，0.213 ミリモル)を乾燥DMF(3 ml)に溶解する。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(31 mg，0.22ミリモル)、EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド(43 mg，0.224 ミリモル)、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン(122μl，0.70 3 ミリモル)を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。第二アミン1050B(73mg，0 .255 ミリモル)を加え、反応液を18時間攪拌する。反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加える。水相を酢酸エチルで抽出(3×10 ml)する。次に、合わせた有機相を水(2×5 ml)、1N HCl

    (aq.) (5 ml)、 重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (50 ml)、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得、これを次のように第二アルコールの酸化の工程に直接続ける。第二アルコール（21 mg，0.044ミリモル）を乾燥CH

    2 Cl

    2 (2 ml)に溶解し、デス・マルチンペリオジナン（26 mg，0.088ミリモル）を加える。反応混合液を周囲温度で24時間攪拌し、酢酸エチル(10 ml)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム

    (aq.)

    (5 ml)及びチオ硫酸ナトリウムを加えることにより急冷する。水相を酢酸エチル(3×20 ml)で抽出する。合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。ヘキサン中 30％酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して各生成物1050を 3:1のジアステレオマー混合物(無色の油状物)(20 mg，95%)として無色の油状物として得る。 Ｎ−ベンジル−cis −及びtrans −２,５−ジカルボメトキシピロリジン化合物1 051A の合成(図28): Ｎ−ベンジル-cis −及びtrans −２,５−ジカルボメトキシピロリジンをシグナレラ＆ナタンソンの方法に従って合成した(Cignarella，G ．Nathansohn，G.，JOC ，1961，26，1500.)。２つのジアステレオマー（シスとトランス）をフラッシュクロマトグラフィー(1:9 EA/H 〜 1:4 EA/H)で分離した。分析データは、ケムプ＆カランによって示されたものと一致した（Kemp，DS ，Curran，TPJOC，1988，53，5729）。 シス−(2S,5R)−ジカルボメトキシピロリジン（工程１、化合物1051B(図28)に対する中間体）の合成: Ｎ−ベンジル−cis −(2S，5R)−ジカルボメトキシピロリジン(1.0当量)をMeOH(0.10 M)に溶解し、触媒量の 10％パラジウム／炭素を加えた。反応液が完結したことを TLCが示すまで混合液を水素バルーン下で激しく攪拌した。ろ過及び濃縮して純粋な生成物を得た。 Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ジメチルピロリジン−(2S,5R)−ジカルボキシレートの合成(工程２、化合物1051B(図28)に対する中間体): 粗基質ジメチルピロリジン−２,５−ジカルボキシレート(869 mg，4.06 ミリモル)に水(20ml)を加えた。この溶液を氷浴中で０℃に冷却し、0.3 MK

    2 CO

    3をpH = 9まで滴下した。CbzCl（1.1 eq，4.5ミリモル）を加え、混合液を０℃で30分間及び周囲温度で30分間攪拌した。水層を EtOAc(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、ろ過し、 減圧下で濃縮して黄色油状物を得た。フラッシュクロマトグラフィー(1:3 EA/H) で精製して透明な油状物を得た。（1.2 g）Rf（1:1 EA/H）= 0.48. Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis −(2S,5R)−ジメタノールピロリジン化合物 1051Bの合成: 基質Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ジメチルピロリジン−（2S，5R）−ジカルボキシレート(766 mg，2.3ミリモル)を無水THF（15ml ）に溶解し、この溶液をドライアイス／アセトン浴中で -78℃に冷却した。この溶液にDIBAL-H(トルエン中1.5M)(14.2 ml，9.6 ミリモル，4.2 eq.)を加えた。 この溶液を -78℃で攪拌し、１時間かけて０℃まで徐々に温めた。次に、反応液を1N HCl（数滴）で急冷し、THFを減圧下で除去した。スラリーをEt0Ac(3×30ml )で抽出し、食塩水(30 ml)で洗浄した。MgSO

    4で乾燥した後、減圧下で濃縮して黄色油状物を得た。1:1 EA/Hでフラッシュカラム処理して所望のジオールを得た。 Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis −(2S)−メタノール−(5R)−（ブチロキシメチル）ピロリジンの合成(工程１、化合物1051C(図28)に対する中間体): 基質ジオール(800 mg，3.02 ミリモル)を酪酸ビニル(10 ml)に溶解し、553 mgのリパーゼAKを加えた。TLC が出発物質がなくなったことを示すまで反応液を周囲温度で徐々に攪拌した（60時間）。反応混合液をCH

    2 Cl

    2で希釈し、セライトでろ過し、濃縮した。ヘキサン中 1:4〜1:1 酢酸エチルの勾配で溶離するフラッシュクロマトグラフィー後、生成物を無色の油状物として単離した。(675 mg，67%収率，85% ee)(モシャーエステルに変換し、次に、19F NMR分析してエナンチオマー過剰量を求めた)。 Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−cis −（ブチロキシメチル）−Ｌ−プロリン化合物1051Cの合成(図28)．1.5MH

    2 S0

    4

    (aq.) （9 ml）中 Cr0

    3 (6.83ミリモル，3.75 eq.)の冷却溶液にアセトン(30 ml + 10 ml洗浄液)中基質（611mg，1 .82ミリモル）を加えた。得られた橙色溶液を０℃で30分間、次に周囲温度で７ 時間激しく攪拌した。次に、エチルエーテル(40 ml)を加え、有機層を食塩水(20 ml)で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。この生成物を100%酢酸エチルで溶離するシリカゲルのショートカラムに供して純粋な生成物を無色の油状物(571 mg，89%)として得た。

    1 H NMR(CD

    3 OD，250 MHz)(ピークは回転異性体によって幅広くなった)δ=7.45-7.20(5H，m)，5.25-4.90 (3H，m)，4.40-4.25(1H，m),4.25-4.00(3H，m)，2.38-2.15(2H，m)，2.15-1.73( 4H，m)，1.72-1.42(2H，m)，1.00-0.78(3H，m);

    13 C NMR(CD

    3 OD)d =75.7，174.9 ，156.4，156.0，137.6，129.5，129.3，129.2，129.0，128.8，128.5，128.4， 68.3，68.1，65.4，65.0，61.3，60.9，58.6，58.1，36.7，29.9，28.9，28.1， 19.2，13.9; FABHRMS（NBA）m/e 350.1593（[M + H］

    + C

    18 H

    23 NO

    6の計算値 350 .1604. Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−cis −（ブチロキシメチル）−Ｌ−プロリン−tert−ブチルアミド化合物1051D の合成(図28): 基質i(13.9ミリモル) を乾燥CH

    2 Cl

    2 (20 ml)に溶解した。HOBT，１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(2.07g，15.3 ミリモル)、EDC，１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３ −エチルカルボジイミド(2.93 g，15.3 ミリモル)及び tert-ブチルアミン(1.6m l，15.3ミリモル)を加え、混合液を周囲温度で18時間攪拌した。反応液を酢酸エチル(100 ml)で希釈し、水(2×20 ml)、1N HCl

    (aq.) （10ml）、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （10 ml）、水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥（MgSO

    4

    ）した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。ヘキサン中33%EtOAcで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物を無色の油状物を得た。 Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−cis −ヒドロキシメチル−Ｌ−プロリン−tert−ブチルアミド化合物 1052Aの合成（化合物 1051Eに対する経路中の中間体(図28及び図29): 基質をMe0H: H

    2 O(8 ml:4 ml)に溶解し、０℃に冷却した。LiOHを加え(128 mg，5.0 eq.)、混合液を０℃で20分間攪拌した。混合液を 1N HCl で中和してから EtOAcに抽出し、MgSO

    4で乾燥し、ろ過して生成物を得、これを精製せずに次の工程で用いた。 ５−cis −ヒドロキシメチル−Ｌ−プロリン−tert−ブチルアミドの合成（化合物 1051E(図28): 中間化合物1052A（1.0当量; 上記参照）をMe0H(0.10 M)に溶解し、触媒量の 10%パラジウム／炭素を加えた。反応が完結したことを TLCが示すまで混合液を水素バルーン下で激しく攪拌した。ろ過及び濃縮して純粋な生成物を得た。 次のような一般手順を用いる化合物1051（図28）の合成: ピロリジン誘導体1051 E(20 mg，0.091ミリモル)に乾燥メタノール(2 ml)，Cbz-フェニルアラニルエポキシド21(27 mg，0.091 ミリモル，1.0 eq; 上記参照）及びトリエチルアミン（ 14 μl，0.100ミリモル，1.1eq.）を加えた。この溶液を32時間還流してから減圧下で濃縮した。酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を透明な油状物として得る。 Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−cis −（tert−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−Ｌ−プロリン−tert−ブチルアミドの合成（化合物 1052Bに対する中間体;(図29) CH

    2 Cl

    2 (3 ml)中 Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５ −cis −ヒドロキシメチル−Ｌ−プロリン−tert−ブチルアミド1052A(81 mg，0 .24ミリモル; 上記参照)をアルゴン床によって０℃に冷却した。続いて、2,6-ルチジン(0.48 ml，56 ml，2.0eq.)及び tert-ブチルジメチルシリルトリフラート(88 ml，0.38ミリモル，1.6 eq.)を加えた。０℃で1時間攪拌した後、反応混合液を NaHC0

    3(aq.)飽和溶液: H

    2 O(5 m1: 25 ml)の氷冷混合液に注入すると共にCH

    2 Cl

    2 (3×20 ml)に抽出することにより反応液を急冷した。プールした有機層を10 % CuS0

    4(aq.)溶液（2 ×20ml）で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発した。ヘキサン中 25％酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して中間化合物を無色の油状物(85mg，79%)として得た。Rf = 0.58(1:1 E tOAc/ヘキサン)．

    1 H NMR(CDCl

    3 ，250 MHz)（ピークは回転異性体によって幅広くなった）ｄ = 7.33-7.26(5H，m)，5.14(2H，brs)，4.18-4.12(1H，m)，4.08-3 .90(1H，m)，3.83-3.71(2H，m)，2.39-2.00(2H，m)，2.00-1.82(2H，m)，1.24(9 H，s)，0.86(9H，s)，0.03(6H，br s);

    13 C NMR(CDCl

    3 ，62.5 MHz)136.1，128. 4，128.1，127.9，67.2，64.3，50.7，28.4，25.9; FABHRMS（NBA）m/e 581.182 4（[M + Cs］

    + C

    24 H

    40 N

    2 O

    4 Si の計算値 581.1822．中問化合物(1.0当量; 上記参照)をMeOH(0.10 M)に溶解し、触媒量の 10%パラジウム／炭素を加えた。反応が完結したことを TLCが示すまで混合液を水素バルーン下で激しく攪拌した。ろ過及び濃縮して純粋な生成物 1052Bを得た。 (2S,3S)−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル−５'−cis −（tert−ブチルアミドの合成（化合物1052に対する経路中の中間体; 図29、工程 1) α−ヒドロキシ酸11(62.5 mg，0.19ミリモル，1.0 eq; 上記参照）、EDC(40 mg，1.1 eq.)、HOBT(28.2 mg，1.1 eq.)を乾燥 DMF(1 ml)中アルゴン下に周囲温度で攪拌した。30分間前活性化した後、乾燥DMF（0.5 ml + ２×0.5 ml洗浄液）に溶解したアミン1052B(59 mg，1.0 eq)を活性酸混合液にカニューレ注入した。12時間攪拌した後、反応混合液を減圧下で濃縮し、EtOAcを加えた。有機層を水(2×5 ml)で洗浄し、MgS0

    4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。ヘキサン中 20%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して中間体を白色結晶性固形物(77mg，65%)として得た。Rf=0.59 (1:2 EtOAc/ヘキサン);

    1 H NMR(CDCl

    3 ，400MHz):（２つの回転異性体の混合物）ｄ = 7.32-7.09(20H，m),6.86(1H，s)，6.42(1H，s)，5.63（1H，d,J= 8.9 Hz )，5.42(1H，d，J= 8.8 Hz),5.07(1H，d，J=12.0 Hz)，5.00(1H，d，J= 12.0 Hz )，5.08-4.92(2H，m)，4.53-4.38(2H，m)，4.37 -4.19(3H，m)，4.12-3.97(3H， m)，3.89-3.71 (2H，m)，3.63-3.52(1H，m)，3.52-3.47(1H，m)，2.90-2.62(4H ，m)，2.50-2.32(1H，m)，2.20-1.60(9H，m)，1.30(9H，s)，1.27(9H，s)，0.87 (9H，s)，0.86（9H，s)，0.08（3H，s)，0.06（3H，s)，0.04(3H，s)，0.01（3H ，s);

    13 C NMR(CDCl

    3 ，100MHz); FABHRMS（NBA）m/e758.2618([M + Cs］+ C

    34 H

    51 N

    3 O

    6 Siの計算値 758.2601. 化合物1052に対する中間体の合成（工程２，図29）デス・マルチン一般手順:(2S ，3S）−３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ケト−４−フェニルブチリル−5'−cis −（tert−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド基質X(28 mg，0.044ミリモル)を乾燥CH

    2 Cl

    2 (2 ml)に溶解し、デス・マルチンペリオジナン(26 mg，0.088 ミリモル，2.0 eq.)を加えた。反応混合液を周囲温度で24時間攪拌してから酢酸エチル(10 ml)で希釈し、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) (5 ml)及びチオ硫酸ナトリウムを加えることにより急冷した。水相を酢酸エチル(3×20 ml)で抽出した。合わせた有機抽出液を水(10 ml)で洗浄し、MgSO

    4

    で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得た。ヘキサン中 50%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を白色固形物(1:1 のジアステレオマーの混合物)として得た。（26 mg，95%）Rf = 0.47(1:2Et0Ac/ ヘキサン); 1H NMR(CDCl

    3 ，400MHz);ｄ = 7.36-7.13（20 H，m)，6.40(1H，s)， 6.07（1H，ｓ），5.36(1H，d，J= 7.2 Hz)，5.18(1H，d，J= 6.8 Hz)， 5.11-4.97(5h，m)，4.96-4.90(1H，m)，4.50-4.47(1H，m)，4.22-4.18(2H，m)， 3.99(1H，dd，J= 9.6，4.9 Hz)，3.96-3.87(1H，m)，3.75（1H，dd，J=10.0，4. 8 Hz)，3.53-3.32(3H，m)，3.27(1H，dd，J= 14.2，5.5 Hz)，3.18(1H，dd，J= 14.1，8.1 Hz),2.91 (1H，dd，J= 14.0，9.7 Hz)，2.40-2.28(1H，m)，2.25-2.1 6(1H，m)，2.08-1.97(1H，m)，1.96-1.78(2H，m)，1.72-1.52(3H，m)，1.34(9H ，s)，1.31(9H，s)，0.88(9H，s)，0.86(9H，s)，0.09(3H，s)，0.06(3H，s)，0 .04(3H，s)，0.03(3H，s);

    13 C(CDCl

    3 ，100MHz); IR（NaCl）vmax 3332.3，2955 .0，2856.0，2358.1，1714.7，1634.1，1537.8，1454.8，1258.0，1094.6; FABH RMS（NBA）m/e 756.2469（[M + Cs］

    + C

    34 H

    49 N

    3 O

    6 Siの計算値 756.2445. 化合物1052の合成(図29に示されている): 1.0 当量の基質の1.0 モル溶液にTBA F(THF中1.OM 溶液)を加え(0.34 ml，1.05 eq.)、反応液を TLCでモニターした。０℃で30分後、反応が完結し、溶媒を減圧下で蒸発した。粗物質をシリカゲルのショートカラムに加え、酢酸エチル中 33%ヘキサンで溶離して黄色油状物（16 2 mg，94%）を得た。 Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−５−cis −（メトキシメチル）−Ｌ−プロリン−tert−ブチルアミド化合物 1053Aの合成(図29)．無水 DMF(3 ml)中1052A （156 mg，0.467ミリモル）の溶液をアルゴン下で０℃に冷却した。NaH，鉱油中 60%分散液(28.0 mg，0.70ミリモル，1.5eq.)を加え、懸濁液を20分間攪拌した。次に、ヨードメタン(116 ml，1.8ミリモル，4.0 eq.)を加え、混合液を０℃で３時間攪拌した。数滴の1N HCl

    (aq.)溶液を加えることにより反応液を冷却してからH

    2 O(10 ml)で希釈した。水層を EtOAc(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、ろ過し、減圧下で蒸発した。ヘキサン中 50%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して中間体を無色の油状物(146 mg，89%)として得た。Rf = 0.25(1:1 EtOAc/ヘキサン)．1H NMR（CDCl

    3 ）

    13 C NMR（CDCl

    3 ，MHz）FAB HRMS（NBA）m/e 349.2119([M+ H］

    + C

    19 H

    28 N

    2 O

    4の計算値 349.21270MeOH(3 ml) 中上記中間体（85 mg，0.19ミリモル）の溶液に触媒量の10% Pd/Cを加え、混合液をH

    2バルーン下に周囲温度で攪拌した。20分後、反応が完結したことをTLC が示し、混合液をセライトパッドでろ過し、MeOHで洗浄した。溶媒を減圧下で除去して無色の油状物（89mg，定量的）を化合物1053A として得、これを精製せずに次の工程で用いた。

    1 H NMR（CDCl

    3 ，400MHz）ｄ = 5.64(1H，br s)， 4.21 (1H，dd，J= 9.2，5.0 Hz)，3.78-3.68(1H，m)，3.53(1H，dd，9.8，4.1Hz )，3.46-3.37(1H，m)，3.42(3H，s),2.41-2.31(m，1H)，2.06-1.89(2H，m)，1.6 9-1.60(1H，m)，1.36(9H，s)．

    13 C（CDCl

    3 ，100 MHz）ｄ 171.2，73.4，60.2，5 9.2，59.0，51.0，30.7，28.6，27.0.FABHRMS（NBA）m/e 215.1764([M+ H］

    + C

    1

    1 H

    22 N

    2 O

    2の計算値 215.1760. （2S,3S）−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ヒドロキシ−４− フェニルブチリル−５'−cis −（メトキシメチル）−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミドの合成（化合物1053に対する中間体，図29） 上記及び化合物1052の合成に示されたカップリング一般手順により合成した（図29）。Rf= 0.30（EtOAc:ヘキサン 1:2）

    1 H NMR(CDCl

    3 ，400 MHz):（回転異性体の混合物）ｄ = 7.33-7.17(20 H，m)，6.91(2H，d，J= 5.6 Hz)，5.75(1H，d，J = 8.8 Hz)，5.64(1H，d，J= 8.8Hz)，5.07(1H，d，J=12.3 Hz)，5.03(2H，s)，4 .91(1H，ｄ)，4.61-4.55(1H，m)，4.53-4.38(3H，m)，4.28-4.15(4H，m)，4.02- 3.95(1H，m)，3.93-3.86(2H，m)，3.81-3.75(1H，m)，3.46（1H，d，Ｊ= 8.7 Hz )，3.39-3.26(3H，m)，3.35(3H，s)，3.20(3H，s)，2.93-2.84(3H，m)，2.80-2. 73(1H，m)，2.42-2.35(1H，m)，2.15-1.82(3H，m)，1.80-1.74(1H，m)，1.72-1. 62(1H，m)，1.30(9H，s)，1.27(9H，s);

    13 C NMR（CDCl

    3 ，100MHz）ｄ=172.4，1 71.6，171.1，169.9，156.2，156.0，137.6，137.2，136.4，136.2，129.5，129 .4，129.1，128.5，128.4，128.3，128.2，128.0，127.9，127.8，127.7，126.9 ，126.4，73.2，71.2，71.0，70.2，66.6，66.4，61.8，60.8，60.7，60.4，59. 5，59.0，58.8，58.7 58.0，55.3，54.7，54.5，51.1，50.8，35.1，29.8，29.6 ，28.5，27.9，26.2，24.1，21.0，14.1; FABHRMS（NBA）m/e 658.1879([M + Cs ］

    + C

    29 H

    39 N

    3 O

    6の計算値 658.1893. (2S,3S)−３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ケト−４−フェニルブチリル−5'−cis −（メトキシメチル）−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミドの合成（化合物1053; 図29） 上記及び化合物1052の例に示されたデス・マルチン一般手順により合成した（図29）。Rf = 0.40(1:1 EtOAc／ヘキサン);

    1 H NMR(CDCl

    3 ，400 MHz)(1:1のジアステレオマーの混合物)ｄ = 7.33-7.16(20H，m)，6.88（1H，s)，6.79(1H，s)，5. 70(1H，d，J = 8.6 Hz)，5.26(1H，d，J = 7.1 Hz)，5.18-5.12(2H，m)，5.08-4 .92(4H，m)，4.48-4.43(2H，m)，4.28-4.22(1H，m)，4.14-4.10(1H，m)，4.09-4 .02(1H，m)，3.45(1H，dd，J = 9.5，1.9 Hz),3.37(3H，s)，3.36-3.17(6H，m) ，3.15(3H，s)，2.94(1H，dd，J = 13.9，9.4 Hz)，2.42-2.30(1H，m)，2.20-2. 10(1H，m)，2.08-1.82(5H，m)，1.81-1.72(1H，m)，1.34(9H，s)，1.30(9H，s);

    13 C(CDCl

    3 ，100MHz); 198.0，197.0，171.1，169.4，164.9，163.9，155.9，1 55.6，136.3，136.1，129.7，129.3，128.7，128.5，128.4，128.3，128.1，127 .0，126.8，74.3，70.4，67.1，66.8，63.6，61.2，59.8，58.8，58.6，58.5，5 7.9，57.6，51.0，50.9，37.2，29.9，28.6，27.4，25.7，24.9; IR（NaCl）vma x 3331.1，2966.8，2340.9，1717.4，1646.2，1540.6，1455.8，1252.9，1111.7 ，1047.1; FABHRMS（NBA）m/e 656.1714([M+ CS］

    + C

    29 H

    37 N

    3 O

    6計算値 656.173 7; (実測値 C，66.24; H，7.21; N，7.78;C

    29 H

    37 N

    3 O

    6計算値 C，66.50，H，7.1 3; N，8.03). 図30に示されるｐ−（ｏ−ニトロベンジルオキシ）ヒドキシベンジルブロミド化合物 1054Aの合成工程 1）乾燥アセトン(15 ml)に溶解したp-ヒドロキシベンジルアルコール(2.0g ，16.1 ミリモル; Aldrich)の溶液にK

    2 CO

    3 (4.45 g，32.2ミリモル，2.0 eq.)及びｏ-ニトロベンジルブロミド(3.83 g，17.7 ミリモル，1.1 eq)を加えた。混合液を周囲温度で16時間攪拌してからこの溶液を減圧下で濃縮した。残留物を EtO Ac(100 ml)に溶解してから有機層をH

    2 O(2 ×30 ml)、食塩水(30 ml)で洗浄し、M gSO

    4で乾燥した。生成物をEt

    2 O/ヘキサンから再結晶してｐ−（ｏ−ニトロベンジルオキシ）ヒドキシベンジルアルコールの黄色針状晶(2.0 g，60%)を得た。 1H NMR（CDCl

    3 ，400 MHz）ｄ = 8.16(1H，dd，J = 8.2，1.3 Hz)，7.88(1H，dd ，7.9，1.0 Hz),7.68(1H，dt，J = 7.5，1.2 Hz),7.51-7.46(1H，m)，7.32-7.26 (2H，m)，6.98-6.95(2H，m)，5.48(2H，s)，4.61(2H，s);

    13 C NMR（CDCl

    3 ，100 MHz)ｄ = 157.6，133.9，128.7，128.5，128.2，124.9，114.8，66.8，64.9; 工程 2）０℃に冷却したCH

    3 CN(10 ml)中Ph

    3 P(1.03 g，3.94 ミリモル，1.02 eq. )の懸濁液に臭素(0.20 ml，3.86ミリモル，1.0 eq.)を滴下した。次に、氷浴を取り除き、5mlの CH

    3 CN中ｐ−（ｏ−ニトロベンジル）ヒドロキシベンジルアルコールの溶液をカニューレ注入によって加えた。10分間攪拌した後、CH

    3 CNを減圧下で除去し、残留物をヘキサン（5 ×30ml）で抽出し、セライトパッドでろ過した。そのヘキサンを減圧下で濃縮して綿毛状の白色固形物化合物 1054Aを得た（1.1g，88%）。

    1 H NMR（CDCl

    3 ，400 MHz）ｄ = 8.17(1H，d，J = 8.2 Hz，7.8 6（1H，d，J = 7.8 Hz)，7.68(1H，t，J = 7.4 Hz)，7.54-7.49(1H，m)，7.34(2 H，d，J = 8.4 Hz)，6.94(2H，d，J = 8.4 Hz)，5.49(2H，s)，4.50(2H，s); 図30に示される trans−3'−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｌ−プロリンtert−ブチルアミド化合物 1054Cの合成無水 DMF(10ml)中Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−trans −3'−ヒドロキシプロリンtert−ブチルアミド 1054B（739 mg，2.31ミリモル; 上記参照; 1050A のように合成した，図27）の溶液にTBDMSCl(366 mg，2.42ミリモル，1.05 eq)， Et

    3 N(0.35 ml，2.54ミリモル，1.1 eq)及び触媒量のDMAPを加えた。この溶液を周囲温度で15時間攪拌してからEtOAc(60 ml)とH

    2 O(30 ml)に分配した。次に、有機層をNH

    4 Cl

    (aq.)溶液(2×30 ml)，水(30 ml)、食塩水(30 ml)で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、減圧下で濃縮して粗物質を黄色油状物として得た。次に、黄色油状物を MeOH(20 ml)に溶解し、触媒量の10% Pd/Cを加えた。混合液をH

    2バルーン下で１時間激しく攪拌した。次に、混合液をセライトでろ過し、減圧下で濃縮して黄色の油状物を得た(690 mg，99 %)。 1H NMR（CDCl

    3 ，400 MHz）δ=6.97(1H， ｓ)，4.46(1H，dd，J = 9.1，4.6 Hz)，3.76(1H，d，J = 4.04 Hz)，3.42(1H，d t，J = 10.6，7.6 HZ)，3.21 (1H，ddd，J = 10.6，7.5，5.8 Hz)，1.34(9H，s) ，0.89(9H，s)，0.12(3H，s)，0.11(3H，s);

    13 C NMR（CDCl

    3 ，100 ＭHz）ｄ = 168.3，75.5，67.8，51.4，44.1，33.8，28.6，25.7，-4.6，-4.8; FABHRMS（NB A）m/e 301.2317([M + H］

    + C

    15 H

    32 N

    2 O

    2 Si の計算値 301.2311); 図30に示される(2S,3S)−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２ −ヒドロキシ−４−フェニルブチリル−trans−3'−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｌ−ジメチルシリルオキシ）−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド化合物 1054Dの合成． 化合物 1052，図29に例示される上記ペプチドカップリング一般手順により合成した。

    1 H NMR（CDCl

    3 ，400 MHz）d = 7.28-7.08(10H，m)，6.48(1H，s)，5.57(1 H，d，J = 8.8 Hz)，5.08-4.93(2H，m)，4.63-4.58(1H，m)，4.52-4.38(1H，m) ，4.26(1H，br s)，4.20-3.61 (4H，m)，1.24(9H，s)，0.88(9H，s)，0.09(6H， s);

    13 C NMR（CDCl

    3 ，100 MHz）d = 171.4，170.0，168.5，156.6，156.1，137. 4，136.2，135.9，129.1，128.8，128.4，128.0，127.9，127.4，126.4，73.1， 71.6，71.2，69.7，69.2，66.6，66.5，54.8，54.5，51.4，51.3，45.9，45.5， 34.5，33.6，32.9，31.8，28.5，28.4，25.7，17.9，14.1; 図30に示される(2S,3S)−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２−アセトキシ−４−フェニルブチリル−trans −3'−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド中間化合物 1054Eの合成． 無水CH

    2 Cl

    2中(2S,3S)−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチリル−trans −3'−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド1054D(216 mg，0.35ミリモル)の溶液に酢酸無水物(67 ml，0.71ミリモル，2.0 eq.)、ピリジン(71 ml，0.882 ミリモル，2.5 eq.)を加えた。出発物質と生成物のRf値がほとんど同じであったので、TLC でモニターすることにより反応が完結したかを知ることは難しかった。 反応液をアルゴン下で15時間攪拌した後、EtOAc(40 ml)を加え、溶液を飽和 NH

    4

    Cl

    (aq.) 20 ml)、飽和 NaCO

    3(aq.) （20 ml）、水(20 ml)及び食塩水(20 ml)で洗浄した。有機層を MgSO

    4で乾燥し、ろ過し、濃縮して綿毛状の白色固形物を得た。 (211 mg，92%);

    1 H NMR(CDCl

    3 ，400 MHz)δ = 7.33-7.13(10H，m)，6.47(1H，s) ，5.57(1H，d)，5.36-5.30（1H，m)，5.02（2H，s)，4.69-4.58(1H，m)，4.39-4 .31 (1H，m)，4.20-4.09(1H，m)，3.87-3.57(2H，m)，2.98-2.79(2H，m)，2.26- 2.22(1H，m)，2.08(3H，s)，1.95-1.85(1H，m)，1.31(9H，s)，0.87(9H，s)，0. 099(6H，s);

    13 C NMR（CDCl

    3 ，100 MHz）d = 170.2，169.9，168.6，167.8，167 .4，166.5，155.9，136.9，136.1，128.9，128.5，128.4，128.0，127.8，127.7 ，126.6，76.5，73.3，72.8，71.3，69.5，69.4，66.7， 66.5，52.7，52.4，51.4，51.1，45.5，45.2，35.5，34.3，33.8，31.0，28.5， 28.2，25.6，25.5，20.5，20.3，17.9，17.6; FABHRMS（NBA）m/e 786.2571([M+ Cs]

    + C

    35 H

    51 N

    3 O

    7 Siの計算値 786.2551); 図30に示される(2S,3S)−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２ −アセトキシ−４−フェニルブチリル−trans −3'−ヒドロキシ−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド化合物 1054Eの合成． 基質(2S,3S)−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２−アセトキシ−４−フェニルブチリル−tran s −3'−（tert−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｌ−tert−ブチルアミド（1. 0当量; 上記参照）を THFに溶解し、０℃に冷却した。TBAF(THF中 1.0M溶液)を加え(0.34 ml，1.05 eq.)、反応液を TLCでモニターした。０℃で30分後、反応が完結し、溶媒を減圧下で蒸発した。粗物質をショートカラムのシリカゲルに加え、酢酸エチル中 33%ヘキサンで溶離して黄色油状物(162 mg，94%)を得た。（2 S,3S）−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２−ヒドロキシ−４ −フェニルブチリル−trans −3'−（ｐ−（ｏ−ニトロベンジル）ベンジルオキシ）−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド化合物 1054Fの合成、図30. 無水 THF(3 ml)に溶解した(2S,3S)−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）− アミノ−２−アセトキシ−４−フェニルブチリル−trans −3'−ヒドロキシ−Ｌ −プロリル−tert−ブチルアミドの溶液にｐ−（ｏ−ニトロベンジル）ヒドロキシベンジルブロミド(106.4 mg，0.331ミリモル）、4Aモレキュラーシーブ（へら一杯の）及び銀トリフラート（へら一杯の）を加えた。反応が周囲温度において10分で完結し、直ちにセライトパッドでろ過し、Et

    2 Oで洗浄した。ヘキサン中50 % 酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製した後、無色の油状物を単離した(165 mg，70%)。 基質(2S,3S)−３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−アセトキシ−４−フェニルブチリル−3'−trans −［ｐ−（ｏ−ニトロベンジル）ベンジルオキシ］−Ｌ−tert−ブチルアミドをMe0H: H

    2 O(7 ml: 1 ml)に溶解し、０℃に冷却した。K

    2 CO

    3 (146 mg，1.06 ミリモル，5.0 eq.)を加え、濁った混合液を室温に徐々に温めた。出発物質と生成物のRf値がほとんど同じなので反応を TLCでモニターすることは難しかった。反応液を室温で更に30分間攪拌してからMeOHを減圧下で除去した。得られた残留物を水(20 ml)とEtOAc(30 ml)に分配し、MgSO

    4

    で乾燥し、ろ過し、濃縮して無色の油状物(155 mg，99%)を得た。 （2S,3S）−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ−２−ケト−４−フェニルブチリル−trans −3'−［ｐ−ヒドロキシベンジルオキシ］−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミド化合物1054の合成． 工程 1）上記化合物1052に示されたデス・マルチン酸化の一般手順に従って合成した，図29。 工程 2)基質(2S,3S)−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２−ケト−４−フェニルブチリル−trans −3'−［ｐ−（ｏ−ニトロベンジルオキシ） ベンジルオキシ］−Ｌ−プロリル−tert−ブチルアミドをCH

    2 Cl2(1 ml)に溶解し、反応が完結したことを TLCが示すまで日光にあてた。この溶液を減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（溶離剤ヘキサン中 33%酢酸エチル）で精製してわずかに黄色の油状物を得た。 代替的化合物1059、1060及び他のヒドロキシベンジルオキシプロリン置換α−ケトアミド 上記trans−３−ｐ−ヒドロキシベンジル置換系と類似の方法でtrans −３−ｍ−ヒドロキシベンジルオキシプロリン置換α−ケトアミドの合成を行い、図30に示されるブロミドを用いて1059及び1060が合成される。 図31に示されるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis −4'−（ベンジルオキシ）−Ｌ−プロリンスクシネートエステル化合物 1O55Aの合成． 工程 １）アルゴン下、無水 DMF(2 ml)中Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis -4'−ヒドロキシプロリン(290 mg，1.09 ミリモル; Aldrich)の氷冷溶液にNaH(鉱油中 6 0%分散液)(96 mg，2.40 ミリモル，2.2 eq.)を加えた。混合液を20分間攪拌してから臭化ベンジル(0.14 ml，1.20ミリモル，1.1 eq.)を加えた。混合液を０℃で１時間攪拌してから数滴の水で急冷した。NaHCO

    3飽和溶液を加え(10 ml)、水層をエチルエーテルで洗浄した。次に、水層を 1N HCleでpH 2まで酸性にしてから酢酸エチル(3×20 ml)で抽出し、MgSO

    4で乾燥し、濃縮して黄色油状物を得た。 （205 mg，53%）粗物質を精製せずに続けた。 工程 2）無水CH

    2 Cl

    2 (2 ml)中Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis −4'−（ ベンジルオキシ）−Ｌ−プロリン(41 mg，0.115 ミリモル)の溶液に EDC(68mg， 0.356 ミリモル，3.1 eq.)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(40 mg，0.345 ミリモル，3.0 eq.)を加えた。この溶液を２時間攪拌した。溶媒を除去し、残留物をエチルエーテルと水(10 ml/5 ml)に分配した。水層をエチルエーテルで抽出し、合わせた有機層を食塩水(10 ml)で洗浄し、MgSO

    4で乾燥した。濃縮に続いて酢酸エチル中9%メタノールで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を白色固形物(51 mg，98%)として得た。1H NMR（CDCl

    3 ，400MHz） （２つの異なる回転異性体、ここには主要な回転異性体のみ示す）ｄ7.38-7.25( 10H，m)，5.23(1H，d，J = 12.4 Hz，ab-Cbz)，5.10(1H，d，12.4 Hz ab-Cbz)， 4.75(1H，dd，J = 9.4，3.0 Hz，aH)，4.63(1H，d J = 12.5 Hz，ab-Bn)，4.48 (1H，d，J = 12.5 Hz，ab-Bn)，4.15-4.09(1H，m，CH-OBn)，3.75-3.62(2H，m， NCH

    2 CHOBn)，2.82(4H，s，succ.CH

    2 )，2.65-2.62(1H，m，NCH

    2 CHOBnCH

    2 )，2.47- 2.34(1H，m，NCH

    2 CHOBnCH

    2 ); Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis −4'−（ベンジルオキシ）−Ｌ−プロリン−イソロイシン−グルタミン−tert−ブチルエステル化合物 1055Bの合成． 無水CH

    2 Cl

    2 (2 ml)中Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis −4'−（ベンジルオキシ（−Ｌ−プロリンスクシネートエステル1055A（28 mg，0.0619ミリモル） の溶液にジペプチドH

    2 N-Ile-Gln-(OtBu エステル)(39 mg，0.123ミリモル，2 eq .)を加え、この溶液を周囲温度で45分間攪拌した。この溶液をCH

    2 Cl

    2 (5 ml)で希釈してから NH

    4 C1飽和溶液(5 ml)、NaHCO

    3飽和溶液、食塩水(5 ml)で洗浄し、 MgSO

    4で乾燥した。濃縮に続いて酢酸エチル中8%メタノールでフラッシュクロマトグラフィー処理して所望の生成物を白色固形物(40 mg，99)として得た。

    1 HNM R（CDCl

    3 ，400 MHz）d =7.36-7.27(10H，m)，6.99(1H，br s)，6.84(1H，d，J = 8.6 Hz)，6.75(1H，br s)，5.80(1H，br s)，5.15(2H，s)，4.53-4.32(4H，m) ，4.33-4.30(1H，m)，4.12-4.09(1H，m)，3.71(1H，d，J = 11.9 Hz)，3.59-3.5 4(1H，m)，2.64-2.61(1H，m)，2.30-2.15(4H，m)，2.00-1.85(1H，m)，1.83-1.6 9(1H，m)，1.53-1.38(2H，m)，1.45(9H，s)，1.00-0.93(1H，m)，0.81-0.71(6H ，m);

    13 C NMR(CDCl

    3 ，100 MHz)d 175.2，171.2，170.5，156.2，137.4，135.9 ，81.9，76.4，70.5，67.7，60.6，57.8，53.4，52.1，36.7，34.1，31.7，28.1 ，24.5，15.0，11.2; FABHRMS（NBA）m/e 785.2520([M + Cs］

    + C

    35 H

    48 N

    4 O

    8の計算値 785.2526); 図31に示される cis−４−（ベンジルオキシ）−Ｌ−プロリンイソロイシングルタミン−tert−ブチルエステル化合物 1055Cの合成． MeOH(2 ml)中Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−cis −4'−（ベンジルオキシ）−Ｌ−プロリンーイソロイシン−グルタミン−tert−ブチルエステル 1055B(6 0mg，0.092 ミリモル)の溶液に 20%水酸化パラジウム／炭素(10 mg)を加え、懸濁液を水素バルーン下に室温で激しく攪拌した。５分後、反応が完結したことをTLC が示した。懸濁液をセライトパッドでろ過し、減圧下で濃縮して X(47 mg， 定量的)を得た。

    1 H NMR(CD

    3 OD，400 MHz)d 7.33-7.23(5H，m)，4.47（1H，d，J= 11.8 Hz)，4.41(1H，d，J=11.8 Hz)，4.27-4.18(2H，m)，4.17-4.13(1H，m)，3. 88(1H，dd，J=7.8，4.3 Hz)，3.20(1H，d，J=11.7 Hz)，3.12(1H，dd，J=11.7， 4.6 Hz),2.36-2.17(2H，m)，2.12-2.07(1H，m)，1.92-1.75(2H，m)，1.57-1.46( 1H，m)，1.49(9，s)，1.16-1.05(1H，m)，0.92-0.88(3H，m)，0.85-0.75(3H，m) ;

    13 C NMR（CD

    3 OD，100 MHz）d 177.4，175.3，173.3，172.1，139.6，129.4，1 28.9，128.6，82.9，79.9，71.9，60.4，59.0，54.0，53.0，38.4，37.1，32.1 ，32.5，28.2，25.8，15.9，11.5; 図31に示される(2S,3S)−３−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−アミノ−２ −ケト−４−フェニルブチリル−cis −4'−ベンジルオキシ−Ｌ−プロリン−イソロイシン−グルタミン−tert−ブチルエステル化合物1055の合成． 次の物質をアルゴン床のもとでフラスコ中で合わせた： α−ヒドロキシ酸11(26 mg，0.0 80 ミリモル，1.2 eq.)、アミン1055C(35 mg，0.067ミリモル)、HBTU(30.5mg，0 .080 ミリモル，1.2 eq.)及びHOBT(10.9 mg，0.080 ミリモル，1.2 eq.)。無水T HF(1 ml)、続いてDIEA(28 ml，0.161 ミリモル，2.4 eq.)を加え、この溶液を室温で18hr攪拌した。減圧下で溶媒を除去した後、得られた残留物を EtOAc(10 ml )に溶解し、 NH

    4 Cl

    (aq.) （2×5 ml）、NaHCO

    3(aq.) （2×5 ml）、水(1×5 ml)及び食塩水(1×5 ml)で洗浄した。次に、有機層を MgS0

    4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して粗黄色油状物を得た。粗油状物をCH

    2 Cl

    2中5%Me0Hでフラッシュクロマトグラフィーにかけた後、白色固形物を単離した(24 mg，収率43%)。Rf＝0.33 (9:1 CH

    2 Cl

    2 )．1H NMR(CDCl

    3 ，400 MHz)（主要回転異性体のみ）d =7.33-7.11 ( 15H，m)，7.11 (1IH，d，J= 8.4Hz)，6.78(1H，d，J=10.2 Hz)， 6.71(1H，s)，5.12(1H，d，J=12.5Hz)，4.89(1H，d，J=12.5 Hz)，4.67-4.55(1H ，m)，4.55(1H，d J=12.5 Hz)，4.50(1H，d，J=12.5 Hz)，4.48-4.29(3H，m)，4 .19-4.03(2H，m)，4.02-4.92(1H，m)，3.74-3.66(1H，m)，3.07(2H，d，J=7.4 H z)，2.52(1H，d，J=14.3 Hz)，2.32-2.06(4H，m)，2.05-1.86(1H，m)，1.71-1.5 2(1H，m)，1.42(9H，s)，1.06-0.89(1H，m)，0.83-0.59(6H，m);

    13 C NMR（CDCl

    3

    ，100 MHz）d = 175.5，173.4，171.5，170.5，170.4，156.6，137.9，137.7，1 37.1，136.3，129.2，129.1，128.5，128.4，127.9，127.8，127.7，126.5，82. 1，76.5，71.6，70.7，66.5，60.8，57.8，56.2，53.1，52.2，37.0，34.4，33. 3，31.7，27.9，25.0，24.6，14.9，10.9. 工程 2)化合物1055を生成するために化合物1052、図29について上記で示したデス・マルチン酸化一般手順を用いて最終生成物を得た。 図32に示される化合物1056の合成． 標準ペプチドカップリング条件を用いて固相樹脂(MBHA)上で次の伸長ペプチドアイソスターを合成した。Ｃ末端から出発してペプチドを合成した。N-B0C-トレオニンを樹脂(DCC，HOBT，DIEA)にカップリングし、次に、アミノ基を脱保護(TFA)し、DMF及びCH

    2 Cl

    2で十分に洗浄した。この標準カップリング／脱保護／洗浄手順を次の N-B0Cアミノ酸で数回繰り返した:（Gln，Ile，Pro，Phe （α−ヒドロキシ酸，Ala，Gln，Pro)。続いてペプチドを固体支持体に結合したままデス・マルチン酸化を行った。樹脂結合ペプチドをCH

    2 Cl

    2に懸濁し、デス・マルチンペリオジナンを加えた(2.0 eq)。樹脂を多量の水とMeOHでフリット漏斗によって洗浄した。α−ケトアミドへの完全な酸化を行わせるためにこの手順を繰り返した。ペプチドの固体支持体からの切断は、標準無水HF装置で行い、逆相HPLCで精製した。 ２(R),5(R)−ビス（ヒドロキシメチル）−３(R),4(S)−ジヒドロキシ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−２,３−ベンジリデンアセタール化合物1 057C の合成 図33． 無水 DMF(1 ml)に溶解した２(R),5(R)−ビス（ヒドロキシメチル）−３(R),4(S)−ジヒドロキシ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン(267 mg，0.90 ミリモル; Sleeら J．Am．Chem．Soc.，1995，117,1186 7 の方法により合成した）にベンズアルデヒドジメチルアセタール(242 ml，1.6 2ミリモル，1.8 eq.)を加えた。触媒量のpTSAを加え、この溶液をアルゴン下で６時間攪拌した後、この溶液をH

    2 O(30 ml)とEtOAc(30 ml)に分配し、水層をEt OAc(2×30 ml)で抽出した。プールした有機層を食塩水(20 ml)で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、ろ過し、濃縮して粗黄色油状物を得た。続いて、ヘキサン中50% 酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して白色泡状物1057C(24 6 mg，71%)を得た。 図33に示される化合物 1057Dの合成． 工程 1) 無水 DMF(4 ml)中2(R),5(R)−ビス（ヒドロキシメチル−3(R),4(S)− ジヒドロキシ−Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）ピロリジン−2,３−ベンジリデンアセタール化合物1057C(784 mg,2.04ミリモル)をTBDMSCl(316 mg，2.09ミリモル，1.02 eq.)、トリエチルアミン(310 ml，2.24 ミリモル，1.1 eq.)及び触媒量のDMAPを加えた。この溶液をアルゴン下に18時間攪拌してからEtOAc(40ml) とH

    2 O(30 ml)に分配した。水層を EtOAc(2×40 ml)で抽出し、有機層をNH

    4 Cl

    (a

    q.) （30 ml）、食塩水(30 ml)で洗浄し、MgSO

    4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して粗黄色油状物を得た。（914 mg，90%） 工程 2)粗黄色油状物を5 mlの無水 DMF(5 ml)に再溶解し、この溶液を氷浴中で０℃に冷却した。NaH(52 mg，2.16 ミリモル，2.2 eq.)及び臭化ベンジル(0.128 ml，1.08 ミリモル，1.1 eq.)を加え、混合液を０℃で１時間攪拌した。反応液を飽和 NH

    4 Cl(5 ml)で冷却してからEtOAc(40 ml)を加えた。有機層を飽和NaHCO

    3

    (aq.) （30 ml）、水(2×30 ml)及び食塩水(30 ml)で洗浄した。MgSO

    4で乾燥し、 ろ過し、減圧下で濃縮した後、粗生成物を黄色油状物として単離した。 図33に示される化合物 1057Eの合成工程 1）粗黄色油状物(0.982ミリモル)にTBAF(THF中1M)(1.9 ml，1.9 ミリモル，2 eq.)を加え、この溶液を室温で２時間攪拌した。この溶液を減圧下で濃縮し、直ちにヘキサン中 33%酢酸エチルで溶離するショートシリカゲルカラムに加えた。生成物を白色泡状物(443 mg，95%)として単離した。 工程 2）白色泡状物(O.191ミリモル)をCH

    2 Cl

    2 (1 ml)に溶解し、デスマルチンペリオジナン(112 mg，2.0ミリモル，2.0 eq.)を加えた。１時問後、チオ硫酸ナトリウム(500 mg)とH

    2 O(30 ml)を加え、水層を EtOAc(3×30 ml)で抽出し、MgSO

    4

    で乾燥し、ろ過し、濃縮して粗生成物を得、これをtert-ブタノール(2.5 ml)に溶解した。この溶液に２−メチル−２−ブテン(2M 溶液)(2 ml)を加えてからH

    2 O (1 ml)中亜塩素酸ナトリウム(199 mg，1.75 ミリモル，9.2 eq.)とNaH

    2 PO，(354 mg，1.32 ミリモル，6.9 eq.)の溶液を攪拌基質溶液に滴下した。 １時間後、反応が完結したことを TLCが示し、減圧下で揮発分を除去してから残存している水層をジエチルエーテル(3×20 ml)で抽出した。図33のに示される化合物1057 Fの合成．図33に示されるように、基質1057E(70 mg，0.213 ミリモル)を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド(43 mg，0.224 ミリモル) を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert-ブチルアミン(73 mg，O.255 ミリモル)を加え、反応液を18時間攪拌する。反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加える。水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。次に、合わせた有機相を水(2×5 ml)、1N HCl

    (aq.) (5 ml)、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(M gSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。図33に示される化合物1057G の合成．ベンジリデン環の還元的開裂を1.0THF溶液中 1.1当量の DIBALを用いて０℃で１時間行う。反応混合液を酢酸エチル（20 ml）で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加える。水相を酢酸エチル(3×1 0 ml)で抽出する。次に、合わせた有機相を水（2 ×5 ml）、1N HCl

    (aq.) （5ml ）、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を得る。図33に示される化合物 1057Hの合成． Cbz 基の脱保護は、上記化合物 1055C、 図31についての手順に記載される0.10当量の水酸化パラジウム／炭素を用いて選択的に（ベンジル基の存在下に）達成される。図33に示される化合物1057の合成．図33に示されるように、CB-Phe(α-OH)11（70 mg，O.213 ミリモル）を乾燥 D MF(3 ml)に溶解する。 HOBT，1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(31 mg，0. 22ミリモル）、EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド(43 mg，0.224 ミリモル）、DIEA，ジイソプロピルエチルアミン（122μl ，0.703 ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。第二アミン1057H （73 mg，0.255ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌する。反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)に加える。水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。次に、合わせた有機相を水（2 ×5 ml）、1N HCl

    (a

    q.) （5 ml）、重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水(5 ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1 酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得、これを次のように第二アルコールの酸化の次の工程に直接続ける。第二アルコール(21 mg，0.044 ミリモル)を乾燥 CH

    2 Cl

    2 (2ml)に溶解し、デス・マルチンペリオジナン（26 mg，0.088ミリモル）を加える。反応混合液を周囲温度で24時間攪拌してから酢酸エチル(10 ml)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム

    (aq.) (5 ml)及びチオ硫酸ナトリウムを加えることにより急冷する。水層を酢酸エチル(3×20 ml)で抽出する。合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。ヘキサン中 30%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して各生成物1057を 3:1のジアステレオマー混合物(無色の油状物)(20 mg，95%)として無色の油状物として得る。図34に示されるＮ−（ベンジルオキシカルボンニル）−３,４−ジデヒドロ−Ｌ −プロリンエチルエステル化合物 1058Cの合成． J． Org． Chem． 1994，59，5192 からの方法によって合成した。図34に示されるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−(3R,4S)−ジヒドロキシ− Ｌ−プロリンエチルエステル化合物 1058Dの合成． t-ブタノール／H

    2 O(10 ml: 10 ml)中基質(600 mg，2.18 ミリモル）の溶液にAD- mix-b(3.0g)及びメタンスルホンアミド(290 mg，3.05 ミリモル，1.4 eq.)を加え、反応液を４℃で48時間攪拌した。水相を酢酸エチル(3×20ml)で抽出する。合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、 減圧下で濃縮して粗生成物を得る。ヘキサン中 30%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して各生成物 1058Dを無色の油状物として得る。図34に示されるＮ−（ベンジルオキシカルボニル）−(3R,4S)−ジヒドロアセタール−Ｌ−プロリンエチルエステル化合物 1058Eの合成． cis 及びtrans−ジヒドロキシ−Ｌ−プロリンエチルエステルの粗混合物にアセトン(10 ml)、pTsA （へら一杯の）及びCuSO

    4 （へら一杯の)を加え、混合液を還流し、24時間攪拌して対応するアセトニドを得る。水相を酢酸エチル(3×20 ml)で抽出する。合わせた有機抽出液を水(10 ml)、食塩水(10 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )し、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。ヘキサン中 30%酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して各生成物 1058Eを無色の油状物として得る。図34に示される(3R,4S)−ジヒドロアセタール−Ｌ−プロリンtert−ブチルアミド化合物 1058Fの合成図34に示されるように、基質 1058E（70 mg，0.213ミリモル）を乾燥塩化メチレン(3 ml)に溶解する。 EDC，1−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（43 mg，0.224ミリモル）を加え、混合液を室温で30分間攪拌する。 tert-ブチルアミン(73 mg，0.255 ミリモル）を加え、反応液を18時間攪拌する。反応混合液を酢酸エチル(20 ml)で希釈し、飽和塩化アンモニウム(30 ml)へ加える。水相を酢酸エチル(3×10 ml)で抽出する。次に、合わせた有機相を水(2 ×5 ml）、1N HCl

    (aq.) (5 ml)重炭酸ナトリウム飽和溶液

    (aq.) （50 ml）、水（ 5ml)、食塩水(5 ml)で洗浄し、乾燥(MgSO

    4 )した後、減圧下で濃縮して粗生成物を得る。 1:1酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望のカップリング生成物を得る。工程 2）生成物をMeOH(0.10 M)に溶解し、触媒量の 10

    %パラジウム／炭素を加えた。反応が完結したことを TLCが示すまで水素バルーン下で激しく攪拌した。ろ過及び濃縮して純粋な生成物 1058Fを得た。図34に示される化合物1058の合成ピロリジン誘導体1058F(20 mg，0.091ミリモル)に乾燥メタノール(2 ml)、Cbz- フェニルアラニルエポキシド21(27 mg，0.091 ミリモル，1.0 eq.)及びトリエチルアミン(14μl，0.100ミリモル，1.1eq.)を加えた。この溶液を32時間還流してから減圧下で濃縮した。酢酸エチルで溶離するフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を透明な油状物として得、各々ヒドロキシルエチルアミン誘導体1058を得る。 ＨＩＶプロテアーゼの調製、アッセイ及び阻害分析 racプロモーターの制御下 lacZ-プロテアーゼ融合築物(lacオペレーターに融合したE.コリリボソームRNAプロモーターから構成される)を含むプラスミドpLAC -PRO 6.5を調製し、E.コリ JM103に形質転換した。 lacZ-pro合成を誘導するために、pLAC-PRO 6.5(PRO 6-5)の隠れている JM103の一夜培養を300 g/mlアンピシリンを含むLBブイヨンで50倍に希釈した。細胞を37℃で1時間 A

    600 = 0.2-0.3 まで増殖してからラクトース（最終濃度0.4%）を加えて lacZ-プロテアーゼ融合タンパク質の合成を誘導した。一晩増殖した後、ソルバル GSAローター中6,000 rpmで７分間遠心分離することにより細胞を回収した。 250 ml培養物からの細胞ペーストを200 g/mlリゾチームを含む 10 mlの溶菌バッファー(50 mMトリス，2 mM EDTA，2 mM DTT，100 mM NaCl，pH 7.5)に懸濁し、４℃で一晩放置した。引き続き、細胞浮遊液を食塩氷浴上で各々振動器(Branson 450)の最大出力の10-15 パルスで10回音波処理した。音波処理中細胞浮遊液の温度を10℃よりも低く保持ことを注意した。次に、音波処理物を GSAローター中6k rpmで10分間遠心分離した。 lacZ-pro融合タンパク質の大部分が沈降物中に見られた。不溶性lacZ-pro タンパク質を8M尿素及び 50 mMジチオトレイトール(DTT)又は 1% 2-メルカプトエタノールを含む水溶液中 0.2〜0.4 mg/ml 濃度で可溶化しほぐした。 lacZ-proタンパク質を再生するために、タンパク質浮遊液をpH 6.0の12容量の10 mMトリスで希釈し、室温で一晩インキュベートした（最終タンパク質濃度15〜30 g/ml）。これらの条件下、lacZ-proタンパク質が自己タンパク質分解を受けて成熟10 kDaプロテアーゼを得た。再生した lacZ-プロテアーゼ融合タンパク質混合物を上記のように調製し、凍結乾燥器で一晩凍結乾燥し、H

    2 Oに再懸濁し、pH 8.0の 10 mMトリスバッファーに対して一晩透析して尿素を除去した。これらの条件下、成熟ＨＩＶプロテアーゼは不溶性沈殿となり、2,000 ×g で20分間低速遠心分離することにより容易に精製される。沈殿したプロテアーゼを8M尿素、10 mM トリス、pH 8.0、1 mM DTT に再溶解し、同一バッファー中 DEAE-セファセルカラム又はファーマシアモノQ カラムを通過させた。フロースルー画分を集め、10 mM トリス、pH 8.0、1 mM D TTに対して透析し、凍結乾燥によって濃縮した。 SDSゲル電気泳動及びイムノブロット分析及びアミノ酸分析の双方からプロテアーゼの均一性が示された。本方法は、通常、E.コリ細胞１ｇに対して２〜３mgの成熟プロテアーゼを与える。カルバイオケム（サンディエゴ）から市販されているチオエステル結合を含む合成ＨＩＶプロテアーゼも用いられる。文献に記載されている方法に従って蛍光発生基質Ac-Thr-Ile-Nle-Phe(P-NO

    2 )-Gln-Arg-NH

    2 (CalBiochem製，サンディエゴ)を用いて酵素活性を分析した。阻害分析を阻害剤の存在下に行い、IC

    50 （酵素活性の 50%阻害を生じる阻害剤の濃度）で示した。

    ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｄ 207/08 Ｃ０７Ｄ 207/08 207/16 207/16 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 スリー デボラ エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ヴィラ ラ ジョラ 8829―ジー(72)発明者 ラスロ カレン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92122 サンディエゴ ＃190 アヴェニダ ナヴィダッド 7870

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