| 说明书全文 |
발현 및 분비 시스템 {EXPRESSION AND SECRETION SYSTEM}
관련 출원에 대한 상호 참조 본원은 2012년 7월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 61/668397, 2013년 3월 15일에 출원된 61/852483, 및 2013년 5월 3일에 출원된 61/819063을 우선권 주장하며, 이들은 모두 그의 전체내용이 본원에 참조로 포함된다. 발명의 분야 본 발명은 핵산이 파지 디스플레이를 위해 원핵 세포로 형질전환된 경우에 하나의 Fab 융합 단백질의 발현 및 분비 및 핵산이 발현 및 정제를 위해 진핵 세포로 형질감염된 경우에 특징적인 또는 동일한 Fab 융합 단백질의 발현 및 분비를 위한 발현 및 분비 시스템, 및 그의 사용을 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 핵산 분자, 벡터, 및 이러한 벡터 및 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다.
필라멘트형 파지 입자 상의 펩티드 또는 단백질의 파지 디스플레이는 변이체 펩티드 또는 단백질의 큰 풀로부터 바람직한 특성을 갖는 펩티드 또는 단백질의 선택을 허용하는 시험관내 기술이다 (문헌 [McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Sidhu et al., Current Opinion in Biotechnology, 11: 610-616 (2000); Smith et al., Science, 228: 1315-1317 (1985)]). 파지 디스플레이는 필라멘트형 파지 입자의 표면 상에서 펩티드 또는 단백질 (항체 단편, 예컨대 항체 발견 분야의 Fab 포함)의 다양한 라이브러리를 디스플레이하는데 사용될 수 있으며, 이들 라이브러리는 이어서 특정한 관심 항원에 대한 결합에 대해 선택된다. 항체 단편은 파지 코트 단백질의 유전자에 항체 단편에 대한 유전자를 융합시킴으로써 필라멘트형 파지 입자의 표면 상에 디스플레이될 수 있으며, 이로부터 코딩된 항체 단편을 그의 표면 상에 디스플레이하는 파지 입자가 생성된다. 이러한 기술은 큰 파지 라이브러리로부터 다수의 항원에 대해 바람직한 친화도를 갖는 항체 단편의 단리를 허용한다. 파지-기반 항체 발견에서, 기능적 검정 (예컨대, 표적 결합, 세포-기반 활성 검정, 생체내 반감기 등)에서 선택된 항체 단편 및 그의 동족 IgG의 특성의 평가는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 코딩하는 DNA 서열을 파지 디스플레이에 사용되는 벡터 외부로 및 IgG 발현을 위한 포유동물 발현 벡터 내부로 서브클로닝함으로써 Fab HC 및 LC 서열을 전장 IgG로 재포맷시키는 것을 필요로 한다. 수십개 또는 수백개의 선택된 HC/LC 쌍을 서브클로닝하는 고된 과정은 파지-기반 항체 발견 과정에서의 주요 애로요인으로 나타난다. 또한, 선택된 Fab 중 상당한 비율이 일단 재포맷되면 초기 스크리닝 검정에서 만족스럽게 작동하는데 실패하기 때문에, 이러한 재포맷/스크리닝 과정을 통해 옮겨지는 클론의 수를 증가시키는 것은 궁극적인 성공 확률을 크게 증가시킨다. 본원에서, 본 발명자들은 이. 콜라이( E. coli )로 형질감염된 경우에는 Fab-파지 융합체의 발현을 구동하고, 포유동물 세포로 형질감염된 경우에는 동일한 Fab 단편을 보유하는 전장 IgG의 발현을 구동하기 위한 발현 및 분비 시스템의 생성을 기재한다. 본 발명자들은 뮤린 결합 이뮤노글로불린 단백질 (mBiP)로부터의 포유동물 신호 서열 (문헌 [Haas et al., Immunoglobulin heavy chain binding protein, Nature, 306: 387-389 (1983); Munro et al., An Hsp70-like protein in the ER: identify with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein, Cell, 4:291-300 (1986)])이 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 효율적인 단백질 발현을 구동할 수 있다는 것을 입증한다. 인간 IgG 1 HC의 힌지 영역 내에 삽입된 파지 융합 펩티드를 함유하는 합성 인트론을 제거하기 위해 포유동물 mRNA 스플라이싱을 이용하여, 본 발명자들은 숙주 세포-의존성 방식으로 2가지 특징적인 단백질: 이. 콜라이에서 파지 디스플레이를 위해 어댑터 펩티드에 융합된 Fab 단편 및 포유동물 세포에서 천연 인간 IgG 1 을 생성할 수 있다. 이러한 기술은 서브클로닝을 필요로 하지 않으면서, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 관심 항원에 결합하는 Fab 단편의 선택 및 포유동물 세포에서 동족 전장 IgG의 후속 발현 및 정제를 허용한다.
한 측면에서, 본 발명은 부분적으로 (1) 비-원핵 기원의 신호 서열이 원핵 세포에서 기능하고, (2) mRNA 프로세싱이 진핵 세포에서 일어나지만, 원핵 세포에서는 일어나지 않는 경우에 상이한 Fab-융합 단백질 (원핵 세포에서 Fab-파지 융합 단백질 및 진핵 세포에서 Fab-Fc 융합 단백질)이 동일한 핵산 분자로부터 숙주-세포 의존성 방식으로 발현된다는 것을 입증하는 실험적 발견에 기초한다. 따라서, 서브클로닝을 필요로 하지 않으면서, 핵산이 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이)로 형질전환된 경우에 박테리아에서 파지 디스플레이를 위해 파지 입자 단백질, 코트 단백질 또는 어댑터 단백질에 융합된 Fab 단편의 발현 및 분비 및 핵산이 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)로 형질전환된 경우에 Fc에 융합된 Fab 단편의 발현 및 분비를 위한 핵산 분자, 및 사용 방법이 본원에 기재된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 가변 중쇄 도메인 (VH)의 VH-HVR1, VH-HVR2 및 HVR3을 포함하는 제1 폴리펩티드 및/또는 가변 경쇄 도메인의 VL-HVR1, VL-HVR2 및 VL-HVR3을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하고, 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 기능하고 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 서열에 의해 코딩되는 신호 서열을 추가로 코딩하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 전장 항체는 핵산 분자의 제1 및/또는 제2 폴리펩티드로부터 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 가변 경쇄 (VL) 도메인을 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, VH 도메인은 CH1에 연결되고, VL 도메인은 CL에 연결된다. 한 측면에서, 본 발명은 가변 중쇄 도메인 (VH)의 VH-HVR1, VH-HVR2 및 VH-HVR3 및 가변 경쇄 도메인 (VL)의 VL-HVR1, VL-HVR2 및 VL-HVR3을 코딩하고, 원핵 및 진핵 세포에서 VH의 HVR 및 VL의 HVR의 발현을 허용하도록 VH의 HVR 및/또는 VL의 HVR에 작동가능하게 연결된 원핵 프로모터 및 진핵 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 VH 및/또는 VL의 HVR은 진핵 세포에 의해 발현되는 경우에 유용 펩티드에 연결되고, 핵산은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 기능하는 신호 서열을 추가로 코딩한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 가변 경쇄 (VL) 도메인을 코딩하고, 원핵 및 진핵 세포에서 VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 발현을 허용하도록 VH 도메인 및/또는 VL 도메인에 작동가능하게 연결된 원핵 프로모터 및 진핵 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 VH 도메인 및/또는 VL은 진핵 세포에 의해 발현되는 경우에 유용 펩티드에 연결되고, 핵산은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 기능하는 신호 서열을 추가로 코딩한다. 한 실시양태에서, VL 및 VH는 유용 펩티드에 연결된다. 추가 실시양태에서, VH는 CH1에 추가로 연결되고, VL은 CL에 연결된다. 유용 펩티드는 Fc, 태그, 표지 및 대조 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, VL은 대조 단백질에 연결되고, VH는 Fc에 연결된다. 예를 들어, 대조 단백질은 gD 단백질, 또는 그의 단편이다. 다른 추가 실시양태에서, 본 발명의 제1 및/또는 제2 폴리펩티드는 코트 단백질 (예를 들어, 박테리오파지 M13, f1 또는 fd의 pI, pII, pIII, pIV, pV, pVI, pVII, pVIII, pIX 및 pX, 또는 그의 단편, 예컨대 pIII 단백질의 아미노산 267-421 또는 262-418 (달리 명시되지 않는 한, "pI", "pII", "pIII", "pIV", "pV", "pVI", "pVII", "pVIII", "pIX" 및 "pX"는 본원에 사용된 경우에 전장 단백질 또는 그의 단편을 지칭함)) 또는 어댑터 단백질 (예를 들어, 류신 지퍼 단백질, 또는 서열 12 (cJUN(R): ASIARL E E K V KTL K A Q NYEL A S T ANMLRE Q VAQLGGC) 또는 서열 13 (FosW(E): AS I DEL Q AE V EQLEE R NYAL R KE V EDL Q K Q A EKLGGC)의 아미노산 서열 또는 그의 변이체 (변형될 수 있는 서열 12 및 서열 13 내의 아미노산은 밑줄표시 및 볼드체를 포함하나 이에 제한되지는 않음)를 포함하는 폴리펩티드 (여기서, 변이체는 아미노산 변형을 갖� �, 변형은 어댑터 단백질의 또 다른 어댑터 단백질에 대한 친화도를 유지하거나 또는 증가시킴), 또는 서열 6 (ASIARLRERVKTLRARNYELRSRANMLRERVAQLGGC) 또는 서열 7 (ASLDELEAEIEQLEEENYALEKEIEDLEKELEKLGGC)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드) 또는 서열 8 (GABA-R1: EEKSRLLEKE NRELEKIIAE KEERVSELRH QLQSVGGC) 또는 서열 9 (GABA-R2: TSRLEGLQSE NHRLRMKITE LDKDLEEVTM QLQDVGGC) 또는 서열 14 (Cys: AGSC) 또는 서열 15 (힌지: CPPCPG)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 융합된다. 코트 단백질 또는 어댑터 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 합성 인트론 내에 포함된다. 합성 인트론은 VH 도메인을 코딩하는 핵산 및 Fc를 코딩하는 핵산 사이에 위치한다. 합성 인트론은 IgG1로부터의 자연 발생 인트론을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 자연 발생 인트론은 IgG1로부터의 인트론 1, 인트론 2 또는 인트론 3을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 원핵 세포에서 제1 융합 단백질이 발현되고, 진핵 세포에서 제2 융합 단백질이 발현되는 핵산 분자를 제공한다. 제1 융합 단백질 및 제2 융합 단백질은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 추가 실시양태에서, 제1 융합 단백질은 Fab-파지 융합 단백질일 수 있고 (예를 들어, Fab-파지 융합 단백질은 pIII에 융합된 VH/CH1을 포함함) 및 제2 융합체는 Fab-Fc 또는 Fab-힌지-Fc 융합 단백질일 수 있다 (예를 들어, Fab-Fc 또는 Fab-힌지-Fc 융합 단백질은 Fc에 융합된 VH/CH1을 포함함). 한 실시양태에서, 본 발명은 신호 서열이 진핵 세포에서 세포질 세망 또는 세포 외부로의 단백질 분비를 지시하고/거나 신호 서열이 원핵 세포에서 주변세포질 또는 세포 외부로의 단백질 분비를 지시하는 핵산 분자를 제공한다. 또한, 신호 서열은 서열 10 (XMKFTVVAAALLLLGAVRA, 여기서 X = 0개 아미노산 또는 1 또는 2개 아미노산 (예를 들어, X = M (서열 3; MMKFTVVAAALLLLGAVRA; 아생형 mBIP) 또는 X = MT (서열 19; MTMKFTVVAAALLLLGAVRA) 또는 X는 부재함 (서열 20; MKFTVVAAALLLLGAVRA))의 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 또는 mBIP를 코딩하는 핵산 서열 (서열 4; ATG ATG AAA TTT ACC GTG GTG GCG GCG GCG CTG CTG CTG CTG GGC GCG GTC CGC GCG), 및 그의 변이체, 또는 서열 3 (mBIP 아미노산 서열)으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (여기서, 신호 서열은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 기능함), 또는 서열 11의 핵산 서열 (컨센서스 mBIP 서열, X ATG AAN TTN ACN GTN GTN GCN GCN GCN CTN CTN CTN CTN GGN GCN GTN CGN GCN, 여기서 N = A, T, C 또는 G, 여기서 X = ATG (서열 5; ATG ATG AAN TTN ACN GTN GTN GCN GCN GCN CTN CTN CTN CTN GGN GCN GTN CGN GCN), X = ATG ACC (서열 21; ATG ACC ATG AAN TTN ACN GTN GTN GCN GCN GCN CTN CTN CTN CTN GGN GCN GTN CGN GCN) 또는 X = 부재함 (서열 22; ATG AAN TTN ACN GTN GTN GCN GCN GCN CTN CTN CTN CTN GGN GCN GTN CGN GCN), 또는 서열 16 (mBIP.Opt1: ATG ATG AAA TTT ACC GTT GTT GCT GCT GCT CTG CTA CTT CTT GGA GCG GTC CGC GCA), 서열 17 (mBIP.Opt2: ATG ATG AAA TTT ACT GTT GTT GCG GCT GCT CTT CTC CTT CTT GGA GCG GTC CGC GCA) 및 서열 18 (mBIP.Opt3: ATG ATG AAA TTT ACT GTT GTC GCT GCT GCT CTT CTA CTT CTT GGA GCG GTC CGC GCA)의 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 추가 실시양태에서, 핵산 분자의 합성 인트론은 그의 5' 말단에서 CH1을 코딩하는 핵산 및 그의 3' 말단에서 Fc를 코딩하는 핵산에 의해 플랭킹된다. 또한, CH1 도메인을 코딩하는 핵산은 천연 스플라이스 공여자 서열의 일부를 포함하고, Fc를 코딩하는 핵산은 천연 스플라이스 수용자 서열의 일부를 포함한다. 대안적으로, CH1 도메인을 코딩하는 핵산은 변형된 스플라이스 공여자 서열의 일부를 포함하며, 여기서 변형된 스플라이스 공여자 서열은 하나 이상의 핵산 잔기의 변형을 포함하고, 변형은 스플라이싱을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 원핵 프로모터는 phoA, Tac, Tphac 또는 Lac 프로모터이고/거나 진핵 프로모터는 CMV 또는 SV40 또는 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 U3 영역 또는 염소 관절염-뇌염 바이러스 U3 영역 또는 비스나 바이러스 U3 영역 또는 레트로바이러스 U3 영역 서열이다. 원핵 프로모터에 의한 발현은 박테리아 세포에서 일어나고, 진핵 프로모터에 의한 발현은 포유동물 세포에서 일어난다. 추가 실시양태에서, 박테리아 세포는 이. 콜라이 세포이고, 진핵 세포는 효모 세포, CHO 세포, 293 세포 또는 NSO 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터 및/또는 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 박테리아 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 세포) 또는 진핵 세포 (예를 들어, 효모 세포, CHO 세포, 293 세포 또는 NSO 세포)일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 핵산이 발현되도록 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 숙주 세포에 의해 발현된 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 항체는 숙주 세포 배양 배지로부터 회수된다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 8, 9, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열의 하나 이상의 잔기의 변형의 포함하는 어댑터 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 아미노산 서열은 서열 6 (ASIARLRERVKTLRARNYELRSRANMLRERVAQLGGC) 또는 서열 7 (ASLDELEAEIEQLEEENYALEKEIEDLEKELEKLGGC)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 이러한 어댑터 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 3의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 mBIP 폴리펩티드, 또는 서열 3의 아미노산 서열과 85%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하며 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 기능하는 핵산 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 3의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 mBIP 폴리펩티드를 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 발현시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 3의 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 mBIP 서열을 발현하는 박테리아 세포를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 합성 인트론이 항체의 VH 도메인을 코딩하는 핵산 및 Fc 또는 힌지를 코딩하는 핵산 사이, 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 코딩하는 핵산 사이, 항체의 힌지 영역 및 CH2 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 위치한 것을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명은 서열 3의 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 신호 서열, 가변 중쇄 도메인 (VH) 및 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하는 폴리펩티드 (여기서, VH 도메인은 VL 도메인의 N-말단에 연결됨), 또는 서열 3의 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 신호 서열, 가변 중쇄 도메인 (VH) 및 가변 경쇄 도메인 (VL)을 포함하는 폴리펩티드 (여기서, VH 도메인은 VL 도메인의 C-말단에 연결됨), 또는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열 및 가변 중쇄 도메인 (VH)의 VH-HVR1, VH-HVR2 및 VH-HVR3을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열 및 가변 경쇄 도메인 (VL)의 VL-HVR1, VL-HVR2 및 VL-HVR3을 포함하는 폴리펩티드, 또는 서열 3의 아미노산 서열, 또는 그의 변이체를 포함하는 신호 서열, 가변 중쇄 도메인 (VH)의 VH-HVR1, VH-HVR2 및 VH-HVR3 및 가변 경쇄 도메인 (VL)의 VL-HVR1, VL-HVR2 및 VL-HVR3을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 또는 항체 단편이다. 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 및 단일-쇄 항체 분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 측면에서, 본 발명은 단백질의 파지 디스플레이를 증진시키기 위한 돌연변이체 헬퍼 파지를 포함한다. 한 실시양태에서, 헬퍼 파지의 뉴클레오티드 서열은 pIII에 앰버 돌연변이를 포함하며, 여기서 앰버 돌연변이를 포함하는 헬퍼 파지는 파지 상에서 pIII에 융합된 단백질의 디스플레이를 증진시킨다. 추가 실시양태에서, 제70항의 뉴클레오티드 서열에서 앰버 돌연변이는 M13KO7에 대한 핵산의 뉴클레오티드 2613, 2614 및 2616에서의 돌연변이이다. 다른 추가 실시양태에서, 제71항의 뉴클레오티드 서열에서 M13KO7에 대한 핵산의 뉴클레오티드 2613, 2614 및 2616에서의 돌연변이는 앰버 정지 코돈을 도입한다.
도 1. (a) 4가지 상이한 진핵 신호 서열 (mBiP, 가우시아 프린세프스(Gaussia princeps), yBGL2, hGH)의 제어 하에 항-Her2 Fab를 디스플레이하는 정제된 파지의 Her2 파지 ELISA. 파지미드에서 통상적으로 사용되는 열-안정성 장독소 II (STII) 원핵 신호 서열은 벤치마크로서 역할을 한다. (b) 아생형 진핵 mBiP 신호 서열에 융합된 항-Her2 Fab (mBiP.wt) 및 파지 라이브러리 패닝에 의해 수득한 코돈 최적화 버전 (mBiP.Opt1, mBiP.Opt2 및 mBip.Opt3 (서열 16-18))의 파지 디스플레이.
도 2. (a) 개별 클론의 30 mL 293 세포 현탁 배양물로부터의 발현 산출량 및 (b) 진핵 mBiP 또는 원핵 천연 IgG HC (VHS) 신호 서열에 대한 융합체로서 발현된 hIgG1 클론에 대한 응집체 통계.
도 3. (a) 3개의 천연 인트론을 함유하는 인간 IgG1 HC의 게놈 구조. 인트론1은 힌지 영역 바로 앞에서 발생한다. (b) 인트론1 또는 3으로부터 유래된 합성 인트론을 함유하고 파지 어댑터 융합 펩티드를 함유하는 HC 구축물. 합성 인트론은 인트론1 또는 3으로부터 천연 인트론 스플라이스 공여자 (D) 및 수용자 (A)에 의해 플랭킹된다. (c) 인트론1 또는 3으로부터 유래된 합성 인트론을 함유하고 파지 코트 융합 단백질을 함유하는 HC 구축물. 합성 인트론은 인트론1 또는 3으로부터 천연 인트론 스플라이스 공여자 (D) 및 수용자 (A)에 의해 플랭킹된다. 구축물 (b) 및 (c)는 둘 다 어댑터 펩티드 또는 파지 코트 단백질 서열의 3' 말단에 정지 코돈을 함유한다.
도 4. (a) 인트론을 함유하지 않거나, 파지 어댑터 펩티드를 함유하는 합성 인트론을 함유하거나 (도 3b 참조), 또는 파지 코트 단백질을 함유하는 합성 인트론을 함유하는 (유전자-III, 도 3c 참조) 구축물로부터의 h4D5 IgG의 발현 수준. (b) 형질감염된 세포로부터의 hIgG1 HC의 RT-PCR. 적절하게-스플라이싱된 HC mRNA에 대해 예측된 크기는 1,650 nt이다. 어댑터 + 인트론1 구축물에서 상부 밴드는 스플라이싱되지 않은 전구체 mRNA를 나타낸다. 어댑터- 및 유전자-III-함유 구축물에서 하부 밴드는 VH에서 잠재 스플라이스 공여자에 의해 부정확하게 스플라이싱된다.
도 5. (a) 포유동물 mRNA에서 컨센서스 스플라이스 공여자에 대한 정합을 증가시키기 위해 천연 인트론1 스플라이스 공여자에서 생성된 점 돌연변이. (b) 인트론 스플라이스 공여자의 최적화는 스플라이싱되지 않은 및 부정확하게 스플라이싱된 HC mRNA의 축적을 제거하고, (c) 포유동물 세포에서의 발현을 인트론이 존재하지 않은 경우에 관찰된 수준까지 증가시킨다.
도 6. (a) pDV.5.0 및 아생형 KO7 (1가 디스플레이) 또는 어댑터 KO7 (다가 디스플레이)을 사용하는 디스플레이의 조절. (b) 3가지 상이한 포유동물 세포주에서의 pDV.5.0으로부터의 4가지 상이한 mAb의 발현.
도 7. 원핵 및 진핵 세포에서의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 위한 벡터의 개략도. 합성 인트론은 어댑터 서열, 또는 파지 코트 단백질 서열을 hIgG1로부터의 임의의 자연-발생 인트론 서열과 함께 함유할 수 있다. HC 및 LC는 둘 다 1) ORF의 상류에 포유동물 및 박테리아 프로모터, 2) ORF의 상류에 단독 박테리아 프로모터 (또한, 도 14 참조), 또는 3) ORF의 상류에 단독 포유동물 프로모터를 가질 수 있다. HC 및 LC가 둘 다 양쪽 프로모터 유형을 갖는 구축물이 제시된다. 유전자-III를 어댑터 펩티드 융합체와 함께 함유하는 카세트 (pDV5.0, 제시됨)는 오직 합성 인트론이 어댑터 펩티드 융합체를 함유하는 경우에 존재하지만, 파지 코트 단백질 융합체가 합성 인트론에 존재하는 경우에는 그렇지 않다.
도 8. M13 파지 상에서 pIII에 융합된 단백질의 디스플레이를 증진시키기 위한 돌연변이체 헬퍼 파지 앰버 KO7의 pIII의 뉴클레오티드 서열 (뉴클레오티드 1579 내지 2853 (서열 24)). 앰버 KO7은 부위 지정 돌연변이유발에 의해 M13KO7 헬퍼 파지 게놈에 도입된 앰버 코돈을 갖는다. 밑줄표시된 잔기는 M13KO7 유전자 III의 코돈 346에 앰버 정지 (TAG) 및 코돈 345에 AvrII 제한 부위에 대한 무음 돌연변이를 도입하는 뉴클레오티드 2613, 2614 및 2616의 돌연변이 (T2613C, C2614T 및 A2616G)이다. M13KO7의 뉴클레오티드 1은 특유한 HpaI 제한 부위의 세번째 잔기이다.
도 9. 앰버 KO7 헬퍼 파지의 사용에 의한 M13 파지의 pIII 상의 Fab 단편의 증진된 디스플레이. 아생형 M13KO7 및 종래의 고-디스플레이 파지미드 (개방 다이아몬드형)는 아생형 M13KO7이 파지 생산에 사용된 경우에 저-디스플레이 파지미드 벡터에 의해 달성된 것 (폐쇄된 사각형)보다 유의하게 높은 Fab 디스플레이의 수준을 유도한다. pIII에 앰버 돌연변이를 보유하는 변형된 M13KO7 (앰버 KO7)의 사용은 저-디스플레이 파지미드의 디스플레이 수준 (폐쇄된 삼각형)을 아생형 M13KO7 및 고-디스플레이 파지미드의 수준 (개방 다이아몬드형)으로 증가시킨다.
도 10은 고정된 VEGF에 대한 실시예 5의 나이브 이중 벡터 Fab-파지 라이브러리의 파지 라이브러리 분류로부터 선택된 클론의 결합 (파지 ELISA에 의해 측정된 바와 같음)을 보여주는 막대 그래프이다. 개별 클론을 4 라운드의 선택 후에 피킹하고, 파지 상청액을 고정된 항원 (VEGF) 및 비관련 단백질 (Her2)에 대한 결합에 대해 시험하여 결합 특이성을 평가하였다.
도 11은 비아코어(BIAcore) T100 기기 상에서 Fc-포획 검정에 의해 측정시에 VEGF에 대한 항원 결합에 대해 비아코어에 의해 IgG 포맷에서 선택된 파지 클론을 스크리닝하는 것을 보여준다. 서열 분석 및 파지 ELISA에서 피킹한 96개의 클론을 293S 세포 (1 mL)로 형질감염시키고, IgG 발현을 위해 7일 동안 배양하였다. 상청액을 0.2 μm 여과하고, 이를 사용하여 비아코어 T100 기기 상에서 Fc-포획 검정에 의해 VEGF 항원 결합을 평가하였다.
도 12는 실시예 5의 VEGF 패닝 실험으로부터 양성 결합제의 서열을 보여준다. 8개의 클론에 대한 중쇄 CDR 서열 (VEGF50 (나타나는 순서대로 각각 서열 25-27), VEGF51 (나타나는 순서대로 각각 서열 28-30), VEGF 52 (나타나는 순서대로 각각 서열 31-33), VEGF59 (나타나는 순서대로 각각 서열 34-36), VEGF55 (나타나는 순서대로 각각 서열 37-39), VEGF60 (나타나는 순서대로 각각 서열 40-42), VEGF61 (나타나는 순서대로 각각 서열 43-45) 및 VEGF64 (나타나는 순서대로 각각 서열 46-48))이 제시된다. 모든 클론은 동일한 경쇄 CDR 서열을 공유한다.
도 13은 VEGF에 대한 파지 분류로부터 선택된 항-VEGF IgG가 VEGF의 그의 천연 수용체 중 하나인 VEGF-R1에 대한 결합을 억제하는 능력을 보여준다. VEGF에 대한 분류로부터 선택된 항체를 CHO 세포에서 발현시키고, 정제된 IgG를 사용하여 선택된 클론이 VEGF-R1에 대한 VEGF의 결합을 억제하는 능력을 측정하였다. 하나의 클론 (VEGF55)은 VEGF-R1 결합을 베바시주맙 (아바스틴(Avastin))의 3.5배 내의 IC50으로 억제하였다.
도 14는 원핵 및 진핵 세포에서의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 위한 벡터의 개략도를 보여주며, 여기서 합성 인트론은 pIII를 hIgG1로부터의 임의의 자연-발생 인트론 서열과 함께 함유하고, LC는 ORF의 상류에 박테리아 프로모터를 갖고, HC는 ORF의 상류에 포유동물 및 박테리아 프로모터를 둘 다 갖는다. 도 7에 나타낸 벡터와 달리, 이러한 벡터 (pDV6.5)는 파지 입자에 대한 융합을 위해 추가의 gIII 카세트를 필요로 하지 않는다. 이. 콜라이 및 포유동물 세포에서의 발현으로부터 생성된 단백질은 벡터 개략도 아래 나타낸다. 파선은 포유동물 세포에서 스플라이싱된 중쇄 전사체의 인트론을 나타낸다. IgG1 힌지를 코딩하는 서열의 부분이 이. 콜라이 및 포유동물 세포 발현된 단백질 둘 다에서의 봉입을 허용하도록 벡터에서 반복된다는 것에 주목한다.
도 15는 pDV6.5로부터 발현된 전장 항-VEGF IgG의 특성을 보여준다. IgG는 100 mL 형질감염된 CHO 세포 배양물에서 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 IgG의 최종 산출량은 비-특이적 결합을 측정하는데 이용된 바큘로바이러스 ELISA에서의 스코어와 함께 나타낸다. 파지 포맷 (파지 ELISA) 또는 IgG 포맷 (비아코어)에서의 각 클론의 양성 또는 음성 결합을 또한 나타낸다.
I. 정의 본원에서 용어 "합성 인트론"은 CH1을 코딩하는 핵산 및 힌지-Fc 또는 Fc를 코딩하는 핵산 사이에 위치한 핵산 절편을 규정하는데 사용된다. "합성 인트론"은 단백질 합성을 코딩하지 않는 임의의 핵산, 단백질 합성, 파지 입자 단백질 또는 코트 단백질 (예를 들어, pI, pII, pIII, pIV, pV, pVI, pVII, pVIII, pIX, pX), 또는 어댑터 단백질 (예를 들어, 류신-지퍼 등)을 코딩하는 임의의 핵산, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 한 실시양태에서, "합성 인트론"은 스플라이스 사건을 허용하는 스플라이스 공여자 서열 및 스플라이스 수용자 서열의 부분을 포함한다. 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자 서열은 스플라이스 사건을 허용하고, 천연 또는 합성 핵산 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 용어 "유용 폴리펩티드"는 다수의 활성에 유용한, 예컨대 단백질 정제, 단백질 태그부착, 단백질 표지 (예를 들어, 검출가능한 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지 또는 효소적 표지)로의 표지)에 유용한 폴리펩티드를 지칭한다. 표지는 아미노산 측쇄, 활성화된 아미노산 측쇄, 시스테인 조작된 항체 등에 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체를 비오틴과 접합시키고, 상기 언급한 표지의 3가지 광범위한 카테고리 중 임의의 표지를 아비딘 또는 스트렙타비딘과 접합시킬 수도 있고, 또는 그 반대로 접합시킬 수도 있다. 비오틴은 스트렙타비딘에 선택적으로 결합하기 때문에, 표지가 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안적으로, 표지를 폴리펩티드 변이체와 간접적으로 접합시키기 위해서, 폴리펩티드 변이체는 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합시키고 상기 언급한 여러 유형의 표지 중 하나를 항-합텐 폴리펩티드 변이체 (예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 이에 따라, 표지를 폴리펩티드 변이체와 간접적으로 접합시킬 수 있다 (문헌 [Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego]). 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더의 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA가 상기 폴리펩티드의 분비에 수반되는 전구단백질로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이며; 또는 리보솜 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 용이하게 하도록 배치될 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 그들이 핵산으로서 또는 그에 의해 발현된 단백질로서 서로 기능적 관계를 갖는 방식으로 핵산 분자에 존재한다는 것을 의미한다. 이들은 인접할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 분비 리더의 경우에, 이들은 종종 인접하고, 리딩 상이다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용될 수 있다. VH 또는 VL 도메인은 이종 단백질 서열 (예를 들어, VH 또는 VL 도메인)을 코딩하는 핵산이 파지 코트 단백질 (예를 들어, pII, pVI, pVII, pVIII 또는 pIX)을 코딩하는 핵산으로 직접 삽입된 경우에 파지에 "연결"된다. 원핵 세포로 도입되는 경우에, 코트 단백질이 VH 또는 VL 도메인을 디스플레이할 수 있는 파지가 생산될 것이다. 한 실시양태에서, 생성된 파지 입자는 파지 코트 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합된 항체 단편을 디스플레이한다. 본원에 사용된 용어 "연결된" 또는 "연결하다" 또는 "연결"은 각각 펩티드 또는 포스포디에스테르 결합을 통해 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열이 함께 공유 연결되는 것을 지칭하며, 이러한 연결은 연결되는 2개의 아미노산 서열 또는 핵산 서열 사이에 임의의 수의 추가의 아미노산 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 아미노산 서열 사이의 직접 펩티드 결합 연결 또는 제1 및 제2 아미노산 서열 사이에 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 연결이 존재할 수 있다. 본원에 사용된 "링커"는 길이가 2개 이상의 아미노산인 아미노산 서열을 의미한다. 링커는 중성 극성 또는 비극성 아미노산으로 구성될 수 있다. 링커는 예를 들어 2 내지 100개 아미노산 길이, 예컨대 2 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 링커는 예를 들어 자가-절단, 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 "절단가능"할 수 있다. 아미노산 서열 내의 절단 부위 및 이러한 부위에서 절단하는 효소 및 화학물질은 당업계에 공지되어 있고, 또한 본원에 기재된다. 용어 "신호 서열 기능"은 분비된 단백질을 ER (진핵생물에서) 또는 주변세포질 (원핵생물에서) 또는 세포 외부로 지시하는 신호 서열의 생물학적 활성을 지칭한다. 본원에 사용된 "대조 단백질"은 그의 발현이 단백질 서열의 디스플레이 수준을 정량화하기 위해 측정되는 단백질 서열을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 서열은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하여 친화도 정제에 의해 VH 또는 VL이 용이하게 정제되도록 할 수 있는 "에피토프 태그"일 수 있다. 적합한 태그 폴리펩티드 및 그의 각각의 항체의 예는 폴리-히스티딘 (폴리-His) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-His-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)])를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 플래그-펩티드 (문헌 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]); KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]); α-튜불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)])를 포함한다. 본원에 사용된 "코트 단백질"은 pIII, pVI, pVII, pVIII 및 pIX를 포함하는, 파지 입자의 성분인 임의의 5가지 캡시드 단백질을 지칭한다. 한 실시양태에서, "코트 단백질"을 사용하여 단백질 또는 펩티드를 디스플레이할 수 있다 (문헌 [Phage Display, A Practical Approach, Oxford University Press, edited by Clackson and Lowman, 2004, p. 1-26] 참조). 한 실시양태에서, 코트 단백질은 pIII 단백질 또는 그의 일부 변이체, 부분 및/또는 유도체일 수 있다. 예를 들어, M13 박테리오파지 pIII 코트 단백질 (cP3)의 C-말단 부분, 예컨대 M13 파지의 단백질 III의 C-말단 잔기 267-421을 코딩하는 서열이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, pIII 서열은 서열 1의 아미노산 서열 을 포함한다. 한 실시양태에서, pIII 단편은 서열 2의 아미노산 서열 을 포함한다. 본원에 사용된 "어댑터 단백질"은 용액 중에서 또 다른 어댑터 단백질 서열과 특이적으로 상호작용하는 단백질 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, "어댑터 단백질"은 이종다량체화 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 어댑터 단백질은 cJUN 단백질 또는 Fos 단백질이다. 또 다른 실시양태에서, 어댑터 단백질은 서열 6 (ASIARLRERVKTLRARNYELRSRANMLRERVAQLGGC) 또는 서열 7 (ASLDELEAEIEQLEEENYALEKEIEDLEKELEKLGGC)의 서열을 포함한다. 본원에 사용된 "이종다량체화 도메인"은 이종다량체 형성의 촉진 및 동종다량체 형성의 방해를 위한, 생물학적 분자에 대한 변경 또는 부가를 지칭한다. 동종이량체보다 이종이량체를 형성하는 것이 강하게 우세한 임의의 이종이량체화 도메인은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예시적인 예는, 예를 들어 미국 특허 출원 20030078385 (Arathoon et al. - 제넨테크; 노브 인투 홀 기재); WO2007147901 (Kjærgaard et al. - 노보 노르디스크(Novo Nordisk): 이온성 상호작용 기재); WO 2009089004 (Kannan et al. - 암젠(Amgen): 정전기적 스티어링 효과 기재); WO2011/034605 (Christensen et al. - 제넨테크; 코일드 코일 기재)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 예를 들어 류신 지퍼를 기재하는 문헌 [Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)] 또는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프를 기재하는 문헌 [Pack et al., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993)]을 참조한다. 어구 "이종다량체화 도메인" 및 "이종이량체화 도메인"은 본원에서 교환가능하게 사용된다. 용어 "Fab-융합 단백질"은 원핵 세포에서 Fab-파지 융합 단백질 및/또는 진핵 세포에서 Fab-Fc 융합 단백질을 지칭한다. Fab-Fc 융합체는 또한 Fab-힌지-Fc 융합체일 수 있다. 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포함한다. "항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 ; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG 1 , IgG 2 , IgG 3 , IgG 4 , IgA 1 및 IgA 2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 신장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다. "프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 하기 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. 용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 교환가능하게 사용되고, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다. 본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 예시적인 초가변 루프는 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)에서 발생한다. (문헌 [Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)].) 예시적인 CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)].) VH 내의 CDR1을 제외하고는, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 지칭되는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다. "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다. "단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정된 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제한다. 항체 순도의 평가 방법의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다. "단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체 외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. "항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하기 위해 사용되고, 즉 이러한 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재할 수도 있는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나, 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다. "네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다. "천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다. 용어 "포장 삽입물"은 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기사항, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 대한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하기 위해 사용된다. 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6 th ed., WH Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 그 벡터가 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 벡터가 그 내부로 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그 벡터가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. II . 상세한 설명 파지-기반 항체 발견 방법은 개별 파지 클론의 큰 풀로부터 바람직한 결합 특이성을 갖는 Fab 단편을 선택하기 위해 파지 디스플레이 기술을 이용한다 1 -3 . 이러한 접근법에서, 주요 코트 단백질 중 하나를 통해 직접 또는 간접적으로 M13 필라멘트형 파지 입자에 융합되며, 다양화된 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하는 Fab 단편으로 구성된 파지 라이브러리는 확립된 분자 생물학 기술 및 전문화된 파지 디스플레이 벡터를 이용하여 생성되었다 (문헌 [Tohidkia et al., Journal of drug targeting, 20: 195-208 (2012); Bradbury et al., Nature biotechnology, 29: 245-254 (2011); Qi et al., Journal of molecular biology, 417: 129-143 (2012)]). 이러한 라이브러리의 이론적 다양성은 10 25 개의 특유한 서열을 쉽게 넘어설 수 있으나, 파지 풀의 구축에 있어 실질적인 제한은 전형적으로 실제 다양성을 주어진 라이브러리에 대해 ≤10 11 개 클론으로 제한한다 (문헌 [Sidhu et al., Methods in enzymology, 328: 333-363 (2000)]). 출발 라이브러리가 함유할 수 있는 특유한 서열의 실질적인 수를 고려하여, 선택된 클론의 스크리닝 처리량은 매우 중요하다. 파지-기반 항체 발견에서, 기능적 검정 (표적 결합, 세포-기반 활성 검정, 생체내 반감기 등)에서 선택된 Fab 및 그의 동족 전장 IgG의 특성의 철저한 평가는 중쇄 (HC) 및 경쇄 (LC)를 코딩하는 DNA 서열을 디스플레이에 사용되는 파지미드 벡터 외부로 및 IgG 발현을 위한 포유동물 발현 벡터 내부로 서브클로닝함으로써 Fab HC 및 LC 서열을 전장 IgG로 재포맷시키는 것을 필요로 한다. 수십개 또는 수백개의 선택된 HC/LC 쌍을 서브클로닝하는 고된 과정은 파지-기반 항체 발견 과정에서 주요 애로요인으로 나타난다. 또한, 선택된 Fab 중 상당한 비율이 일단 재포맷되면 초기 스크리닝 검정에서 만족스럽게 작동하는데 실패하기 때문에, 이러한 재포맷/스크리닝 과정을 통해 옮겨지는 클론의 수를 증가시키는 것은 궁극적인 성공 확률을 크게 증가시킨다. 여기서, 본 발명자들은 원핵 세포에서 하나의 Fab 융합 단백질의 발현 및 분비 및 진핵 세포에서 특징적인 (또는 동일한) Fab 융합체의 발현 및 분비를 위한 발현 및 분비 시스템의 생성을 기재한다. 예를 들어, 발현 및 분비 시스템은 이. 콜라이로 형질전환된 경우에 Fab-파지 융합체의 발현을 구동하고, 포유동물 세포로 형질감염된 경우에 동일한 Fab 단편을 보유하는 전장 IgG의 발현을 구동한다. 본 발명자들은 뮤린 결합 이뮤노글로불린 단백질 (mBiP)로부터의 포유동물 신호 서열 8 , 9 이 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 효율적인 단백질 발현을 구동할 수 있다는 것을 입증한다. 인간 IgG 1 HC의 힌지 영역 내에 삽입된 파지 융합 펩티드를 함유하는 합성 인트론을 제거하기 위해 포유동물 mRNA 스플라이싱을 이용하여, 본 발명자들은 숙주 세포-의존성 방식으로 2가지 특징적인 단백질: 이. 콜라이에서 파지 디스플레이를 위해 어댑터 펩티드에 융합된 Fab 단편 및 포유동물 세포에서 천연 인간 IgG 1 을 생성할 수 있다. 이러한 기술은 서브클로닝을 필요로 하지 않으면서, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 관심 항원에 결합하는 Fab 단편의 선택 및 포유동물 세포에서 동족 전장 IgG의 후속 발현 및 정제를 허용한다. 본 발명은 부분적으로 (1) 비-박테리아 기원의 신호 서열이 진핵 세포에서의 IgG 발현과 절충되지 않으면서 파지 라이브러리의 분류에 충분한 수준으로 원핵 세포에서 기능하고, (2) mRNA 프로세싱이 진핵 세포에서 일어나지만 원핵 세포에서는 그렇지 않은 경우에 상이한 Fab-융합 단백질 (원핵 세포에서는 Fab-파지 융합 단백질 및 진핵 세포에서는 Fab-Fc 융합 단백질)이 동일한 핵산 분자로부터 숙주-세포 의존성 방식으로 발현된다는 것을 입증하는 실험적 발견에 기초한다. 따라서, 서브클로닝을 필요로 하지 않으면서, 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이)에서 파지 디스플레이를 위해 파지 입자 단백질, 코트 단백질 또는 어댑터 단백질에 융합된 Fab 단편의 발현 및 분비 및 진핵 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)에서 Fc에 융합된 Fab 단편의 발현 및 분비를 위한 발현 및 분비 시스템, 및 발현 및 분비 시스템의 구축 및 사용에 관한 방법이 본원에 기재된다. 특히, 원핵 세포에서 Fab-파지 융합 단백질의 발현 및 분비 및 진핵 세포에서 Fab-Fc 융합 단백질의 발현 및 분비를 위한 벡터, 원핵 및 진핵 세포에서 단백질 또는 펩티드의 발현 및 분비를 위한 핵산 분자, 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 기재된다. 또한, 관심 단백질에 대한 신규 항체의 스크리닝 및 선택을 위한 발현 및 분비 시스템의 사용 방법을 포함하는 발현 및 분비 시스템의 사용 방법이 본원에 기재된다. 본 발명의 수행 방식 본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한 당업계 기술범위 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌, 예컨대 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 nd edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (MJ Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (RI Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4 th edition (DM Weir & CC Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (JM Miller & MP Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (FM Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); 및 "Current Protocols in Immunology" (JE Coligan et al., eds., 1991)]에 상세하게 설명되어 있다. 원핵 및 진핵 세포에 대한 발현 및 분비 시스템 원핵 및 진핵 세포에 대한 발현 및 분비 시스템은 관심 단백질 (예를 들어, IgG 분자의 중쇄 또는 경쇄)에 대한 조절 및 코딩 서열을 함유하는 벡터를 포함하며, 여기서 원핵 및 진핵 프로모터 (예를 들어, CMV (진핵) 및 PhoA (원핵))는 관심 유전자(들)의 상류에 일렬로 정렬되고, 단일 신호 서열은 원핵 및 진핵 세포에서 관심 단백질의 발현을 구동한다. 본 발명은 IgG1의 VH/CH1 및 힌지-Fc 영역 사이에 위치한 합성 인트론을 사용함으로써 숙주-세포 의존성 방식으로 관심 단백질의 2가지 상이한 융합 형태를 생성하기 위한 이러한 벡터의 용도를 제공하며, 여기서 합성 인트론은 진핵 세포에서 mRNA 프로세싱 동안 스플라이싱된다. A. 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 기능하는 신호 서열 원핵 (이. 콜라이) 및 진핵 (포유동물) 세포 둘 다에서 관심 단백질을 발현할 수 있는 벡터의 구축에 있어 한가지 도전할 점은 이러한 세포 유형에서 발견되는 신호 서열의 차이로부터 발생한다. 신호 서열의 특정의 특성은 일반적으로 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 보존되지만 (예를 들어, 서열의 중간에 위치한 소수성 잔기의 패치 및 성숙 폴리펩티드의 N-말단에 있는 절단 부위에 인접합 극성/하전된 잔기), 다른 것은 나머지보다 큰 한 세포 유형의 특징이다. 또한, 당업계에서 상이한 신호 서열은 서열이 모두 포유동물 기원일지라도 포유동물 세포에서의 발현 수준에 대해 유의한 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Hall et al., J of Biological Chemistry, 265: 19996-19999 (1990); Humphreys et al., Protein Expression and Purification, 20: 252-264 (2000)]). 예를 들어, 박테리아 신호 서열은 전형적으로 개시 메티오닌 바로 뒤에 양으로-하전된 잔기 (가장 통상적으로 리신)를 갖는 반면, 이들은 포유동물 신호 서열에는 항상 존재하지는 않는다. 양쪽 세포 유형에서 분비를 지시할 수 있는 기지의 신호 서열이 존재하나, 이러한 신호 서열은 전형적으로 오직 하나의 세포 유형 또는 다른 것에서 높은 수준의 단백질 분비를 지시한다. 박테리아 신호 서열이 포유동물 세포에서 임의의 기능성을 나타낸다는 것은 매우 드물게 밝혀졌으나, 포유동물 기원의 신호 서열이 박테리아의 주변세포질로의 전위를 구동할 수 있다는 보고가 있었다 (문헌 [Humphreys et al., The Protein Expression and Purification, 20: 252-264 (2000)]). 그러나, 단지 신호 서열의 기능성 만으로는 파지 디스플레이 및 IgG 발현에 사용될 강한 이중 발현 시스템에 적합하지 않았다. 오히려, 선택된 신호 서열은 양쪽 발현 시스템, 특히 낮은 수준의 디스플레이가 파지 패닝 실험을 수행하는 시스템의 능력과 절충될 파지 디스플레이에서 잘 기능해야 한다. 본 발명은 부분적으로 비-박테리아 기원의 신호 서열이 진핵 세포에서의 IgG 발현과 절충되지 않으면서 파지 라이브러리의 분류에 충분한 수준으로 원핵 세포에서 기능한다는 발견에 기초한다. 본 발명은 폴리펩티드를 원핵생물에서는 주변세포질에 표적화시키고 진핵생물에서는 원형질/세망에 표적화시키는 사용가능한 임의의 신호 서열 (컨센서스 신호 서열 포함)을 제공한다. 사용될 수 있는 신호 서열은 뮤린 결합 이뮤노글로불린 단백질 (mBiP) 신호 서열 (유니프롯KB(UniProtKB): 등록 P20029), 인간 성장 호르몬 (hGH)으로부터의 신호 서열 (유니프롯KB: 등록 BIA4G6), 가우시아 프린세프스 루시페라제 (유니프롯KB: 등록 Q9BLZ2), 효모 엔도-1,3-글루카나제 (yBGL2) (유니프롯KB: 등록 P15703)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 신호 서열은 천연 또는 합성 신호 서열이다. 추가 실시양태에서, 합성 신호 서열은 그의 비-최적화된 천연 신호 서열에 비해 최적화된 수준의 디스플레이 수준을 구동하는 최적화된 신호 분비 서열이다. 신호 서열이 원핵 세포에서 관심 폴리펩티드의 디스플레이를 구동하는 능력을 결정하는데 적합한 검정은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 파지 ELISA를 포함한다. 신호 서열이 진핵 세포에서 관심 폴리펩티드의 발현을 구동하는 능력을 결정하는데 적합한 검정은 예를 들어 본원에 기재된 바와 같이, 관심 신호를 갖는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 포유동물 발현 벡터를 배양된 포유동물 세포에 형질감염시키는 것, 소정의 기간 동안 세포를 성장시키는 것, 배양된 세포로부터 상청액을 수집하는 것, 및 친화성 크로마토그래피에 의해 상청액으로부터 IgG를 정제하는 것을 포함한다. B. 동일한 핵산으로부터 숙주-의존성 융합 단백질의 발현을 발생시키는 합성 인트론 본 발명은 부분적으로 상이한 Fab-융합 단백질이 진핵에서 mRNA 프로세싱 동안 일어나지만 원핵 세포에서는 그렇지 않은 인트론 스플라이싱의 천연 과정을 활용함으로써 숙주 세포 의존성 방식으로 동일한 핵산 분자로부터 발현될 수 있다는 발견에 기초한다. hIgG1 HC 불변 영역의 게놈 서열은 3개의 천연 인트론 (도 3a), 인트론 1, 인트론 2 및 인트론 3을 함유한다. 인트론 1은 HC 가변 도메인/CH1 (VH/CH1) 및 힌지 영역 사이에 위치한 391개 염기 쌍의 인트론이다. 인트론 2는 힌지 영역 및 CH2 사이에 위치한 118개 염기 쌍의 인트론이다. 인트론 3은 CH2 및 CH3 사이에 위치한 97 염기 쌍의 인트론이다. 본 발명은 VH/CH1 및 힌지 영역 사이에 위치한 인트론 1을 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 실시예는 VH/CH1 및 힌지 영역 사이에 위치한 인트론 2 또는 인트론 3을 포함한다. 일부 벡터의 경우에, 코트 단백질 또는 어댑터 단백질을 코딩하는 핵산을 그의 5' 말단에 인트론에 대한 천연 스플라이스 공여자 및 그의 3' 말단에 천연 스플라이스 수용자를 갖는 VH/CH1 및 힌지 영역 사이에 위치한 인트론에 삽입하였다. 다른 예는 스플라이스 공여자의 8개의 위치 중 위치 1 및 5에 치환을 갖는 돌연변이체 스플라이스 공여자를 포함한다. 예를 들어, 파지 ELISA는 원핵 세포에서 발현 및 분비 시스템을 분석하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 A 및 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 배양 상청액으로부터 IgG를 정제하는 것을 이용하여 진핵 세포에서 발현 및 분비 시스템을 분석할 수 있다. 또한, RT-PCR을 이용하여 진핵 세포에서 합성 인트론-함유 HC 카세트의 스플라이싱을 분석할 수 있다. C. 원핵 및 진핵 세포에서 폴리펩티드의 발현 및 분비를 위한 벡터 원핵 및 진핵 세포에서 Fab-융합 단백질의 발현 및 분비를 위한 발현 및 분비 시스템은 당업계의 기술 범위 내에 속하는 다양한 기술을 이용하여 구축될 수 있다. 한 측면에서, 발현 및 분비 시스템은 (1) 포유동물 프로모터, (2) (5'으로부터 3'으로의 순서로) 박테리아 프로모터, 신호 서열, 항체 경쇄 서열, 대조 단백질 (gD)을 포함하는 LC 카세트; (3) (5'으로부터 3'으로의 순서로) 포유동물 폴리아데닐화/전사 정지 신호, 원핵 세포에서 정지 전사를 위한 전사 종결인자 서열, 포유동물 프로모터, 및 HC의 발현을 구동하기 위한 박테리아 프로모터를 포함하는 합성 카세트; (4) 신호 서열 및 항체 중쇄 서열을 포함하는 HC 카세트; 및 (5) 포유동물 폴리아데닐화/전사 정지 신호 및 원핵 세포에서 정지 전사를 위한 전사 종결인자 서열을 포함하는 제2 합성 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. LC 및 HC 앞의 분비 신호 서열은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 기능하는 동일한 신호 서열 (예를 들어, 포유동물 mBiP 신호 서열)일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 중쇄 서열은 합성 인트론을 포함한다. 합성 인트론은 VH/CH1 도메인 (그의 5' 말단에) 및 힌지 영역 (그의 3' 말단에)과 위치한다. 한 실시양태에서, 합성 인트론은 5' 말단에서 최적화된 스플라이스 공여자 서열 및 3' 말단에서 천연 인트론 1 스플라이스 수용자 서열에 의해 플랭킹된다. 한 실시양태에서, 합성 인트론은 직접 융합 디스플레이를 위한 파지 코트 단백질 (예를 들어, pIII) (도 14 참조), 또는 간접 융합 디스플레이를 위한, 인트론 1에 뉴클레오티드 수준에서 융합된 어댑터 단백질 (도 7 참조)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 간접 융합 디스플레이의 경우에, 벡터는 (5'으로부터 3'으로의 순서로) 박테리아 프로모터, 박테리아 신호 서열, 파지 코트 단백질 (예를 들어, pIII)을 코트 단백질의 N-말단에 뉴클레오티드 수준에서 융합된 파트너 어댑터 펩티드 및 전사 종결인자 서열과 함께 포함하는 별도의 박테리아 발현 카세트를 추가로 포함한다 (도 7 참조). 또한, HC 및 LC가 둘 다 나란히 포유동물 및 박테리아 프로모터에 의해 제어되거나 (도 7 참조) 또는 오직 하나의 (예를 들어, HC) 카세트가 일렬의 포유동물 및 박테리아 프로모터에 의해 제어되는 반면 다른 (예를 들어, LC) 카세트는 오직 박테리아 프로모터에 의해 제어되는 (도 14 참조) 상기 구축물의 상이한 실시양태가 가능하다. 또한, 벡터는 박테리아 복제 기점, 포유동물 복제 기점, 대조군 (예를 들어, gD 단백질)으로서 유용하거나 또는 단백질 정제, 단백질 태그부착, 단백질 표지 (예를 들어, 검출가능한 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지 또는 효소적 표지)로의 표지)와 같은 활동에 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물 및 박테리아 프로모터 및 신호 서열은 항체 경쇄 서열 및 포유동물 및 박테리아 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 신호 서열은 항체 중쇄 서열에 작동가능하게 연결된다. D. 관심 항원에 대한 항체의 선택 및 스크리닝 본 발명은 Fab-기반 라이브러리의 파지 또는 박테리아 디스플레이에 의해 관심 단백질에 대한 항체를 스크리닝 및 선택하는 방법 또는 유사한 방법에 의해 기존의 항체를 최적화시키는 방법을 제공한다. 상기 기재된 이중 벡터의 사용은 서브클로닝을 필요로 하지 않으면서, 원핵 세포에서 Fab 단편의 스크리닝 및 선택 및 추가의 시험을 위해 전장 IgG 분자로서 용이하게 발현될 수 있는 Fab의 선택에 이용될 수 있다. 본 발명의 항체 본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab') 2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형이다. 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항체는 하기 섹션 1-7에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다: 1. 항체 친화도 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10 -8 M 이하, 예를 들어 10 -8 M 내지 10 -13 M, 예를 들어 10 -9 M 내지 10 -13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 ( 125 I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [ 125 I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다. 또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (k on ) 및 해리율 (k off )을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k off /k on 의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 회합률이 10 6 M -1 s -1 을 초과하는 경우, 회합률은 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 2. 항체 단편 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 , Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab') 2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조). 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 3. 키메라 및 인간화 항체 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다. 인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다. 인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 4. 인간 항체 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다. 인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (KM 마우스(KM MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다. 인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다. 인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다. 5. 라이브러리-유래 항체 본 발명의 항체는 원하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다. 특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다. 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다. 6. 다중특이적 항체 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 제1 항원에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 제1 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 제1 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다. "옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조). 본원의 항체 또는 단편은 또한 제1 항원 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조). 7. 항체 변이체 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. a) 치환, 삽입 및 결실 변이체 특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 부모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 이차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항 체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-지시된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 랜덤화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다. 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다. b) 글리코실화 변이체 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다. 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다. c) Fc 영역 변이체 특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, MS et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, MS and MJ Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조). 감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581). FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.) 특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다. 증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826). Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다. d) 시스테인 조작된 항체 변이체 특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. e) 항체 유도체 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 재조합 방법 및 조성물 항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함). 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다. 원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다. 글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다( Spodoptera frugiperda ) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다. 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다. 척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR - CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 검정 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다. 1. 결합 검정 및 기타 검정 한 측면에서, 본 발명의 항체는 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다. 또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 관심 항원에 대한 결합에 대해 본 발명의 항체와 경쟁하는 항체를 확인하는데 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 본 발명의 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 예시적인 방법의 상세내용은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공된다. 예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 관심 항원을 관심 항원에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 본 발명의 항체) 및 관심 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 관심 항원을 제1 표지된 항체는 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. 관심 항원에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후에, 잉여량의 미결합 항체를 제거하고, 고정된 관심 항원과 연관된 표지의 양을 측정한다. 고정된 관심 항원과 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 관심 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다. 2. 활성 검정 한 측면에서, 생물학적 활성을 갖는 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 생체내 및/또는 시험관내에서 이러한 생물학적 활성을 갖는 항체가 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이러한 생물학적 활성에 대해 시험된다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌은 그 전문이 명백하게 본원에 참조로 포함된다. III . 실시예 다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있는 것으로 이해된다. M13KO7 헬퍼 파지는 뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터의 것이었다. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 트윈 20은 시그마(Sigma)로부터의 것이었다. 카세인은 피어스(Pierce)로부터의 것이었다. 항-M13 접합된 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)는 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)로부터의 것이었다. 맥시소르프 이뮤노플레이트는 눈크(NUNC)로부터의 것이었다. 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질은 키르케가드 앤 페리 래보러토리즈(Kirkegaard and Perry Laboratories)로부터의 것이었다. 모든 다른 단백질 항원은 제넨테크, 인크.에 있는 연구 그룹에 의해 생성되었다. 실시예 1: 원핵 및 진핵 세포에서의 발현을 위한 신호 서열의 선택 벡터가 에스케리키아 콜리( Escherichia coli ) 및 진핵 (포유동물) 세포 둘 다에서 관심 단백질을 발현할 수 있는지 여부를 다루기 위해, 그들이 포유동물 세포에서 기능할 수 있다는 개념을 뒷받침하는 일화적 증거가 존재하는 비-박테리아 기원의 4개의 신호 서열을 선택하였다. 본 발명자들은 파지 ELISA를 이용하여 이들 신호 서열이 M13 파지 상의 항-Her2 (h4D5) Fab의 디스플레이를 구동하는 능력에 대해 시험하였다 (도 1a). 디스플레이의 수준을 박테리아 열-안정성 장독소 II (STII) 신호 서열에 대해 평가하였다. 신호 서열이 Fab-파지 디스플레이를 구동하는 능력은 크게 달라지며, 뮤린 결합 이뮤노글로불린 단백질 (mBiP)로부터의 하나의 신호 서열은 Fab 디스플레이의 효율적인 수준을 허용할 가능성이 있었던 디스플레이의 수준을 구동하였다. 추가로 mBiP 신호 서열의 성능을 개선시키기 위해, 본 발명자들은 박테리아에서 진핵 신호 서열의 기능이 코돈 용법에 의해 크게 영향을 받는다는 것이 이전에 입증된 적이 있는 파지-기반 코돈 최적화 접근법을 활용하였다 (문헌 [Humphreys et al., The Protein Expression and Purification, 20: 252-264 (2000)]). mBiP 신호 서열이 표준 파지미드 벡터에서 h4D5 Fab HC의 N-말단에 융합된 파지 라이브러리를 구축하였다. mBiP 신호 펩티드의 DNA 서열을 처음 2개의 메티오닌 뒤의 각 코돈의 제3 염기에서 다양화시켜 오직 무음 돌연변이만을 허용하였다. 고정된 Her2에 대한 4 라운드의 고체-상 패닝 후에, 개별 클론을 피킹하고, 서열분석하였다. 본 발명자들은 선택된 클론의 컨센서스 서열이 구아닌 또는 시토신보다는 오히려 무작위화된 위치에서 아데닌 또는 티미딘을 강하게 선호한다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 아생형 mBiP 서열에서 17개의 코돈 중 15개가 제3 염기 위치에 구아닌 또는 시토신을 함유하지만, 분류된 라이브러리에서 17개의 코돈은 각각 그 시점의 이들 위치 60-90%에 아데닌 또는 티미딘을 함유하였다는 사실에 의해 강조된다. 파지 ELISA에서 시험되는 경우에, 최적화된 mBiP 신호 서열은 h4D5 Fab의 디스플레이를 원핵 STII 신호 서열과 대등한 수준으로 구동하며, 이는 mBiP 신호 서열이 파지 디스플레이 및 패닝 실험에서 원핵 STII 신호 서열 대신에 성능에 있어 어떠한 명백한 감소도 없이 활용될 수 있다는 것을 시사한다 (도 1b). 다음에, mBiP 신호 서열이 포유동물 세포에서 IgG의 발현 및 분비를 뒷받침하는 능력을 평가하였다. h4D5 hIgG 1 의 HC 및 LC를 코딩하며, 각각 N-말단에 융합된 mBiP 신호 서열을 갖는 포유동물 발현 벡터를 현탁 293S 세포에 공동형질감염시키고, 5일 동안 성장시키고, 그 후에 상청액을 수집하고, IgG를 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 하나의 30 mL 배양물로부터의 IgG 산출량은 통상적으로 ~2.0 mg이었으며, 양쪽 쇄에서 천연 HC 신호 (VHS)를 사용하여 수득한 산출량과 대등하였다 (데이터는 제시되지 않음). 흥미롭게도, mBiP 신호 서열의 아생형 대 코돈 최적화 형태의 사용은 IgG 발현 수준에 대해 어떠한 인지가능한 효과도 갖지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 겔 여과 크로마토그래피 및 질량 분광측정법은 정제된 단백질이 용액 중에서 >90% 단량체성이며, mBiP 신호 서열이 양쪽 HC 및 LC 상의 적절한 위치에서 완전하게 절단되었다는 것을 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음). h4D5가 우수한 발현인자인 것으로 알려져 있으므로, 본 발명자들은 파지 패닝 실험으로부터 임의로 선택된 비특성화 클론의 풀 상에서 VHS에 대한 mBiP의 성능을 시험하였다. 이들 클론으로부터의 평균 산출량은 30 mL 현탁 배양물로부터 ~1.0 mg이었으며, 2개의 신호 서열 사이에 유의한 차이는 관찰되지 않았다 (도 2a 및 b). 요컨대, mBiP 포유동물 분비 신호 서열은 IgG를 포유동물 세포에서 스크리닝에 충분한 수준으로 발현할 수 있었으며, 일단 코돈 최적화되면 또한 IgG 발현 수준의 절충 없이 파지 상에서 강한 Fab 디스플레이를 구동할 수 있었다. 실시예 2: 원핵 및 진핵 세포에서의 대안적 Fab 융합체의 발현 상이한 Fab-융합 단백질을 숙주 세포-의존성 방식으로 생성하기 위해, 본 발명자들은 진핵 세포에서 mRNA 프로세싱 동안 일어나지만 원핵 세포에서는 일어나지 않는 인트론 스플라이싱의 자연적 과정을 조사하고자 노력하였다. hIgG 1 HC 불변 영역의 게놈 서열은 3개의 천연 인트론을 함유한다 (도 3a). 이들 중 첫번째 (인트론1)는 HC 가변 도메인 (V H ) 및 힌지 영역 사이에 위치한 384개 염기 쌍의 인트론이다. 인트론1 및 최적화된 스플라이스 공여자 서열을 함유하는 HC 발현 벡터는 RT-PCR 및 전사체의 서열분석에 의해 평가시에 완전하게 스플라이싱된 mRNA를 발현하였고, LC 벡터로 공동형질감염된 경우에 IgG 1 을 인트론이 없는 벡터와 대등한 수준으로 발현하였다 (도 5). 인트론1 서열 내에 개재된 파지 어댑터 펩티드에 대한 Fab 단편이 각각 박테리아 및 포유동물 세포에서 파지 상의 디스플레이 및 IgG 발현을 둘 다 허용하는지 여부를 결정하기 위해, 어댑터 펩티드 (도 3b) 또는 파지 코트 단백질 유전자-III (도 3c)를 h4D5 HC.인트론1 구축물에서 인트론 1 또는 인트론 3의 5' 말단에 삽입하였다. 인트론 1 또는 3으로부터의 천연 스플라이스 공여자는 어댑터 펩티드의 바로 상류로 이동하였다. HC-어댑터.인트론1 구축물이 포유동물 세포에서 h4D5 LC와 공동-발현되는 경우에, h4D5 IgG의 발현은 대략 인트론이 없는 대조 구축물의 대략 40% (어댑터-함유 인트론의 경우) 또는 5% (유전자-III-함유 인트론의 경우)였다 (도 4a). RT-PCR은 HC-어댑터 mRNA의 분획이 적절하게 스플라이싱되는 반면 (도 4b, 중간 밴드), 상당한 양의 mRNA가 스플라이싱되지 않거나 (도 4b, 상부 밴드) 또는 V H 영역에서 잠재 스플라이스 공여자로부터 부정확하게 스플라이싱된다는 것 (도 4b, 하부 밴드)을 입증하였다. HC-유전자-III mRNA는 잠재 스플라이스 공여자로부터 거의 완전하게 스플라이싱되었다. 잠재 스플라이스 공여자 서열의 무음 돌연변이는 오직 스플라이싱되지 않은 mRNA의 축적을 발생시켰다 (제시되지 않음). 어댑터 서열이 삽입된 경우에 인트론이 효율적으로 스플라이싱하는데 실패한 점에 미루어 보아, 본 발명자들은 천연 스플라이스 공여자를 포유동물 mRNA에 대한 스플라이스 공여자의 기지의 컨센서스 서열과 비교하였다 (문헌 [Stephens et al., J of Molecular Biology, 228: 1124-1136 (1992)]). 도 5에 나타난 바와 같이, hIgG 1 인트론1로부터의 천연 스플라이스 공여자는 8개의 위치 중 3개가 컨센서스 공여자 서열과 상이하다. 위치 1 및 5가 위치 8보다 더 보존되므로 이들 위치에서의 치환을 추가로 분석하였다. 위치 1 및 5에서의 염기가 돌연변이체 스플라이스 공여자 (공여자1) (도 5a)를 생성하고, 이들 변형된 공여자가 HC에서 합성 인트론의 스플라이싱을 매개하는 능력을 시험하였다. 이러한 최적화된 스플라이스 공여자는 h4D5 IgG 발현을 동시 증가시키면서 인트론을 함유하지 않는 대조 구축물의 수준에 매치되는 수준으로 (도 5c) 합성 인트론의 스플라이싱을 완벽하게 복구시켰다 (도 5b). 스플라이싱 및 IgG 발현의 개선은 합성 인트론이 어댑터 펩티드 또는 유전자-III를 함유하는 경우, 또한 합성 인트론이 hIgG1 인트론 1 또는 인트론 3을 기반으로 하는 경우 모두에서 관찰되었다. 실시예 3: 원핵 및 진핵 세포에 대한 발현 및 분비 시스템의 생성 이중 벡터 플라스미드의 생성을 위해, 본 발명자들은 파지 디스플레이, pRS에 현재 사용되는 pBR322-유래 파지미드 벡터를 생성하였다. 이러한 비-시스트론 벡터는 그의 연관 STII 신호 서열을 갖는 항체 경쇄 카세트의 발현을 구동하는 박테리아 PhoA 프로모터, 이어서 그의 연관 STII 신호 서열을 갖는 항체 중쇄 카세트로 이루어진다. 경쇄 서열의 말단에서, 파지 입자 상의 Fab 디스플레이의 검출을 위한 gD 에피토프 태그가 존재한다. 종래의 파지미드에서, 중쇄 서열은 오직 hIgG의 V H 및 C H 1 도메인으로 이루어지고, 파지 코트 단백질 pIII 또는 어댑터 펩티드를 코딩하는 유용 펩티드, 예컨대 파지 융합 단백질, 가장 흔하게는 유전자-III에 뉴클레오티드 수준에서 융합된다. 경쇄 및 중쇄 카세트의 3' 말단은 이. 콜라이에서 정지 전사를 위한 람다 전사 종결인자 서열을 함유한다. 이러한 벡터가 단일 mRNA 전사체로부터 경쇄 및 중쇄-pIII를 생산하기 때문에, LC 및 HC 서열 사이에는 전사 조절 요소가 존재하지 않는다. 벡터는 또한 암피실린 내성을 부여하기 위한 베타-락타마제 ( bla ) 유전자, 이. 콜라이에서의 복제를 위한 pMB1 기점, 및 박테리아 표면 상에서의 필루스의 발현을 위한 f1 기점 (M13 파지에 의한 감염을 허용함)을 함유한다. 이러한 벡터의 또 다른 형태는 또한 포유동물 세포의 적절한 세포주에서 플라스미드의 에피솜 복제를 위한 복제의 SV40 기점을 포함한다. 초기 이중 벡터 (본원에서 "pDV.6.0"으로 지칭됨)의 구축을 위해, 본 발명자들은 우선 LC-HC 시스트론을 구동하는 PhoA 프로모터의 상류에 pRK (IgG 및 다른 단백질의 발현에 사용되는 포유동물 발현 벡터)로부터의 포유동물 CMV 프로모터를 삽입하였다. LC 항체 코딩 서열의 말단에, 본 발명자들은 앰버 정지 코돈에 이어 gD 에피토프 태그를 삽입하여, 앰버 억제인자 이. 콜라이 균주에서 디스플레이되는 경우에 파지 상에서의 태그부착된 LC의 검출을 허용하였다. 에피토프 태그는 벡터가 포유동물 세포에서 발현되는 경우에는 존재하지 않는다. 따라서, LC 카세트는 (5'으로부터 3'으로의 순서로) 진핵 프로모터, 박테리아 프로모터, 신호 서열, 항체 경쇄 (LC) 코딩 서열, 및 에피토프 태그 (gD)를 포함한다. 다음에, HC 및 LC 카세트 사이에 본 발명자들은 (5'으로부터 3'으로의 순서로) SV40 포유동물 폴리아데닐화/전사 정지 신호, 이. 콜라이에서의 전사 종결을 위한 람다 종결인자 서열, CMV 프로모터 및 PhoA 프로모터를 포함하는 합성 카세트를 삽입하였다. 다음에, SV40 포유동물 폴리아데닐화/전사 정지 신호 및 람다 종결인자 서열을 HC 카세트 뒤에 삽입하였다. HC 카세트는 신호 서열 및 항체 중쇄 (HC) 코딩 서열을 포함한다. 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 관심 융합 단백질(들)의 분비를 허용하기 위해, 본 발명자들은 LC 및 HC 앞의 STII 신호 서열을 진핵 뮤린 결합 이뮤노글로불린 단백질 (mBiP) 신호 서열로 대체하였다. 여러 후보 신호 서열의 스크리닝은 본 발명자들이 이러한 신호 서열이 원핵 발현 (즉, 파지 디스플레이) 및/또는 진핵 발현 (즉, 포유동물 세포에서 IgG의 발현)을 필요로 하는 응용에서 기능할 수 있고, mBiP가 이러한 작업 전에 이용된 각각의 신호 서열이 그러했던 바와 같이 이러한 셋팅 둘 다에서 잘 작동하였다는 것을 발견하도록 하였다. 이. 콜라이에서 Fab-파지 및 포유동물 세포에서 IgG의 발현을 허용하기 위해, 본 발명자들은 HC 카세트에서 합성 인트론을 생성하였다. 본 발명자들은 인간 IgG1 인트론 1 또는 인트론 3으로부터 천연 인트론을 변형시켜 파지 입자 상에서의 디스플레이를 위한 융합 단백질 (유전자-III)을 함유하는 합성 인트론을 생성하였다. 인간 IgG1로부터의 인트론 1 (또는 인트론 3)의 게놈 서열을 정지 코돈에 의해 분리된 유전자-III 서열 바로 뒤에 삽입하여 이. 콜라이에서 Fab HC-p3 융합체를 생산하였다. 합성 인트론의 5' 플랭킹 영역에서 천연 스플라이스 공여자 옥타뉴클레오티드의 배치는 이. 콜라이에서 발현되는 경우에 힌지 영역에서 2개의 아미노산 돌연변이 (E212G 및 P213K, 카바트 넘버링)를 필요로 할 것이며, 최적화된 스플라이스 공여자를 생성하기 위한 돌연변이는 리신으로 돌연변이되는 이들 잔기를 둘 다 생성한다. 이러한 돌연변이는 파지 상에서의 디스플레이의 수준에 영향을 미치지 않으며 (제시되지 않음), 파지 힌지 영역은 스플라이싱 과정 동안 제거되므로, 포유동물 세포에서 발현된 전장 IgG에는 존재하지 않을 것이다. 대안적으로, 어댑터 파지 디스플레이의 활용을 위해, 본 발명자들은 상이한 합성 인트론을 갖는 상기 기재된 pDV6.0 벡터와 유사한 벡터 (본원에서 pDV5.0으로 지칭됨, 도 7에 제시됨)를 생성하였다. 유전자-III 서열을 류신 지퍼 쌍 (본원에서 "어댑터"를 칭함)의 2개의 구성원 중 하나로 대체하였다. 이러한 합성 인트론에서, 어댑터 펩티드 서열 뒤에 정지 코돈 및 인트론 1 또는 3의 게놈 서열이 존재한다. 이러한 구축물에서, 본 발명자들은 또한 류신 지퍼 쌍의 동족 구성원에 융합된 유전자-III으로 이루어진 개별 박테리아 발현 카세트를 삽입하였다. 이러한 개별 박테리아 발현 카세트는 LC CMV 프로모터의 상류에 도입되고, PhoA 프로모터에 의해 제어되며, 이. 콜라이에 대한 어댑터-유전자-III의 발현을 제한하는 STII 신호 서열을 함유하고, 바로 하류에 람다 종결인자를 함유한다. 이. 콜라이에서 발현되는 경우에, 중쇄 및 경쇄는 주변세포질에서 어셈블리되어 Fab를 형성하고, 중쇄에 융합된 어댑터는 pIII-어댑터 단백질 상에서 동족 어댑터에 안정하게 결합한다. 이러한 어셈블리된 Fab-어댑터-pIII 복합체가 파지 입자에 패키징되면 관심 Fab의 파지 디스플레이가 발생할 것이다. 또한, 본 발명자들은 파트너 어댑터가 유전자-III의 N-말단에 융합된 KO7 헬퍼 파지의 맞춤형 돌연변이체 (어댑터-KO7)를 생성하였다. 어댑터-KO7을 갖는 pDV.5.0을 보유하는 이. 콜라이의 감염은 어댑터에 융합되는 성숙 파지미드 상에 존재하는 pIII의 모든 카피를 생성하였다. 그 결과, pIII의 모든 카피는 단지 pDV5로부터 기원한 pIII의 카피보다는 오히려 Fab-어댑터와 회합하는데 이용가능하다. 그러나, 일부 경우에, (예를 들어, 친화도 성숙 적용에서) 드물게 고-친화도 클론이 발견되는 경우에는 보다 낮은 수준의 디스플레이가 바람직할 수 있다. 이러한 경우에, 종래의 KO7 헬퍼 파지를 갖는 pDV.5.0을 보유하는 이. 콜라이의 감염은 파지 입자 상에 디스플레이되는 어댑터-pIII (pDV.5.0으로부터의 것) 및 아생형 pIII (KO7 헬퍼 파지로부터의 것)의 혼합물을 생성할 것이다. 이러한 시나리오에서는, 단지 전체 pIII 풀의 하위세트만이 어댑터-Fab와 회합할 수 있으므로, 생성된 디스플레이 수준은 어댑터-KO7이 사용된 경우보다 낮을 것이다. 간단하게 적절한 헬퍼 파지를 선택함으로써 디스플레이 수준을 조정하는 이러한 능력은 본 발명의 특유한 이점이다. 본 발명자들은 pDV5.0이 포유동물 세포에서 상이한 IgG를 발현하는 능력을 평가하였다. 4가지 상이한 인간 IgG로부터의 HC 및 LC를 pDV5.0에 서브클로닝하고, 293 세포에서 발현시켰다. 다소 놀랍게도, pDV로부터의 전체 산출량은 일관적으로 2-플라스미드 시스템으로부터보다 ~10배 낮았다. 그러나, 산출량은 여전히 30 mL 배양물 당 ~0.1-0.4 mg의 정도였다 (도 6b). 물질의 이러한 양은 통상의 스크리닝 검정에 적합한 것보다 크고, 물질의 보다 많은 양이 요구되는 경우에 0.1-1 L 이상까지 용이하게 확대될 수 있다. IgG는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 용액 중에서 >90% 단량체성인 것으로 밝혀졌다. 실시예 4: 유전자- III 에 앰버 돌연변이를 갖는 돌연변이체 헬퍼 파지, M13KO7 ( 앰버 KO7)의 구축 M13 파지 상에서 pIII에 융합된 단백질의 디스플레이를 증진시키기 위해, 본 발명자들은 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 돌연변이체 헬퍼 파지, 앰버 KO7을 생성하였다. 앰버 KO7은 부위-지정 돌연변이유발에 의해 M13KO7 헬퍼 파지 게놈에 도입된 앰버 코돈을 갖는다. pIII의 뉴클레오티드 서열 (돌연변이체 헬퍼 파지 앰버 KO7의 뉴클레오티드 1579 내지 2853)은 도 8에 제시된다. 앰버 KO7을 생성하기 위해, 헬퍼 파지 M13KO7을 사용하여 에스케리키아 콜라이 CJ236 균주 (유전자형 dut - / ung - )를 감염시키고, 자손 비리온을 수확하여 ssDNA 정제 키트 (퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 ssDNA를 정제하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 (서열 5'-GTGAATTATCACCGTCACCGACCTAGGCCATTTGGGAATTAGAGCCA-3') (서열 23)를 사용하여 올리고뉴클레오티드-지정 부위 돌연변이유발에 의해 M13KO7에서 유전자-III를 돌연변이시켰다. 돌연변이된 DNA를 사용하여 이. 콜라이 XL1-블루 세포 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))를 형질전환시키고, 연질 한천 플레이트 상의 비감염된 XL1-블루 세포의 층 상에 시딩하였다. 플라크를 개별적으로 피킹하고, 세포를 50 μg/ml 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 성장시켰다. 이중-가닥 복제 형태 (RF) DNA를 DNA 미니프렙 키트로 추출하고, 서열분석하여 앰버 정지 돌연변이의 존재를 확인하였다. 집단의 동질성은 RF DNA의 AvrII 제한 엔도뉴클레아제 분해 및 한천 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 모든 재조합 DNA 조작 단계는 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Sambrook, J. et al., A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratroy Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001]). 앰버 KO7을 사용하여 생산된 파지 미립자 상에서의 Fab 디스플레이의 수준을 파지 ELISA에 의해 측정하였다. 항원 (Her2)을 이뮤노플레이트 상에 고정시키고, 항-Her2 Fab를 보유하는 파지를 XL1-블루 세포에서 야생형 KO7 (WT KO7) 또는 pIII (앰버 KO7) 헬퍼 파지에 앰버 돌연변이을 보유하는 변형된 M13KO7을 사용하여 생산하였다. 이를 마우스 항-M13-HRP 접합체와 인큐베이션한 후에 450 nm에서의 TMB 기질 OD 측정에 의해 결합을 검출하였다. 앰버 KO7의 사용은 WT KO7가 파지 생산에 사용된 경우에 동일한 파지미드에 의해 달성된 수준 (폐쇄된 사각형)에 비해 저-디스플레이 파지미드로부터 보다 높은 디스플레이 수준 (폐쇄된 삼각형)을 발생시켰다 (도 9). 앰버 KO7 및 저-디스플레이 파지미드를 사용한 경우에 Fab 디스플레이의 수준 (폐쇄된 삼각형)은 또한 WT KO7 및 고-디스플레이 파지미드를 사용한 경우에 관찰된 Fab 디스플레이의 수준 (개방 다이아몬드형)과 유사하였다 (도 9). 실시예 5: 나이브 HC -단독 라이브러리의 생성을 위한 원핵 및 진핵 세포의 발현 및 분비 시스템의 생성 및 파지 패닝을 위한 이러한 시스템의 사용 실시예 3에 기재된 양쪽 HC 및 LC (pDV5.0 및 pDV6.0) 상의 원핵 및 진핵 프로모터를 특징으로 하는 직접 및 간접 융합 벡터 뿐만 아니라, 본 발명자들은 Fab LC가 STII 신호 서열에 융합되며, 오직 박테리아 PhoA 프로모터에 의해 구동되는 반면 Fab HC (포유동물 세포에서 전장 hIgG1 HC의 발현을 위한 유전자-III-합성 인트론 및 hIgG Fc 서열 함유)는 진핵 CMV 프로모터 및 원핵 PhoA 프로모터 둘 다에 의해 구동되는 변형된 직접 융합 이중 벡터 구축물 (도 14에 제시된 pDV.6.5)을 생성하였다. 이러한 구축물을 사용하여 이전에 기재된 합성 인간 Fab 라이브러리를 재현하였으며 (문헌 [Lee, et al., Journal of Molecular Biology, 340. 1073-1093 (2004)]), 여기서 다양성은 오직 HC에 도입된다. 이러한 벡터로부터 전장 IgG의 발현은 LC를 코딩하는 포유동물 발현 벡터의 공동형질감염을 필요로 한다. 파지-디스플레이된 라이브러리를 올리고뉴클레오티드-지정 (쿤켈(Kunkel)) 돌연변이유발, 및 정지 코돈 (TAA)이 모든 3개의 중쇄 CDR에 위치한 pDV.6.5의 "정지 주형" 버전을 사용하여 생성하였다. 이러한 정지는 CDRH1, H2 및 H3을 코딩하는 영역에 걸쳐 어닐링된 올리고뉴클레오티드 및 축중성 코돈으로의 무작위화를 위해 선택된 위치에서 대체된 코돈의 혼합물에 의한 돌연변이유발 반응 동안 복구되었다. 돌연변이유발 반응물을 XL1-블루 세포로 전기천공시키고, 배양물을 앰버.KO7 헬퍼 파지, 50 μg/ml 카르베니실린 및 25 μg/ml 카나마이신이 보충된 2YT 브로쓰에서 온도 이동 프로토콜 (4시간 동안 37℃, 이어서 30℃에서 36시간)을 이용하여 성장시켰다. 파지를 PEG/NaCl로의 침전에 의해 배양 배지로부터 수확하였다. 각각의 전기천공 반응은 ~5 μg의 DNA를 사용하였고, 1x10 8 -7x10 8 개 형질전환체가 생성되었다. 이러한 벡터에서 생성된 나이브 파지 라이브러리의 패닝은 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대해 수행하였다. 파지 라이브러리 분류를 위해, 단백질 항원을 맥시소르프 이뮤노플레이트 상에 고정시키고, 라이브러리를 4 내지 5 라운드의 결합 선택에 적용하였다. 대안적으로 웰을 대안 라운드에서 BSA 또는 카세인을 사용하여 차단하였다. 라운드 3 내지 5로부터 선택된 무작위 클론을 파지 ELISA를 이용하여 검정함으로써, 비-특이적 결합을 확인하기 위해 표적 항원 (VEGF) 및 비관련 단백질 (Her2)에 대한 결합을 비교하였다. 간략하게, 파지 클론을 앰버.KO7 헬퍼 파지가 보충된 1.6 mL의 2YT 브로쓰에서 밤새 성장시켰다 (실시예 4). 상청액을 고정된 항원 또는 비관련 단백질-코팅된 플레이트에 1시간 동안 실온에서 결합시켰다. 세척 후에, 결합된 파지를 HRP-접합된 항-M13 항체를 이용하여 검출하고 (실온에서 20분), 이어서 TMB 기질로 검출하였다. 본 발명자들은 VEGF에 대해 ELISA 양성이나, 비관련 대조 단백질 (Her2)에 대해서는 그렇지 않은 다중 클론을 단리하였다 (도 10 - 막대 그래프). 이어서, VEGF에 대한 특이성을 입증한 이들 클론으로부터의 DNA를 사용하여, 전장 hIgG1의 발현을 위한 소규모 현탁 배양물 중 293 세포에서 공통 LC를 코딩하는 포유동물 발현 벡터로의 공동형질감염에 의해 전장 IgG를 발현시켰다. 1 mL 배양물을 제조업체의 지침에 따라 에피펙타민(Expifectamine) 또는 JetPEI를 사용하여 형질감염시키고, 37℃/8% CO 2 에서 5-7일 동안 인큐베이션하였다. 확대된 형질감염을 30 mL 293 세포에서 수행하였다. 이어서 배양 상청액을 사용하여 비아코어 T100 기기 상에서의 Fc 포획 검정에서 IgG를 VEGF 결합에 대해 스크리닝하였다 (도 11). 1 mL 배양물로부터의 IgG 상청액을 사용하여 항원 결합에 대해 스크리닝하였다. 항-인간 Fc 포획 항체를 시리즈 S CM5 센서 칩 상에 고정시켰다 (~10,000 RU). 이후에, 상청액을 유동 세포 2, 3 및 4 상에서 유동시켜 (4분 동안 5 μL/분) 상청액으로부터의 IgG 포획 (50-150 RU)을 허용하고, 그 후에 항원 (100-1000 nM)을 고정된 IgG 상에서 유동시켜 (2분 동안 30 μL/분) 결합 반응을 측정하였다. 양성 결합제의 서열분석은 양성 결합 특성을 갖는 8개의 특유한 서열 (중쇄 CDR 서열은 도 12에 제시됨)을 보여준다 (도 12). 파지 ELISA (도 10) 및 비아코어 데이터 (도 11)와 합한 서열분석 데이터 (도 12)를 이용하여 추가의 분석을 위한 8개의 항-VEGF 클론의 풀을 선택하였다. 이러한 8개의 클론에 대한 발현을 100 mL 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물까지 확대시키고 (도 15 참조), 정제된 물질을 사용하여 수용체-차단 ELISA를 통해 항-VEGF 클론이 VEGF의 그의 동족 수용체 중 하나 (VEGFR1)에 대한 결합을 차단하는 능력을 평가하였다. 비오티닐화 hVEGF165 (2 nM)를 PBS/0.5% BSA/0.05% 트윈-20에서 3배 연속 희석된 항-VEGF 항체 (200 nM 최고 농도)와 인큐베이션하였다. 실온에서 1-2시간 인큐베이션한 후에, 혼합물을 VEGFR1-고정된 플레이트에 전달하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, VEGFR-1 결합된 VEGF를 스트렙타비딘-HRP에 의해 30분 동안 검출한 후에 TMB 기질로 발현시키고, IC50 값을 측정하였다. 본 발명자들은 상업적인 항-VEGF 항체인 베바시주맙과 대등한 IC 50 을 갖는 1개의 클론 (VEGF55)을 확인하였다 (도 13). 이러한 방식으로, 본 발명자들은 파지 패닝으로부터 IgG 발현으로 직접 이동시키고, 클론의 풀을 단일 후보에 이르기까지 선별할 수 있었으며, 이는 모두 서브클로닝을 필요로 하지 않았다. 요컨대, 이러한 변형된 직접 융합 이중 벡터 (pDV.6.5)는 이. 콜라이에서 무작위화된 중쇄 및 불변 경쇄를 갖는 파지 디스플레이 라이브러리의 구축에 사용될 수 있었으며, 또한 이후에 경쇄 발현 벡터로 보충된 경우에 서브클로닝하지 않고 포유동물 세포에서 선택된 클론을 천연 IgG1로서 발현시키는데 사용될 수 있었다. 포유동물 CMV 프로모터가 HC의 상류에 단독으로 존재하기 때문에, pDV는 이. 콜라이에서 Fab LC 및 Fab HC-pIII를 둘 다 발현하지만, 포유동물 세포에서는 hIgG1HC만을 발현한다. 이러한 벡터를 사용하여 나이브 합성 Fab 라이브러리 결합 다중 항원으로부터 Fab 단편을 선택하고, 이어서 변형된 직접 융합 이중 벡터 클론을 공통 LC를 코딩하는 포유동물 발현 벡터로 공동형질감염시킴으로써 포유동물 293 및 CHO 세포에서 선택된 클론으로부터 전장 천연 hIgG1을 발현시켰다. 천연 IgG1을 이러한 발현 실험으로부터 수득하여 여러 검정을 수행함으로써, ELISA 및 비아코어에 의해 결합 활성을 보여주는 8개의 특유한 항-VEGF 클론의 풀로부터, 본 발명자들은 본래 파지 벡터 클론으로부터 HC 서열을 서브클로닝할 필요 없이 IgG 포맷에서 후보의 용액내 거동, 비-특이적 결합 및 생물학적 활성을 평가하여 단일 후보에 이르기까지 선별할 수 있었다. 상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전체내용이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. ET AL. <120> EXPRESSION AND SECRETION SYSTEM <130> P4825R1-WO <140> <141> <150> 61/819,063 <151> 2013-05-03 <150> 61/852,483 <151> 2013-03-15 <150> 61/668,397 <151> 2012-07-05 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Ala Glu Asp Ile Glu Phe Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Glu Thr 1 5 10 15 Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser Phe Thr Asn 20 25 30 Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu Gly 35 40 45 Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly Asp Glu Thr 50 55 60 Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile Pro Glu Asn 65 70 75 80 Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro Ile Pro Gly 100 105 110 Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro Gly Thr Glu 115 120 125 Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser Gln Pro Leu 130 135 140 Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg Gln Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp Pro Val Lys 165 170 175 Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met Tyr Asp Ala 180 185 190 Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser Gly Phe Asn 195 200 205 Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro 210 215 220 Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp 260 265 270 Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala 275 280 285 Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val 290 295 300 Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser 305 310 315 320 Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn 325 330 335 Ser Gln Met Ala Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn 340 345 350 Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro 355 360 365 Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp 370 375 380 Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala 385 390 395 400 Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys 405 410 415 Glu Ser <210> 2 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala 1 5 10 15 Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu 20 25 30 Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly 35 40 45 Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly 50 55 60 Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln 65 70 75 80 Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr 85 90 95 Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe G ly 100 105 110 Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu 115 120 125 Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr 130 135 140 Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser 145 150 155 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Met Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Val Arg Ala <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 atgatgaaat ttaccgtggt ggcggcggcg ctgctgctgc tgggcgcggt ccgcgcg 57 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (33)..(33) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (36)..(36) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (39)..(39) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (42)..(42) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (45)..(45) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (51)..(51) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (54)..(54) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (57)..(57) <223> a, c, t or g <400> 5 atgatgaant tnacngtngt ngcngcngcn ctnctnctnc tnggngcngt ncgngcn 57 <210> 6 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 6 Ala Ser Ile Ala Arg Leu Arg Glu Arg Val Lys Thr Leu Arg Ala Arg 1 5 10 15 Asn Tyr Glu Leu Arg Ser Arg Ala Asn Met Leu Arg Glu Arg Val Ala 20 25 30 Gln Leu Gly Gly Cys 35 <210> 7 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Des cription of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7 Ala Ser Leu Asp Glu Leu Glu Ala Glu Ile Glu Gln Leu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Asn Tyr Ala Leu Glu Lys Glu Ile Glu Asp Leu Glu Lys Glu Leu Glu 20 25 30 Lys Leu Gly Gly Cys 35 <210> 8 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 8 Glu Glu Lys Ser Arg Leu Leu Glu Lys Glu Asn Arg Glu Leu Glu Lys 1 5 10 15 Ile Ile Ala Glu Lys Glu Glu Arg Val Ser Glu Leu Arg His Gln Leu 20 25 30 Gln Ser Val Gly Gly Cys 35 <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Thr Ser Arg Leu Glu Gly Leu Gln Ser Glu Asn His Arg Leu Arg Met 1 5 10 15 Lys Ile Thr Glu Leu Asp Lys Asp Leu Glu Glu Val Thr Met Gln Leu 20 25 30 Gln Asp Val Gly Gly Cys 35 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Se quence: Synthetic peptide" <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> /note="This region may encompass 'Met' or 'Met-Thr' or be absent" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotation for the variant position" <400> 10 Met Thr Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ala Val Arg Ala 20 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> variation <222> (1)..(6) <223> /replace=" " <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> /note="This region may encompass 'ATG' or 'ATGACC' or be absent" <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> /note="Variant nucleotides given in the sequence have no preference with respect to those in the annotation for the variation position" <220> <221> modified_base <222 > (12)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (33)..(33) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (36)..(36) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (39)..(39) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (42)..(42) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (45)..(45) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (51)..(51) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (54)..(54) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (57)..(57) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (60).. (60) <223> a, c, t or g <400> 11 atgaccatga anttnacngt ngtngcngcn gcnctnctnc tnctnggngc ngtncgngcn 60 <210> 12 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Ala Ser Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln 1 5 10 15 Asn Tyr Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala 20 25 30 Gln Leu Gly Gly Cys 35 <210> 13 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 13 Ala Ser Ile Asp Glu Leu Gln Ala Glu Val Glu Gln Leu Glu Glu Arg 1 5 10 15 Asn Tyr Ala Leu Arg Lys Glu Val Glu Asp Leu Gln Lys Gln Ala Glu 20 25 30 Lys Leu Gly Gly Cys 35 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 14 Ala Gly Ser Cys 1 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note ="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Cys Pro Pro Cys Pro Gly 1 5 <210> 16 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 16 atgatgaaat ttaccgttgt tgctgctgct ctgctacttc ttggagcggt ccgcgca 57 <210> 17 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 17 atgatgaaat ttactgttgt tgcggctgct cttctccttc ttggagcggt ccgcgca 57 <210> 18 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 18 atgatgaaat ttactgttgt cgctgctgct cttctacttc ttggagcggt ccgcgca 57 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 19 Met Thr Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ala Val Ar g Ala 20 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 20 Met Lys Phe Thr Val Val Ala Ala Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ala Val 1 5 10 15 Arg Ala <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (33)..(33) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (36)..(36) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (39)..(39) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (42)..(42) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (45)..(45) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (51)..(51) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (54)..(54) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (57)..(57) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (60)..(60) <223> a, c, t or g <400> 21 atgaccatga anttnacngt ngtngcngcn gcnctnctnc tnctnggngc ngtncgngcn 60 <210> 22 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (9)..(9) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_ba se <222> (21)..(21) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (33)..(33) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (36)..(36) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (39)..(39) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (42)..(42) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (45)..(45) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (51)..(51) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (54)..(54) <223> a, c, t or g <400> 22 atgaanttna cngtngtngc ngcngcnctn ctnctnctng gngcngtncg ngcn 54 <210> 23 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 23 gtgaattatc accgtcaccg acctaggcca tttgggaatt agagc ca 47 <210> 24 <211> 1275 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 24 gtgaaaaaat tattattcgc agttccttta gttgttcctt tctattctca ctcagctgag 60 actgttgaaa gttgtttagc aaaaccccat acagaaaatt catttactaa cgtctggaaa 120 gacgacaaaa ctttagatcg ttacgctaac tatgagggtt gtctgtggaa tgctacaggc 180 gttgtagttt gtactggtga cgaaactcag tgttacggta catgggttcc tattgggctt 240 gctatccctg aaaatgaggg tggtggctct gagggtggcg gttctgaggg tggcggttct 300 gagggtggcg gtactaaacc tcctgagtac ggtgatacac ctattccggg ctatacttat 360 atcaaccctc tcgacggcac ttatccgcct ggtactgagc aaaaccccgc taatcctaat 420 ccttctcttg aggagtctca gcctcttaat actttcatgt ttcagaataa taggttccga 480 aataggcagg gggcattaac tgtttatacg ggcactgtta ctcaaggcac tgaccccgtt 540 aaaacttatt accagtacac tcctgtatca tcaaaagcca tgtatgacgc ttactggaac 600 ggtaaattca gagactgcgc tttccattct ggctttaatg aggatccatt cgtttgtgaa 660 tatcaaggcc aatcgtctga cctgcctcaa cctcctgtca atgctggcgg cggctctggt 720 ggtggttctg gtggcggctc tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 780 ggctctgagg gaggcggttc cggtggtggc tctggttccg gtgattttga ttatgaaaag 840 atggcaaacg ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct 900 gacgctaaag gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc 960 attggtgacg tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct 1020 aattcccaaa tggcctaggt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt 1080 caatatttac cttccctccc tcaatcggtt gaatgtcgcc cttttgtctt tagcgctggt 1140 aaaccatatg aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg 1200 tttcttttat atgttgccac ctttatgtat gtattttcta cgtttgctaa catactgcgt 1260 aataaggagt cttaa 1275 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 25 Thr Ser Tyr Ala 1 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 26 Gly Gly Ile Ser Pro Ty r Gly Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Ala Arg Pro Gly Pro Gly Gly Gly Phe Asp Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 28 Thr Asp Tyr Ala 1 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 29 Gly Phe Ile Tyr Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 30 Ala Arg Glu Val His Phe Trp Tyr Tyr Ser Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 31 Ser Ser T yr Gly 1 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 32 Gly Trp Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 33 Ala Arg Phe Gly Tyr Asp Val Leu Arg Tyr Trp Asp Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Met Ala Tyr <210> 34 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 34 Ser Asn Thr Ser 1 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 35 Gly Trp Ile Tyr Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Asn 1 5 10 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 36 Ala Arg Phe Gly Tyr Gln His Glu Val Gln Phe Ser Asp His Tyr Tyr 1 5 10 15 Ala Met Asp Tyr 20 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 37 Ser Gly Thr Tyr 1 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 38 Gly Phe Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Tyr Thr Asp 1 5 10 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 39 Ala Arg Leu Gln Phe Asn Thr Met Trp Val Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 40 Ser Ser Tyr Ala 1 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 41 Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn 1 5 1 0 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 42 Ala Arg Ile Gly Phe Gly Ser Leu Cys Phe Asp Cys Asn Leu Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Tyr 20 <210> 43 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 43 Ser Ser Thr Ala 1 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 44 Ala Gly Ile Thr Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 45 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 45 Ala Arg Ile Gly Ser Gly Ser His Trp Ser Ala Phe Asp His Tyr Tyr 1 5 10 15 Ala Met Asp Tyr 20 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400 > 46 Ser Ser Tyr Ala 1 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 47 Gly Ser Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Asn 1 5 10 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 48 Ala Arg Thr Gly Phe Gly Gly Ile Val Val Asp Trp Ser Leu Tyr Tyr 1 5 10 15 Gly Met Asp Tyr 20 |
