표면 앵커링된 경쇄 미끼 항체 디스플레이 시스템

표면 앵커링된 경쇄 미끼 항체 디스플레이 시스템 {SURFACE ANCHORED LIGHT CHAIN BAIT ANTIBODY DISPLAY SYSTEM}

본 출원은 2012년 5월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/645,763을 우선권 주장하고, 이 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명의 분야는 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하기 위한 항체 디스플레이 시스템 및 사용 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

파지 디스플레이는 항체 라이브러리를 구축하고 스크리닝하기 위한 주지된 기술로서, 이에 의해 관심 단백질이 박테리오파지 코트 단백질에 대한 폴리펩티드 융합체로서 발현되고, 이어서 고정된 또는 가용성인 비오티닐화 리간드에 결합하는 것에 의해 스크리닝된다. 그러나, 전통적인 파지 디스플레이는 몇몇 단점이 있다. 예를 들어, 일부 진핵생물의 분비 단백질 및 세포 표면 단백질은 번역후 변형, 예컨대 글리코실화 또는 광범위한 디술피드 이성질체화를 요구하고, 이는 박테리아 세포에서는 이용가능하지 않다.

현재의 효모 표면 항체 디스플레이 시스템, 예컨대 저온 포획(cold capture) 또한 다양한 단점을 겪는다. 저온 포획 항체 디스플레이 시스템에서는, 낮은 온도에서 숙주 세포 운송 소포로부터의 항체 방출 과정이 지연되어, 분비된 항체가 항원 결합에 대해 세포 표면 상에서 검정될 수 있다. 저온 포획 방법은 낮은 신호-대-소음 비로 불리하고, 표적 항원에 대한 특이성이 있는 항체의 확인이 항체의 세포 발현 수준에 크게 좌우된다.

친화도 매트릭스 시스템은 항체를, 예를 들어 비오틴에 의해 숙주 세포 표면에 커플링시키고, 여기에서 항체가 항원 결합에 대해 검정될 수 있다. 친화도 매트릭스 시스템은 항체 클론들 간의 교차-오염의 높은 발생률을 나타낸다. 항체가 숙주 세포로부터 탈커플링될 수 있고, 따라서 항체가 그의 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 연결을 잃을 수 있다.

전장 항체 디스플레이 시스템은 세포 표면 앵커(anchor) 단백질에 융합된 이뮤노글로불린 결합 단백질, 예컨대 단백질 A에 결합하는 것에 의해 전장 항체를 숙주 세포 표면에 테더링(tethering)시킨다. 숙주 세포는 항체 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유한다. 전형적으로, 항체의 결합은 이뮤노글로불린 결합 단백질이 세포 표면 상에서 발현된 후에 발생한다. 따라서, 이러한 시스템은 항체를 발현하지 않는 숙주 세포에 대한 항체의 일부 오류 결합에 이른다. 본 발명의 시스템 및 방법은 이러한 이전의 방법들에 비해 수많은 장점을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은, 부분적으로, 현재 이용가능한 시스템의 단점을 겪지 않는 항체 디스플레이 시스템을 제공한다. 이러한 디스플레이 시스템은 특이적인 바람직한 생물학적 성질, 예컨대 Fc 수용체 결합 친화도를 보유하는 신규 Fc 변이체의 발견을 허용한다. 이는 Fab 영역의 조작을 또한 허용한다. 기존의 방법은 배양 배지 내의 분비 후에 세포 표면 상에 항체를 포획하는 것에 의존하였다. 본 발명의 방법 및 포획 시스템은 분비 전에 항체를 포획하는 것에 의해 동일한 배양물 내의 클론들 간의 교차-오염을 방지한다. 유리하게는, 본 발명의 실시양태는 디스플레이된 분자의 공분비를 허용하여, 추가적인 시험관내 분석을 허용한다.

본 발명은

(a) 단리된 숙주 세포;

(b) 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편에 융합된 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 미끼;

(c) 이뮤노글로불린 경쇄 가변 영역을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및

(d) 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드

를 포함하는 항체 디스플레이 시스템을 제공한다.

임의로, 항체 디스플레이 시스템은

(i) 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 상기 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄를 포함하는 비-테더링 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및/또는

(ii) 미끼의 이뮤노글로불린 경쇄와 복합체화된 이뮤노글로불린 중쇄와 복합체화된 1가 항체 단편

을 추가로 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 유전자적으로 다양한 이뮤노글로불린 경쇄 집단으로부터의 것이고/거나; 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 유전자적으로 다양한 이뮤노글로불린 중쇄 집단으로부터의 것이다.

본 발명의 추가적인 실시양태에서, 숙주 세포는 조절가능한 프로모터와 작동가능하게 회합된 미끼를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

특정 실시양태에서, 숙주 세포는 피키아( Pichia ) 세포 또는 사카로미세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae ) 세포이다.

본 발명은 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편에, 임의로 펩티드 링커에 의해 융합된 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 기능적 단편을 포함하며, 임의로 아미노-말단에서 신호 펩티드에 융합된 단리된 미끼 폴리펩티드를 또한 제공한다. 이러한 미끼 폴리펩티드는 표면 앵커 폴리펩티드가 SED-1 또는 그의 기능적 단편인 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 기능적 단편은 카파 또는 람다 불변 이뮤노글로불린 도메인을 포함한다.

이러한 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 임의의 단리된 폴리뉴클레오티드, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포가 본 발명에 포함된다. 추가로, 본 발명은 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 단리된 숙주 세포 (예를 들어, 진핵 숙주 세포 (차이니즈 햄스터 난소 세포, 즉 CHO 세포가 포함됨)이고, 하등 진핵 효모 또는 사상 진균 숙주 세포, 예컨대 피키아, 예를 들어 피키아 파스토리스( Pichia pastoris ) 세포가 또한 포함됨)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 미끼 폴리펩티드는 세포 막 표면 상에 위치한다.

본 발명은 임의로 항원과 복합체화된, 상기 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄를 포함하는 비-테더링 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 및/또는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 추가로 포함하는, 본 발명의 숙주 세포 중 임의의 것 (예를 들어, 상기 참조)를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.

본 발명은

(a) 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및 미끼의 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 기능적 단편과 복합체화되는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어 피키아, 예컨대 피키아 파스토리스); 및

(b) 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편 (예를 들어, SED1)에 융합된 이뮤노글로불린 경쇄 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 미끼

를 포함하는 항체 디스플레이 시스템을 항원과 접촉시키는 단계; 및

상기 미끼 및 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 포함하는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 세포 표면에서 상기 항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계

를 포함하고, 이때 상기 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 세포 표면에서 상기 항원에 특이적으로 결합하는 경우, 숙주 세포로부터 분비된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 결정되는 것인,

숙주 세포로부터 분비된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 확인된 폴리뉴클레오티드를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 상기 미끼의 발현을 억제하는 단계, 및 상기 항원에 대한 상기 분비된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 추가적인 실시양태에서, 이러한 방법은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 이뮤노글로불린 쇄를 재조합적으로 발현시키는 단계, 및 임의로, 상기 이뮤노글로불린을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 단계, 및 임의로, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 조합하는 것을 포함하는 제약 제제를 제조하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명은

(a) 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어 피키아, 예컨대 피키아 파스토리스)를 제공하는 단계,

(b) 상기 숙주 세포 내로, 표면 앵커 폴리펩티드에 융합된 경쇄 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 미끼, 및

(i) 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 및

(ii) 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드

를 도입하는 단계

를 포함하는, 항체 디스플레이 시스템을 제조하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명은 본원에 기술된 방법의 생성물인 항체 디스플레이 시스템을 또한 제공한다.

본 발명은 인간 유사 N-글리칸이 있는 이종 단백질을 생산할 수 있는 임의의 당조작(glycoengineered) 피키아를 숙주로서 이용하는 항체 디스플레이 시스템을 또한 제공한다.

본 발명은 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편에 융합된 경쇄 이뮤노글로불린 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 미끼를 포함하는 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어 피키아, 예컨대 피키아 파스토리스) 내로, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 및 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 상기 쇄로부터 형성되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 이때 상기 미끼는 조절가능한 프로모터와 작동가능하게 회합되고, 상기 이뮤노글로불린 쇄가 발현될 때 미끼 발현은 억제되는 것인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명은

(a) 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 글리코실화 제어형 진핵 숙주 세포 (예를 들어 피키아, 예컨대 피키아 파스토리스); 및

(b) 상기 숙주 세포의 표면 상의 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편 (예를 들어, SED1)에 융합된 경쇄 이뮤노글로불린 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 미끼

를 포함하는 항체 디스플레이 시스템을 항원과 접촉시키고, 이때 상기 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린은 숙주 세포 표면 상에서 상기 이뮤노글로불린 중쇄 및 이뮤노글로불린 경쇄와 복합체화되고, 상기 중쇄 또는 경쇄는 당을 포함하는 것인 단계;

상기 미끼/항원-결합 단편이 상기 항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계;

항원에 대한, 상기 당을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화도를 결정하는 단계; 및

항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를, 상기 당이 결여되어 있지만 다른 면에서는 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도와 비교하는 단계

를 포함하고, 이때 상기 당을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 당이 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 높은 경우, 당은 항원에 대한 친화도를 증가시키는 것으로 결정되고/되거나; 상기 당을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 당이 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 낮은 경우, 당은 항원에 대한 친화도를 감소시키는 것으로 결정되는 것인,

항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 당의 효과를 결정하는 방법을 또한 제공한다.

본 발명은 (a) 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 돌연변이(들)을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어 피키아, 예컨대 피키아 파스토리스); 및 (b) 상기 진핵 숙주 세포의 표면 상의 표면 앵커 폴리펩티드 (예를 들어, SED1) 또는 그의 기능적 단편에 융합된 경쇄 이뮤노글로불린 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 미끼를 포함하는 항체 디스플레이 시스템을 Fc 수용체 또는 렉틴과 접촉시키고, 이때 상기 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린은 중쇄 이뮤노글로불린과 복합체화되어, 숙주 세포 표면 상에서 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체 복합체를 형성하는 것인 단계; 및 상기 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 상기 Fc 수용체 또는 렉틴에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계; 및 Fc 수용체 또는 렉틴에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화도를 결정하는 단계; 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를, 상기 돌연변이가 결여되어 있지만 다른 면에서는 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도와 비교하는 단계를 포함하고, 이때 상기 돌연변이를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 돌연변이가 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 높은 경우, 돌연변이는 Fc 수용체 또는 렉틴에 대한 중쇄의 친화도를 증가시키는 것으로 결정되고/되거나, 상기 돌연변이를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 돌연변이가 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 낮은 경우, 돌연변이는 Fc 수용체 또는 렉틴에 대한 친화도를 감소시키는 것으로 결정되는 것인, 이뮤노글로불린 중쇄 Fc 영역에서의 돌연변이가 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b)) 또는 렉틴 (예를 들어, DC-SIGN (CD209) 및 마우스 오르토로그(ortholog) SIGN-R, DCIR (수지상 세포 억제 수용체))에 대한 상기 쇄의 결합을 증가시키는지 또는 감소시키는지 여부를 결정하는 방법을 또한 제공한다.

도면의 간단한 설명
도 1: 항-PCSK9 Lc 미끼 카세트를 함유하는 pGLY11714의 플라스미드 지도.
도 2: Lc-Sed1p 항체 디스플레이 시스템의 개략도. IgG 경쇄 (Lc)를 포함하는 DNA 서열이 가요성 링커를 통해 세포 벽 앵커링 파트너 (이러한 경우에는 에스. 세레비지아에( S. cerevisiae ) GPI 앵커 Sed1p이 사용됨)에 융합된다. 분비가능한 전장 IgG 분자와 함께 동일한 숙주에서 공발현되는 경우에, 앵커링된 융합체 (미끼)의 Lc 부분이 ER에서 IgG 분자의 중쇄 (Hc) 영역과 이종이량체화되어, 디술피드 가교를 형성한다. 표면에 디스플레이된 절반 IgG 분자가 분비된 중쇄 및 경쇄 (H+L)와 여전히 쌍을 이룰 수 있기 때문에, 이러한 복합체는 전장 IgG 분자 (2개의 중쇄가 2개의 경쇄와 쌍을 이룸, 즉 H2+L2)의 표면 디스플레이를 초래한다. 동시에, 가용성 전장 IgG의 조립이 동일한 확률로 발생하여, 배양 배지 내의 2가물 (H2+L2)의 분비를 초래한다.
도 3a-d: 인간 IgG 및 Lc-SED1 미끼 발현 카세트를 발현하는 당조작 효모의 FACS 분석. 조작된 세포 배양물이 BMMY + PMTi 억제제에서의 인큐베이션에 의해 유도되었다. 세포를 APC 635-표지 마우스 항-인간 Fc, His 태그(tag)가 부착된 Hs FcγRI, Hs FcγRIIB, 또는 Mm FcγRIIB에 이어서, 다이라이트(DyeLight) 488-표지 항-His로 표지하고, 유동 세포측정법으로 검정하여, 디스플레이된 IgG의 Fc 결합을 검출하였다. 도 3a는 Lc-Sed1p 미끼가 없는 모 항-Her2 균주를 나타낸다. 도 3b는 Lc-Sed1p 미끼를 함유하는 항 Her2 IgG1 균주를 나타낸다. 도 3c는 Fc 영역 내의 돌연변이 (F243A/V264A)를 보유하는 항-PCSK9 IgG2와 공발현된 Lc-Sed1p를 나타낸다. 도 3d는 Fc 영역 내의 돌연변이 F243A/V264A/S267E/L328F를 보유하는 항-PCSK9 IgG2와 공발현된 Lc-Sed1p를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 디스플레이 모드 및 완전 항체 분비 모드를 동시에 특색으로 하는 항체 표면 디스플레이를 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 숙주 세포는 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab') ₂ 또는 단일쇄 항체)를 분비하고, 세포 표면 상에 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 디스플레이한다. 이러한 방법은 세포 표면 (예를 들어, 세포 벽)에 공유결합으로 커플링되거나, 세포 막 상에 있거나, 또는 (부분적으로 또는 완전히) 세포 막 내에 (예를 들어, 막횡단 단백질로서) 매립되고, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 클론 공급원 또는 라이브러리로부터의 단일한 특정 항체 또는 단편)의 이뮤노글로불린 쇄와 공발현되는 "미끼"로서 세포 표면 단백질, 예컨대 SED-1과의 이뮤노글로불린 경쇄 (예를 들어, VL-CL; 예를 들어, 인간) 융합체 (예를 들어, N- 또는 C-말단에서 융합됨)을 사용한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 정상적으로 항체 분자가 이량체화되어 완전 항체 분자를 형성하는 소포체에서, 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린이 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄와 이종이량체화되고 (예를 들어, 1가 항체 단편을 형성함), 이러한 복합체가 세포 표면 상에 디스플레이된다. 세포 표면 상의 경쇄/중쇄 복합체, 예컨대 1가 항체 단편이 항원에 결합할 수 있다.

이론에 제한되기를 원치 않으면서, 항체 경쇄를 표면에 디스플레이하고, 동일한 숙주에서 공발현되는 항체 분자의 중쇄와 이러한 경쇄의 공유결합 상호작용을 이용함으로써 본 발명의 실시양태들이 작용된다. 이러한 상호작용은 IgG 분자를 세포 표면 상에 테더링한다 (도 2 참조). 이러한 디스플레이는 특이적인 원하는 생물학적 성질, 예컨대 Fc 수용체 결합 친화도를 보유하는 신규 Fc 변이체의 발견을 허용한다. 이는 Fab 영역의 조작을 또한 허용한다. 기존의 방법은 배양 배지 내의 분비 후에 세포 표면 상에 항체를 포획하는 것에 의존하였다. 본 발명의 방법 및 포획 시스템은 분비 전에 항체를 포획하는 것에 의해 동일한 배양물 내의 클론들 간의 교차-오염을 방지한다. 유리하게는, 본 발명의 실시양태는 디스플레이된 분자의 공분비를 허용하여, 추가적인 시험관내 분석을 허용한다.

미끼 (예를 들어, 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린)와 중쇄 이뮤노글로불린 간의 복합체는 "미끼/항원-결합 단편"으로 지칭될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 디스플레이 시스템 및 이같은 시스템을 제조 또는 사용하는 방법은, 미끼가 세포 표면 단백질에 융합된 임의의 중쇄 이뮤노글로불린 쇄 또는 이의 단편, 예를 들어 Hc-Sed1p를 포함하는 실시양태를 배제한다.

본 발명의 항체 시스템은, 미끼가 숙주 세포 표면에서 발현될 수 있는, 예를 들어 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 세포 표면에 있는 동안 항원에 결합할 수 있는 임의의 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 포유동물 세포, 박테리아)에서 사용될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 미끼가 없는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 형성이 여전히 발생하여, 배양 상청액 내로의 항체 또는 단편의 분비를 허용한다. 분비된 항체 또는 단편은, 예를 들어 단리 후에, 예를 들어 전임상 연구를 위해 사용될 수 있다.

원한다면, 항체 또는 단편만 생산하는 균주 (미끼 없음)가 생성되도록 미끼가 녹-아웃(knock-out) 또는 돌연변이될 수 있거나, 이의 발현이 꺼질 수 있다.

분자 생물학

본 발명에 따르면, 당업계의 기술 내의 통상적인 분자 생물학, 미생물학, 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이같은 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] (본원에서 ["Sambrook, et al., 1989"]); [DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (DN Glover ed. 1985)]; [Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (BD Hames & SJ Higgins eds. (1985))]; [Transcription And Translation (BD Hames & SJ Higgins, eds. (1984))]; [Animal Cell Culture (RI Freshney, ed. (1986))]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986))]; [B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; [FM Ausubel, et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)]을 참조한다.

라이브러리는, 일반적으로, 관련되었지만 다양한 폴리뉴클레오티드들의 선집이고, 이들은 일반적으로 공통 벡터 골격 내에 존재한다. 예를 들어, 경쇄 또는 중쇄 이뮤노글로불린 라이브러리는, 공통 벡터 골격 내에, 뉴클레오티드 서열 면에서 다양하지만 관련된 경쇄 및/또는 중쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 함유할 수 있고, 예를 들어 이러한 이뮤노글로불린들은, 예를 들어 본 발명의 항체 디스플레이 시스템에서, 다른 이뮤노글로불린과 복합체화되는 능력 및 특정 항원에 결합하는 능력 면에서 기능적으로 다양하다. 예를 들어, 공통 벡터 골격 내의 폴리뉴클레오티드 삽입물들은 오직 1개 또는 2개 또는 수개의 뉴클레오티드만큼 상이하여, 예를 들어 90％ 이상의 서열 동일성 (예를 들어, 95 또는 99％)을 나타낼 수 있다. 라이브러리는 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab') ₂ 또는 단일쇄 항체)을 형성하는 이뮤노글로불린을 코딩할 수 있다.

세포 내의 전사 및/또는 번역 제어 서열이 코딩 서열의 RNA, 바람직하게는 mRNA로의 RNA 폴리머라제 매개 전사를 지시하고, 그 후 이러한 RNA가 스플라이싱되고 (인트론을 함유하는 경우), 코딩 서열이 코딩하는 단백질로 번역될 수 있을 때, 코딩 서열은 세포 내의 전사 및/또는 번역 제어 서열의 "제어 하"에 있거나, 이와 "기능적으로 회합"되거나, 또는 이와 "작동가능하게 회합"된다. 따라서, 미끼를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터, 예컨대 조절가능한 프로모터 또는 구성적 프로모터와 작동가능하게 회합될 수 있다.

본원에서 논의되는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 일부를 형성한다. "폴리뉴클레오티드", "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥의 DNA 및 RNA를 포함한다.

예를 들어 본 발명의 항체 디스플레이 시스템의 이뮤노글로불린 쇄 또는 성분 (예를 들어, 미끼)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 한 실시양태에서, 천연 조절 (발현 제어) 서열이 플랭킹(flanking)될 수 있거나, 또는 예를 들어 프로모터, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 기타 리보솜 결합 부위 서열, 인핸서, 반응 요소, 억제인자, 신호 서열, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 5'- 및 3'-비-코딩 영역 등이 포함되는 이종 서열과 회합될 수 있다.

예를 들어 본 발명의 항체 디스플레이 시스템의 이뮤노글로불린 쇄 또는 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동가능하게 회합될 수 있다. "프로모터" 또는 "프로모터 서열"은, 본 발명의 한 실시양태에서, (예를 들어, 직접적으로 또는 다른 프로모터-결합 단백질 또는 물질을 통해) 세포 내에서 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 코딩 서열의 전사를 개시시킬 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은, 일반적으로, 이의 3' 말단에서 전사 개시 부위가 결합되고, 임의 수준의 전사를 개시시키는데 필요한 최소 개수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 (5' 방향)로 확장된다. 프로모터 서열 내에서, 전사 개시 부위 (예를 들어, 뉴클레아제(nuclease) S1에 의해 편리하게 규정됨), 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (컨센서스(consensus) 서열)이 발견될 수 있다. 프로모터는 인핸서 및 억제인자 서열이 포함되는 다른 발현 제어 서열 또는 본 발명의 핵산과 작동가능하게 회합될 수 있다. 유전자 발현을 제어하는데 사용될 수 있는 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (미국 특허 번호 5,385,839 및 5,168,062), SV40 초기 프로모터 영역 (문헌 [Benoist, et al., (1981) Nature 290:304-310]), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터 (문헌 [Yamamoto, et al., (1980) Cell 22:787-797]), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (문헌 [Wagner, et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445]), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (문헌 [Brinster, et al., (1982) Nature 296:39-42]); 원핵 발현 벡터 예컨대 □-락타마제(lactamase) 프로모터 (문헌 [Villa-Komaroff, et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731), 또는 tac 프로모터 (문헌 [DeBoer, et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25]; ["Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American (1980) 242:74-94]를 또한 참조); 및 효모 및 기타 진균류로부터의 프로모터 요소 예컨대 Gal 4 프로모터, ADC (알콜 데히드로게나제(dehydrogenase) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나제) 프로모터 또는 알칼리성 포스파타제(phosphatase) 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

"벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어는 숙주를 형질전환시키고, 임의로 도입된 서열의 발현 및/또는 복제를 촉진하도록, DNA 또는 RNA 서열이 이에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 비히클(?ehicle) (예를 들어, 플라스미드)을 포함한다. 본 발명의 항체 디스플레이 시스템의 이뮤노글로불린 쇄 또는 성분 (예를 들어, 미끼)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 한 실시양태에서, 벡터 내에 존재할 수 있다.

본원에서 논의된 바와 같은 본 발명의 조성물 또는 방법에서 사용될 수 있는 숙주 세포는 진핵생물, 예컨대 하등 및 고등 진핵 세포, 뿐만 아니라 원핵생물을 포함한다. 고등 진핵 세포는 포유동물, 곤충 (예를 들어, 스포도프테라 프루기페르다( Spodoptera frugiperda ) 세포), 및 식물 세포 (예를 들어, 프로탈릭스( Protalix ) 세포)를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포는 하등 진핵생물, 예컨대 효모 또는 사상 진균 세포이고, 이는, 예를 들어 임의의 피키아 세포, 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카( Pichia finlandica ), 피키아 트레할로필라( Pichia trehalophila ), 피키아 코클라마에( Pichia koclamae ), 피키아 멤브라나에파시엔스( Pichia membranaefaciens ), 피키아 미누타( Pichia minuta ) (오가타에아 미누타( Ogataea minuta ), 피키아 린드네리( Pichia lindneri )), 피키아 오푼티아에( Pichia opuntiae ), 피키아 써모톨레란스( Pichia thermotolerans ), 피키아 살릭타리아( Pichia salictaria ), 피키아 구에르쿠움( Pichia guercuum ), 피키아 페즈페리( Pichia pijperi ), 피키아 스팁티스( Pichia stiptis ), 피키아 메타놀리카( Pichia methanolica ), 피키아, 사카로미세스 세레비지아에, 사카로미세스( Saccharomyces ), 한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha ), 클루이베로미세스( Kluyveromyces ), 클루이베로미세스 락티스( Kluyveromyces lactis ), 칸디다 알비칸스( Candida albicans ), 아스페르길루스 니둘란스( Aspergillus nidulans ), 아스페르길루스 니거( Aspergillus niger ), 아스페르길루스 오리자에( Aspergillus oryzae ), 트리코더마 레에세이( Trichoderma reesei ), 크리소스포리움 룩크노웬세( Chrysosporium lucknowense ), 푸사리움( Fusarium ), 푸사리움 그라미네움( Fusarium gramineum ), 푸사리움 베네나툼( Fusarium venenatum ), 및 뉴로스포라 크라사( Neurospora crassa )로 이루어진 군으로부터 선택된다. 고등 진핵 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, BHK 세포, 또는 NSO 세포를 포함한다. 원핵 숙주 세포는, 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 에스케리키아( Escherichia ) (예를 들어, 이. 콜라이( E. coli )), 엔테로박터( Enterobacter ), 아조토박터( Azotobacter ), 에르위니아( Erwinia ), 바실루스( Bacillus ), 슈도모나스( Pseudomonas ), 클레브시엘라( Klebsiella ), 프로테우스( Proteus ), 살모넬라( Salmonella ), 세라티아( Serratia ), 시겔라( Shigella ), 리조비아( Rhizobia ), 비트레오실라( Vitreoscilla ), 및 파라코쿠스( Paracoccus )일 수 있다. 이. 콜라이 숙주 세포는 DHB4, BL21 (Lon (문헌 [Phillips et al. (1984) J. Bacteriol. 159: 283]) 및 OmpT 프로테아제(protease) 양쪽 모두가 결핍됨), HB101, BL21 DE3, 이. 콜라이 AD494, 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325), 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 및 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537)을 포함한다. 기타 균주는 메티오닌 결핍성인 이. 콜라이 B834 (문헌 [Leahy et al. (1992) Science 258, 987])를 포함한다; 기타 균주는 BLR 균주, 및 K-12 균주인 HMS174 및 NovaBlue를 포함하고, 이들은 플라스미드 단량체 수율을 개선하고 반복 서열을 함유하는 표적 플라스미드를 안정화시키는 것을 도울 수 있는 recA-유도체이다 (이러한 균주들은 노바젠(Novagen)으로부터 수득될 수 있음). 미국 특허 번호 4,952,496, 5,693,489 및 5,869,320 및 문헌 [Davanloo, P., et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2035-2039]; [Studier, FW, et al., (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130]; [Rosenberg, AH, et al., (1987) Gene 56: 125-135]; 및 [Dunn, JJ, et al., (1988) Gene 68: 259]을 또한 참조한다. 원핵 세포는, 예를 들어 폴리펩티드, 예컨대 이뮤노글로불린 폴리펩티드 및/또는 미끼의 재조합 발현을 허용하는 조건 하의 배지에서 또한 배양될 수 있다. 이같은 방법 및 이같은 유전자 및 단백질을 포함하는 숙주 세포는 본 발명의 일부이다. 원핵 숙주 세포도 본원에서 논의된 바와 같은 본 발명의 항체 디스플레이 시스템에서 숙주 세포로서 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 경우에, "N-글리칸" 및 "당형태(glycoform)"는 상호교환가능하게 사용되고, N-연결 올리고사카라이드, 예를 들어 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 결합에 의해 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 지칭한다. N-연결 당단백질은 단백질 내의 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유한다. 당단백질 상에서 발견되는 우세한 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시알산 (예를 들어, N-아세틸-뉴라민산 (NANA))이다.

N-글리칸에는 Man ₃ GlcNAc ₂ ("Man"은 만노스를 지칭하고, "Glc"는 글루코스를 지칭하며, "NAc"는 N-아세틸을 지칭하고, GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 지칭함)의 통상적인 펜타사카라이드 코어(core)가 있다. Man ₃ GlcNAc ₂ ("Man ₃ ") 코어 구조 ("트리만노스 코어", "펜타사카라이드 코어" 또는 "포시만노스(paucimannose) 코어"로 또한 지칭됨)에 부가되는 말초 당 (예를 들어, GlcNAc, 갈락토스, 푸코스 및 시알산)을 포함하는 분지 (안테나)의 개수와 관련하여 N-글리칸들이 상이하다. N-글리칸은 이의 분지 구성성분에 따라 분류된다 (예를 들어, 고-만노스, 복합 또는 하이브리드). "고-만노스" 유형 N-글리칸은 5개 이상의 만노스 잔기가 있다. "복합" 유형 N-글리칸은 전형적으로 "트리만노스" 코어의 1,3 만노스 팔(arm)에 부착된 하나 이상의 GlcNAc 및 1,6 만노스 팔에 부착된 하나 이상의 GlcNAc가 있다. 복합 N-글리칸은 시알산 또는 유도체 (예를 들어, "NANA" 또는 "NeuAc" [식 중, "Neu"는 뉴라민산을 지칭하고 "Ac"는 아세틸을 지칭한다])로 임의로 변형된 갈락토스 ("Gal") 또는 N-아세틸갈락토사민 ("GalNAc") 잔기가 또한 있을 수 있다. 복합 N-글리칸은 "양분성(bisecting)" GlcNAc 및 코어 푸코스 ("Fuc")를 포함하는 쇄내 치환이 또한 있을 수 있다. 복합 N-글리칸은 "트리만노스 코어" 상의 다중 안테나가 또한 있을 수 있고, "다중 안테나성 글리칸"으로 종종 지칭된다. "하이브리드" N-글리칸은 트리만노스 코어의 1,3 만노스 팔의 말단 상의 하나 이상의 GlcNAc, 및 트리만노스 코어의 1,6 만노스 팔 상의 0개 이상의 만노스가 있다. 다양한 N-글리칸이 "당형태"로 또한 지칭된다. "PNGase", 또는 "글리카나제(glycanase)" 또는 "글루코시다제(glucosidase)"는 펩티드 N-글리코시다제(glycosidase) F (EC 3.2.2.18)를 지칭한다.

본 발명의 한 실시양태에서, "진핵 숙주 세포" 내의 당단백질의 O-글리코실화가 제어된다. 본 발명의 범주는 (본원에서 논의된 바와 같은) O-글리코실화가 제어되어 있는 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스), 뿐만 아니라 이같은 진핵 숙주 세포를 포함하는 항체 디스플레이 시스템 및 이의 사용 방법 (본원에서 논의된 바와 같음)을 포함한다. 예를 들어, O-글리칸 점유 및 만노스 쇄 길이가 감소된다. 하등 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모에서, 하나 이상의 단백질 O-만노실트랜스퍼라제 (Dol-PMan: 단백질 (Ser/Thr) 만노실 트랜스퍼라제 유전자) (PMT)를 코딩하는 유전자를 결실시킴으로써, 또는 하나 이상의 Pmtp 억제제를 함유하는 배지에서 숙주를 성장시킴으로써, O-글리코실화가 제어될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어 PMT를 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 결실을 포함하고/하거나, 예를 들어 숙주 세포가 하나 이상의 Pmtp 억제제를 포함하는 배지에서 배양될 수 있는 경우의 단리된 진핵 숙주 세포, 항체 디스플레이 시스템 및 이의 사용 방법 (본원에서 논의된 바와 같음)을 포함한다. Pmtp 억제제는 벤질리덴 티아졸리딘디온을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 벤질리덴 티아졸리딘디온의 예는 5-[[3,4비스(페닐메톡시)페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산; 5-[[3-(1-25 페닐에톡시)-4-(2-페닐에톡시)]페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산; 및 5-[[3-(1-페닐-2-히드록시)에톡시)-4-(2-페닐에톡시)]페닐]메틸렌]-4-옥소-2-티옥소-3-티아졸리딘아세트산이다.

본 발명의 한 실시양태에서, "진핵 숙주 세포"는 이를 분비에 지시하는 신호 펩티드가 있는 알파-1,2-만노시다제를 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 최적 pH가 5.1 내지 8.0, 바람직하게는 5.9 내지 7.5인 외인성 알파-1,2-만노시다제 효소를 발현하도록 숙주 세포가 조작된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 외인성 효소는 숙주 세포의 소포체 또는 골지체로 표적화되고, 여기에서 N-글리칸 예컨대 Man ₈ GlcNAc ₂ 를 트리밍(trimming)하여 Man _s GlcNAc ₂ 를 산출시킨다. 미국 특허 번호 7,029,872를 참조한다.

"진핵 숙주 세포는", 본 발명의 한 실시양태에서, 베타-만노실트랜스퍼라제 유전자 (예를 들어, BMT1 , BMT2 , BMT3 , 및 BMT4 ) 중 하나 이상을 결실시키거나 파괴하는 것에 의해 (미국 특허 출원 공개 번호 2006/0211085 참조), 또는 간섭 RNA, 안티센스 RNA 등을 사용하여 베타-만노실트랜스퍼라제 유전자 중 하나 이상을 코딩하는 RNA의 번역을 폐지하는 것에 의해, 알파-만노시다제-저항성 N-글리칸이 있는 당단백질을 제거하도록 유전자 조작된 하등 진핵 세포 (예를 들어, 효모 예컨대 피키아 파스토리스)이다. 본 발명의 범주는 이같은 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스), 뿐만 아니라 이같은 진핵 숙주 세포를 포함하는 항체 디스플레이 시스템 및 이의 사용 방법 (본원에서 논의된 바와 같음)을 포함한다.

"진핵 숙주 세포"는 포스포만노실 트랜스퍼라제 유전자인 PNO1 및 MNN4B (예를 들어, 미국 특허 번호 7,198,921 및 7,259,007 참조) 중 하나 또는 양쪽 모두를 결실시키거나 파괴함으로써 포스포만노스 잔기가 있는 당단백질을 제거하도록 유전자 조작된 하등 진핵 세포 (에를 들어, 효모 및 사상 진균 예컨대 피키아 파스토리스)를 추가로 포함하고, 이는 MNN4A 유전자를 결실시키거나 파괴하는 것 또는 간섭 RNA, 안티센스 RNA 등을 사용하여 포스포만노실트랜스퍼라제 중 하나 이상을 코딩하는 RNA의 번역을 폐지하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, "진핵 숙주 세포"는 복합 N-글리칸 (시알릴화 α2,3 또는 α2,6 결합; 또는 비-시알릴화), 하이브리드 N-글리칸, 및 고-만노스 N-글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 N-글리칸이 우세하게 있는 당단백질을 생산하도록 유전자 변형되었고, 이때 복합 N-글리칸은, 본 발명의 한 실시양태에서, Man ₃ GlcNAc ₂ , GlcNAc _(1-4) Man ₃ GlcNAc ₂ , Gal _(1-4) GlcNAc _(1-4) Man ₃ GlcNAc ₂ , 및 NANA _(1-4) Gal _(1-4) Man ₃ GlcNAc ₂ ; NAGNA _(1-4) Gal _(1-4) Man ₃ GlcNAc ₂ 로 이루어진 군으로부터 선택되고; 하이브리드 N-글리칸은, 본 발명의 한 실시양태에서, Man ₅ GlcNAc ₂ , GlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ , GalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ , 및 NANAGalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ ; NAGNAGalGlcNAcMan ₅ GlcNAc ₂ 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 고-만노스 N-글리칸은, 본 발명의 한 실시양태에서, Man ₆ GlcNAc ₂ , Man ₇ GlcNAc ₂ , Man ₈ GlcNAc ₂ , 및 Man ₉ GlcNAc ₂ 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 범주는 이같은 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스), 뿐만 아니라 이같은 진핵 숙주 세포를 포함하는 항체 디스플레이 시스템 및 이의 사용 방법 (본원에서 논의된 바와 같음)을 포함한다.

본원에서 사용되는 경우에, 당단백질 상의 특정 당 잔기, 예컨대 푸코스, 또는 갈락토스 등의 결여와 관련될 때의 "~이 본질적으로 없는"이라는 용어는 당단백질 조성에 이같은 잔기를 함유하는 N-글리칸이 실질적으로 없다는 것을 가리키도록 사용된다. 순도 관점에서 표현될 때, 본질적으로 없음은 이같은 당 잔기를 함유하는 N-글리칸 구조의 양이 10％를 초과하지 않고, 바람직하게는 5％ 미만, 더욱 바람직하게는 1％ 미만, 가장 바람직하게는 0.5％ 미만임을 의미하고, 이때 백분율은 중량 기준 또는 몰％ 기준이다.

본원에서 사용되는 경우에, 검출가능한 양의 특정 당 잔기, 예컨대 푸코스 또는 갈락토스가 N-글리칸 구조 상에 존재하지 않을 때, 당단백질 조성물에 이같은 당 잔기가 "결여되거나" 또는 "결여되어 있다". 예를 들어, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 당단백질 조성물이 본원에서 정의된 바와 같은 하등 진핵생물에 의해 생산되고, "푸코스가 결여될" 것인데, 이는 이러한 생물의 세포에 푸코실화 N-글리칸 구조를 생산하는데 필요한 효소가 없기 때문이다. 따라서, "본질적으로 푸코스가 없는"이라는 용어는 "푸코스가 결여된"이라는 용어를 포함한다. 그러나, 상기 기술된 바와 같이, 조성물이 한 시점에 푸코실화 N-글리칸 구조를 함유하였거나 또는 제한된, 그러나 검출가능한 양의 푸코실화 N-글리칸 구조를 함유하더라도, 조성물에 "푸코스가 본질적으로 없을" 수 있다.

예를 들어, 숙주 세포 (예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같음)에서 발현된 이뮤노글로불린 상에서 당 잔기를 도입하거나, 제거하거나 또는 변형시키는 숙주 세포는, 특정 경우에, 본원에서 "글리코실화 제어형 숙주 세포"로서 지칭될 수 있다.

본 발명의 범주는 본 발명의 항체 디스플레이 시스템 또는 이의 임의의 성분 (예를 들어, 미끼 및/또는 미끼를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들); 및/또는 이뮤노글로불린 쇄 및/또는 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들))을 포함하는 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스), 예를 들어 본원에서 논의된 것들 중 임의의 것; 뿐만 아니라 이같은 진핵 숙주 세포를 포함하는 항체 디스플레이 시스템, 및 이의 사용 방법 (본원에서 논의된 바와 같음)을 포함한다.

형광-활성화 세포 분류 (FACS)는 특수 유형의 유동 세포측정법이다. 이는 각각의 세포의 특이적인 광 산란 및 형광 특성을 기초로 한번에 1개의 세포씩 생물학적 세포들의 이종 혼합물을 2개 이상의 용기 내로 분류하는 방법을 제공한다. 본 발명은 (미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체에 의해) 관심 항원에 결합된 진핵 숙주 세포가 결합되지 않은 세포 또는 충분한 수준의 결합이 없는 세포로부터 FACS 분류에 의해 분류되는, 예를 들어 본원에서 논의된 바와 같은 본 발명의 항체 디스플레이 시스템을 사용하는 방법을 포함한다. FACS 분류는, 본 발명의 한 실시양태에서, 세포가 검출가능한 형광 표지 (예를 들어, 항원 자체 또는 2차 항체가 표지됨)로 표지되었는지 여부를 기초로 한다. 예를 들어, 형광 표지 항원이 미끼/항체 또는 미끼/항원-결합 단편에 결합하는 것으로 기초로, 또는 형광 표지 2차 항체가 미끼/항체 또는 미끼/항원-결합 단편에 결합된 항원에 결합하는 것을 기초로, 관심 항원에 결합하는 미끼/항체 또는 미끼/항원-결합 단편을 디스플레이하는 세포를 확인할 수 있다. 이같은 분류된 표지 숙주 세포, 및 이같은 분류된 표지 숙주 세포를 포함하는 조성물 또한 본 발명의 일부이다.

조절가능한 프로모터는 이의 발현이 유도 또는 억제되는 프로모터이다. 본 발명의 실시양태는 미끼 발현이 조절가능한 프로모터에 의해 제어되는 항체 디스플레이 시스템, 뿐만 아니라 본원에서 논의된 바와 같은 이의 사용 방법을 포함한다. 조절가능한 프로모터와 작동가능하게 회합된, 미끼를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 진핵 숙주 세포와 함께 본 발명의 일부를 형성한다. 효모에서 발생하는 조절가능한 프로모터의 예는 GUT1 프로모터, GADPH 프로모터 및 PCK1 프로모터를 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 세포를 안티센스 RNA에 노출시키는 것 또는 RNA 간섭 (예를 들어, 마이크로RNA (miRNA) 또는 소형 간섭 RNA (siRNA))에 의해 진핵 숙주 세포에서의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 미끼)의 발현이 억제된다. 본 발명의 실시양태는 미끼 발현이 RNA 간섭 또는 안티센스 RNA에 의해 억제되는 항체 디스플레이 시스템 (예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같음)을 사용하는 방법을 포함한다. 미끼를 포함하고 미끼 발현을 억제하는 안티센스 또는 RNA 간섭 분자를 추가로 포함하는 본 발명의 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 본원에서 논의된 바와 같음)는 본 발명의 일부이다.

Fc 수용체는, 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a) 및 FcγRIIIB (CD16b)를 포함하고, 렉틴은, 예를 들어 DC-SIGN (CD209) 및 마우스 오르토로그 SIGN-R 및 DCIR (수지상 세포 억제 수용체)을 포함한다.

항체

본 발명의 숙주 세포는 숙주 세포로부터 분비될 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 형성하도록 복합체화되는 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 (미끼에 더하여) 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 중쇄는 하나 이상의 항원-결합 부위를 포함하는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 형성하도록 경쇄 이뮤노글로불린과 복합체화될 수 있다. 세포 표면 상에 있을 때, 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 항원에 결합할 수 있고, 예를 들어 FACS에 의해 이러한 결합을 검출할 수 있으며, 따라서 이는 중쇄 및 경쇄가 항원에 대한 특이성이 있는 결합 부위를 포함한다는 것을 가리킨다.

본 발명을 사용하는 것 (예를 들어, 본 발명의 항체 디스플레이 시스템을 사용하는 것)과 관련하여 확인된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 임의의 적절한 형태로 재설정될 수 있다. 예를 들어, 항체 디스플레이 시스템을 사용하여 단리된 완전 항체로부터의 CDR을 상이한 프레임워크 (예를 들어, 인간 프레임워크) 내로 혼입시켜, 본 발명의 항체 디스플레이 시스템으로부터 단리된 CDR을 포함하는 항체 또는 항원-결합 단편을 생성시킬 수 있다. 키메라, 인간화 및 인간 항체를 생산하는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 퀸(Queen) 등에게 허여된 미국 특허 번호 5,530,101, 윈터(Winter) 등에게 허여된 미국 특허 번호 5,225,539, 보스(Boss) 등에게 허여된 미국 특허 번호 4,816,397을 참조한다. 항체 또는 항원-결합 단편을 재설정하거나 한 프레임워크로부터의 CDR을 또다른 것으로 재배치하기 위한 이같은 방법들은 당업계에서 통상적이고 주지되어 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편의 CDR이 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 항-이디오타입(idiotype) 항체, 인간화 항체 및 이중특이적 항체; 또는 그의 항원-결합 단편 예컨대 나노바디(nanobody), Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fv 단편; dsFv; (dsFv) ₂ , ds 디아바디(diabody); dsFv-dsFv'; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어 sc-Fv, sc-Fv 이량체 (2가 디아바디); 및 이중특이적 디아바디를 생성시키는데 사용될 수 있다.

완전 항체는 서브유닛들의 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍이 있고, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄" (LC) 및 1개의 "중쇄" (HC)가 있다. 경쇄 (LC)는 경쇄 내의 불변 도메인의 유형을 기초로 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄 (HC)는 중쇄 내의 불변 도메인의 유형을 기초로 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형(isotype)을 각각 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4), IgM, IgA (예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD 또는 IgE로 규정한다.

본 발명은 표면 앵커, 예를 들어 SED-1 또는 그의 기능적 단편에 융합된 이뮤노글로불린 경쇄 (예를 들어, VL-CL; 예를 들어, 인간)를 포함하는 미끼를 포함하는 단리된 숙주 세포 (예를 들어, 진핵 숙주 세포, 예컨대 피키아, 예를 들어 피키아 파스토리스) 내로, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계, 및 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되고 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 상기 쇄들로부터 형성되는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 상기 미끼는 조절가능한 프로모터와 작동가능하게 회합되고, 상기 이뮤노글로불린 쇄가 발현될 때 미끼 발현은 억제된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 안티센스 RNA로 또는 RNA 간섭에 의해 미끼 발현이 억제된다.

본 발명은, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 결정하는 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편에 융합된 이뮤노글로불린 경쇄 (예를 들어, VL-CL; 예를 들어, 인간)를 포함하는 미끼 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하는 진핵 숙주 세포를 배양하고, 이때 숙주 세포가 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 분비하는 단계 (임의로, 항체 또는 단편이 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 단리됨); 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 ELISA에 의해 결정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포가 완전 항체만 발현 및 분비하도록 정량 전에 미끼 발현이 억제된다. 미끼 폴리뉴클레오티드가 미끼 발현을 억제하도록 억제되는 조절가능한 프로모터와 작동가능하게 회합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, ELISA는 항원을 고체 기판 상에 코팅하는 단계; 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 항원에 결합시키는 단계; 검출가능하게 표지된 2차 항체를 항체 또는 단편에 결합시키는 단계; 및 2차 항체를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 알칼리성 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제(peroxidase)로 2차 항체가 표지된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 알칼리성 포스파타제 (AP) 또는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)를 기질과 결합시키고 플레이트의 흡광도를 측정함으로써 표지가 검출된다 (예를 들어, HRP 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB); HRP 기질 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB); 또는 HRP 기질 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) (ABTS); 또는 AP 기질 파라-니트로페닐포스페이트).

본 발명은 본 발명의 항체 디스플레이 시스템에서 진핵 숙주 세포로부터 분비된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 항원에 대한 친화도를 결정하는 방법을 또한 제공한다. 예를 들어, 표준 친화도 ELISA, 비아코어(Biacore)™ 분석 또는 경쟁 검정에 의해 친화도를 결정할 수 있다.

항체 디스플레이 시스템

본 발명은 (1) 진핵 숙주 세포 및 (2) N- 또는 C-말단에서, 임의로 펩티드 링커 예컨대 GGGS (×3)에 의해 표면 앵커에 융합된 이뮤노글로불린 경쇄 (예를 들어, VL-CL; 예를 들어, 인간)를 포함하고, 임의로 신호 서열 (예를 들어, 알파 짝결합(mating) 인자 신호 서열, 예를 들어 사카로미세스 세레비지아에로부터의 것)에 연결된 미끼를 포함하는 항체 디스플레이 시스템, 조성물 또는 키트를 제공하고, 이러한 시스템은, 예를 들어 관심 항원에 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편의 확인에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 시스템 내의 숙주 세포는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및/또는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체의 하나 이상의 이뮤노글로불린 쇄 (예를 들어 쇄 중 하나 이상이 라이브러리 공급원으로부터의 것인 경우의 예를 들어 경쇄 및 중쇄)를 발현한다.

미끼의 경쇄 이뮤노글로불린은 미끼의 일부가 아닌 경쇄 이뮤노글로불린과 동일하거나 상이할 수 있다. 숙주 세포는 1가지를 초과하는 중쇄 이뮤노글로불린 서열을 함유할 수 있다.

미끼/항체의 항원-결합 단편은 (1) 미끼의 이뮤노글로불린 경쇄 (예를 들어, VL-CL; 예를 들어, 인간)와 중쇄 이뮤노글로불린 사이의 복합체이고; (2) 숙주 세포의 표면 상에 있을 때 항원에 결합한다. 미끼/항원-결합 단편의 예는 미끼의 세포 표면 앵커에 결합된 완전 항체의 1가 단편 (즉, 1가 항체 단편)이다. 미끼/항체는 숙주 세포의 표면 상에 있을 때 항원과 결합하는, 미끼의 이뮤노글로불린 경쇄 (예를 들어, VL-CL; 예를 들어, 인간)와 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가 있는 완전 항체 사량체성 복합체를 형성하는 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 사이의 복합체이다.

"1가 항체 단편"은 항체의 한쪽 절반, 즉 3개의 쌍을 이룬 CDR을 포함하는 항체 경쇄 (VL-CL)에 결합된 항체 중쇄 (VH-CH1-CH2-CH3)를 포함하고, 예를 들어 CH1 및 CL이 디술피드 가교에 의해 결합된 경우, 이러한 1가 항체 단편은 항원에 검출가능하게 결합할 수 있다.

"미끼"는, 예를 들어 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서, 세포 표면 앵커에 융합된 경쇄 이뮤노글로불린, 예를 들어 CL 폴리펩티드 또는 VL-CL 폴리펩티드를 포함하고, 이러한 미끼는 미끼가 본 발명의 항체 디스플레이 시스템에서 기능할 수 있게 하는 본원에 기술된 기능성 성질 (예를 들어 하기에 기재된 바와 같음)을 보유한다. 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린은, 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 디스플레이 시스템에서 기능하는 이의 능력을 개선하도록 돌연변이될 수 있고, 예를 들어 중쇄 이뮤노글로불린과 복합체화될 때 더욱 광범위한 디술피드 가교가 형성되게 허용하도록 시스테인 또는 기타 잔기가 부가 또는 이동될 수 있다. 미끼에서 사용하기에 적절한 경쇄 이뮤노글로불린은, 표면 앵커 단백질에 융합될 때, 진핵 숙주 세포의 표면 상에서 예를 들어 중쇄 이뮤노글로불린과 이량체화될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 미끼와 이뮤노글로불린 중쇄 사이의 이량체화는 세포 표면으로 발송되기 전에 세포 내에서 발생하고, 이때 일단 세포 표면에 있으면 중쇄 이뮤노글로불린 및 미끼가 여전히 회합된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 미끼와 공발현되는 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 1가 항체 단편을 형성하도록 서로 이량체화될 수 있는 경쇄 및 중쇄를 포함하고, 이러한 1가 항체 단편도 미끼의 경쇄와 중쇄 이뮤노글로불린 사이의 복합체와 이량체화될 수 있다. (도 2 참조).

항원은 임의의 면역원성 분자 또는 물질, 예를 들어 폴리펩티드 (예를 들어, 올리고펩티드), 세포 막, 세포 추출물 또는 전체 세포일 수 있다. 폴리펩티드 항원은, 예를 들어 하기의 폴리펩티드를 포함한다: 케모카인, 시토카인 (예를 들어, 염증성 시토카인 또는 케모카인), 수용체, PCSK9, 과립구-CSF; 응집 인자 예컨대 VIII 인자, IX 인자, 및 인간 단백질 C; 가용성 IgE 수용체 알파-쇄; 우로키나제(urokinase); 키마제(chymase) 및 요소 트립신 억제제; IGF-결합 단백질; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체, 혈관 표피 성장 인자, 표피 성장 인자; 성장 호르몬-방출 인자; GITR (글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질), 아넥신 V 융합 단백질; IL-23p19, IL-23p40, IL-23R, IL12R-베타 1, TNF 알파 (종양 괴사 인자 알파), TGF 베타 (전환 성장 인자 베타), IL-10, IL-17, TSLP (흉선 기질 림포포이에틴), 안지오스타틴; 혈관 내피 성장 인자-2; 골수 전구세포 억제 인자-1; 오스테오프로테게린 (OPG), RANK (핵 인자 카파 B에 대한 수용체 활성화제) 또는 RANKL (핵 인자 카파 B 리간드에 대한 수용체 활성화제); 본 발명의 한 실시양태에서, 이들 중 임의의 것이 인간형일 수 있다.

"표면 앵커"는 경쇄 이뮤노글로불린 또는 그의 기능적 단편 (예를 들어, VL-CL 또는 CL 또는 VL)과 융합될 때 세포 표면에서 발현되어 세포 표면에 위치하고, 여기에 중쇄 이뮤노글로불린이 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린에 결합하는 것을 통해 복합체화될 수 있는 임의의 폴리펩티드이다. 적절한 세포 표면 앵커의 예는 하기의 것들 중 임의의 것과 같은 단백질을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다: SED1P, α-응집소, Cwp1, Cwp2, GasI, Yap3, FIoIp1 Crh2, Pir1, Pir4, Tip1, Wpi, Hpwp1, Als3, 및 Rbt5; 예를 들어, 사카로미세스 세레비지아에 CWP1, CWP2, SED1, 또는 GAS1; 피키아 파스토리스 SP1 또는 GAS1; 또는 에이치. 폴리모르파( H. polymorpha ) TIP1; 또는 이러한 단백질들의 임의의 기능적 단편 또는 변이체 (이들은 국제 공개 번호 WO09/111183에 기술되어 있음). 본 발명의 한 실시양태에서, 표면 앵커는 임의의 글리코실포스파티딜이노시톨-앵커 (GPI) 단백질이다. 표면 앵커의 기능적 단편은 본 발명의 항체 디스플레이 시스템에서 어느 정도 완전 표면 앵커 폴리펩티드와 같이 기능할 수 있는 완전 표면 앵커 폴리펩티드의 단편을 포함한다.

본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체 디스플레이 시스템에서 사용하기 위한 적절한 진핵 숙주 세포는 피키아 세포, 예컨대 피키아 파스토리스이다.

본 발명의 범주는 예를 들어 세포 표면 상의 미끼를 포함하고, 임의로 미끼가 하나 이상의 이뮤노글로불린 쇄와 이량체화되어 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 형성하는 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스)를 포함한다. 본 발명은, 예를 들어 액체 배양 배지 내에, 분비된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 추가로 포함하는, 이같은 진핵 숙주 세포를 포함하는 조성물을 또한 포함한다.

본 발명은, 예를 들어 본 발명의 항체 디스플레이 시스템을 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (i) 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체; 및/또는 (ii) 상기 것들 중 임의의 것의 이뮤노글로불린 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 이뮤노글로불린 폴리펩티드 쇄 자체 중 하나를 확인하는 방법을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

(a) 미끼 (예를 들어, 세포 표면 앵커, 예컨대 Sed1p에 연결된 경쇄 이뮤노글로불린을 포함하는 폴리펩티드를 포함함) 및 하나 이상의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 (예를 들어, 이같은 쇄 중 하나 이상이 라이브러리 공급원으로부터의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 경우)를 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린과 상기 중쇄 이뮤노글로불린 중 하나 이상 사이의 복합체 (예를 들어, 미끼/항체 또는 미끼-항원-결합 단편)가 형성되고 세포 표면에 위치하도록 단리된 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스)에서 공발현시키고, 예를 들어 숙주 세포가 미끼 및/또는 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질전환되는 단계.

(b) 항원에 대한 검출가능한 친화도 (예를 들어, 허용가능한 친화도)가 있는 (예를 들어, 항원에 검출가능하게 결합하는), 중쇄 이뮤노글로불린과 이량체화된 미끼를 발현하는 진핵 숙주 세포를 확인하는 단계.

본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포 내로 도입된 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린을 포함하는, 비-테더링된 분비된 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 형성된다. 이들을 분석하여, 이들이 검출가능한 친화도를 보유하는지 여부를 결정할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 숙주 세포로부터 배지 내로 분비된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분비된 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 숙주 세포 및/또는 배지로부터 단리된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 단계 (b) 이후에, 숙주 세포에서의 미끼 발현이 억제되지만, 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현은 억제되지 않는다. 본 발명의 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 완전 항체만 발현하고, 어떠한 유의한 양으로도 미끼를 발현하지 않는다. 일단 미끼 발현이 억제되면, 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포로부터 생산된 완전 항체를 분석하여, 이것이 검출가능한 친화도 (예를 들어, 허용가능한 친화도)을 보유하는지 여부를 결정할 수 있다.

(c) 항원에 대한 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체의 검출가능한 결합이 관찰되면, 상기 항체 또는 항원-결합 단편 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하고, 예를 들어 경쇄 및/또는 중쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 숙주 세포로부터 임의로 단리되는 단계. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 결정된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포들의 집단이 공통 미끼 및 공통 이뮤노글로불린 중쇄, 뿐만 아니라 예를 들어, 라이브러리 공급원으로부터의 다양한 상이한 경쇄 이뮤노글로불린 (비-미끼 쇄)을 발현하고, 이때 미끼/항원-결합 단편을 형성하는 개별적인 경쇄 이뮤노글로불린 및 미끼에 테더링되고 항원 결합을 나타내는 완전 항체가 확인될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포들의 집단이 공통 미끼 및 공통 이뮤노글로불린 경쇄 (비-미끼), 뿐만 아니라 예를 들어 라이브러리 공급원으로부터의 다양한 상이한 중쇄 이뮤노글로불린을 발현하고, 이때 미끼/항원-결합 단편을 형성하는 개별적인 중쇄 이뮤노글로불린 및 미끼에 테더링되고 항원 결합을 나타내는 완전 항체가 확인될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유하는 숙주 세포를 분비된 비-테더링 항체 (예를 들어, 완전 항체) 또는 그의 항원-결합 단편을 배양에서 발현시키는데 추가로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 실시양태에서, 유의한 양의 미끼 발현이 발생하지 않도록 미끼 발현이 임의로 억제된다. 그 후, 분비된 비-테더링 항체 (예를 들어, 완전 항체) 또는 그의 항원-결합 단편이 발현되어 숙주 세포로부터 분비되는 조건 하에 숙주 세포가 배양 배지에서 배양된다. 비-테더링 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 임의로 숙주 세포 및 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 쇄가 재조합 발현을 위해 별도의 숙주 세포 (예를 들어, 항체 디스플레이 시스템 성분이 결여됨)로 전달된다.

본 발명의 항체 디스플레이 시스템은 항원에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도에 대한 소정의 글리코실화 패턴의 효과를 평가하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 변경된 글리코실화 패턴을 포함하는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체의 항원에 결합하는 능력을 평가할 수 있고, 그 후 유리 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 평가할 수 있다. 예를 들어, 쇄들이 발현될 때 글리코실화 패턴을 변형시키는, 예를 들어 본원에서 논의된 바와 같은 숙주 세포를 사용함으로써, 및/또는 예를 들어 본원에서 논의된 바와 같이 글리코실화 패턴이 변형되는 조건 하에 숙주를 배양함으로써, 항체 디스플레이 시스템에서 발현되는 이뮤노글로불린 쇄 상에서 글리코실화 패턴이 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 글리코실화 제어형 진핵 숙주 세포; 및 (b) 상기 진핵 숙주 세포의 표면 상의 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편에 융합된 경쇄 이뮤노글로불린 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 미끼를 포함하는 항체 디스플레이 시스템을 상기 항원과 접촉시키고, 이때 상기 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린은 중쇄 이뮤노글로불린과 복합체화되어 숙주 세포 표면 상에 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 형성하고, 상기 중쇄 또는 경쇄는 상기 당을 포함하는 것인 단계; 상기 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 상기 항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계; 항원에 대한, 상기 당을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화도를 결정하는 단계; 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를, 상기 당이 결여되어 있지만 다른 면에서는 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도와 비교하는 단계를 포함하고, 이때 상기 당을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 당이 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 높은 경우, 당은 항원에 대한 친화도를 증가시키는 것으로 결정되고/되거나, 상기 당을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 당이 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 낮은 경우, 당은 항원에 대한 친화도를 감소시키는 것으로 결정된다. 예를 들어, 당이 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 본 발명의 항체 디스플레이 시스템과 유사한 방식으로 결정할 수 있거나, 또는 이의 친화도를 ELISA, 비아코어™ 검정 또는 경쟁 검정과 같은 공지된 방법에 의해 친화도를 측정함으로써 직접적으로 결정할 수 있다.

여러 허용가능한 수단 중 임의의 것에 의해 미끼 발현이 억제될 수 있다. 예를 들어, 미끼를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포에서 발현이 억제될 수 있는 조절가능한 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 미끼 발현이 RNA 간섭, 안티센스 RNA, 돌연변이 또는 미끼를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로부터 제거하는 것 또는 숙주 세포가 기능성 미끼를 발현하지 않도록 하는 폴리뉴클레오티드의 유전자 돌연변이에 의해 억제된다.

"허용가능한 친화도"는 적어도 약 10 ^-3 M 이상의 친화도 (더 낮은 값), 예를 들어 약 10 ^-3 M, 10 ^-4 M, 10 ^-5 M, 10 ^-6 M, 10 ^-7 M, 10 ^-8 M, 10 ^-9 M, 10 ^-10 M, 10 ^-11 M 또는 10 ^-12 M인 항원에 대한 항체 또는 항원-결합 단편 친화도를 지칭한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 유리 항체 또는 그의 항원-결합 단편; 또는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들은 경쇄 및/또는 중쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 하나 이상의 라이브러리 내에 존재한다 (예를 들어, 경쇄를 코딩하는 1개의 라이브러리 및 중쇄를 코딩하는 1개의 라이브러리). 이러한 실시양태에서, 특정한 관심 이뮤노글로불린 쇄는 숙주 세포 표면 상의 표면 앵커링된 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 관심 항원에 결합하는 것으로 관찰될 때 라이브러리 내의 다른 쇄와 구별된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 항체 디스플레이 시스템에서 발현되는 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린은 라이브러리 공급원으로부터의 것이고, 다른 이뮤노글로불린 쇄는 공지된 것이다 (즉, 클론 공급원으로부터의 단일쇄). 본 발명의 이러한 실시양태에서, 항체 디스플레이 시스템이, 본원에서 논의된 바와 같이, 공지된 쇄와 커플링되는 경우에 바람직한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 형성하는 새로운 라이브러리 쇄를 확인하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 항체 디스플레이 시스템이 2개의 공지된 이뮤노글로불린 쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현 및 결합 특성을 분석하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 디스플레이 시스템은 이뮤노글로불린 중쇄 (예를 들어, 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역, 예를 들어 중쇄의 CH2 및/또는 CH3 도메인) 내의 하나 이상의 돌연변이가 중쇄가 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32), FcγRIIB (CD32), FcγRIIIA (CD16a), FcγRIIIB (CD16b)) 또는 렉틴 (예를 들어, DC-SIGN (CD209) 및 마우스 오르토로그 SIGN-R, DCIR (수지상 세포 억제 수용체))에 결합하는 것을 작동시키는지 또는 길항하는지 여부를 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 (a) 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 평가될 돌연변이(들)을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 진핵 숙주 세포; 및 (b) 상기 진핵 숙주 세포의 표면 상의 표면 앵커 폴리펩티드 또는 그의 기능적 단편에 융합된 경쇄 이뮤노글로불린 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 미끼를 포함하는 항체 디스플레이 시스템을 상기 Fc 수용체 또는 렉틴과 접촉시키고, 이때 상기 미끼의 경쇄 이뮤노글로불린은 중쇄 이뮤노글로불린과 복합체화되어, 숙주 세포 표면 상에서 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체 복합체를 형성하는 것인 단계; 상기 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체가 상기 Fc 수용체 또는 렉틴에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계; Fc 수용체 또는 렉틴에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화도를 결정하는 단계; 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를, 상기 돌연변이가 결여되어 있지만 다른 면에서는 동일한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도와 비교하는 단계를 포함하고, 이때 상기 돌연변이를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 돌연변이가 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 높은 경우, 돌연변이는 Fc 수용체 또는 렉틴에 대한 친화도를 증가시키는 것으로 (결합을 작동시키는 것으로) 결정되고/되거나, 상기 돌연변이를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도가 돌연변이가 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도보다 낮은 경우, 돌연변이는 Fc 수용체 또는 렉틴에 대한 친화도를 감소시키는 것으로 (결합을 길항하는 것으로) 결정된다. 예를 들어, 돌연변이가 결여되어 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화도를 본 발명의 항체 디스플레이 시스템과 유사한 방식으로 결정할 수 있거나, 또는 이의 친화도를 ELISA, 비아코어™ 검정 또는 경쟁 검정과 같은 공지된 방법에 의해 친화도를 측정함으로써 직접적으로 결정할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 돌연변이를 포함하는 중쇄 이뮤노글로불린 (예를 들어, 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역, 예를 들어 중쇄의 CH2 및/또는 CH3 도메인)은 라이브러리 공급원으로부터의 것이고, 이때 라이브러리 내의 클론이 중쇄 (예를 들어, 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역, 예를 들어 중쇄의 CH2 및/또는 CH3 도메인) 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 세포를 형광 표지 항원 (예를 들어, 비오틴 표지)와 함께 인큐베이션하고 항원에 특이적으로 결합하는 세포를 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 분류/선별함으로써, 항원에 결합하는, SED1과 같은 앵커에 의해 세포에 테더링된 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 항원과 결합된 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 발현하는 진핵 숙주 세포가 형광-활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 확인 및 분류된다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 세포 표면 상에서 항원에 결합된 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 발현하는 세포가 형광 항원 또는 항원에 또한 결합하는 형광 2차 항체로 표지된다. FACS 분류 동안 형광 표지가 검출되고, 분류용 신호로서 사용된다. 표지된 세포는 항원에 결합된, 세포 표면에서 발현된 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체의 존재를 가리키고 1개의 용기에서 수집되는 한편, 신호를 나타내지 않은 세포는 별도의 용기에서 수집된다. 따라서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 라이브러리로부터의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 항원에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법을 포함한다:

(1) (i) 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 함유하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 라이브러리;

(ii) 경쇄 이뮤노글로불린 및 단일 클론 중쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 함유하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 라이브러리; 또는

(iii) 중쇄 이뮤노글로불린 및 단일 클론 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드들을 함유하는 하나 이상의 이뮤노글로불린 라이브러리

를 미끼를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스) 내로 형질전환시키고, 이때 상기 쇄들은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 형성할 수 있는 것인 단계;

(2) 형질전환된 세포를 액체 배양 배지에서 성장시키는 단계;

(3) 세포 표면 상에서 미끼가 발현되게 하는 단계;

(4) 세포를 형광 표지 항원 또는 형광 표지 2차 항체에 결합된 항원으로 표지하는 단계;

(5) 제1 사이클에 대해 FACS를 사용하여 형광 표지 세포를 분류 및 단리하는 단계;

(6) 분류된 표지 세포를 다시 성장시키는 단계;

(7) 세포에서 미끼가 발현되게 하는 단계;

(8) 세포를 형광 표지 항원 또는 형광 표지 2차 항체에 결합된 항원으로 표지하는 단계;

(9) 제2 사이클에 대해 FACS를 사용하여 형광 표지 세포를 분류 및 단리하는 단계;

(10) 개별적인 세포 클론들이 별개의 세포 콜로니로 성장되도록, 분류된 표지 세포를 고체 배양 배지에서 다시 성장시키는 단계;

(11) 항원에 대한 친화도가 있는 콜로니를 확인하는 단계;

(12) 확인된 콜로니로부터의 세포를 액체 배양 배지에서 성장시키고, 이뮤노글로불린 경쇄 및 중쇄를 포함하는 비-테더링 완전 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 상청액을 단리하며, 이때 미끼 발현은 임의로 억제되는 것인 단계;

(13) 상청액으로부터의 비-테더링 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 항원에 대한 친화도를 결정하고, 허용가능한 친화도가 있는 클론을 확인하는 단계 (예를 들어, 비아코어™ 분석에 의함);

(14) 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 확인된 클론 내의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계.

본 발명의 범주는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인하거나 또는 높은 안정성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 확인하는 방법을 또한 포함한다. 이같은 방법은 하기의 단계들을 포함한다:

(a) 진핵 숙주 세포 (예를 들어, 피키아 파스토리스)에서 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 미끼를 공발현시키면서, 상기 쇄들을 포함하는 항체를 변성제에 적용하는 단계.

본 발명의 한 실시양태에서, 변성제는 적어도 부분적으로 항체를 변성시키고 따라서 항원에 결합하는 항체의 능력을 억제할 것으로 당업자가 예상하는 농도 또는 양 또는 규모 (예를 들어, 충분히 높은 온도에서의 것)로 존재한다. 예를 들어, 가능한 변성제는 요소 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6 M 또는 이를 초과하는 값), 세제 예컨대 트리톤(triton) X-100 (예를 들어, 1％ 또는 이를 초과하는 값), 디티오트레이톨 (DTT) (예를 들어, 250 mM 또는 500 mM 또는 이를 초과하는 값), 구아니딘 히드로클로라이드, 광 (예를 들어, 자외선 또는 가시광선), 극단적인 pH (예를 들어, 1, 2, 3, 14, 13 또는 12) 또는 약 4℃를 초과하는 온도, 예컨대 37℃ (예를 들어, 42℃, 48℃ 또는 50℃) 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 500 mM DTT/6 M 요소)을 포함한다.

(b) 항원에 대한 검출가능한 친화도 (예를 들어, 허용가능한 친화도)가 있는 미끼/항원-결합 단편 또는 미끼/항체를 발현하는 진핵 숙주 세포를 확인하는 단계.

본 발명의 한 실시양태에서, 미끼와 복합체화된 것들과 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 완전 항체가 이들이 검출가능한 친화도를 보유하는지 여부를 결정하기 위해 또한 분석된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 완전 항체가 숙주 세포로부터 분비된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 완전 항체가 숙주 세포로부터 단리된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포에서의 미끼 발현이 억제되지만, 완전 항체의 발현은 억제되지 않는다. 본 발명의 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는 완전 항체만 발현하고, 어떠한 유의한 양으로도 미끼를 발현하지 않는다. 미끼 발현이 억제되면, 본 발명의 한 실시양태에서, 숙주 세포로부터 생산된 완전 항체를 분석하여, 이것이 검출가능한 친화도 (예를 들어, 허용가능한 친화도)를 보유하는지 여부를 결정한다.

(c) 세포로부터 상기 항체 또는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인하고, 이때 임의로 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 숙주 세포로부터 단리되고, 변성제의 존재 하에 항원에 대한 친화도를 나타내는 항체가 높은 안정성을 나타내는 것으로 결정되는 단계. 본 발명의 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 결정된다.

본 발명의 한 실시양태에서, sed1p는 사카로미세스 세레비지아에 sed1p이고, 이는 본 발명의 한 실시양태에서 하기의 아미노산 서열을 포함한다: (서열 1)

sed1p를 코딩하는 상응하는 뉴클레오티드 서열 ( SED -1 )은 하기 서열 2이다:

본 발명의 한 실시양태에서, 미끼가 신호 서열 예컨대 사카로미세스 세레비지아에의 알파 짝결합 인자 신호 서열 (예를 들어,

본 발명의 한 실시양태에서, Sed1p 폴리펩티드에 융합된 인간 경쇄 이뮤노글로불린 도메인을 포함하는 미끼는 하기 서열 5의 아미노산 서열을 포함하고, 이때 경쇄 이뮤노글로불린 도메인은 밑줄이 그어져 있고, 링커는 볼드체이며, Sed1p 서열이 이어진다:

서열 5를 코딩하는 상응하는 뉴클레오티드 서열은 하기 서열 6이다 (경쇄 서열은 밑줄이 그어져 있고, 링커 서열은 볼드체이며, 평문인 SED -1 서열이 이어진다):

실시예

본 실시예는 본 발명을 예시하도록 의도되고, 이를 제한하지 않는다. 하기 개시된 방법 및 조성물 (예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 효모 세포)는 본 발명의 범주 내에 속한다.

실시예 1. 발현 카세트 구축

단백질을 효모 세포 벽에 앵커링하는 부착된 글리코포스티딜이노시톨 (GPI) 번역후 변형을 본질적으로 함유하는 세포 표면 앵커링 단백질 에스. 세레비지아에 Sed1p의 N-말단을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인간 IgG2 항 PCSK9 (1F11) 경쇄 (Lc)를 코딩하는 핵산 서열에 연결시켰다.

항-PCSK9 Lc 미끼 카세트를 함유하는 플라스미드 pGLY11714를 인간 IgG2 Lc (VL+CL) 단편의 코돈 최적화 서열을 사용하여 구축하였고, 이를 합성하여 에스. 세레비지아에 α-짝결합 인자 신호 서열의 핵산 서열의 3' 말단에 인-프레임(in frame)으로 융합시켰다. 3개의 (GGGS, 서열 10) 링커의 핵산 서열을 사용하여 Lc 3' 말단의 핵산 서열을 에스. 세레비지아에 Sed1p의 5' 말단에 연결시켰다. 계약 연구 기관 (CRO)인 진와이즈(Genewiz)에 의해 구축물을 EcoRI-SalI에서 pGLY9008 내로 서브클로닝하였다 (Fc를 교체함). 상기 예에서와 같이, 생성된 플라스미드는 피키아 파스토리스에서 URA6 유전자좌에서 피키아 파스토리스 AOX1 프로모터의 제어 하에 Lc-SED1 카세트의 전달을 가능하게 한다.

pGLY11714 의 핵산 서열 (서열 7)

항- PCSK9 경쇄의 아미노산 서열 (서열 8)

알파 짝결합 인자-항 pPCSK9 Lc -( GGGS , 서열 10) 링커- 에스 . 세레비지아에 Sed1p 의 아미노산 서열 (서열 9)

실시예 2. 당조작 모노클로날 항체 생산 균주

이러한 시스템을 효모 세포 벽 상에 전장 항체 (인간 IgG를 포함함)를 디스플레이하는 것에 대해 테스트하기 위해, pGLY11714를 이전에 선택된 피키아 파스토리스 균주 내로 도입하고, 인간 항-Her2 또는 항-PCSK9 IgG의 발현 숙주로서 생성시켰다 (PCT/US2011/62286에 기술된 바와 같음). 빈 피키아 파스토리스 균주가 대조군으로서 포함되었다. 상이한 항체 형태를 포획하는 능력을 확립하기 위해 상이한 IgG 형태 (IgG1, IgG2 및 IgG4)가 이러한 연구에 포함되었다.

표 1의 당조작 피키아 파스토리스 모노클로날 항체 생산 균주를 50 ㎖ BMGY 배지에서 600 nm에서의 배양물 광학 광도가 2일 때까지 성장시켰다. 세포를 1 M 소르비톨로 3회 세정하고, 1 ㎖ 1 M 소르비톨에 재현탁시켰다. 약 1-2 ㎍의 Spe I로 선형화된 pGLY11714를 이러한 수용성 세포와 혼합하였다. 피키아 파스토리스 내로의 핵산의 전기천공에 대해 특이적인 제조사의 프로그램을 사용하여 바이오라드(BioRad) 전기천공 기구로 형질전환을 수행하였다. 1 ㎖의 회수 배지를 세포에 첨가한 후, 이를 효모-소이톤(soytone)-덱스트로스 (YSD) 배지 + 50 ㎍/㎖ 아비산염에 플레이팅(plating)하였다.

실시예 3. Lc - Sed1p 를 디스플레이하는 효모의 성장 및 유도

세포 표면 상의 Fc 단편을 검출함으로써, Lc-Sed1p 시스템을 사용하여 항체가 디스플레이될 수 있다는 것이 확립될 수 있는데, 이는 Fc가 세포 표면 상에 디스플레이되는 유일한 방식이 중쇄에 대한 양쪽 경쇄의 이종이량체화를 통해서이기 때문이다. 이를 위해, Lc-SED1 미끼 발현 카세트 및 인간 IgG를 발현하는 당조작 효모를 96-딥 웰(deep well) 플레이트 내의 600 ㎕ BMGY 또는 250 ㎖ 진탕 플라스크 내의 50 ㎖ BMGY를 사용하여 2일 동안 접종하였다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 상청액을 폐기하였다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2007/061631에 기술된 방법을 따라 밤새 300 ㎕ 또는 25 ㎖ BMMY + PMTi 억제제에서 인큐베이션함으로써 세포를 유도시켰다.

실시예 4. 표면에 디스플레이된 항체의 유동 세포측정법 검출

이러한 방법을 사용하여 항체를 표면에 디스플레이하는 것의 효율을 결정하기 위해, 세포를 인간 항체 분자의 Fc 단편을 검출하는 APC 635-표지 마우스 항-인간 Fc로 표지하고, 유동 세포측정법에 의해 프로세싱하였다. 간략하게, 600 nm에서 광학 밀도 2까지 성장한 후의 각각의 배양물을 원심분리에 의해 펠릿화하고, 100 ㎕ PBS에서 세정하였다. 세포를 형광 표지 (APC635) 마우스 항-인간 Fc를 함유하는 100 ㎕ 포스페이트 완충 염수 (PBS)에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 100 ㎕ PBS에서 세정하였다. 100 ㎕의 PBS를 사용하여 펠릿을 재현탁시킨 후에 유동 세포측정기에서 분석하였다 (도 3a-d 참조).

Lc-Sed1p 미끼 및 항-Her2 (도 3b), 또는 Lc-Sed1p 미끼 및 항-PCSK9 변이체 (도 3c 및 d)를 공발현하는 세포를 사용하여 유동 세포측정법 분석을 수행하였다. 전장 항-Her2 항체 (H2+L2)만 발현하는 빈 균주 (도 3a) 또는 Lc-Sed1p를 발현하는 균주인 대조군을 제조하였다. 항-Her2와 Lc-Sed1p 미끼 (도 3b), 또는 항-PCSK9와 Lc-Sed1p 미끼 (도 3c)를 공발현하는 균주는 유의한 수준의 항-Fc 결합을 디스플레이하는 것으로 발견된 반면, Lc-Sed1p 미끼가 결여된 균주는 배경 신호 수준을 나타냈고 (도 3a), 따라서 Lc-Sed1p 미끼가 Fc를 함유하는 중쇄 단편을 포획하였음을 시사한다. 도 3a-d에서, 이러한 실험들로부터의 형광 강도가 비교되었다. 도 3b는 항-Her2를 디스플레이하는 세포에 대한 여러 형광 강도를 나타내는 한편, 도 3c는 항-PCSK9를 디스플레이하는 세포에 대한 강도를 나타내고, 모 균주는 Lc-Sed1p 미끼를 함유하지 않았다 (도 3a).

실시예 5. Fc 수용체에 결합하는 것을 조절하기 위한 디스플레이 양식의 설명

본 발명의 디스플레이 양식은 Fc 수용체에 결합하는 것을 조절하는 것을 가능하게 하는 Fc 단편의 조작을 용이하게 한다. 디스플레이된 여러 IgG에 대한 Fc 수용체의 결합을 테스트하여 이러한 원리를 설명하였다. 인간 Fc 감마 수용체 I 및 인간 Fc 감마 수용체 IIb를 사용하였는데, 이들이 상이한 Fc 형태에 대한 상이한 친화도를 지니기 때문이다. 마우스 Fc 감마 수용체 IIb를 대조군으로서 사용하였다. 100 nM의 각각의 수용체 (His 태그가 부착된 R 및 D 시스템)를 100 ㎕ 포스페이트 완충 염수에서 앞서 기술된 바와 같이 각각의 배양물의 600 nm 광학 밀도 2로 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 100 ㎕의 동일한 완충제로 세정하였다. 1 ㎕의 FITC-접합 항-His 단편을 100 ㎕의 PBS 내의 세포에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 펠릿화하고, 100 ㎕ PBS에서 세정하고, 100 ㎕ PBS에 재현탁시킨 후, 유동 세포측정법 시스템에서 분석하였다.

도 3a에 나타난 바와 같이, Lc-Sed1 시스템 없이 전장 항체를 발현하는 균주로부터의 세포는 항-His FITC로 염색되지 않은 한편, Lc-Sed1p와 함께 IgG를 발현하는 균주는 항체, IgG 유형, 또는 당형태와 관계 없이 항-His FITC와 반응하였고, 이는 모든 Fc 형태가 Fc 감마 수용체 I에 결합할 수 있었음을 가리킨다. 이러한 결과는 경쇄 및 중쇄가 세포 표면 상에서 완전히 조립되었음을 설명한다.

대조적으로, Fc 내에 4개의 돌연변이 (F243A/V264A/S267E/L328F)를 함유하는 균주만 항-His FITC와 반응하였고, 이는 이러한 Fc 형태가 Fc 감마 수용체 IIb에 결합할 수 있었음을 시사한다 (도 3d). 이는 가용성 IgG로부터 수득된 비아코어 데이터와 일치한다. 이는 이러한 방법이 생물학적 및 약동학적 성질의 강화를 위해 바람직한 Fc 감마 수용체 결합이 있는 Fc 단편을 조작하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

본 발명은 범주 면에서 본원에 기술된 구체적인 실시양태에 의해 한정되지 않는다. 실제로, 본 발명의 범주는 본원에 구체적으로 기재된 실시양태 및 본원에 구체적으로 기재되지 않은 기타 실시양태를 포함한다; 본원에 구체적으로 기재된 실시양태는 반드시 포괄적인 것으로 의도되지는 않는다. 본원에 기술된 것들에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 상기의 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이같은 변형은 청구항의 범주 내에 속하도록 의도된다.

특허, 특허 출원, 간행물, 제품 설명 및 프로토콜이 본 출원 전반에 걸쳐 인용되고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Shaheen, Hussam H Zha, Dongxing <120> SURFACE ANCHORED LIGHT CHAIN BAIT ANTIBODY DISPLAY SYSTEM <130> 23234GFIBIO <150> 61/645,763 <151> 2012-05-11 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 322 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Val Asp Gln Phe Ser Asn Ser Thr Ser Ala Ser Ser Thr Asp Val Thr 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser Ile Ser Thr Ser Ser Gly Ser Val Thr Ile Thr Ser 20 25 30 Ser Glu Ala Pro Glu Ser Asp Asn Gly Thr Ser Thr Ala Ala Pro Thr 35 40 45 Glu Thr Ser Thr Glu Ala Pro Thr Thr Ala Ile Pro Thr Asn Gly Thr 50 55 60 Ser Thr Glu Ala Pro Thr Thr Ala Ile Pro Thr Asn Gly Thr Ser Thr 65 70 75 80 Glu Ala Pro Thr Asp Thr Thr Thr Glu Ala Pro Thr Thr Ala Leu Pro 85 90 95 Thr Asn Gly Thr Ser Thr Glu Ala Pro Thr Asp Thr Thr Thr Glu Ala 100 105 110 Pro Thr Thr Gly Leu Pro Thr Asn Gly Thr Thr Ser Ala Phe Pro Pro 115 120 125 Thr Thr Ser Leu Pro Pro Ser Asn Thr Thr Thr Thr Pro Pro Tyr Asn 130 135 140 Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Thr Asp Tyr Thr Val Val Thr Glu 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aatcgcacc gatatactga ctacgatcaa 4080 gtcattgtca tggcttgact tgatgttgcc atttactata attctctcca taatcattgc 4140 agtaataatt tctgtctatg tgccttcttc ccgtcacact tttgacgctg aaggtcatcc 4200 caatctaatg ggagtgtcca ttcctttgac tgttggtatg attgtaatga tgattccccc 4260 gatctgcaaa gtttcctggg agtctattca caagtacttc tacaggagct atataaggaa 4320 gcaactagcc ctctcgttat ttttgaattg ggtcatcggt cctttgttga tgacagcatt 4380 ggcgtggatg gcgctattcg attataagga ataccgtcaa ggcattatta tgatcggagt 4440 agctagatgc attgccatgg tgctaatttg gaatcagatt gctggaggag acaatgatct 4500 ctgcgtcgtg cttgttatta caaactcgct tttacagatg gtattatatg caccattgca 4560 gatattttac tgttatgtta tttctcatga ccacctgaat acttcaaata gggtattatt 4620 cgaagaggtt gcaaagtctg tcggagtttt tctcggcata ccactgggaa ttggcattat 4680 catacgtttg ggaagtctta ccatagctgg taaaagtaat tatgaaaaat acattttgag 4740 atttatttct ccatgggcaa tgatcggatt tcattacact ttatttgtta tttttattag 4800 tagaggttat caatttatcc acgaaattgg ttctgcaata ttgtgctttg tcccattggt 4860 gctttacttc tttattgcat ggtttttgac cttcgca 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ggccgatc catgattatg 5760 taatgcatat agtttttgtc gatgctcacc cgtttcgagt ctgtctcgta tcgtcttacg 5820 tataagttca agcatgttta ccaggtctgt tagaaactcc tttgtgaggg caggacctat 5880 tcgtctcggt cccgttgttt ctaagagact gtacagccaa gcgcagaatg gtggcattaa 5940 ccataagagg attctgatcg gacttggtct attggctatt ggaaccaccc tttacgggac 6000 aaccaaccct accaagactc ctattgcatt tgtggaacca gccacggaaa gagcgtttaa 6060 ggacggagac gtctctgtga tttttgttct cggaggtcca ggagctggaa aaggtaccca 6120 atgtgccaaa ctagtgagta attacggatt tgttcacctg tcagctggag acttgttacg 6180 tgcagaacag aagagggagg ggtctaagta tggagagatg atttcccagt atatcagaga 6240 tggactgata gtacctcaag aggtcaccat tgcgctcttg gagcaggcca tgaaggaaaa 6300 cttcgagaaa gggaagacac ggttcttgat tgatggattc cctcgtaaga tggaccaggc 6360 caaaactttt gaggaaaaag tcgcaaagtc caaggtgaca cttttctttg attgtcccga 6420 atcagtgctc cttgagagat tacttaaaag aggacagaca agcggaagag aggatgataa 6480 tgcggagagt atcaaaaaaa gattcaaaac attcgtggaa acttcgatgc ctgtggtgga 6540 ctatttcggg aagcaaggac gcgttttgaa ggtatcttgt gaccaccc 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