신호 프로브를 이용하는 방법 및 물질

신호 프로브를 이용하는 방법 및 물질{METHODS AND MATERIALS USING SIGNALING PROBES}

본 출원은 그의 전체내용이 본원에 참고로 포함되는 2004년 2월 18일에 출원된 미국 가출원 제60/546,075호를 우선권으로 주장한다.

발명의 배경

특이적 핵산 서열의 존재를 인식하여 보고하는 핵산 프로브는 주로 시험관내 반응에서 특이적 핵산을 검출하기 위해 사용되고 있다(참조예: 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,925,517호). 프로브의 한 유형은 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드가 중앙에 연장되어 있고 말단에 상호 상보적인 단길이 서열을 가지는 헤어핀 형태의 구조를 가지도록 디자인된다(참조예: 본원에 참고로 포함되는 Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology , 14, 303-308 (1996)). 스템-루프형(stem-loop shaped) 프로브의 한 말단은 형광단에 공유 결합하고, 다른 말단은 퀀칭 부분(quenching moiety)에 공유 결합한다. 하이브리드화 말단을 가지는 이의 고유 형태에서, 형광단과 퀀처가 근접하여 있는 경우에는 형광이 비교적 거의 생성되지 않거나 실질적으로 생성되지 않는다. 스템-루프 프로브가 이의 표적 핵산과 하이브리드화하는 경우, 형태 변화를 거쳐 형광단으로부터 형광 생성에 검출가능한 변화를 초래한다. 연구원들은 생존 세포에서 메신저 RNA를 동일계에서 가시화하는 데 헤어핀 형태의 프로브를 사용해 왔다(Matsuo, 1998, Biochim . Biophys . Acta 1379:178-184).

발명의 개요

본 발명은 1 이상의 RNA를 발현하는 세포 또는 세포주를 분석 또는 단리하기 위해 신규한 신호 프로브를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이 방법은 표적 서열과의 하이브리드화 시 프로브에 의해 생성되는 신호 검출을 기반으로 한다. RNA는 DNA 컨스트럭트(construct)를 통해 세포 내로 도입될 수 있거나, 또는 세포는 RNA를 내인성으로 발현할 것이라 여겨진다. DNA 컨스트럭트는 태그(tag) 서열을 추가로 코딩하며, 신호 프로브는 태그 서열에 상보성이다. 일례로, 단리된 세포 또는 생성된 세포주는 발현에 대해 기능적으로 효력이 없거나(null), 1 이상의 예비 선별 단백질 또는 RNA의 발현을 감소시킨다. 본 발명은 또한 상술된 방법에 따라 단리된 세포를 사용하여 형질전환 동물을 형성하는 방법을 제공한다.

본 발명은 1 이상의 RNA 전사물의 발현 수준을 정량화하는 방법에 사용되는 신호 프로브를 제공한다. 또한, 신호 프로브는 적어도 하나의 예비 선별 RNA 전사를 조절하는 화합물 또는 RNA 서열의 정량 방법에 사용된다. 다른 구체예로, 신호 프로브는 생존 세포에서 유전자 재조합의 확인 방법에 사용된다. 신호 프로브는 1 이상의 뉴클레오티드 스트랜드(strand)를 포함하며, 이 때 신호 프로브는 소정의 표적 핵산(예: RNA)에 상보성인 뉴클레오티드를 포함하고, 두 부분을 포함하는 상호 쌍을 추가로 포함한다. 신호 프로브의 구조는 신호 프로브가 표적 서열에 하이브리화되지 않은 경우에, 상호 쌍의 두 부분이 신호를 생성하지 않거나 백그라운드 신호를 생성하도록 물리적으로 위치하는 방식으로 존재한다. 신호 프로브가 표적 서열에 하이브리화되면, 두 부분은 신호가 생성되도록 한다. 또한, 신호 프로브 부분은 프로브가 표적에 하이브리화되지 않은 경우에 특정 신호를 생성하고, 프로브가 표적 서열에 하이브리화되는 경우에는 상이한 신호가 생성되도록 한다. 상호 쌍의 두 부분은 1 이상의 신호 프로브 스트랜드의 1 이상의 말단에 부착될 수 있다. 또한, 상기 부분들은 1 이상의 신호 프로브 스트랜드에 내부적으로 도입될 수 있다. 신호 프로브의 뉴클레오티드는 변경될 수도 있다.

본 발명은 또한 프로테아제 프로브를 제공한다. 일례로, 신호 또는 프로테아제 프로브는 1 이상의 부분이 서로 어닐링(annealing)되고, 한 스트랜드의 한 개 이상의 말단이 다른 스트랜드의 말단에 인접한 두 개의 별도의 핵산 스트랜드 또는 변형된 핵산을 포함한다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 2개의 분리된 스트랜드를 가지는 신호 프로브의 경우, 일례로, 한 스트랜드는 한 개 이상의 말단에 퀀처 부분을 가지며, 다른 스트랜드는 적어도 인접 말단 상에 형광단을 가진다. 프로테아제 프로브의 경우, 일례로, 한 스트랜드는 한 개 이상의 말단에 단백질 분해효소를 가지며, 다른 스트랜드는 적어도 인접 말단 상에 단백질 분해효소의 저해제를 가진다.

다른 구체예로, 신호 또는 프로테아제 프로브는 적어도 상호 상보적인 영역 및 적어도 비상보적인 영역을 포함하도록 디자인된다. 일례로, 적어도 하나의 비상보적인 영역은 루프 영역을 형성하도록 디자인될 수 있다. 일례로, 프로브는 적어도 스템-루프 구조를 형성하도록 디자인된다. 다른 구체예로, 프로브는 덤벨(dumbbell) 구조 또는 3-암 접합 구조(three-arm junction structure)를 형성한다. 일례로, 신호 프로브는 스트랜드의 각 말단에 적어도 형광단 및 적어도 퀀처 부분을 가진다. 일례로, 프로테아제 프로브는 스트랜드의 각 말단에 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제를 가진다.

다른 구체예로, 신호 또는 프로테아제 프로브는 화학적으로 변형된다. 1 이상의 당-포스포디에스테르 타입 골격(backbone), 2'OH 및 퓨린 또는 피리미딘 염기가 변형된다. 일례로, 데옥시리보스 골격은 펩티드 핵산으로 대체된다.

일례로, 태그 서열은 구조 RNA이며, 즉, RNA는 2차 구조, 바람직하게는 3-암 접합 구조를 가진다. 일례로, 태그 서열은 도 42A, B 또는 C에 따른 구조 또는 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 소정의 1 이상의 RNA 및 태그 서열을 코딩하는 1 이상의 DNA를 포함하는 DNA 컨스트럭트를 제공한다. 본 발명은 또한 DNA 컨스트럭트를 포함하는 벡터 및 세포를 제공한다.

다른 구체예로 하기 측면들이 제공된다:

1. a) 적어도 하나의 RNA를 코딩하는 DNA를 적어도 세포 내로 도입하는 단계;

b) 상기 적어도 하나의 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법.

2. 제1 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

3. a) 제1 RNA를 코딩하는 제1 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 적어도 제2 RNA를 코딩하는 제2 DNA를 적어도 상기 세포 내로 도입하는 단계;

c) 제1 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브에 적어도 상기 세포를 노출시키는 단계;

d) 적어도 상기 제2 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 적어도 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

e) 상기 신호 프로브가 그들 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 적어도 하나의 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 2 이상의 RNA 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 단리하는 방법.

4. 제3 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 2 이상의 RNA 중 적어도 하나를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

5. a) 세포의 적어도 한 서브세트(subset)에 적어도 상이한 RNA를 코딩하는 상이한 DNA가 적어도 도입된 세포에 다수의 RNA를 코딩하는 다수의 DNA를 도입하는 단계;

b) 상기 다수의 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 다수의 신호 프로브에 상기 세포를 순차적으로 또는 동시에 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 한 서브세트의 세포가 적어도 상이한 RNA를 발현하는 다수의 세포를 단리하는 방법.

6. 제5 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 적어도 상이한 RNA를 발현하는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

7. a) 적어도 하나의 RNA 및 적어도 하나의 태그 서열을 코딩하는 DNA를 적어도 세포 내로 도입하는 단계;

b) 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법.

8. 제7 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

9. a) 제1 RNA 및 적어도 제1 태그 서열을 코딩하는 제1 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 적어도 추가 RNA 및 적어도 제1 태그 서열과 동일하거나 상이한 제2 태그 서열을 코딩하는 제2 DNA를 적어도 세포 내로 도입하는 단계;

c) 제1 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브에 적어도 상기 세포를 노출시키는 단계;

d) 제2 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 적어도 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

e) 신호 프로브가 그들 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 적어도 하나의 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 2 이상의 RNA 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 단리하는 방법.

10. 제9 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 2 이상의 RNA 중 적어도 하나를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

11. 제3 항목 또는 제9 항목에 있어서, 제1 RNA의 단계가 적어도 하나의 추가 RNA의 상응하는 단계와 동시에 또는 순차적으로 수행되는 방법.

12. 제3 항목 또는 제9 항목에 있어서, 2 이상의 RNA 또는 2 이상의 RNA에 의해 코딩되는 단백질이 동일하거나 또는 관련된 생물학적 경로 내의 RNA 또는 단백질, 서로의 업스트림 또는 다운스트림으로 작용하는 RNA 또는 단백질, 서로에 대해 조절(modulating), 활성화 또는 억제 기능을 가지는 RNA 또는 단백질, 기능 또는 활성에 대해 서로 의존적인 RNA 또는 단백질, 컴플렉스(complex)를 형성하는 RNA 또는 단백질, 및 단백질 패밀리에 속하는 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

13. a) 세포에 적어도 하나의 RNA 및 적어도 제1 태그 서열을 코딩하는 적어도 제1 DNA 및 적어도 하나의 RNA 및 적어도 제2 태그 서열을 코딩하는 적어도 제2 DNA를 도입하되, 제1 및 제2 DNA 컨스트럭트의 도입은 순차적으로 또는 동시에 수행되고, 제1 및 제2 태그 서열은 동일하거나 상이한 단계;

b) 적어도 제1 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 제1 신호 프로브 및 적어도 제2 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 제2 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호 프로브가 그들 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 적어도 하나의 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 RNA를 과다발현하는 세포를 단리하는 방법.

14. 제13 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 RNA를 과다발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

15. 제3 항목, 제9 항목 또는 제13 항목에 있어서, 제1 신호 프로브가 제2 신호 프로브에 의해 생성된 신호와 상이한 신호를 생성하는 방법.

16. 제13 항목에 있어서, 제1 신호 프로브의 단계가 제2 신호 프로브의 상응하는 단계와 동시에 또는 순차적으로 수행되는 방법.

17. 제3 항목, 제9 항목 또는 제13 항목에 있어서, 제1 DNA 및 제2 DNA가 동일한 컨스트럭트 또는 상이한 컨스트럭트 상에 존재하는 방법.

18. a) 세포에 다수의 RNA 및 적어도 제1 태그 서열을 코딩하는 다수의 DNA를 도입하되, 세포의 적어도 한 서브세트에 적어도 상이한 RNA를 코딩하는 적어도 상이한 DNA가 도입되는 단계;

b) 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 한 서브세트의 세포가 적어도 상이한 RNA를 발현하는 다수의 세포를 단리하는 방법.

19. 제18 항목에 있어서, 다수의 RNA가 적어도 발현 라이브러리를 형성하는 방법.

20. 제18 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 적어도 상이한 RNA를 발현하는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

21. a) 적어도 제1 RNA 발현 라이브러리 및 적어도 제1 태그 서열을 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 적어도 제2 RNA 발현 라이브러리 및 적어도 제1 태그와 동일하거나 상이한 제2 태그 서열을 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

c) 적어도 제1 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브에 적어도 상기 세포를 노출시키는 단계;

d) 적어도 제2 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 적어도 상기 세포를 노출시키되, 제1 신호 프로브로부터의 검출가능한 신호는 제2 신호 프로브로부터의 검출가능한 신호와 동일하거나 상이한 단계; 및

e) 적어도 하나의 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 세포의 2 이상의 RNA 발현 라이브러리 중 적어도 하나를 단리하는 방법.

22. 제21 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 2 이상의 RNA 발현 라이브러리 중 적어도 하나를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

23. 제5 항목 또는 제18 항목에 있어서, 다수의 RNA 또는 다수의 RNA에 의해 코딩되는 단백질이 동일하거나 또는 관련된 생물학적 경로 내의 RNA 또는 단백질, 서로의 업스트림 또는 다운스트림으로 작용하는 RNA 또는 단백질, 서로에 대해 조절, 활성화 또는 억제 기능을 가지는 RNA 또는 단백질, 기능 또는 활성에 대해 서로 의존적인 RNA 또는 단백질, 컴플렉스를 형성하는 RNA 또는 단백질, 및 단백질 패밀리에 속하는 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

24. 제18 항목에 있어서, 다수의 DNA의 적어도 한 서브세트는 동일한 태그 서열을 코딩하는 방법.

25. 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목 및 제21 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 태그 서열이 적어도 신호 프로브에 의해 인식되는 다수의 표적 서열을 포함하는 방법.

26. 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목 및 제21 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 태그 서열이 구조 RNA인 방법.

27. 제25 항목에 있어서, 태그 서열이 3-암 접합 구조를 형성하는 방법.

28. 제27 항목에 있어서, 스템 영역이 8-9개의 염기쌍을 포함하고, 제1 스템-루프 영역이 4-6개의 염기쌍을 포함하며, 제2 스템-루프 영역이 13-17개의 염기쌍을 포함하는 방법.

29. 제27 항목에 있어서, 3-암의 스템 영역이 비상보적인 영역을 추가로 포함하는 방법.

30. 제27 항목에 있어서, 스템 영역 및 제1 스템-루프 영역이 둘 다 하나의 미스매치(mismatch) 영역을 추가로 포함하고, 제2 스템-루프 영역이 2-7개의 미스매치 또는 벌지(bulge) 영역을 추가로 포함하는 방법.

31. 제27 항목에 있어서, 스템 영역 사이의 결합이 총 8-12개의 뉴클레오티드를 가지는 방법.

32. 제26 항목에 있어서, 태그 서열이 도 42A, B 및 C에 나타내어진 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

33. 제32 항목에 있어서, 태그 서열이 도 42A, B 및 C에 나타내어진 서열로 예측되는 에너지적으로 보다 유리한 구조를 형성하는 방법.

34. 제27 항목에 있어서, 표적 서열이 제1 스템-루프 영역의 스템 중 3' 측의 전부 또는 일부에서부터 제1 및 제2 스템-루프 영역 사이의 결합, 제2 스템-루프 영역의 스템 중 5' 측의 전부 또는 일부까지의 영역인 방법.

35. 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목 및 21 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 적어도 한 서브세트의 DNA가 다수의 동일한 태그 서열을 코딩하는 방법.

36. 제35 항목에 있어서, 적어도 한 서브세트의 DNA가 50개 이하의 동일한 태그 서열을 코딩하는 방법.

37. 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목 및 21 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 태그 서열을 코딩하는 DNA가 RNA를 코딩하는 DNA와 동일 골격에 존재하는 방법.

38. 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목 및 제21 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 태그 서열을 코딩하는 DNA가 RNA를 코딩하는 DNA와 동일한 골격에 존재하지 않는 방법.

39. a) 잠재적으로 적어도 하나의 RNA를 발현할 세포를 제공하는 단계;

b) 적어도 하나의 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법.

40. 제39 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

41. 제39 항목에 있어서, 세포가

a) 적어도 하나의 추가 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 추가 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

b) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 잠재적으로 1 이상의 추가 RNA를 추가로 발현하는 방법.

42. 제41 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 적어도 하나의 RNA 및 추가 RNA를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

43. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목 및 제21 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 a) 전에 상기 RNA, 추가 RNA 또는 다수의 RNA의 발현을 조절 또는 조정하는 화합물을 세포에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

44. 제43 항목에 있어서, 화합물이 상기 RNA, 추가 RNA 또는 다수의 RNA의 발현을 유도하는 방법.

45. 제5 항목 또는 제18 항목에 있어서, 다수의 RNA의 단계가 동시에 또는 순차적으로 수행되는 방법.

46. a) 적어도 하나의 외인성 RNA를 코딩하는 DNA를 잠재적으로 적어도 하나의 외인성 RNA를 발현할 세포 내로 도입하는 단계;

b) 적어도 하나의 외인성 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브에 적어도 세포를 노출시키는 단계;

c) 적어도 하나의 내인성 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 적어도 세포를 노출시키는 단계; 및

d) 신호 프로브가 그들 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 적어도 하나의 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 외인성 RNA 및 적어도 하나의 내인성 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법.

47. 제46 항목에 있어서, 단리된 세포를 증식시켜 적어도 하나의 외인성 RNA, 또는 적어도 하나의 내인성 RNA, 또는 이 둘 다를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

48. 제46 항목에 있어서, 외인성 RNA의 단계가 내인성 RNA의 상응하는 단계와 동시에 또는 순차적으로 수행되는 방법.

49. 제46 항목에 있어서, 제2 신호 프로브가 제1 신호 프로브에 의해 생성된 신호와 상이한 신호를 생성하는 방법.

50. 제46 항목에 있어서, 내인성 RNA 및 외인성 RNA 또는 내인성 및 외인성 RNA에 의해 코딩되는 단백질이 동일하거나 또는 관련된 생물학적 경로 내의 RNA 또는 단백질, 서로의 업스트림 또는 다운스트림으로 작용하는 RNA 또는 단백질, 서로에 대해 조절, 활성화 또는 억제 기능을 가지는 RNA 또는 단백질, 기능 또는 활성에 대해 서로 의존적인 RNA 또는 단백질, 컴플렉스를 형성하는 RNA 또는 단백질, 및 단백질 패밀리에 속하는 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

51. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목 및 제39 항목 중 어느 한 항목에 있어서, RNA가 단백질을 코딩하는 메신저 RNA, 펩티드를 코딩하는 RNA, 안티센스 RNA, siRNA, tRNA, 구조 RNA, 리보좀 RNA, hnRNA 및 snRNA 중 1 이상을 포함하는 방법.

52. 제51 항목에 있어서, 단백질이 세포 표면에 편재화된 단백질, 분비 단백질 및 세포 내 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

53. a) 적어도 제1 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 RNA 및 적어도 제1 태그 서열을 코딩하는 적어도 제1 DNA; 및 적어도 하나의 RNA 및 적어도 하나의 제2 태그 서열을 코딩하는 적어도 제2 DNA를 세포 내로 도입하되, 제1 및 제2 태그 서열은 상이한 단계;

b) 적어도 제2 단백질의 mRNA 전사물에 결합하거나 이를 방해하는 적어도 하나의 안티센스 RNA 또는 siRNA를 코딩하는 적어도 하나의 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

c) 적어도 제1 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 제1 신호 프로브, 및 적어도 제2 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 제2 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계;

d) 적어도 하나의 안티센스 RNA 또는 siRNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

e) 신호 프로브가 그들 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 적어도 하나의 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 제2 단백질에 대한 발현에 기능적으로 효력을 나타내지 않거나, 이를 감소시킨 적어도 제1 단백질을 과다발현하는 세포를 단리하는 방법.

54. 제53 항목에 있어서, 적어도 제1 단백질을 과다발현하고, 적어도 제2 단백질을 기능적으로 효력을 나타내지 않거나, 발현을 감소시킨 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

55. 제53 항목에 있어서, 제1 단백질의 단계가 제2 단백질의 상응하는 단계와 동시에 또는 순차적으로 수행되는 방법.

56. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 제53 항목 중 어느 한 항목에 있어서, DNA가 조건부 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 방법.

57. 제56 항목에 있어서, 프로모터가 유도 또는 억제가능하고, 단계 (a) 전에, 최소량의 유도제 또는 충분량의 억제제가 세포에 첨가되는 방법.

58. 제57 항목에 있어서, RNA가 안티센스 RNA 또는 siRNA인 방법.

59. 제57 항목에 있어서, RNA가 세포에 치명적이거나, 유해한 방법.

60. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 53 항목 중 어느 한 항목에 있어서, DNA를 세포 내로 도입한 후, 세포를 신호 프로브에 노출시키기 전에 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

61. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 53 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 적어도 하나의 DNA가 적어도 하나의 약물 내성 마커를 추가로 코딩하고, 마커에 의해 내성이 부여되는 적어도 하나의 약물에 내성인 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

62. a) 구성 프로모터(constitutive promoter)의 조절 하에 적어도 제1 RNA 서열을 코딩하고 조직 특이적 프로모터의 조절 하에 적어도 제2 RNA 서열을 코딩하는 적어도 하나의 DNA 컨스트럭트를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 제1 RNA 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 조직 특이적 프로모터의 조절 하에 있는 RNA 서열을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 세포를 단리하는 방법.

63. 제62 항목에 있어서, 조직 특이적 프로모터의 조절 하에 있는 RNA 서열을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

64. 제62 항목에 있어서, 조직 특이적 프로모터가 선별 마커 유전자의 발현을 조절하는 방법.

65. 제62 항목에 있어서, 선별 마커 유전자가 약물 내성 유전자 또는 검출가능한 단백질 유전자인 방법.

66. a) 화합물을 제62 항목으로부터 단리된 세포에 첨가하는 단계;

b) 선별 마커에 의해 세포를 동정하는 단계; 및

c) 조직 특이적 프로모터를 활성화시키는 화합물로서 화합물을 동정하는 단계

를 포함하는, 조직 특이적 프로모터를 활성화시키는 화합물을 동정하는 방법.

67. a) 구성 프로모터의 조절 하에 적어도 하나의 시험 RNA 서열, 동일하거나 상이한 제2 구성 프로모터의 조절 하에 적어도 제2 RNA 서열 및 조직 특이적 프로모터의 조절 하에 적어도 제3 RNA 서열을 코딩하는 적어도 하나의 DNA 컨스트럭트를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 제2 RNA 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 시험 RNA 서열 및 조직 특이적 프로모터의 조절 하에 있는 RNA 서열을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 세포를 단리하는 방법.

68. 제67 항목에 있어서, 적어도 시험 RNA 서열 및 조직 특이적 프로모터의 조절 하에 있는 RNA 서열을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

69. 제67 항목에 있어서, 시험 RNA 서열이 발현 라이브러리로부터 유래된 것인 방법.

70. 제67 항목에 있어서, 조직 특이적 프로모터가 선별 마커 유전자의 발현을 조절하는 방법.

71. 제62 항목에 있어서, 선별 마커 유전자가 약물 내성 유전자 또는 검출가능한 단백질 유전자인 방법.

72. a) 선별 마커에 의해 제67 항목의 단리된 세포를 동정하는 단계; 및

b) 조직 특이적 프로모터를 활성화시키는 시험 RNA 서열을 동정하는 단계를 포함하는, 조직 특이적 프로모터를 활성화시키는 시험 RNA 서열을 동정하는 방법.

73. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 53 항목 중 어느 한 항목에 있어서,

i) 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 단리된 세포를 노출시키는 단계;

ii) 단리된 세포가 각각의 RNA를 발현하는지를 결정하거나; 신호 수준을 정량화하여 각 RNA의 발현 수준을 결정하는 단계

를 추가로 포함하는 방법.

74. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 53 항목 중 어느 한 항목의 방법으로부터 수득된, 세포계 분석(cell-based assay)에 적용되는 단리된 세포.

75. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 53 항목 중 어느 한 항목의 방법으로부터 수득된, 동물에 이식가능한 단리된 세포.

76. 동물에 이식가능한 배아 줄기 세포(들)를 사용하여 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 53 항목 중 어느 한 항목의 단계를 수행하고, 줄기 세포(들)의 생존성을 결정하며, 생 줄기 세포(들)를 사용하여 형질전환 동물을 형성하는 것을 포함하여, 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목 및 53 항목 중 어느 한 항목에 따른 RNA를 발현하는 형질전환 동물을 형성하는 방법.

77. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목 및 제39 항목 중 어느 한 항목에 있어서, RNA가 안티센스 RNA 또는 siRNA이고, 적어도 하나의 예비 선별 단백질의 siRNA가 mRNA로 전사하는 것을 방해하거나 안티센스 RNA가 결합됨에 따라 단리된 세포 내 적어도 하나의 예비 선별 단백질이 기능적으로 효력을 나타내지 않거나 발현 수준이 감소되는 방법.

78. 제77 항목에 있어서, 예비 선별 단백질이 택일적으로 스플라이싱된 형태의 유전자 산물인 방법.

79. 동물에 이식가능한 배아 줄기 세포(들)를 사용하여 제77 항목의 단계를 수행하고, 줄기 세포(들)의 생존성을 결정하며, 생 줄기 세포(들)를 사용하여 형질전환 동물을 형성하는 것을 포함하여, 적어도 하나의 예비 선별 단백질이 기능적으로 효력을 나타내지 않거나 발현 수준이 감소된 형질전환 동물을 형성하는 방법.

80. a) RNA 전사물과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브에 생물학적 샘플을 노출시키는 단계;

b) 생물학적 샘플내 신호 수준을 정량화하는 방법; 및

c) 상기 신호 수준을 적어도 하나의 mRNA 전사물과 서로 연관시키는 단계

를 포함하는, 생물학적 샘플내 적어도 하나의 RNA 전사 발현의 수준을 정량화하는 방법.

81. 제80 항목에 있어서, 생물학적 샘플이 세포 샘플, 조직 샘플 또는 이들로부터 유래된 제제인 방법.

82. 제80 항목에 있어서, RNA 전사물이 단백질을 코딩하는 메신저 RNA, 펩티드를 코딩하는 RNA, 안티센스 RNA, siRNA, tRNA, 구조 RNA, 리보좀 RNA, hnRNA 및 snRNA 중 1 이상인 방법.

83. 제80 항목에 있어서, 생물학적 샘플이 고정된 방법.

84. 제80 항목에 있어서, 제2 RNA 전사물과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브를 사용하여 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 제2 RNA 전사 발현 수준을 정량화하는 방법.

85. a) 예비 선별 RNA를 외인성으로 또는 내인성으로 발현하는 세포에 화합물을 첨가하는 단계;

b) 적어도 하나의 예비 선별 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계;

c) 세포 내 신호 수준을 정량화하는 단계;

d) 화합물이 첨가되지 않은 세포의 신호에 비해 신호가 감소 또는 증가된 세포를 동정하는 단계; 및

e) 적어도 하나의 예비 선별 RNA 전사를 조절하는 화합물을 동정하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절하는 화합물을 동정하는 방법.

86. 제85 항목에 있어서, 예비 선별 RNA를 외인성으로 발현하는 세포가 제1 항목 또는 제7 항목의 방법에 따라 단리되는 방법.

87. 제85 항목에 있어서, DNA 컨스트럭트가 프로모터 또는 오퍼레이터를 포함하고, 전사를 조절하는 억제제, 인핸서(enhancer) 또는 서열을 코딩하는 방법.

88. a) 외인성으로 또는 내인성으로 발현된 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 잠재적으로 조절할 시험 RNA 서열을 적어도 세포 내로 도입하는 단계;

b) 적어도 하나의 예비 선별 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계;

c) 세포 내 신호 수준을 정량화하는 단계;

d) 시험 RNA 서열을 갖지 않는 세포의 신호에 비해 신호가 감소 또는 증가된 세포를 동정하는 단계; 및

e) 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절하는 시험 RNA 서열을 동정하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절하는 RNA 서열을 동정하는 방법.

89. 제88 항목에 있어서, 예비 선별 RNA를 외인성으로 발현하는 세포가 제1 항목 또는 제7 항목의 방법에 따라 단리되는 방법.

90. 제88 항목에 있어서, RNA의 발현 라이브러리가 시험 RNA 서열로 사용되는 방법.

91. a) 재조합 서열로부터의 전사물 및 비재조합 서열로부터의 전사물로 이루어지는 군으로부터 선택된 RNA 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계; 및

b) 상기 RNA 서열을 발현하는 세포를 검출하는 단계

를 포함하는, 생존 세포 내 유전자 재조합을 확인하는 방법.

92. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목, 제53 항목, 제62 항목, 제67 항목, 제73 항목, 제80 항목, 제85 항목, 제88 항목 및 91 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 신호 프로브가 적어도 상호 상보적인 영역을 형성하는 핵산 또는 변형된 핵산의 2개의 분리된 스트랜드를 포함하는 방법.

93. 제92 항목에 있어서, 2개의 분리된 스트랜드가 5'에서 3' 말단으로의 연속되는 상호 상보적인 영역을 형성하고, 상기 2개의 스트랜드가 동일한 수의 뉴클레오티드를 가지는 방법.

94. 제92 항목에 있어서, 상호 상보적인 영역이 2개의 스트랜드 사이에 형성된 후, 스트랜드의 5' 말단이 다른 스트랜드로부터 갈라져 나오거나, 스트랜드의 3' 말단이 다른 스트랜드로부터 갈라져 나오거나, 또는 5' 말단 및 3' 말단 둘 다가 갈라져 나오고, 갈라짐은 10개 이하의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드인 방법.

95. 제92 항목에 있어서, 2개의 스트랜드가 각 말단에 5 또는 6개의 연속 염기쌍의 상호 상보적인 영역을 형성하는 방법.

96. 제92 항목에 있어서, 2개의 스트랜드의 서열이 동일하지 않은 방법.

97. 제92 항목에 있어서, 스트랜드가 30개를 초과한 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 가지는 방법.

98. 제92 항목에 있어서, 핵산이 DNA, RNA, 또는 이 둘 다인 방법.

99. 제92 항목에 있어서, 변형된 핵산이 펩티드 핵산, 화학적으로 변형된 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법

100. 제92 항목에 있어서, 변형된 핵산이 1 이상의 당 기, 포스포디에스테르 결합 및 염기 기에서 화학적으로 변형되어 있는 방법.

101. 제100 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(OH)(O)O--, -OP(O ^- M ⁺ )(O)O--, -OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O--, --NHP(O) ₂ O--, --OC(O) ₂ O--, --OCH ₂ C(O) ₂ NH--, --OCH ₂ C(0) ₂ 0--, --OP(CH ₃ )(0)O--, --OP(CH ₂ C ₆ H ₅ )(O)O--, --P(S)(O)O-- 및 --OC(0) ₂ NH--로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기로 치환되어 있는 방법.

102. 제101 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O-- 또는 --P(S)(O)O--로 치환되어 있는 방법.

103. 제100 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA의 2' 위치가 C ₁ -C ₄ 알콕시, OCH ₂ -CH=CH ₂ , OCH ₂ -CH=CH-CH ₃ , OCH ₂ -CH=CH-(CH ₂ ) _n CH ₃ (n=0, 1...30), 할로겐, C ₁ -C ₆ 알킬 및 OCH ₃ 로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기를 포함하는 방법.

104. 제100 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA가 2'-O-메틸 치환을 포함하는 방법.

105. 제92 항목에 있어서, 신호 프로브가 2개 이상의 화학기를 포함하는 상호작용 쌍을 포함하고, 하나의 화학기가 한 스트랜드의 한 말단에 위치하며, 다른 화학기가 다른 스트랜드의 인접 말단에 위치하는 방법.

106. 제92 항목에 있어서, 신호 프로브가 두 상호작용 쌍을 포함하고, 프로브의 각 말단은 양 스트랜드의 인접 말단에 하나의 상호작용 쌍을 가지는 방법.

107. 제92 항목에 있어서, 상호작용 쌍이 형광단 및 퀀처, 화학발광 표지 및 퀀처 또는 부가물, 염료 다이머, 및 FRET 공여체 및 수용체, 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제 또는 효소를 가역적으로 불활성화시킬 수 있는 다른 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

108. 제92 항목에 있어서, 상호작용 쌍이 형광단 및 퀀처이고, 형광 발생 세포가 단리되는 방법.

109. 제92 항목에 있어서, 신호 프로브가 동일하거나 상이한 2개 이상의 형광단을 포함하는 방법.

110. 제109 항목에 있어서, 신호 프로브가 FRET 공여체 및 수용체 쌍, 또는 하베스터(harvester) 및 이미터(emitter) 형광단인 적어도 2개의 형광단을 포함하는 방법.

111. 제108 항목에 있어서, 형광을 발생하는 세포를 단리하는 단계가 형광 활성화 세포 분별장치, 형광 현미경 또는 형광계를 사용하여 수행되는 방법.

112. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목, 제53 항목, 제62 항목, 제67 항목, 제73 항목, 제80 항목, 제85 항목, 제88 항목 및 제91 항목 어느 한 항목에 있어서, 신호 프로브가 스템-루프 구조를 포함하는 방법.

113. 제112 항목에 있어서, 스템 영역이 4 내지 6개의 연속 염기쌍을 형성하는 방법.

114. 제112 항목에 있어서, 스템-루프 구조가 두 화학기를 포함하는 상호작용 쌍을 적어도 포함하고, 하나의 화학기가 스트랜드의 각 말단에 위치하며, 스템 영역은 비상보적인 영역에 의해 연결된 2개의 상호 상보적인 영역을 포함하고, 상호작용 쌍에 인접한 상호 상보적인 영역은 5 내지 6개의 염기쌍을 형성하며, 루프 영역에 인접한 상호 상보적인 영역은 4 내지 5개의 염기쌍을 형성하는 방법.

115. 제114 항목에 있어서, 비상보적인 영역이 단일-스트랜드 루프 영역 또는 미스매치 영역인 방법.

116. 제112 항목에 있어서, 스템-루프 구조가 두 화학기를 포함하는 상호작용 쌍을 적어도 포함하고, 하나의 화학기가 스트랜드의 각 말단에 위치하며, 스템 영역은 두 개의 비상보적인 영역에 의해 연결된 세 개의 상호 상보적인 영역을 포함하고, 상호작용 쌍에 인접한 제1 상호 상보적인 영역은 4 내지 5개의 염기쌍을 형성하며, 제2 상호 상보적인 영역은 2 내지 3개의 염기쌍을 형성하고, 루프 영역에 인접한 제3 상호 상보적인 영역은 2 내지 3개의 염기쌍을 형성하는 방법.

117. 제116 항목에 있어서, 비상보적인 영역이 1 이상의 단일-스트랜드 루프 영역 및 미스매치 영역인 방법.

118. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목, 제53 항목, 제62 항목, 제67 항목, 제73 항목, 제80 항목, 제85 항목, 제88 항목 및 제91 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 신호 프로브가 덤벨 구조를 포함하는 방법.

119. 제118 항목에 있어서, 덤벨 구조가 4개의 연속 염기쌍의 한 스템 영역 및 3개의 연속 염기쌍의 한 스템 영역을 포함하는 방법.

120. 제118 항목에 있어서, 두 스템 영역이 스템 영역의 한 암을 통해 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있는 방법.

121. 제118 항목에 있어서, 두 스템 영역이 스템 영역의 한 암을 통해 1 또는 2개의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드로 연결되어 있는 방법.

122. 제1 항목, 제3 항목, 제5 항목, 제7 항목, 제9 항목, 제13 항목, 제18 항목, 제21 항목, 제39 항목, 제53 항목, 제62 항목, 제67 항목, 제73 항목, 제80 항목, 제85 항목, 제88 항목 및 제91 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 신호 프로브가 3-암 접합 구조를 포함하는 방법.

123. 제122 항목에 있어서, 3-암 접합 구조가 두 화학기를 포함하는 상호작용 쌍을 적어도 포함하고, 하나의 화학기가 스트랜드의 각 말단에 위치하며, 상호작용 쌍에 인접한 스템 영역은 3 내지 4개의 염기쌍을 형성하고, 제1 스템-루프 구조의 스템 영역은 4 내지 5개의 염기쌍을 형성하며, 제1 스템-루프 구조의 스템 영역은 2 내지 3개의 연속 염기쌍을 형성하는 방법.

124. 제122 항목에 있어서, 세 영역이 스템 영역의 암을 통해 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있는 방법.

125. 제122 항목에 있어서, 세 영역이 스템 영역의 암을 통해 1 또는 2개의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드로 연결되어 있는 방법.

126. 제112 항목, 제118 항목 및 제122 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 스템-루프 구조, 덤벨 구조 또는 3-암 접합 구조가 30개를 초과한 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 가지는 방법.

127. 제112 항목, 제118 항목 및 제122 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 구조가 DNA, RNA, 펩티드 핵산, 화학적으로 변형된 DNA, RNA, 또는 이들의 조합물인 방법.

128. 제112 항목, 제118 항목 및 제122 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 구조가 1 이상의 당 기, 포스포디에스테르 결합 및 염기 기에서 화학적으로 변형되어 있는 방법.

129. 제128 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(OH)(O)O--, -OP(O ^- M ⁺ )(O)O--, -OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O--, --NHP(O) ₂ O--, --OC(O) ₂ O--, --OCH ₂ C(O) ₂ NH--, --OCH ₂ C(0) ₂ 0--, --OP(CH ₃ )(0)O--, --OP(CH ₂ C ₆ H ₅ )(O)O--, --P(S)(O)O-- 및 --OC(0) ₂ NH--로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기로 치환되어 있는 방법.

130. 제129 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O-- 또는 --P(S)(O)O--로 치환되어 있는 방법.

131. 제128 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA의 2' 위치가 C ₁ -C ₄ 알콕시, OCH ₂ -CH=CH ₂ , OCH ₂ -CH=CH-CH ₃ , OCH ₂ -CH=CH-(CH ₂ ) _n CH ₃ (n=0, 1...30), 할로겐, C ₁ -C ₆ 알킬 및 OCH ₃ 로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기를 포함하는 방법.

132. 제128 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA가 2'-O-메틸 치환을 포함하는 방법.

133. 제112 항목, 제118 항목 및 제122 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 상호작용 쌍이 형광단 및 퀀처, 화학발광 표지 및 퀀처 또는 부가물, 염료 다이머, 및 FRET 공여체 및 수용체, 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제 또는 효소를 가역적으로 불활성화시킬 수 있는 다른 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

134. 제133 항목에 있어서, 상호작용 쌍이 형광단 및 퀀처이고, 형광 발생 세포가 단리되는 방법.

135. 제134 항목에 있어서, 형광을 발생하는 세포를 단리하는 단계가 형광 활성화 세포 분별장치, 형광 현미경 또는 형광계를 사용하여 수행되는 방법.

136. 제112 항목, 제118 항목 및 제122 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 신호 프로브가 스트랜드의 한 말단 상에 2개 이상의 형광단 및 스트랜드의 다른 말단 상에 퀀처를 포함하고, 2개의 형광단은 FRET 공여체 및 수용체 쌍인 방법.

137. 표적 서열에 상보적인 서열 및 상호 상보적인 서열을 가지는 핵산 또는 변형된 핵산, 적어도 단백질 분해효소 및 적어도 단백질 분해효소 저해제를 포함하는 프로브로서, 표적 서열의 부재 하에 분석 조건 하에서 특징적인 단백질 분해 활성을 갖고, 그의 수준은 단백질 분해효소와 그의 저해제의 상호작용도의 함수이며, 과량의 표적 서열이 존재하는 조건 하에서 표적 서열에 대한 표적 상보 서열의 하이브리드화에 따라 상기 특징적인 단백질 분해 활성 수준이 증가되는 프로브.

138. 제137 항목에 있어서, 단백질 분해효소가 부위-특이적 또는 표적-특이적 프로테아제인 프로브.

139. 제137 항목에 있어서, 단백질 분해효소 저해제가 펩티드 또는 화합물인 프로브.

140. 제137 항목에 있어서, 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제가 아미노펩티다제 및 아마스타틴, 트립신-유사 시스테인 프로테아제 및 안티페인(antipain), 아미노펩티다제 및 베스타틴, 키모트립신-유사 시스테인 프로테아제 및 키모스타틴, 아미노펩티다제 및 디프로틴 A 또는 B, 카복시펩티다제 A 및 EDTA, 엘라스타제-유사 세린 프로테아제 및 엘라스티날, 및 서모라이신 또는 아미노펩티다제 M 및 1,10-페난트롤린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로브.

141. 제137 항목에 있어서, 핵산 또는 변형된 핵산의 2개의 분리된 스트랜드가 적어도 상호 상보적인 영역을 형성하는 프로브.

142. 제141 항목에 있어서, 단백질 분해효소가 하나의 스트랜드의 한 말단에 위치하고, 단백질 분해효소 저해제가 다른 스트랜드의 인접 말단에 위치하는 프로브.

143. 제141 항목에 있어서, 2개의 분리된 스트랜드가 5'에서 3' 말단으로의 연속되는 상호 상보적인 영역을 형성하고, 2개의 스트랜드가 동일한 수의 뉴클레오티드를 가지는 프로브.

144. 제141 항목에 있어서, 상호 상보적인 영역이 2개의 스트랜드 사이에 형성된 후, 스트랜드의 5' 말단이 다른 스트랜드로부터 갈라져 나오거나, 스트랜드의 3' 말단이 다른 스트랜드로부터 갈라져 나오거나, 또는 5' 말단 및 3' 말단 둘 다가 갈라져 나오고, 갈라짐은 10개 이하의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드인 프로브.

145. 제141 항목에 있어서, 2개의 스트랜드가 각 말단에 5 또는 6개의 연속 염기쌍의 상호 상보적인 영역을 형성하는 프로브.

146. 제145 항목에 있어서, 2개의 스트랜드의 서열이 동일하지 않은 프로브.

147. 제141 항목에 있어서, 스트랜드가 30개를 초과한 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 가지는 프로브.

148. 제141 항목에 있어서, 핵산이 DNA, RNA, 또는 이 둘 다인 프로브.

149. 제141 항목에 있어서, 변형된 핵산이 펩티드 핵산, 화학적으로 변형된 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합물을 포함하는 프로브.

150. 제141 항목에 있어서, 변형된 핵산이 1 이상의 당 기, 포스포디에스테르 결합 및 염기 기에서 화학적으로 변형되어 있는 프로브.

151. 제150 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(OH)(O)O--, -OP(O ^- M ⁺ )(O)O--, -OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O--, --NHP(O) ₂ O--, --OC(O) ₂ O--, --OCH ₂ C(O) ₂ NH--, --OCH ₂ C(0) ₂ 0--, --OP(CH ₃ )(0)O--, --OP(CH ₂ C ₆ H ₅ )(O)O--, --P(S)(O)O-- 및 --OC(0) ₂ NH--로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기로 치환되어 있는 프로브.

152. 제150 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O-- 또는 --P(S)(O)O--로 치환되어 있는 프로브.

153. 제150 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA의 2' 위치가 C ₁ -C ₄ 알콕시, OCH ₂ -CH=CH ₂ , OCH ₂ -CH=CH-CH ₃ , OCH ₂ -CH=CH-(CH ₂ ) _n CH ₃ (n=0, 1...30), 할로겐, C ₁ -C ₆ 알킬 및 OCH ₃ 로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기를 포함하는 프로브.

154. 제150 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA가 2'-O-메틸 치환을 포함하는 프로브.

155. 제137 항목에 있어서, 스템-루프 구조를 포함하는 프로브.

156. 제155 항목에 있어서, 스템 영역이 4 내지 6개의 연속 염기쌍을 형성하는 프로브.

157. 제155 항목에 있어서, 스템-루프 구조가 스트랜드의 각 말단에 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제를 적어도 포함하고, 스템 영역은 비상보적인 영역에 의해 연결된 두 상호 상보적인 영역을 포함하고, 상호작용 쌍에 인접한 상호 상보적인 영역은 5 내지 6개의 염기쌍을 형성하며, 루프 영역에 인접한 상호 상보적인 영역은 4 내지 5개의 염기쌍을 형성하는 프로브.

158. 제157 항목에 있어서, 비상보적인 영역이 단일-스트랜드 루프 영역 또는 미스매치 영역인 프로브.

159. 제155 항목에 있어서, 스템-루프 구조가 스트랜드의 각 말단에 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제를 적어도 포함하고, 스템 영역은 두 개의 비상보적인 영역에 의해 연결된 세 개의 상호 상보적인 영역을 포함하며, 스트랜드의 말단에 인접한 제1 상호 상보적인 영역은 4 내지 6개의 염기쌍을 형성하고, 제2 상호 상보적인 영역은 2 내지 3개의 염기쌍을 형성하며, 루프 영역에 인접한 제3 상호 상보적인 영역은 2 내지 3개의 염기쌍을 형성하는 프로브.

160. 제159 항목에 있어서, 비상보적인 영역이 1 이상의 단일-스트랜드 루프 영역 및 미스매치 영역인 프로브.

161. 제137 항목에 있어서, 덤벨 구조를 포함하는 프로브.

162. 제161 항목에 있어서, 덤벨 구조가 4개의 연속 염기쌍의 한 스템 영역 및 3개의 연속 염기쌍의 한 스템 영역을 포함하는 프로브.

163. 제161 항목에 있어서, 두 스템 영역이 스템 영역의 한 암을 통해 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있는 프로브.

164. 제161 항목에 있어서, 두 스템 영역이 스템 영역의 한 암을 통해 1 또는 2개의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드로 연결되어 있는 프로브.

165. 제137 항목에 있어서, 3-암 접합 구조를 포함하는 프로브.

166. 제165 항목에 있어서, 3-암 접합 구조가 스트랜드의 각 말단에 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제를 적어도 포함하고, 스트랜드의 말단에 인접한 스템 영역은 3 내지 4개의 염기쌍을 형성하며, 제1 스템-루프 구조의 스템 영역은 4 내지 5개의 염기쌍을 형성하고, 제2 스템-루프 구조의 스템 영역은 2 내지 3개의 연속 염기쌍을 형성하는 프로브.

167. 제165 항목에 있어서, 세 영역이 스템 영역의 암을 통해 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합으로 연결되어 있는 프로브.

168. 제165 항목에 있어서, 세 영역이 스템 영역의 암을 통해 1 또는 2개의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드로 연결되어 있는 프로브.

169. 제155 항목, 제161 항목 및 제165 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 스템-루프 구조, 덤벨 구조 또는 3-암 접합 구조가 30개를 초과한 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 가지는 프로브.

170. 제155 항목, 제161 항목 및 제165 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 구조가 DNA, RNA, 펩티드 핵산, 화학적으로 변형된 DNA, RNA, 또는 이들의 조합물인 프로브.

171. 제155 항목, 제161 항목 및 제165 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 구조가 1 이상의 당 기, 포스포디에스테르 결합 및 염기 기에서 화학적으로 변형되어 있는 프로브.

172. 제171 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(OH)(O)O--, -OP(O ^- M ⁺ )(O)O--, -OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O--, --NHP(O) ₂ O--, --OC(O) ₂ O--, --OCH ₂ C(O) ₂ NH--, --OCH ₂ C(0) ₂ 0--, --OP(CH ₃ )(0)O--, --OP(CH ₂ C ₆ H ₅ )(O)O--, --P(S)(O)O-- 및 --OC(0) ₂ NH--로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기로 치환되어 있는 프로브.

173. 제171 항목에 있어서, 포스포디에스테르 결합이 --OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O-- 또는 --P(S)(O)O--로 치환되어 있는 프로브.

174. 제171 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA의 2' 위치가 C ₁ -C ₄ 알콕시, OCH ₂ -CH=CH ₂ , OCH ₂ -CH=CH-CH ₃ , OCH ₂ -CH=CH-(CH ₂ ) _n CH ₃ (n=0, 1...30), 할로겐, C ₁ -C ₆ 알킬 및 OCH ₃ 로 이루어지는 군으로부터 선택된 화학기를 포함하는 프로브.

175. 제171 항목에 있어서, 화학적으로 변형된 RNA가 2'-O-메틸 치환을 가지는 프로브.

176. 소정의 적어도 하나의 RNA 및 태그 서열을 코딩하는 적어도 하나의 DNA를 포함하며, 태그 서열은 3-암 접합 구조를 형성하고, 스템 영역은 8-9개의 염기쌍을 포함하며, 제1 스템-루프 영역은 4-6개의 염기쌍을 포함하고, 제2 스템-루프 영역은 13-17개의 염기쌍을 포함하는 DNA 컨스트럭트.

177. 제176 항목에 있어서, 3-암의 스템 영역이 비상보적인 영역을 추가로 포함하는 DNA 컨스트럭트.

178. 제176 항목에 있어서, 스템 영역 및 제1 스템-루프 영역이 둘 다 하나의 하나의 미스매치 영역을 추가로 포함하고, 제2 스템-루프 영역이 2-7개의 미스매치 또는 벌지 영역을 추가로 포함하는 DNA 컨스트럭트.

179. 제176 항목에 있어서, 스템 영역 사이의 결합이 총 8-12개의 뉴클레오티드를 가지는 DNA 컨스트럭트.

180. 소정의 적어도 하나의 RNA 및 태그 서열을 코딩하는 적어도 하나의 DNA를 포함하며, 태그 서열은 도 42A, B 및 C에 예시된 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 DNA 컨스트럭트.

181. 소정의 적어도 하나의 RNA 및 태그 서열을 코딩하는 적어도 하나의 DNA를 포함하며, 태그 서열은 도 42A, B 또는 C에 예시된 서열로부터 추정되는 에너지적으로 보다 유리한 구조를 형성하는 DNA 컨스트럭트.

182. 제176 항목 내지 제181 항목 중 어느 한 항목의 DNA 컨스트럭트를 포함하는 벡터.

183. 제182 항목의 벡터 또는 제176 항목 내지 제181 항목 중 어느 한 항목의 DNA 컨스트럭트를 포함하는 세포.

184. 제183 항목에 있어서, 불멸화, 1차, 줄기 및 생식 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포.

185. 제183 항목에 있어서, HeLa 세포, NIH3T3 세포, HEK293 세포 및 CHO 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포.

186. 적어도 하나의 안정하게 삽입된 발현 서열을 각각 포함하는 1,000개 이상의 세포주를 함유하는 안정한 포유동물 세포주의 라이브러리.

187. 두 개 이상의 안정하게 삽입된 발현 서열을 각각 포함하는 500개 이상의 세포주를 함유하는 안정한 포유동물 세포주의 라이브러리.

188. 세 개 이상의 안정하게 삽입된 발현 서열을 각각 포함하는 50개 이상의 세포주를 함유하는 안정한 포유동물 세포주의 라이브러리.

189. 네 개 이상의 안정하게 삽입된 발현 서열을 각각 포함하는 20개 이상의 세포주를 함유하는 안정한 포유동물 세포주의 라이브러리.

190. 제186 항목 내지 제189 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포주가 약물 내성 유전자를 추가로 포함하는 라이브러리.

191. 적어도 하나의 안정하게 삽입된 서열을 각각 포함하며 약물 내성 유전자를 포함하지 않는 50개 이상의 세포주를 함유하는 안정한 포유동물 세포주의 라이브러리.

192. 두 개 이상의 안정하게 삽입된 서열을 각각 포함하며 약물 내성 유전자를 포함하지 않는 20개 이상의 세포주를 함유하는 안정한 포유동물 세포주의 라이브러리.

193. 제186 항목 내지 제192 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 각 세포주가 가변 라이브러리 서열을 포함하는 라이브러리.

194. 제193 항목에 있어서, 발현 라이브러리의 가변 서열이 게놈, 비번역 게놈, 번역 게놈, 유전자, cDNA, EST, 올리고, 랜덤, RNA, 단백질, 단백질 도메인, 펩티드, 인트론, 엑손, 태그 또는 링커 서열, 또는 이들의 조합물 또는 재조합물, 또는 1 이상의 비변형, 돌연변이화, 랜덤화, 셔플링된(shuffled) 또는 재조합 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 라이브러리.

195. 제186 항목 내지 제192 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 적어도 공지되지 않은 서열 아이덴티티(identity)를 가지는 유전자 서열의 풀(pool) 또는 혼합물을 사용하여 생성되는 라이브러리.

196. 제195 항목에 있어서, 공지되지 않은 서열 아이덴티티를 가지는 서열이 공유 서열 상동성, 기능적 의의(functional significance) 또는 관련된 기원(related origin)을 가지는 라이브러리.

197. 제186 항목 내지 제192 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 공지되지 않은 아이덴티티를 가지는 특이 서열을 포함하는 개별적으로 합성된 컨스트럭트의 집합인 라이브러리.

198. 제197 항목에 있어서, 특이 서열이 공유 서열 상동성, 기능적 의의 또는 관련된 기원을 가지는 라이브러리.

199. 제186 항목 내지 제192 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 발현 서열이 구성 프로모터의 조절 하에 있는 라이브러리.

200. 제186 항목 내지 제192 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 발현 서열이 유도성, 억제성, 조직-특이성, 일시적 및 열-충격 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된 조건부 프로모터의 조절 하에 있는 라이브러리.

201. 제186 항목 내지 제192 항목 중 어느 한 항목에 있어서, 세포계 스크리닝 분석에 사용되는 라이브러리.

202. 제201 항목에 있어서, 세포계 스크리닝 분석이 라이브러리 내 모든 세포주에 대해 병행 실시되는 라이브러리.

203. 제201 항목에 있어서, 세포계 스크리닝 분석이 라이브러리 내 일부 세포주에 대해 실시되는 라이브러리.

204. 도 8 내지 도 24 및 도 41 중 어느 하나에 따른 FP1 내지 FP18 중의 어느 하나의 서열을 포함하는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

205. 제204 항목에 있어서, 상호작용 쌍을 추가로 포함하는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

206. 제205 항목에 있어서, 상호작용 쌍이 형광단 및 퀀처, 화학발광 표지 및 퀀처 또는 부가물, 염료 다이머, 및 FRET 공여체 및 수용체, 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제 또는 효소를 가역적으로 불활성화시킬 수 있는 다른 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

207. 도 42 D1, D2 또는 D3에 따른 서열과 하이브리드되는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

208. 제207 항목에 있어서, 상호작용 쌍을 추가로 포함하는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

209. 제208 항목에 있어서, 상호작용 쌍이 형광단 및 퀀처, 화학발광 표지 및 퀀처 또는 부가물, 염료 다이머, 및 FRET 공여체 및 수용체, 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제 또는 효소를 가역적으로 불활성화시킬 수 있는 다른 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

210. 도 42 A, B 또는 C의 서열을 포함하는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

211. 도 42 D1 또는 D2의 서열을 포함하는 핵산 또는 변형된 핵산 분자.

본 발명은 RNA를 발현하는 세포를 제공하고, RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키고, 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계를 포함하는, RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법을 제공한다. 일례로, RNA는 내인성 RNA이다. 다른 구체예로, 내인성 RNA는 DNA가 세포 내로 도입됨에 따라 발현되며, 예를 들어 DNA는 내인성 RNA의 발현을 유도하는 인핸서 또는 프로모터 또는 다른 서열을 포함한다. 예를 들어, DNA는 단백질, 예컨대 RNA 발현을 유도하는 전사 인자를 코딩할 수 있다. 다른 구체예로, RNA는 세포 내로 도입되는 핵산에 의해 코딩된다. 세포 내로 도입된 DNA는 또한 태그 서열을 코딩하며, 여기에서 신호 프로브는 임의로 태그 및/또는 RNA 서열에 표적화될 수 있다. 태그 서열은 RNA의 ORF(open reading frame)와 동일한 골격상에 존재하거나, 존재하지 않을 수 있다. 일례로, 이 방법은 외인성 또는 이종 RNA 및 내인성 RNA 둘 다의 발현 검출을 포함한다. 이들 방법은 다수의 RNA 및/또는 태그를 동시에 검출하기 위해 실시될 수 있다. RNA는 동일하거나 상이한 RNA일 수 있다. 방법이 복수개의 신호 프로브를 사용하여 복수개의 RNA를 검출하기 위해 사용되는 다른 구체예에서, 상이한 신호 프로브에 의해 생성되는 신호는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명은 또한 복수개의 외인성 또는 이종 DNA 카피를 포함하는 세포를 단리하는 방법을 제공한다. 이 방법은 RNA 및 태그 서열을 코딩하는 DNA를 도입하고, 동일한 RNA 및 상이한 태그 서열을 코딩하는 DNA를 도입하는 단계; 두 태그에 대한 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계; 및 두 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

복수개의 노출 단계를 가지는 본 발명의 임의 방법에서, 1 이상의 노출 단계(즉, 세포가 신호 프로브에 노출되는 단계)는 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있다.

본 발명의 임의 방법에서, RNA 또는 단백질은 동일하거나 관련 생물학적 경로의 것일 수 있거나, 서로의 업스트림 또는 다운스트림으로 작용하거나, 기능 또는 활성에 대해 상호 의존적으로 서로에 대해 조절, 활성화 또는 억제 기능을 가질 수 있거나, 동일한 컴플렉스의 구성 성분, 동일한 단백질 패밀리 구성원 등일 수 있다.

본 발명은 제2 RNA가 발현되지 않거나 저수준으로 발현되는 조건 하에서, 구성 프로모터의 조절 하에 RNA를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 세포 내로 도입하고(여기에서, DNA 컨스트럭트는 조건부 프로모터의 조절 하에 제2 RNA를 추가로 코딩한다); 제1 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키며; 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 조건부 프로모터의 조절 하에 있는 제1 RNA를 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 포함하는 세포를 단리하는 방법을 제공한다. DNA 컨스트럭트는 시험 RNA를 추가로 코딩할 수 있으며, 이때 예를 들어, 시험 RNA는 가변성이며, 예를 들어 발현 라이브러리로부터 유래된다. 이들 세포를 사용하여 제2 RNA의 발현을 유도하는 조건부 프로모터를 활성화할 수 있는 RNA 또는 화합물을 수득하거나 동정할 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 세포에 다수의 RNA를 코딩하는 다수의 DNA를 도입하고(여기에서, 다수의 RNA 중 적어도 한 서브세트는 서로 상이하다); 다수의 DNA에 의해 코딩되는 1 이상의 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 다수의 상이한 신호 프로브에 세포를 노출시키며; 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 일부의 세포가 다른 세포에 의해 발현되지 않는 다수의 세포를 단리하는 방법이 제공된다. 일부 세포는 하나의 세포 또는 복수개의 세포일 수 있다. 일례로, DNA는 RNA를 코딩하지 않으나, 내인성 RNA를 발현시킬 수 있으며, 예컨대 DNA는 인핸서 또는 프로모터 서열을 포함하며, 이를테면 DNA는 내인성 RNA의 발현을 유도하는 서열을 포함한다. 예를 들어, DNA는 단백질, 예컨대 RNA의 발현을 유도하는 전사 인자를 코딩할 수 있다. DNA는 또한 태그 서열을 코딩할 수 있으며, 신호 프로브는 태그 서열 및/또는 RNA 서열을 표적으로 할 수 있다. 일례로, 다수의 RNA는 발현 라이브러리를 형성한다. 다른 구체예로, 적어도 한 서브세트의 DNA가 동일한 태그 서열을 코딩한다.

본 발명은 또한 세포에 제1 RNA 발현 라이브러리를 코딩하는 DNA를 도입하고(여기에서 각 DNA는 추가로 제1 태그 서열을 코딩한다), 세포에 제2 RNA 발현 라이브러리를 코딩하는 DNA를 도입하며(여기에서 각 DNA는 추가로 제2 태그 서열을 코딩한다), 제1 태그와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브 및 제2 태그와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 세포를 노출시키고, 두 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 세포의 2 이상의 RNA 라이브러리의 단리 방법을 제공한다. 이 방법은 제3 태그 등을 사용하는 추가 RNA 발현 라이브러리를 코딩하는 DNA로 수행될 수 있다.

본 발명의 임의 방법은 세포에 화합물을 첨가하고, 신호 프로브(들)에 의해 생성된 신호 변화(증가 또는 감소)를 분석하여 하나의 RNA 또는 복수개의 RNA의 발현을 조절하는 화합물을 동정하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명은 세포에 단백질의 발현을 감소시키는 안티센스 RNA 또는 shRNA를 코딩하는 DNA를 도입하고, 안티센스 RNA 또는 shRNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 1 신호 프로브에 세포를 노출시키며, 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 단백질 발현의 감소방법을 제공한다. 이 방법은 단백질을 코딩하는 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 2 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이때 2 신호 프로브로부터 신호가 존재하지 않으면 단백질의 발현이 감소되었음을 나타낸다. 일례는 또한 다른 방법, 예컨대 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여, 예를 들어 공지된 단백질의 생물학적 활성 등을 분석하기 위한 기능 시험을 이용한 단백질의 발현 감소에 대한 분석일 수 있다. 이 방법의 일례로, 제1 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계가 생략된다. siRNA를 사용한 임의 방법이 또한 shRNA를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 임의 방법에서, 세포 내로 도입된 DNA는 조건부 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일례로, DNA에 의해 코딩된 RNA는 세포에 치명적이거나, 유해하다. DNA는 또한 DNA를 포함하는 세포를 선별하기 위해 사용될 수 있는 선별 마커를 포함한다.

본 발명은 또한 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브에 생물학적 샘플을 노출시키고, 생물학적 샘플내 신호 수준을 정량화한 후, 신호 수준과 RNA의 발현 수준을 서로 연관시키는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플내에서 RNA의 발현 수준을 정량화하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 시험 화합물을 RNA를 발현하는 세포에 첨가하고, RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키며, 시험 화합물에 노출된 세포에 의해 생성된 신호를 시험 화합물에 노출되지 않은 세포에 의해 생성된 신호와 비교하여 후자에 의해 생성된 신호에 비해 전자에 의해 생성된 신호값의 증가 또는 감소에 따라 화합물이 RNA의 발현을 조절 하였음을 제시하는 단계를 포함하는, RNA 발현을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 일례로, RNA는 세포 내로 도입된 DNA에 의해 코딩된다. 일례로, 화합물은 RNA 또는 단백질이다.

본 발명은 재조합 서열로부터 전사된 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계를 포함하여 신호를 생성하는 세포의 검출에 따라 세포가 유전자 재조합을 포함함을 제시하는 단계를 포함하는, 생존 세포에서 유전자 재조합을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 임의 방법에 의해 생성된 세포를 제공한다. 이들 세포는 세포주 또는 다수의 세포주를 생성하기 위하여 배양되거나, 사용될 수 있다. 세포는 다양한 목적, 예컨대 세포계 분석 또는 동물, 비인간 동물 또는 포유동물 이식에 사용될 수 있다. 세포는 배아 줄기 세포, 1차, 생식, 또는 줄기 세포일 수 있다. 세포는 또한 불멸화 세포일 수 있다. 세포는 내피, 표피, 중간엽, 신경, 신장, 간, 조혈 또는 면역 세포일 수 있다. 세포는 진핵생물, 원핵생물, 포유동물, 효모, 식물, 인간, 영장류, 소, 돼지, 고양이, 설치류, 유대류, 쥐 또는 다른 세포일 수 있다.

태그 서열은 다수의 표적 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서 하나의 신호 프로브는 각 표적 서열과 하이브리드된다. 태그 서열은 2차 구조를 가지는 RNA일 수 있다. 구조는 3-암 접합 구조일 수 있다. DNA는 다수의 태그 서열을 포함할 수 있다. 태그 서열은 DNA에 의해 코딩된 RNA와 동일한 RNA로 전사될 수 있거나, 태그 서열은 상이한 RNA로 전사될 수 있다. 또한, RNA 및 태그 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 컨스트럭트가 제공된다. 태그 서열은 본원에 개시된 임의의 것일 수 있다. DNA 컨스트럭트를 포함하는 세포 및 벡터가 또한 제공된다.

본 발명은 또한 적어도 1,000, 적어도 800, 적어도 600, 적어도 500, 적어도 400, 적어도 200, 적어도 100 또는 적어도 50개의 세포주를 포함하며, 각 세포주는 안정하게 삽입된 발현 서열을 함유하는 포유동물 세포주의 라이브러리를 제공한다. 또한, 적어도 500, 적어도 400, 적어도 300, 적어도 200, 적어도 200, 적어도 100, 적어도 50개의 세포주를 포함하며, 각 세포주가 2개 이상의 안정하게 삽입된 서열을 함유하는 포유동물 세포주의 라이브러리가 제공된다. 또한, 적어도 100, 적어도 50, 적어도 25, 적어도 10개의 세포주를 포함하며, 각 세포주가 세 개 이상의 안정하게 삽입된 서열을 함유하는 포유동물 세포주의 라이브러리가 제공된다. 또한, 적어도 50, 적어도 25, 적어도 20, 적어도 10개의 세포주를 포함하며, 각 세포주가 네 개 이상의 안정하게 삽입된 서열을 함유하는 포유동물 세포주의 라이브러리가 제공된다. 이들 세포주 내 안정하게 삽입된 서열은 또한 선별 마커, 예컨대 약물 내성 유전자가 결여되어 있을 수 있다. 안정하게 삽입된 서열은 공지 또는 공지되지 않은 서열 아이덴티티를 가질 수 있다. 이들 서열은 공유 서열 상동성, 기능적 의의 또는 관련된 기원을 가질 수 있다. 이들 라이브러리는 다양한 목적, 예컨대 세포계 선별 분석에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 표적 서열을 포함하는 세포 내로 신호 프로브를 도입하고(여기에서 신호 프로브는 표적 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성한다), 이 세포를 시험 화합물에 노출시키며, 세포에 의해 생성된 신호를 검출하여 시험 화합물에 노출되지 않은 세포에 의해 생성된 신호와 비교하여 시험 화합물에 노출된 세포에 의해 생성된 신호의 증가에 따라 시험 화합물이 신호 프로브를 사용하여 세포 내의 표적의 검출을 증강시키는 화합물임을 제시하는 단계를 포함하는, 신호 프로브를 사용하여 세포 내의 표적의 검출을 증강시키는 화합물의 확인 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 세포를 시험 화합물의 존재 하에 신호 프로브에 노출시키고(여기에서 세포는 표적 서열을 포함하며, 신호 프로브는 표적 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성한다), 세포에 의해 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함하고, 시험 화합물에 노출되지 않은 세포에 의해 생성된 신호와 비교하여 시험 화합물에 노출된 세포에 의해 생성된 신호의 증가에 따라 시험 화합물이 세포로 신호 프로브의 도입을 향상시키는 화합물임을 제시하는 단계를 포함하는, 세포로 신호 프로브의 도입을 매개하거나 향상시키는 화합물의 확인 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 상기 및 다른 측면들을 상세한 설명으로 설명하고자 한다.

[도면의 간단한 설명]

도 1 및 2는 2개의 분리된 스트랜드를 가지는 신호 또는 프로테아제 프로브를 나타낸다. 상호 작용하는 화학기가 타원형으로 표시되었다. 상이한 타원형은 본 발명의 일 구체예를 제시하며, 여기에서 검은색 타원형은 퀀처 부분을 나타내고, 흰색 및 회색 타원형은 상이한 형광단을 나타낸다.

도 3, 4 및 5는 스템-루프 구조를 가지도록 디자인된 신호 또는 프로테아제 프로브를 나타낸다. 상호 작용하는 화학기는 타원형으로 표시되었다. 상이한 타원형은 본 발명의 일 구체예를 제시하며, 여기에서 검은색 타원형은 퀀처 부분을 나타내고, 흰색 타원형은 형광단을 나타낸다.

도 6은 3-암 접합 구조를 가지는 신호 또는 프로테아제 프로브를 나타낸다. 상호 작용하는 화학기는 타원형으로 표시되었다. 상이한 타원형은 본 발명의 일 구체예를 제시하며, 여기에서 검은색 타원형은 퀀처 부분을 나타내고, 흰색 타원형은 형광단을 나타낸다.

도 7은 덤벨 구조를 가지는 신호 또는 프로테아제 프로브를 나타낸다. 상호 작용하는 화학기는 타원형으로 표시되었다. 상이한 타원형은 본 발명의 일 구체예를 제시하며, 여기에서 검은색 타원형은 퀀처 부분을 나타내고, 흰색 타원형은 형광단을 나타낸다.

도 8은 형광 프로브 FP1의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. FP1 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기(flanking base)를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 패널 A는 Nucleic Acides Res . 31:3429-3431(2003)에 따른 DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 추정되는 서열 구조를 나타낸다. 패널 B는 http://biotools.idtdna.com/analyzer/ oligocalc.asp에서 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어에 따라 추정되는 FP1 서열의 자가 다이머화를 나타낸다. 두 패널 A 및 B에서, 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 9는 형광 프로브 FP2의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 패널 A는 Nucleic Acides Res . 31:3429-3431(2003)에 따른 DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 추정되는 서열 구조를 나타낸다. 어두운 영역의 전부 또는 일부는 Watson-Crick 염기쌍을 형성하여 3-암 접합을 형성할 것으로 보인다. 패널 B는 http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.asp에서 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어에 따라 추정되는 FP2 서열의 자가 다이머화를 나타낸다. 두 패널 A 및 B에서, 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 10은 형광 프로브 FP3의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. FP3 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 이 도면은 http://biotools. idtdna.com/analyzer/oligocalc.asp에서 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어에 따라 추정되는 FP3 서열의 자가 다이머화를 나타낸다. 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 11은 형광 프로브 FP4의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. FP4 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 이 도면은 Nucleic Acides Res . 31:3429-3431(2003)에 따른 DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 추정되는 서열 구조를 나타낸다. 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 12 내지 13은 형광 프로브 FP5-FP6의 서열을 나타낸다. 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다.

도 14는 형광 프로브 FP7의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. FP7 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 이 도면에는 http://biotools. idtdna.com/analyzer/oligocalc.asp에서 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어에 따라 추정되는 FP7 서열의 자가 다이머화가 나타나 있다. 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 15는 형광 프로브 FP8의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. FP8 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 패널 A는 Nucleic Acides Res . 31:3429-3431(2003)에 따른 DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 추정되는 서열 구조를 나타낸다. 패널 B는 http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.asp에서 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어에 따라 추정되는 FP1 서열의 자가 다이머화를 나타낸다. 두 패널 A 및 B에서, 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 16 내지 20은 형광 프로브 FP9-FP13의 서열을 나타낸다. 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다.

도 21은 형광 프로브 FP14의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. FP14 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 이 도면은 Nucleic Acides Res . 31:3429-3431(2003)에 따른 DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 추정되는 서열 구조를 나타낸다. 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 22-24는 각각 형광 프로브 FP15-17의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. 서열은 표적 서열에 상보적으로 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 패널 A는 Nucleic Acides Res . 31:3429-3431(2003)에 따른 DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 추정되는 서열 구조를 나타낸다. 패널 B는 http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.asp에서 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어에 따라 추정되는 FP15 서열의 자가 다이머화를 나타낸다. 두 패널 A 및 B에서, 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 25는 FACS 과정 동안 형광 강도에 대해 관찰된 세포수를 나타낸다. 도 25A는 신호 프로브 FP1에 노출된 대조 NIH3T3 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형광단 Alexafluor633이 FP1에 사용되었다. 대조 NIH3T3 세포는 플라스미드로 형질감염되지 않았고 표적 서열을 함유하지 않는다. 도 25B는 신호 프로브 FP1에 노출된 형질감염된 NIH3T3 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형질감염된 NIH3T3 세포는 소정의 RNA 및 도 42A에 도시된 태그1 서열을 코딩하는 DNA를 함유한다. 도 25C는 중첩된 도 25A 및 25B를 나타낸다. 도 25C는 FACS에 의해 표적 서열을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포와 비형질감염된 대조 세포가 구별된 것을 나타낸다.

도 26은 FACS 과정 동안 형광 강도에 대해 관찰된 세포수를 나타낸다. 도 26A는 신호 프로브 FP2에 노출된 대조 NIH3T3 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형광단 Alexafluor680이 FP2에 사용되었다. 대조 NIH3T3 세포는 플라스미드로 형질감염되지 않았고 표적 서열을 함유하지 않는다. 도 26B는 신호 프로브 FP2에 노출된 형질감염된 NIH3T3 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형질감염된 NIH3T3 세포는 소정의 RNA 및 도 42B에 도시된 태그2 서열을 코딩하는 DNA를 함유한다. 도 26C는 중첩된 도 26A 및 26B를 나타낸다. 도 26C는 FACS에 의해 표적 서열을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포와 비형질감염된 대조 세포가 구별된 것을 나타낸다.

도 27은 FACS 과정 동안 형광 강도에 대해 관찰된 세포수를 나타낸다. 도 27A는 신호 프로브 FP3에 노출된 대조 NIH3T3 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형광단 플루오레세인이 FP3에 사용되었다. 대조 NIH3T3 세포는 플라스미드로 형질감염되지 않았고 표적 서열을 함유하지 않는다. 도 27B는 신호 프로브 FP3에 노출된 형질감염된 NIH3T3 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형질감염된 NIH3T3 세포는 소정의 RNA 및 도 42C에 태그3 서열을 코딩하는 DNA를 함유한다. 도 27C는 중첩된 도 27A 및 27B를 나타낸다. 도 27C는 FACS에 의해 표적 서열을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포와 비형질감염된 대조 세포가 구별된 것을 나타낸다.

도 28은 FACS 과정 동안 형광 강도에 대해 관찰된 세포수를 나타낸다. 도 28A는 신호 프로브 FP1에 노출된 대조 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형광단 플루오레세인이 FP1에 사용되었다. 대조 HeLa 세포는 플라스미드로 형질감염되지 않았고 표적 서열을 함유하지 않는다. 도 28B는 신호 프로브 FP1에 노출된 형질감염된 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형질감염된 HeLa 세포는 역 vav RNA를 코딩하는 DNA를 함유한다. 도 28C는 중첩된 도 28A 및 28B를 나타낸다. 도 28C는 FACS에 의해 표적 서열을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포와 비형질감염된 대조 세포가 구별된 것을 나타낸다.

도 29는 FACS 과정 동안 형광 강도에 대해 관찰된 세포수를 나타낸다. 도 29A는 신호 프로브 FP8에 노출된 대조 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형광단 플루오레세인이 FP8에 사용되었다. 대조 HeLa 세포는 플라스미드로 형질감염되지 않았고 표적 서열을 함유하지 않는다. 도 29B는 신호 프로브 FP8에 노출된 형질감염된 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형질감염된 HeLa 세포는 역 vav RNA를 코딩하는 DNA를 함유한다. 도 29C는 중첩된 도 29A 및 29B를 나타낸다. 도 29C는 FACS에 의해 표적 서열을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포와 비형질감염된 대조 세포가 구별된 것을 나타낸다.

도 30은 FACS 과정 동안 형광 강도에 대해 관찰된 세포수를 나타낸다. 도 30A는 신호 프로브 FP5에 노출된 대조 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형광단 플루오레세인이 FP5에 사용되었다. 대조 HeLa 세포는 플라스미드로 형질감염되지 않았고 표적 서열을 함유하지 않는다. 도 30B는 신호 프로브 FP5에 노출된 형질감염된 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형질감염된 HeLa 세포는 역 vav RNA를 코딩하는 DNA를 함유한다. 도 30C는 중첩된 도 30A 및 30B를 나타낸다. 도 30C는 FACS에 의해 표적 서열을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포와 비형질감염된 대조 세포가 구별된 것을 나타낸다.

도 31은 FACS 과정 동안 형광 강도에 대해 관찰된 세포수를 나타낸다. 도 31A는 신호 프로브 FP9에 노출된 대조 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형광단 플루오레세인이 FP9에 사용되었다. 대조 HeLa 세포는 플라스미드로 형질감염되지 않았고 표적 서열을 함유하지 않는다. 도 31B는 신호 프로브 FP9에 노출된 형질감염된 HeLa 세포에 대한 프로파일을 나타낸다. 형질감염된 HeLa 세포는 역 vav RNA를 코딩하는 DNA를 함유한다. 도 31C는 중첩된 도 31A 및 31B를 나타낸다. 도 31C는 FACS에 의해 표적 서열을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포와 비형질감염된 대조 세포가 구별된 것을 나타낸다.

도 32는 약물 내성 유전자 및 역배향으로 클로닝된 vav(r-vav로 언급)의 서열 부분을 코딩하는 발현 플라스미드로 형질감염된 약물 선별성 HeLa 세포의 형광 이미지를 나타낸다. 세포를 r-vav(5' GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGA 3') 내에서 동일한 표적 서열을 인식하도록 디자인된 형광 프로브(FP)에 노출시켰다. FAM으로부터 형광을 검출하도록 디자인된 필터 및 형광 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다. 본원에 사용된 모든 FP는 플루오레세인을 사용하여 표지된 FP1을 제외하고, FAM을 사용하여 표지하였다. 패널 A, B, C, D를 각각 FP10, FP11, FP12 및 FP13에 노출시켰다.

도 33은 FP15에 의해 인식되도록 디자인된 태그 서열 및 RNA를 코딩하는 컨스트럭트로 형질감염되었거나(패널 A, B, D), 동일한 RNA를 코딩하지만 태그 서열을 코딩하지 않는 대조 컨스트럭트로 형질감염된(패널 C 또는 E) 세포의 형광 이미지를 나타낸다. 사용된 태그 서열을 6-5, 6-7 또는 6B10으로 명명하였으며, 이들은 각각 표적 서열의 1, 2 및 3 카피를 함유하며 FP15에 의해 인식되도록 디자인되었다. FP15에 의해 인식되도록 디자인된 태그 서열을 포함하는 컨스트럭트로 형질감염된 세포(패널 A, B, D)는 대조 세포(패널 C 또는 E) 보다 큰 형광을 나타낸다.

도 34는 FP16에 의해 인식되도록 디자인된 태그 서열 6CA4 및 RNA를 코딩하는 컨스트럭트로 형질감염되었거나(패널 A), 동일한 RNA를 코딩하지만 태그 서열을 코딩하지 않는 대조 컨스트럭트로 형질감염된(패널 B) 세포의 형광 이미지를 나타낸다. 태그 서열을 포함하는 컨스트럭트로 형질감염된 세포(패널 A)는 대조 세포(패널 B)보다 큰 형광을 나타낸다.

도 35A는 태그 서열을 형성하기 위해 선택된 vav DNA 서열(r-vav DNA)의 역상보 부분(밑줄)을 나타낸다. 이 서열은 r-vav mRNA를 발현하기 위해 디자인된 발현 플라스미드로 클로닝된다. 굵은 글씨로 표시한 서열은 특정 형광 프로브에 대한 표적 서열이다. 도 35B는 태그 서열(태그1 서열)을 형성하기 위해 결합된 후의 도 35A에서 밑줄쳐진 서열을 나타낸다.

도 36A는 Nucleic Acids Res . 31:3429-3431 (2003)의 RNA 폴딩 프로그램을 사용하여 추정되는 r-vav RNA 부분의 구조를 나타낸다. 도 36B는 도 35B에 나타낸 태그1 서열의 추정 구조이다. 어두운 부분은 일부 형광 프로브에 의해 인식되도록 디자인된 표적 서열을 나타낸다.

도 37A, B 및 C는 도 42에 나타낸 태그 1, 2 및 3 서열의 추정 구조를 나타낸다. 이들 구조는 상호 유사하나, 형광 프로브에 의해 인식되는 서열이 상이하다. 이 구조는 Nucleic Acids Res . 31:3429-3431 (2003)의 RNA 폴딩 프로그램을 사용하여 추정된 것이다.

도 38은 표적 또는 대조 올리고 서열의 존재 하에 용액중의 FP로부터 방출된 형광 신호를 나타낸다. 샘플을 UV로 조사하고, 사진을 찍었다. 본원에 사용된 모든 FP는 플루오레세인이 도입되었다. 튜브는 각각 20 μM FP 스톡 5 ㎕, 25mM MgC1 ₂ 1.5 ㎕, 20 μM 올리고 8 ㎕ 및 물 1.5 ㎕로 구성되고 최종 마그네슘 농도가 2.34 mM인 총 16 ㎕이다. FP1 및 FP18가 사용되었고, 이들은 각각 표적 올리고 TO-FP1 및 TO-FP18을 인식하도록 디자인된 서열의 염기 사이에 황 결합을 도입하여 합성하였다. FP1은 표적 올리고 1의 서열(TO-FP1 5'GTTCTTAAGGCACAGGAACTGGGA3')을 지시하고, FP 18은 표적 올리고 FP18의 서열(TO-FP18 5'TCCCAGTTCCTGTGCCTTAAGAAC3')을 지시한다. TO-FP1 및 TO-FP18의 서열은 상호 역 상보체이다. TO-FP18은 FP1에 의해 표적화되지 않는 서열을 가지며, FP1에 대한 대조 올리고로 제공된다. TO-FP1은 FP18에 의해 표적화되지 않는 서열을 가지며, FP18에 대한 대조 올리고로 제공된다.

모든 패널에서 튜브의 조성은 다음과 같다:

튜브 FP 올리고

1 FP18 TO-FP18

2 FP18 TO-FP1

3 FP1 TO-FP18

4 FP1 TO-FP1

이 수치는 비표적 서열을 가지는 올리고를 함유하는 대조 튜브에 비해 표적 서열을 가지는 올리고를 함유하는 튜브에서 더 큰 신호가 방출됨으로써 시험된 각 FP들이 표적 서열의 존재를 특이적으로 보고함을 나타낸다. 표적 서열을 포함하는 올리고의 존재 하에 FP를 가지는 튜브는 *로 표시하였다.

도 39는 표적 또는 대조 올리고 서열의 존재 하에서 용액중의 FP로부터 방출된 형광 신호를 나타낸다. 샘플을 UV로 조사하고, 사진을 찍었다. 본원에 사용된 모든 FP는 FAM이 도입되었다. 패널 A, B, C는 각각 동일한 FP가 첨가된 네 개의 튜브를 나타낸다. 각 튜브는 20 μM FP 스톡 2 ㎕ 및 4 mM MgC1 ₂ 에 첨가된 PBS중의 100 μm 올리고 스톡 1 ㎕를 함유하는 총 10 ㎕이다. 각 패널에서, 튜브 1은 올리고 스톡을 함유하지 않고, 대신에 물 1 ㎕를 함유하며, 튜브 2는 올리고 TO-M1을 함유하고, 튜브 3은 올리고 TO-M2를 함유하며, 튜브 4는 올리고 TO-M3을 함유한다.

각 패널에 사용된 FP를 FP에 의해 인식되도록 디자인된 서열을 포함하는 올리고와 함께 다음에 나타내었다:

패널 FP 표적 서열을 함유하는 올리고

A FP4 TO-M3(튜브 4)

B FP6 TO-M2(튜브 3)

C FP7 TO-M3(튜브 4)

이 수치는 비표적 서열을 가지는 올리고를 함유하거나 함유하지 않는 대조 튜브에 비해 표적 서열을 가지는 올리고를 함유하는 튜브에서 더 큰 신호가 방출됨으로써 시험된 각 FP들이 표적 서열의 존재를 특이적으로 보고함을 나타낸다. 표적 서열을 포함하는 올리고의 존재 하에 FP를 가지는 튜브는 *로 표시하였다.

TO-M1, TO-M2 및 TO-M3에 대한 5' 에서 3' 방향으로의 서열은 다음과 같다:

도 40은 표적 또는 대조 올리고 서열의 존재 하에서 용액중의 FP로부터 방출된 형광 신호를 나타낸다. 샘플을 UV로 조사하고, 사진을 찍었다. 본원에 사용된 모든 FP는 FAM이 도입되었다. FP 1, 2 및 3이 각각 패널 A, B, C에서 시험되었으며, 도 42에 나타낸 바와 같이, 각각 태그 1, 2 및 3에 도입된 관련 표적 서열을 인식하도록 디자인되었다. 표적 서열을 포함하는 올리고의 존재 하에 FP를 가지는 튜브는 *로 표시하였다.

패널 A, B, C에 대한 프로토콜은 도 39의 프로토콜에 준하며, 샘플은 다음과 같다:

패널 FP 표적 서열을 함유하는 올리고

A FP1 TO-M1(튜브 2)

B FP2 TO-M2(튜브 3)

C FP3 TO-M3(튜브 4)

도 41은 형광 프로브 FP 18의 서열 및 추정되는 고유 형태를 나타낸다. 서열은 표적 서열에 상보적이도록 디자인된 염기 및 추가 측접한 염기를 포함한다. 측접한 염기는 밑줄을 그어 나타냈다. 패널 A는 Nucleic Acides Res . 31:3429-3431(2003)에 따른 DNA 폴딩 프로그램을 이용하여 추정되는 서열 구조를 나타낸다. 패널 B는 http://biotools.idtdna.com/analyzer/oligocalc.asp에서 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어에 따라 추정되는 FP2 서열의 자가 다이머화를 나타낸다. 두 패널 A 및 B에서, 측접한 염기는 회색으로 나타나 있고, 흰색 및 검은색 타원형은 각각 형광단 및 퀀처 부분을 나타낸다.

도 42A, B 및 C는 형광 프로브에 의해 인식되는 세 개의 태그 서열을 나타낸다. 도 42A, B 및 C에서, 표적 서열은 굵은 글씨로 나타나 있으며, 이들은 또한 도 42D에 도시되었다. 제1 서열(태그1, 42A)은 도 35B에 나타나 있는 서열과 동일하다. 다음의 두 서열(태그2, 42B 및 태그3, 42C)은 태그1의 변형된 형태이다. 표적l에 대한 표적2 및 표적3의 차이를 패널 D에 밑줄을 그어 나타내었다. 표시된 부분에 행해진 변화를 보상하기 위하여 나머지 태그 서열에서 추가 서열 변화를 행하였다.

도 43은 태그1 서열로부터 디자인한 태그2 서열을 나타낸다. AF는 디자인 동안 행해진 일련의 염기 변화를 나타낸다.

도 44는 태그1 서열로부터 디자인한 태그3 서열을 나타낸다. AF는 디자인 동안 행해진 일련의 염기 변화를 나타낸다.

도 45는 본 발명의 방법에 따라 단리된 세포가 생존 세포임을 나타낸다. 패널 A는 세포를 각각 태그1, 2 및 3으로 태그된 소정의 RNA를 각각 코딩하는 세 개의 DNA 컨스트럭트로 형질감염시킨 후, FACS를 사용하여 단리된 세포를 나타낸다. 세포는 약물 선별적이고, FP1, 2 및 3에 노출 후, 단리되었다. 세 개의 프로브 각각에 대한 세포의 형광 강도는 임의의 DNA 컨스트럭트로 형질감염되지 않은 대조 세포에 대한 백그라운드 강도보다 크다. 세포를 FACS에 의해 직접 96-웰 플레이트의 웰에 개별적으로 플레이팅하고, 단리한 직후 이미지화하였다. 패널 B는 웰 표면에 부착된 1시간 후의 동일한 세포를 나타낸다. 패널 C는 세포 단리 후 다음날의 동일한 세포를 나타낸다.

세 개의 패널은 각각 본 발명의 방법에 따라 단리된 세포가 프로브에 세포를 노출시키기 위해 사용된 시약의 공지되지 않은 효과에도 불구하고 생존 세포로 존재함을 나타낸다. 이러한 효과에는 세포의 형질막 손상이 포함되며, 경우에 따라 세포는 FACS 동안 고압에 추가로 적용된다. 패널 A는 세포막이 손상되지 않았음을 나타내며, 패널 B 및 C는 추가로 배양 접시 표면에 부착될 수 있고 단리될 수 있기 때문에(이 두 성질은 모두 생존 세포의 특성을 나타낸다), 세포가 생존 세포임을 입증한다.

도 46은 mcon1으로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 47은 mcon2로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 48은 mcon3으로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 49는 mcon4로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 50은 mcon5로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 51은 mcon6으로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 52는 mcon7로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 53은 mcon8로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 54는 mcon9로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 55는 mcon10으로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 56은 mcon11로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 57은 mcon12로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 58은 mcon13으로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 59는 mcon14로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

도 60은 mcon15로 형질감염된 293T 세포의 FACS 분석 결과를 대조 세포와 비교하여 나타낸 것이다.

달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자들이 일반적으로 이해하고 있는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에 언급된 모든 문헌 및 기타 참조문헌들은 전적으로 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 발명의 설명이 적용될 것이다.

프로브와 관련하여 사용된 용어 "인접(adjacent)"은 상호작용 쌍이 서로에 대해 상호 기능적으로 작용가능하도록 접근한 상태를 의미한다. 예를 들어, 접근 상태는 형광단이 퀀처 부분에 의해 퀀치되거나 또는 부분 퀀치되도록 할 수 있거나, 프로테아제 저해제가 프로테아제를 저해 또는 부분적으로 저해하도록 할 수 있다. 현재 알려진 형광단 및 퀀처에 필요한 거리는 약 20-100 Å이다.

용어 "염기쌍"은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 의미한다.

용어 "벌지(bulge) 영역"은 염기쌍을 이루지 않은 하나의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 단일-스트랜드 영역을 의미한다. 벌지 뉴클레오티드는 상호 상보적인 영역 사이에 위치할 수 있다(예: 도 4A).

용어 "덤벨(dumbbell) 구조"는 각 스템 영역으로부터 암의 말단을 통해 연결된 두 스템-루프 구조의 형태를 가지는 핵산 또는 변형된 핵산의 스트랜드를 의미한다(예: 도 7). 결합은 비상보적인 영역 또는 변형되거나 비변형된 포스포디에스테르 결합일 수 있다.

용어 "상호작용 쌍"은 상호 인접하거나 인접하지 않은 상태에서 기능적으로 상호작용하고, 상호작용하는 화학기에 의해 생성된 백그라운드 신호 또는 신호 부재시에 비해 검출가능한 신호를 생성하거나, 상호작용하는 화학기에 의해 생성된 신호와 상이한 신호를 생성하는 두 화학기를 의미한다. 상호작용 쌍은 형광단 및 퀀처, 화학발광 표지 및 퀀처 또는 부가물, 염료 다이머 및 FRET 공여체 및 수용체, 또는 이들의 조합물을 포함하나 이들에만 한정되지 않는다. 신호 프로브는 복수개의 상호작용 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 파장-변환 신호 프로브는 퀀처와 상호작용하는 제1 형광단 및 제2 형광단을 가지며, 2개의 형광단은 FRET 공여체 및 수용체 쌍이다.

용어 "루프 영역"은 염기쌍을 이루지 않은 복수개의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 단일-스트랜드 영역을 의미한다(예: 도 4B 및 도 23A). 루프는 또한 상호 상보적인 영역 사이에 위치할 수 있다(도 8A).

용어 "신호 프로브"는 표적 핵산 서열에 상보적인 서열 및 적어도 상호 상보적인 영역을 포함하고, 적어도 상호작용 쌍을 추가로 포함하는 프로브를 의미한다. 신호 프로브가 그의 표적 서열에 결합되지 않은 경우, 상호작용 쌍 부분은 신호를 전혀 또는 거의 생성하지 않거나 상이한 신호를 생성하도록 상호 인접한다. 신호 프로브가 그의 표적 서열에 결합된 경우, 상호작용 쌍 부분은 서로 더 이상 인접하지 않으며, 그의 비결합 상태에서 프로브에 의해 생성된 신호와 상이하거나 검출가능한 신호를 생성한다. 일례로, 신호 프로브는 형광단 및 퀀처 부분을 포함하는 형광 발생 또는 형광 프로브이며, 표적 서열과 하이브리드화하는 경우 형광 변화가 일어난다. 상호작용 쌍 부분은 신호 프로브 말단에 부착될 수 있거나, 핵산 서열내에 부착될 수 있다. 신호 프로브 서열에 내부적으로 도입될 수 있는 부분의 일례는 퀀처: 댑실 dT, BHQ2 dT, 및 BHQ1 dT, 및 형광단: 플루오레세인 dT, Alexa dT, 및 Tamra dT를 포함한다.

용어 "프로테아제 프로브"는 표적 서열의 상보 서열 및 적어도 상호 상보적인 영역을 포함하며, 적어도 단백질 분해효소 및 적어도 단백질 분해효소 저해제 또는 효소를 가역적으로 불활성화시킬 수 있는 다른 분자를 추가로 포함하는 프로브를 의미한다. 프로브가 표적 서열에 하이브리화되지 않은 경우, 근접한 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제는 상호작용하여 단백질분해 활성을 저해한다. 프로브가 표적 서열에 하이브리화되는 경우, 단백질 분해효소 및 그의 저해제는 분리되어 단백질 분해효소를 활성화시킨다. 단백질 분해효소 및 저해제는 프로브에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합될 수 있다.

용어 "미스매치(mismatch) 영역"은 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자내의 이중-스트랜드 영역을 의미하며, 여기에서 염기 또는 변형 염기는 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하지 않는다(예: 도 4B 및 C). 미스매치 영역은 두 염기-쌍 영역 사이에 위치한다. 이중-스트랜드 영역은 훅스틴(Hoogsteen) 염기쌍 등을 형성하기 위하여 비수소 결합 또는 수소 결합할 수 있거나, 이 두 결합 모두가 가능하다.

용어 "상호 상보적인 영역"은 왓슨-크릭 염기쌍인 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자내 영역을 의미한다.

용어 "비상보적인 영역"은 왓슨-크릭 염기쌍이 아닌 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자내 영역을 의미한다. 예를 들어, 비상보적인 영역은 5' 또는 3' 말단에서 벌지 뉴클레오티드, 단일-스트랜드 루프, 돌출 뉴클레오티드, 또는 미스매치 영역을 가지도록 디자인될 수 있다.

용어 "스템 영역"은 2개 이상의 왓슨-크릭 염기쌍을 가지는 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자내 영역을 의미한다. 예를 들어, 스템 영역은 비상보적인 영역에 의해 연결된 복수개의 상호 상보적인 영역을 가지거나, 연속한 상호 상보적인 영역을 형성하도록 디자인될 수 있다.

용어 "스템-루프 구조"는 한 쌍의 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드 또는 변형 올리고뉴클레오티드 암에 의해 측접한 단일-스트랜드 루프 서열을 가지는 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자를 의미한다(예: 도 4). 5' 및 3' 암은 스템 영역을 형성한다.

용어 "3-암 접합 구조"는 스템 영역의 암을 통해 함께 연결된 스템 영역, 제1 스템-루프 영역 및 제2 스템-루프 영역 형태를 가지는 핵산 또는 변형된 핵산의 스트랜드를 의미한다(예: 도 6). 제1 스템-루프 영역은 제2 스템-루프 영역에 대해 5'이다. 세 영역은 비상보적인 영역, 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합, 또는 이들의 조합에 의해 연결될 수 있다.

신호 프로브

상호작용 쌍

신호 프로브는 복수개의 상호작용 쌍을 가질 수 있거나, 상이한 상호작용 쌍을 가질 수 있다. 일례로, 신호 프로브는 형광 발생 프로브이다. 일례로, 형광 발생 프로브는 그의 비하이브리드화 상태에서 백그라운드 수준의 형광을 방출하거나 방출하지 않으나, 그의 표적에 결합되는 경우 형광을 방출하거나 백그라운드 수준 이상의 형광을 발한다. 신호를 증가시키거나, 상이한 칼러 범위에서 형광을 방출하기 위하여 다수의 형광단이 사용될 수 있다. 표적 서열의 부재 하에 신호를 감소시키거나 제거하기 위하여 다수의 퀀처가 사용될 수 있다. 퀀처의 예로는 댑실(DABCYL), EDAC, 세슘, p-크실렌-비스-피리디늄 브로마이드, 탈륨 및 금 나노입자가 포함되나, 이들에만 한정되지 않는다. 형광단의 예로 설포로다민 101, 아크리딘, 5-(2'-아미노에틸)아미노아프탈린-1-설폰산(EDANS), 텍사스 레드(Texas Red), 에오신(Eosine), Bodipy, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 500, Alexa Fluor 514, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 635, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 750, 알로피코시아닌, 아미노쿠마린, Bodipy-FL, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 카복시플루오레세인(FAM), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), APC-Cy5, APC-Cy5.5, APC-Cy7, 쿠마린, ECD(Red 613), 플루오레세인(FITC), 헥사클로르플루오레세인(HEX), 하이드록시쿠마린, 리사민 로다민 B, 루시퍼 옐로우(Lucifer yellow), 메톡시쿠마린, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), PE-Cy7 접합체, PerC, PerCP-C y5.5, R-피코에리스리틴(PE), 로다민, 로다민 그린, 로다민 레드-X, 테트라클로로플루오레세인(TET), TRITC, 테트라메틸로다민, 텍사스 레드-X, TRITC, XRITC 및 양자점(Quantum dot)이 포함되나, 이들에만 한정되지 않는다. 참조예: 본원에 참고로 포함되는 Tyagi et al. Nature Biotechnology 16:49-53, (1998) 및 Dubertret et al., Nature Biotechnology , 19:365-370 (2001).

본 발명은 또한 파장-변환 신호 프로브를 제공한다. 일례로, 프로브의 한 말단은 적어도 하베스터 형광단 및 이미터 형광단을 가지며, 프로브의 인접 말단은 적어도 퀀처 부분을 가진다. 참조예: 본원에 참고로 포함되는 Tyagi et al., Nature Biotechnology , 18, 1191-1196 (2000). 일례로, 하베스터 형광단 및 이미터 형광단은 동일한 말단을 가지며, 이때 이미터 형광단은 원거리 말단에 위치하고, 퀀처 부분은 하베스터 형광단의 반대 말단에 위치한다. 이미터 형광단은 수개의 뉴클레오티드의 스페이서 암(spacer arm)에 의해 하베스터 형광단과 분리될 수 있다. 하베스터 형광단은 단색 광원의 파장 범위에서 강력한 흡수를 나타낸다. 표적 서열 부재시에, 2개의 형광단은 퀀치된다. 표적 존재시에, 프로브는 이미터 형광단의 방출 범위에서 형광을 발한다. 방출 스펙트럼의 시프트는 흡수 에너지가 형광 공명 에너지 전사에 의해 하베스터 형광단으로부터 이미터 형광단으로 전사됨에 따라 발생한다. 이러한 타입의 신호 프로브는 단색 광원으로부터 에너지를 효율적으로 흡수할 수 없는 형광단을 함유하는 신호 프로브보다 강한 신호를 제공할 수 있다. 일례로, 하베스터 형광단은 플루오레세인이고, 이미터 형광단은 6-카복시로다민 6G, 테트라메틸로다민 또는 텍사스 레드이다.

다른 구체예로, 프로브의 한 말단은 적어도 형광단 F1을 가지며, 다른 인접 말단은 적어도 다른 형광단 F2를 가진다. 2개의 형광단은 밀접하게 위치한 경우 형광 공명 에너지 전사(FRET)가 일어나도록 선택된다. 프로브가 그의 표적 서열에 결합되지 않은 경우, F1의 흡수 밴드에서 여기시에, F1 형광이 F2에 의해 퀀치되고, F2 형광이 관찰된다. 프로브가 그의 표적 서열에 결합되는 경우, FRET가 감소되거나 제거되고 F2 형광이 감소 또는 사라지면서 F1 형광이 발생될 것이다. 이러한 형광 강도의 차이는 모니터링될 수 있고, F1과 F2 사이의 형광비가 산출될 수 있다. 형광단-퀀처 시스템에서 잔류 형광이 빈번히 관찰되며, 이 시스템은 표적 서열을 정량적으로 검출하는데 보다 유리할 수 있다. 참조: 본원에 참고로 포함되는 Zhang et al., Angrew . Chem . Int. Ed., 40, 2, pp. 402-405(2001). FRET 공여체-수용체 쌍의 예로 각각 쿠마린기 및 6-카복시플루오레세인기가 포함되나, 이들에만 한정되지 않는다.

일례로, 신호 프로브는 발광 표지 및 부가물 쌍을 포함한다. 부가물과 발광 표지의 상호작용은 표지로부터 생성된 신호를 감소시킨다. 참조: 본원에 참고로 포함되는 Becker 및 Nelson에 의한 미국 특허 제5,731,148호.

다른 구체예로, 신호 프로브는 적어도 염료 다이머를 포함한다. 프로브가 표적 서열에 결합되는 경우, 염료로부터의 신호는 다이머 구조내 염료의 신호와 상이하다.

또다른 구체예로, 상호작용 쌍은 효소 및 이들 효소의 저해제, 예컨대 뉴클레아제 및 뉴클레아제 저해제, 키나제 및 키나제 저해제, 프로테아제 및 프로테아제 저해제, 포스파타제 및 포스파타제 저해제, 카스파제 및 카스파제 저해제, 또는 리보좀 및 리보좀 저해제, 또는 항원 및 프로브의 검출 표적이 항원의 특정 세포 부분, 예를 들어 뉴론의 시냅스 등에 왕복할 수 있도록 항원에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

신호 프로브 및 프로테아제 프로브 또는 기타 프로브의 형태

이중- 스트랜드 구조

본 발명은 상호 어닐링되거나, 적어도 상호 상보적인 영역을 형성하도록 디자인된 2 이상의 상이한 핵산 스트랜드를 포함하는 신호 또는 프로테아제 프로브 또는 기타 프로브를 제공한다. 한 스트랜드의 적어도 하나의 말단은 다른 스트랜드의 말단에 인접한다(도 1). 핵산은 DNA, RNA 또는 변형 DNA 또는 RNA일 수 있다. 2개의 스트랜드는 자가-다이머를 형성하는 동일 스트랜드일 수 있다(도 8B). 스트랜드는 또한 서열이 상이할 수 있다.

2개의 분리된 스트랜드는 완전 상보적으로 디자인될 수 있거나, 또는 상보적인 영역 및 비상보적인 영역을 포함할 수 있다. 일례로, 2개의 분리된 스트랜드는 상호 완전 상보적으로 디자인될 수 있다. 일례로, 2개의 스트랜드는 각 말단에서 4 내지 9, 5 내지 6, 2 내지 10, 10 내지 40, 또는 40 내지 400개의 연속 염기쌍으로 구성된 상호 상보적인 영역을 형성한다(참조예 도 8, 9, 15, 22, 24 또는 41). 스트랜드는 5-7개, 8-10개, 11-15개, 16-22개, 30개 초과, 3-10개, 11-80개, 81-200개, 또는 200개를 초과한 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 2개의 스트랜드는 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다(도 2). 예를 들어, 하나의 스트랜드는 다른 것보다 더 길 수 있다(도 2C). 일례로, 한 스트랜드의 5' 말단은 다른 스트랜드로부터 갈라져 나오거나, 스트랜드의 3' 말단이 다른 스트랜드로부터 갈라져 나오거나, 또는 5' 말단 및 3' 말단 둘 다가 갈라져 나오고, 갈라짐은 10개 이하, 20개 이하 또는 30개 이하의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드이다.

표적 서열과 하이브리드되는 영역은 1개 또는 2개의 스트랜드의 상보적인 영역, 비상보적인 영역 또는 이들의 조합에 존재할 수 있다. 복수개의 표적 핵산 서열이 동일한 신호 프로브에 의해 표적화될 수 있다. 1 이상의 표적이 동일하거나 상이한 서열상에 위치할 수 있고, 이들은 표적에 결합하도록 디자인된 프로브 부분에 정확히 상보적일 수 있거나 또는 적어도 충분히 상보적일 수 있다. 일례로, 2개의 스트랜드는 각 말단에 상호 상보적인 영역을 형성하며, 표적 상보 서열은 각 말단에 상호 상보적인 영역이 아닌 영역에 존재한다(도 8B).

일례로, 적어도 2개의 분리된 스트랜드를 가지는 신호 프로브는 형광 발생 프로브이다. 일례로, 하나의 스트랜드는 한 개 이상의 말단 상에 퀀처 부분 및 다른 스트랜드의 인접 말단 상에 형광단을 가진다(도 1). 일례로, 한 스트랜드의 각 5' 및 3' 말단은 동일하거나 상이한 형광단을 가지며, 다른 스트랜드의 각 5' 및 3' 말단은 동일하거나 상이한 퀀처 부분을 가진다(도 1B 및 2A). 일례로, 한 스트랜드의 5' 말단은 형광단을 갖고, 3' 말단은 퀀처 부분을 가지며, 다른 스트랜드의 3' 말단은 동일하거나 상이한 퀀처 부분을 갖고, 5' 말단은 동일하거나 상이한 형광단을 갖는다(도 1C 및 2B).

프로테아제 프로브의 경우, 일례로, 한 스트랜드는 적어도 하나의 말단 상에 단백질 분해효소를 갖고, 다른 스트랜드의 인접 말단 상에 단백질 분해효소 저해제를 갖는다. 일례로, 한 스트랜드의 각 5' 및 3' 말단은 단백질 분해효소를 가지며, 다른 스트랜드의 각 5' 및 3' 말단은 단백질 분해효소 저해제를 가진다. 일례로, 한 스트랜드의 5' 말단은 단백질 분해효소를 갖고, 3' 말단은 단백질 분해효소 저해제를 가지며, 다른 스트랜드의 3' 말단은 단백질 분해효소 저해제를 갖고, 5' 말단은 동일하거나 상이한 단백질 분해효소를 갖는다.

스템 -루프 구조

다른 구체예로, 신호 또는 프로테아제 프로브 또는 기타 프로브는 적어도 상호 상보적인 영역 및 적어도 비상보적인 영역을 포함하는 핵산 또는 변형된 핵산의 스트랜드이다. 일례로, 프로브는 스템-루프 구조를 형성한다. 스템 영역은 상호 상보성일 수 있거나, 또는 상호 상보적인 영역 및 비상보적인 영역을 포함한다(도 4). 예를 들어, 스템 영역은 염기-쌍을 이루지 않은 벌지 뉴클레오티드를 가질 수 있다(도 4). 스템 영역은 또한 5' 또는 3' 말단에 염기-쌍이 아닌 돌출 뉴클레오티드를 함유할 수 있다(도 3B 및 3C).

스템 영역이 완전 상보성인 경우, 스템 영역은 3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 2-6, 7-10 또는 11-30개의 염기-쌍을 포함할 수 있다(참조예: 도 3 및 5). 루프 영역은 10-16, 17-26, 27-36, 37-45, 3-10, 11-25 또는 25-60개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일례로, 스템 영역은 4-10, 4 또는 5개의 연속 염기쌍을 형성한다(참조예: 도 23).

일례로, 스템-루프 구조는 2 이상의 화학기를 포함하는 상호작용 쌍을 포함하며, 하나의 화학기는 스트랜드의 각 말단에 위치한다. 일례로, 신호 프로브는 적어도 스트랜드의 각 말단에 형광단 및 퀀처 부분을 가진다(도 3, 4 및 5). 프로테아제 프로브는 적어도 스트랜드의 각 말단에 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제를 가진다.

일례로, 스템 영역은 비상보적인 영역을 통해 연결된 두 상호 상보적인 영역을 포함하고, 상호작용 쌍에 인접한 상호 상보적인 영역은 5 내지 9개의 염기쌍을 형성하며, 루프 영역에 인접한 상호 상보적인 영역은 4 내지 5개의 염기쌍을 형성한다(도 8, 15, 21, 22, 24 또는 41). 일례로, 비상보적인 영역은 단일-스트랜드 루프 영역(도 8), 미스매치 영역(도 15) 또는 이 둘 다이다. 다른 구체예로, 스템 영역은 두 개의 비상보적인 영역을 통해 연결된 세 개의 상호 상보적인 영역을 포함하고, 상호작용 쌍에 인접한 제1 상호 상보적인 영역은 4 내지 5개의 염기쌍을 형성하며, 제2 상호 상보적인 영역은 2 내지 3개의 염기쌍을 형성하고, 루프 영역에 인접한 제3 상호 상보적인 영역은 2 내지 3개의 염기쌍을 형성한다.

스템-루프 구조에서, 표적 서열에 상보적인 영역은 1 이상의 스템 영역 또는 루프 영역 또는 이 둘 다에 위치할 수 있다. 표적과 하이브리드되는 스템 영역은 상호 상보적인 영역, 비상보적인 영역 또는 이 둘 다에 위치할 수 있다. 일례로, 표적 상보 서열은 단일-스트랜드 루프 영역에 존재한다. 일례로, 상호작용 쌍에 인접한 스템 영역 이외의 영역은 표적 상보 서열이다(도 8). 복수개의 표적 핵산 서열이 동일 프로브에 의해 표적화될 수 있다. 1 이상의 표적이 동일하거나 상이한 서열상에 위치할 수 있고, 이들은 표적에 결합하도록 디자인된 프로브 부분에 정확히 상보적일 수 있거나 또는 적어도 충분히 상보적일 수 있다.

스템 길이의 증가는 그의 폐쇄 구조에서 신호 프로브의 안정성을 증가시킬 수 있고, 따라서 검출가능한 신호의 신호 대 노이즈 비를 증가시킬 수 있다. 세포에 이들 신호 프로브를 노출시키는 것은 약간 높지만 세포에는 여전히 안전한 온도에서 수행될 수 있으며, 이후 상온으로 돌아온다. 고온에서, 신호 프로브는 존재하는 그의 표적을 개방시키거나, 이에 결합할 수 있다. 냉각시에 표적에 결합되지 않은 신호 프로브는 그의 폐쇄 상태로 복귀할 수 있으며, 이는 스템의 안정성 증가로 촉진된다. 마찬가지로, 동일한 결과를 얻기 위하여 다른 수단, 예컨대 염기-쌍을 이완시킬 것으로 여겨지는 DMSO가 사용될 수 있다.

3-암 접합 구조

다른 구체예로, 신호 또는 프로테아제 프로브 또는 기타 프로브는 3-암 접합 구조를 형성하는 핵산 스트랜드이다(도 6A 및 6B). 이 구조에서, 스템 영역 및 두 스템-루프 영역은 결합하여 세방향 접합을 형성한다. 스템 영역은 2-5, 7-9, 10-12의 염기 쌍을 함유할 수 있다. 스템-루프 영역의 루프는 3-7, 8-10, 11-13개의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

일례로, 3-암 접합 구조는 2 이상의 화학기를 포함하고, 하나의 화학기가 스트랜드의 각 말단에 위치한 상호작용 쌍을 포함한다. 일례로, 프로브는 적어도 스트랜드의 각 말단에 형광단 및 퀀처 부분을 가진다. 프로테아제 프로브는 적어도 스트랜드의 각 말단에 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제를 가진다.

일례로, 상호작용 쌍에 인접한 스템 영역은 3 내지 4, 또는 3 내지 6개의 연속 염기쌍을 형성하고, 제1 스템-루프 구조의 스템 영역은 4 내지 5개의 연속 염기쌍을 형성하며, 제2 스템-루프 구조의 스템 영역은 2 내지 3개의 연속 염기쌍을 형성한다(도 9). 일례로, 세 영역은 스템 영역의 암을 통해 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합으로 연결된다. 일례로, 세 영역은 스템 영역의 암을 통해 1 또는 2개의 뉴클레오티드 결합 또는 변형된 뉴클레오티드 결합으로 연결된다.

표적과 하이브리드되는 스템 영역은 상호 상보적인 영역, 비상보적인 영역, 또는 이 둘 다에 위치할 수 있다. 일례로, 표적 상보 서열은 단일-스트랜드 루프 영역에 위치한다. 일례로, 상호작용 쌍에 인접한 스템 영역 이외의 영역은 표적 상보 서열이다(도 9). 복수개의 표적 핵산 서열은 동일한 프로브에 의해 표적화될 수 있다. 1 이상의 표적은 동일하거나 상이한 서열상에 위치할 수 있고, 이들은 표적에 결합하도록 디자인된 프로브 부분에 정확히 상보적일 수 있거나 또는 적어도 충분히 상보적일 수 있다.

덤벨 구조

다른 구체예로, 신호 또는 프로테아제 프로브 또는 기타 프로브는 덤벨-형 구조를 형성하는 핵산 스트랜드이다(도 7 또는 11). 구조는 두 스템 영역의 암에 의해 연결된 두 스템-루프 영역이다. 스템 영역은 3-5, 7-9, 10-12개의 염기 쌍을 함유할 수 있다. 스템-루프 영역의 루프는 5-7, 8-10, 11-13개의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일례로, 덤벨 구조는 3개의 연속 염기쌍의 하나의 스템 영역 및 4개의 연속 염기쌍의 하나의 스템 영역을 가진다. 일례로, 두 스템 영역은 1 또는 2개의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드에 의해 연결된다. 다른 구체예로, 두 스템 영역은 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된다. 일례로, 스템-루프 구조, 덤벨 구조 또는 3-암 접합 구조는 30개를 초과한 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 가진다.

일례로, 신호 프로브는 적어도 스트랜드의 각 말단에 형광단 및 퀀처 부분을 가진다. 프로테아제 프로브는 적어도 스트랜드의 각 말단에 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제를 가진다.

표적과 하이브리드되는 스템 영역은 상호 상보적인 영역, 비상보적인 영역, 또는 이들 조합에 위치할 수 있다. 일례로, 표적 상보 서열은 단일-스트랜드 루프 영역에 위치한다. 일례로, 표적 상보 서열은 두 스템 영역 이외에 위치한다. 복수개의 표적 핵산 서열은 동일한 프로브에 의해 표적화될 수 있다. 1 이상의 표적은 동일하거나 상이한 서열상에 위치할 수 있고, 이들은 표적에 결합하도록 디자인된 프로브 부분에 정확히 상보적일 수 있거나 또는 적어도 충분히 상보적일 수 있다.

DNA 또는 RNA 폴딩 프로그램은 주어진 핵산 또는 변형된 핵산의 형태를 예측하기 위하여 당업계에서 사용하는 것이다. 이러한 폴딩 프로그램은 Nucleic Acids Res . 31:3429-3431(2003)에 기술된 프로그램 및 http://biotools.idtdna.com/ analyzer/oligocalc.asp로부터 입수할 수 있는 oligoanalyzer 3.0 소프트웨어를 포함하나, 이들에만 한정되지 않는다. 이러한 폴딩 프로그램은 다수의 에너지적으로 보다 유리한 구조를 예측한다. 다른 구체예로, 본 발명은 폴딩 프로그램으로 예측되는 프로브 FP1-18의 에너지적으로 보다 유리한 구조를 포함한다(도 8-24 및 41). 형태 에너지가 자유 에너지로 측정되는 경우, 낮은 자유 에너지값(음)은 형태가 에너지적으로 보다 유리하다는 것을 나타낸다.

신호 및 프로테아제 프로브 또는 기타 프로브의 화학 변형

본 발명은 또한 화학적으로 변형된 신호 또는 프로테아제 프로브 또는 기타 프로브를 제공한다. 1 이상의 당-포스포디에스테르 타입의 골격, 2'OH, 염기가 변형될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 치환은 --OP(OH)(O)O--, -OP(O ^- M ⁺ )(O)O--, -OP(SH)(O)O--, -OP(S ^- M ⁺ )(O)O--, --NHP(O) ₂ O--, --OC(O) ₂ O--, --OCH ₂ C(O) ₂ NH--, --OCH ₂ C(0) ₂ 0--, --OP(CH ₃ )(0)O--, --OP(CH ₂ C ₆ H ₅ )(O)O--, --P(S)(O)O-- 및 --OC(0) ₂ NH-를 포함하나 이들로만 제한되지 않는다. M ⁺ 는 무기 또는 유기 양이온이다. 골격은 또한 데옥시리보스 포스페이트 골격이 슈도 펩티드 골격으로 대체된 펩티드 핵산일 수 있다. 펩티드 핵산은 본원에 참고로 포함되는 Hyrup and Nielsen, Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5-23, 1996, Hydig-Hielsen and Godskesen, WO 95/32305에 기술되어 있다.

당의 2' 위치는 H, OH, C ₁ -C ₄ 알콕시, OCH ₂ -CH=CH ₂ , OCH ₂ -CH=CH-CH ₃ , OCH ₂ -CH=CH-(CH ₂ ) _n CH ₃ (n=0, 1...30), 할로겐(F, Cl, Br, I), C ₁ -C ₆ 알킬 및 OCH ₃ 를 포함하나 이들로만 제한되지 않는다. C ₁ -C ₄ 알콕시 및 C ₁ -C ₆ 알킬은 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭인 기일 수 있거나, 이들을 포함할 수 있다.

뉴클레오티드의 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실, 이노신, 또는 이들의 변형체중 임의의 하나일 수 있다. 변형 염기는 N4-메틸 데옥시구아노신, 데아자 또는 아자 퓨린 및 피리미딘을 포함하나 이들로만 제한되지 않는다. 환 질소, 예컨대 아데닌의 N1, 구아닌의 N7, 시토신의 N3이 알킬화될 수 있다. 피리미딘 염기는 5 또는 6 위치에서 치환될 수 있고, 퓨린 염기는 2, 6 또는 8 위치에서 치환될 수 있다. 참조예: 본원에 참고로 포함되는 Cook, WO 93/13121; Sanger, Principles of Nucleic Acid Structure , Springer-Verlag, New York (1984).

통상적인 뉴클레오티드의 유도체가 당업계에 익히 공지되었으며, 예를 들어 상이한 타입의 당을 가지는 분자를 포함한다. 당의 04' 위치는 S 또는 CH ₂ 로 치환될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 염기 인식 서열은 연결 부분에 의해 결합된 사이클로부틸 부분을 가질 수 있으며, 여기에서 사이클로부틸 부분은 여기에 부착된 헤테로사이클릭 염기를 가진다. 참조예: 본원에 참고로 포함되는 Cook 등의 국제출원 WO 94/19023호.

세포에 프로브의 전달을 용이하게 하기에 유용한 프로브의 다른 화학 변형체는 콜레스테롤, 형질도입 펩티드(예: TAT, 페네트라틴 등)를 포함하나 이들로만 제한되지 않는다.

방법

본 발명의 방법은 신호 프로브가 생존 세포에서 표적 RNA 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성할 수 있다는 사실에 근거한다. 생성된 신호는 대조 세포에서 생성된 것(예: 백그라운드 형광)보다 높게 검출가능하여야 한다. 따라서, 대조 세포가 형광을 전혀 생성하지 않을 필요는 없다. 일례로, 방법은 RNA를 검출하거나 정량화하기 위한 것이다. 일 방법은 적어도 RNA를 발현하는 세포를 단리하거나 세포주를 발생시키는 것이다. 세포 단리를 포함하는 본 발명의 임의 방법에서, 세포는 배양될 수 있고, 또한 세포주 생성을 위해 배양될 수 있다. RNA, 또는 RNA 및 태그 서열을 코딩하는 DNA 컨스트럭트를 세포로 도입한다. DNA 컨스트럭트는 세포 게놈의 상이한 위치에서 통합될 수 있다. 1 이상의 특정 위치에서 통합이 또한 이루어질 수 있다. 그후, 형질감염된 세포를 표적 RNA 또는 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 노출한다. 검출가능한 신호를 생성하는 세포를 단리한다. 세포를 단리하고, 당업계의 임의 방법으로 배양할 수 있으며, 예를 들어 세포를 단리하고, 개별적으로 또는 배치로 플레이팅할 수 있다. 단리된 세포를 증식시켜 세포주를 생성시킬 수 있다.

본 발명의 임의 방법은 선별 마커를 사용하여 수행될 수 있다. 약물 선별(또는 임의의 다른 적절한 선별 마커를 사용한 선별)이 필요한 단계는 아니지만, 안정하게 형질감염된 세포에 대해 형질감염된 세포 집단을 풍부하게 하기 위하여 이용될 수 있으며, 단 형질감염된 컨스트럭트는 약물 내성을 부여하도록 디자인되어야 한다. 신호 프로브를 사용한 선별이 형질감염 후 너무 빨리 수행되면, 일부 양성 세포가 전이상태로만 존재 하여 안정하게 형질감염될 수 없다. 그러나, 불안정하게 형질감염된 세포로부터 형질감염된 플라스미드가 제거 또는 희석되도록 세포를 충분히 계대배양하면 상기 현상을 최소화시킬 수 있다. 일부 안정하게 삽입된 플라스미드는 클로닝된 cDNA 삽입물에 상응하는 어떠한 RNA도 생성하지 않을 수 있다. 다른 플라스미드는 신호 프로브에 의해 검출되지 않거나 비효율적으로 검출되는 RNA를 생성할 수 있다.

RNA는 1 이상의 하기 상이한 역할을 가질 수 있다: 단백질, 융합 단백질, 단백질에 융합된 펩티드, 유출 신호, 유입 신호, 세포 내 편재화된 신호 또는 단백질 또는 펩티드에 융합될 수 있는 다른 신호를 코딩하는 메신저 RNA; 리보좀 RNA, tRNA, hnRNA, snRNA를 포함하나 이들에 한정되지 않는 안티센스 RNA, siRNA, 구조 RNA, 세포 RNA; 랜덤 RNA, cDNAs 또는 EST에 상응하는 RNA; 다양한 종으로부터의 RNA, 올리고뉴클레오티드에 상응하는 RNA, 전 세포, 조직 또는 유기체 cDNA 제제에 상응하는 RNA 세포; 다른 핵산, 단백질, 다른 세포 성분 또는 약물 분자에 다소 결합 활성을 가지는 RNA; 다양한 거대분자 복합체에 도입될 수 있는 RNA; 일부 세포 기능에 영향을 미칠 수 있는 RNA; 또는 상기 언급된 기능 또는 활성을 가지지 않으나 세포에 의해 발현될 수 있는 RNA; 바이러스 또는 외래 RNA, 링커 RNA, 또는 1 이상의 RNA를 연결하는 서열에 상응하는 RNA; 또는 태그 또는 상기 언급된 임의의 1 이상의 비변형 돌연변이화, 랜덤화 또는 돌출 서열의 조합물 또는 재조합물로 제공되는 RNA. RNA는 유도성, 억제성, 조직-특이성, 열-충격, 발달성, 세포계 특이성 또는 일시적 프로모터 또는 상기 언급된 임의의 1 이상의 비변형 또는 돌연변이화, 랜덤화, 돌출 서열의 조합물 또는 재조합물을 포함하나 이들에만 한정되지 않는 구성 또는 조건부 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.

일례로, 신호 프로브는 형광 발생 프로브이다. 형광 세포 분류기 또는 관련 기술을 형광 발생 프로브와 함께 사용하여 1 이상의 파장에서 형광의 특정 수준(들)을 나타내는 세포를 동정 및/또는 단리할 수 있다. 생존 세포에서 mRNA 뿐 아니라 다른 RNA를 신뢰성있게 효율적으로 검출할 수만 있다면, 이들은, 예를 들어 형광 활성화 세포 분류기(FACS)를 사용하여 세포를 그의 소정 특성에 준해 동정 및 경우에 따라 단리하기 위해 사용될 수 있다. FACS 기술은 현재 초당 최대 70,000개의 세포를 분류하는 것이 가능하다. 5,000,000개의 세포가 2분 내에 분류될 수 있다.

1. 단백질-발현 세포주의 생성

본원에 개시된 신호 프로브를 적용하여 세포주 생성에 관여하는 가장 장황한 일부 단계를 생략할 수 있다. 일례로, 목적하는 유전자를 코딩하는 DNA 컨스트럭트로 형질감염시킨 후, 이들 세포에 소정의 유전자의 메시지를 인식하도록 디자인된 형광 발생 프로브를 도입한다. 이 단계는 선별 마커를 사용한 선별, 예컨대 약물 선별 후 수행될 수 있으나, 단 형질감염된 DNA 컨스트럭트는 또한 약물 내성을 코딩하여야 한다. 유전자 전사 세포가 형광을 발할 것이다. 후속 FACS 분석에 따라 형광 세포를 단리하고, 선별한 유전자를 발현하는 세포주를 제공하기 위하여 증식시킬 수 있다.

일례로, 신호 프로브는 소정의 단백질을 코딩하는 RNA 부분 또는 그의 5' 또는 3' 비번역 영역 부분에 상보적이도록 디자인된다. 소정의 메신저 RNA를 인식하도록 디자인된 신호 프로브가 존재하는 표적 서열을 내인성으로 검출할 수 있다면, 형질감염된 세포에 의해 생성된 표적 서열 부분에 대한 이들의 비율은 분류기가 두 세포 타입을 판독해 낼 수 있는 정도이다. 소정의 유전자는 태그 서열로 표지될 수 있으며, 신호 프로브는 태그 서열을 인식하도록 디자인될 수 있다. 태그 서열은 생성된 단백질의 표지 여부에 따라 유전자 메시지의 단백질-코딩 부분과 동일한 골격에 존재할 수 있거나, 동일한 골격에 존재하지 않을 수 있다.

또한, 주어진 세포에서 소정의 유전자의 발현 수준은 다양할 수 있다. 이는 세포로 형질감염된 DNA의 양 또는 카피수, DNA의 임의 생성된 게놈 통합 부위 및 DNA 보존성, 및 게놈 통합에 따른 발현이 예시되나 이들에만 한정되지 않는, RNA 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는 인자가 다양하기 때문이다. 발현 수준을 평가하고 동일 유전자를 발현하는 개별 세포를 차별적으로 선별하기 위하여 FACS를 적용할 수 있다.

2. 유전자를 하향 조절하는 세포주 생성

다수의 연구에서 단백질을 코딩하는 RNA, 즉 유전자의 안티센스 또는 유전자의 일부를 발현하지 않는 세포주 생성에 대해 다루었다. 이러한 방법은 주어진 세포에서 특이적 RNA 또는 단백질의 양을 감소시키는 것을 목적으로 한다. 단백질-발현 세포주를 생성하기 위한 상술된 단계는 본원에도 동일하게 적용되며, 본원이 신호 프로브가 안티센스 RNA인 RNA를 검출하도록 디자인된 점만을 제외하고 실질적으로 동일하다.

형질감염된 안티센스-발현 세포주를 안정하게 제조하기 위한 모든 착안이 표적 단백질을 충분히 발현시키는 세포주를 제공한 것은 아니다. 이러한 어려움은 상기 세포주를 생산하는데 덜 유용하다. 개시된 방법이 용이해지면, 활성적인, 즉 효과적인 안티센스 발현 세포주를 생산할 수 있는 능력에 대한 효과적인 다수의 상이한 유전자 서열을 용이하게 분석할 수 있다. 그 후, 이들을 분석하여 표적 유전자의 하향 조절이 분석될 수 있는 경우 적절한 발현 프로파일을 나타내는지를 결정할 수 있다.

RNA 간섭은 특정 유전자의 전사 수준을 감소시키는 것이 목적인 대안적인 착안이다. RNA 간섭은 화학적으로 합성된 단길이 siRNA를 코딩하는 siRNA 또는 DNA 컨스트럭트를 사용하여 일시적으로 유도될 수 있거나, 단길이 siRNA를 적절히 발현하는 안정한 세포가 생성되는 경우 안정하게 유도될 수 있다. 개시된 방법은 또한 이러한 siRNA에 대한 발현에 기초해 세포 또는 세포주를 분석하거나 단리하기 위하여 사용될 수 있다.

상기 세포들에서 일반적으로 나타나는 일부 복잡성을 해결하는데 도움을 줄 것이기 때문에, RNA 간섭을 유도하는 RNA를 발현하는 세포를 수득하기 위하여 개시된 방법을 적용하는 것이 또한 중요하다. 예를 들어, RNA 간섭이 표적 RNA의 전사 수준을 감소시키기 위하여 수행되고 다른 RNA의 전사 수준에 하향 효과를 초래할 수 있지만, 의도하지 않은 표적 RNA의 전사 수준도 감소시키는 것으로 또한 알려져 있다. 이들 의도되지 않은 표적의 아이덴티티는 RNA 간섭을 유도하기 위하여 사용된 RNA의 서열에 따라 변한다. 이는 상기 언급된 바와 같은 의도하지 않은 결과로 나타날 수 있는 것으로서, 세포에서 RNA 간섭을 사용하는 경우 복잡한 일면이다. 서술된 방법이 각각, 예를 들어 동일한 유전자에 대해 RNA 간섭을 유도하기 위해 사용되는 상이한 RNA 서열을 발현하는 다수의 안정한 세포를 효율적으로 생성할 수 있기 때문에, 이들 각 서열은 세포에서 다른 유전자의 전사 수준에 미치는 효과에 대해 분석될 수 있다. 전사 수준을 감소시키는 RNA를 구별하기 위하여 상기 정보 분석을 사용할 수 있으며, 이들의 감소는 표적 RNA의 발현 감소에 기인하지 않는다. 안티센스 RNA를 사용하여 특이적 하향조절을 이루는데 따르는 어려움을 해결하는데 성공적으로 사용됨에 따라, RNA 간섭은 급속도로 대중화되었다. 본 발명의 방법은 비특이적 활성이 감소된 보다 특이적인 RNA에 가장 효과적인 서열을 결정하는데 유용할 수 있다. 이 방법은 또한 가장 효과적이고 특이적인 안티센스를 선별하는 방법을 제공하기 때문에, 효과적인 안티센스 RNA를 동정하는 방법을 나타낸다.

3. 세포 표면에 편재화된 항원에 기초한 세포의 차별화

면역학자 및 기타 다른 사람들은 세포를 분류하는데 오랫동안 FACS를 사용하여 왔다. 일반적으로, 이 방법은 상이하게 표지된 프로브, 일반적으로 형광단-표지 항체 프로브를 가지는 세포-표면에 편재화된 단백질을 기초로 한다. 예를 들어, 세포 표면에 편재화된 단백질의 발현에 양성적인 세포가 실시될 수 있다. 이 방법은 세포 고유성을 보존하고 그의 생존성을 유지하도록 디자인된 조건 하에서 가장 일반적으로 사용된다.

본 발명에 따라, 세포 표면에 편재화된 단백질의 존재를 검출하기 위하여, 신호 프로브는 소정의 단백질을 코딩하는 mRNA를 표적화하도록 제조된다. 세포 생존성의 파괴없이 형질감염에 의해 신호 프로브를 세포 내로 도입한다. 그후, 세포 분류기를 사용하여 양의 값 세포를 단리한다. 또한, 각각 소정의 단백질 중 하나의 mRNA에 표적화된 신호 프로브 조합이 사용되는 경우, 이들 각각은 상이하게 표지될 수 있다. 세포가 FACS를 단일 적용하여 검출될 수 있는 것보다 상당히 많은 수의 표적을 가지는 경우, 세포를 분류하기 위해 다수의 분류 반복이 수행될 수 있다.

개시된 방법은 또한 다른 세포 RNA, 예를 들어 세포로부터 분비되거나 내부적으로 편재화된 단백질을 코딩하는 mRNA, 또는 단백질을 코딩하지 않는 RNA에 대해 세포의 분석 또는 분류를 가능하게 한다. 그 결과, 프로브가 아직 개발되지 않았거나 일반적으로 사용되는 항체 프로브를 사용할 수 없는 단백질을 코딩하는 mRNA를 비롯하여, 개시된 1 이상의 세포 RNA가 표적으로 검출될 수 있다. 이들은 막-관련, 막-스패닝(spanning), 막-고정, 세포 세포질 또는 핵세포질 단백질을 포함할 수 있다.

4. 특이적 RNA 의 발현을 위한 세포 분석 및 세포에서 RNA 발현 수준의 정량화

세포 내로 도입된 형광 발생 프로브의 표적 RNA가 존재하는 경우, 세포는 형광을 발할 것이다. 이 정보는 형광 현미경(공초점, 레이저-스캐닝 또는 다른 타입의 현미경) 또는 FACS를 사용하여 정성적으로 평가될 수 있으며, 또한 이들중 어느 한 방법으로 정량적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 특정 RNA의 발현 패턴을 결정하기 위하여 동일계에서 조직 슬라이스에 대해 역-전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 대신, 동일한 실험을 수행하는데 신호 프로브가 사용된다. 또한, 각각 특이적 RNA를 표적화하는 상이하게 형광된 형광 발생 프로브 조합을 사용하여, 소정의 수개의 RNA의 존재 또는 양을 단일 단계로 분석할 수 있다. RNA(고정 샘플에서)의 검출은 비표적 특이적 신호 발생을 제한하기 위해 경험적으로 결정된 온도에서 수행될 수 있다. 핵산 프로브를 사용한 경우 표적 검출에 대해 최적의 온도 조건을 확립하는 것이 일반적이다(Localization of Antigens in Combination with Detection of RNA in Cells and Tissues).

고정 세포 또는 조직 슬라이스를 사용하는 경우, 면역세포화학을 이용하여 인식된 단백질 항원을 위치화하고, 특이적 RNA를 표적화하는 신호 프로브를 사용하는 경우, 소정의 RNA를 동일 샘플에 공-위치화시킨다. RNA 기능에 표적화된 형광 발생 프로브가 고정 세포에서 기능하는 것으로 나타났다.

5. 다수의 RNA 또는 단백질을 발현하는 세포주 생성

본 발명의 방법을 사용하여, 다수의 선택적인 약물 혼합물의 존재 하에서(또는 다른 선택적인 약제를 사용) 세포를 유지하지 않고도, 임의 수의 RNA 또는 단백질을 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주를 매우 신속히 생성할 수 있다. 유전자 형질감염 및 임의로, 약물-선별 후, 각 단백질 메시지에 대한 신호 프로브 조합을 세포 내로 도입한다. 메시지가 관련될 수 있는 태그 서열 또는 오직 한 유전자의 mRNA와 하이브리드되도록 각 형광 발생 프로브의 표적 상보 서열을 디자인함으로써, 각 신호 프로브는 오직 한 유전자에 의해 코딩되는 mRNA를 인식하도록 디자인된다. 일례로, 그후 세포는 FACS에 의해 분류된다. 1 이상의 신호를 선택하여 단일 적용으로 다양한 세포주를 생성한다.

FACS를 단일 응용하여 동정될 수 있는 수보다 많은 다수의 소정의 RNA를 발현하는 세포주를 생성할 필요가 있다. 예를 들어, 특정 복합체의 형성에 연루되거나 생물학적 경로에 연루된 것으로 생각되는 모든 단백질 및 RNA 서열을 과다발현하는 세포주를 제공하는 것이 매우 유익할 수 있다. 예를 들면, 동일하거나 또는 관련된 생물학적 경로내 RNA 또는 단백질, 서로의 업스트림 또는 다운스트림으로 작용하는 RNA 또는 단백질, 서로에 대해 조절, 활성화 또는 억제 기능을 가지는 RNA 또는 단백질, 기능 또는 활성이 상호 의존적인 RNA 또는 단백질, 복합체를 형성하거나 상호 결합하는 RNA 또는 단백질, 또는 상동성(예: 서열, 구조 또는 기능 상동성)을 공유하는 RNA 또는 단백질이 있다. 필요한 RNA 수가 FACS를 단일 적용하여 분석될 수 있는 것보다 많은 경우, 이를 수행하기 위해, 이미 일부 RNA 조합을 발현한 세포를 숙주 세포(추가 RNA를 코딩하는 추가 컨스트럭트가 형질감염될 수 있다)로 사용하여 상술된 단계를 반복한다.

발현될 다수의 RNA가 모두 세포에 동일 약물에 대한 내성을 부여하는 컨스트럭트로 클로닝되는 경우, 일례로, FACS를 사용하여 모든 목적 RNA를 발현하는 세포를 단리할 수 있다. 서열이 게놈에 안정하게 삽입된 경우, 세포가 임의 서열의 발현을 상실하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 1 이상의 서열이 상실될 수도 있다. 이러한 경우에는, 이들 세포가 증식하는 배지 내 선택적인 약물 또는 선택 약제의 농도를 증가시켜 상기 가능성을 감소시켜야 한다. 또한, 각각 상이한 약물에 대한 내성을 부여하고, 적절한 약물들의 혼합물내에서 세포를 유지하는 컨스트럭트가 사용된다. 또한, 세포에 안정하게 형질감염될 컨스트럭트 부분이 하나의 약물에 대한 내성 유전자를 코딩하기 위해 선택될 수 있고, 다른 부분이 다른 약물에 대한 내성 유전자를 코딩하기 위해 선택될 수 있다.

또한, 세포주의 일부 세포가 소정의 RNA의 발현을 상실하는 경우, 한 수단으로, 상술된 세포주를 단리하기 위한 제1 실험을 반복하고, 새로운 세포를 수득한다. 또한, 기술된 세포 혼합물을 FACS로 분석하여 모든 목적 RNA를 발현하는 세포를 재단리한다. 이는 선택된 원 세포주와 동일한 유전자 구성을 이루는 세포주를 발생시키는 세포를 또 다시 산출하기 때문에, 매우 유용한 절차이다.

상술된 방법은 실질적으로 무제한 분석 방법으로 분석될 수 있는 단백질 및 RNA 서열의 임의 조합을 발현하는 세포를 무제한 공급한다. 과다발현된 단백질은 여전히 세포에 독성일 가능성이 있으며, 이후 논의되는 바와 같이, 이러한 가능성은 용이하게 다루어질 수 있다.

모든 RNA를 더 이상 발현하지 않는 세포로부터 모든 목적 RNA를 발현하는 세포를 용이하게 재단리할 수 있다면 약물 부재 하 또는 최소 농도의 약물의 존재 하에 세포를 유지하는 것이 가능해 진다. 본원에 기술된 방법은 또한 앞서 생성된 세포 또는 세포주에 신호 프로브를 재적용하는 것을 가능케 한다. 예를 들어, 세포가 최초 단리된 임의의 1 이상의 RNA에 대해 여전히 양성인지의 여부 및 그의 정도를 결정하는 것이 가능하다.

6. 1 이상의 RNA 또는 단백질을 현저히 과다발현하는 세포주 생성

고도로 과다발현될 각 유전자에 대해, 예를 들어, 동일한 유전자에 대한 2 이상의 서열을 먼저 임의로 약물 내성 또는 다른 선별 마커를 또한 부여하는 DNA 컨스트럭트에 클로닝한다. 각 유전자에 대한 다수의 각 서열을 상이한 태그 서열을 코딩하는 서열을 포함하도록 디자인한다. 일례로, DNA 컨스트럭트를 세포에 형질감염시킨 후, 각각 하나의 태그 서열에만 표적화되고 상이하게 형광 표지된 선택 형광 발생 프로브를 세포 내로 도입하며, 세포 분류기를 사용하여 이들의 신호에 양성인 세포를 단리한다. 이 세포를 상이하게 표지된 각 서열 중 적어도 하나의 카피를 가지는 그의 게놈에 통합하고, 그에 따라 실질적으로 동일한 대상 서열의 카피수 증가로부터 소정의 서열이 발현된다. 소정의 서열을 세포 내 게놈의 상이한 위치에 통합시킬 수 있다. 이 방법은 각 형광단의 신호에 대해 가장 강한 기록을 이루는 세포를 식별하기 위해 FACS와 함께 사용된다. 이러한 공통 서열에 대한 공통 신호 프로브가 세포 내 모든 다양한 태그를 검출하기 위해 사용될 수 있도록 하기 위해 상이한 태그의 일부 또는 전부는 동일할 수 있다.

7. 다수의 안티센스 RNA 를 발현하는 세포주 생성

다수의 안티센스 메시지를 생성하는 안정하게 형질감염된 세포주를 다음과 같이 형성한다. 이러한 안티센스 메시지는 mRNA 또는 다른 RNA를 표적으로 한다. 형질감염된 안티센스 서열 중 임의의 하나를 상이한 수준으로 발현하는 세포를 선별한다. 안정한 형질감염을 반복하여, 무제한적인 수의 RNA의 안티센스 메시지를 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주를 발생시킬 수 있는 세포를 용이하게 선별한다.

물론, 안티센스 RNA 이외의 다른 RNA를 발현하는 세포도 본원에 개시된 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 RNA에는 1 이상의 mRNA, rRNA, siRNA, shRNA, 다른 구조 RNA, 예컨대 hnRNA, tRNA, 또는 snRNA, RNA 간섭 활성을 가지는 RNA, 태그로 제공되는 RNA 등이 포함되나 이들로만 한정되지 않는다.

8. 세포주 라이브러리 생성

다수의 세포를 발현 라이브러리를 형성하는 DNA 컨스트럭트로 형질감염시킨다. DNA 서열의 발현 라이브러리는 예를 들어 전 유기체, 조직, 세포 또는 세포주로부터 생성된 cDNA 또는 EST 라이브러리가 예시되나 이들에만 한정되지 않는 당업계에 공지된 임의 종류 또는 이들의 혼합물 및 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 코딩 서열이 예시되나 이들에만 한정되지 않는 합성 라이브러리를 포함할 수 있다. 유사하게, DNA 컨스트럭트의 라이브러리는 발현 라이브러리가 사용될 수 있는 바와 같이 특이적으로 디자인되지 않는다. 예를 들어, DNA 컨스트럭트 라이브러리는 프로모터, 억제제 또는 인핸서 요소와 같은 조절 기능을 가질 수 있는 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 이들은 구성, 유도 또는 억제성일 수 있다. 마찬가지로, DNA 컨스트럭트 라이브러리는 대형 DNA 세그먼트, 이를테면 전사가 일어날 수 있는 전체 또는 부분 유전자 위치 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. DNA 컨스트럭트의 임의의 이들 발현 라이브러리는 각각 전체 또는 부분 돌연변이화, 랜덤화, 재조합, 셔플링, 변형일 수 있거나, 또는 이들 임의 조합으로 처리될 수 있다. 또한, 이들 타입중 임의 라이브러리는 발현되고 신호 프로브용 표적으로 사용될 수 있는 적어도 하나의 태그를 추가로 포함할 수 있다.

특정 계통의 단백질에 대한 DNA 서열의 발현 라이브러리가 작성되어 세포주 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 키나제에 대한 cDNA를 태그 서열을 포함하는 발현 컨스트럭트에 클로닝시킬 수 있다. 상이한 키나제를 안정하게 발현하는 세포를 수득하여 키나제를 발현하는 세포주에 한정된 세포주 라이브러리를 생성하는 데 사용할 수 있다. 약물 스크리닝과 같은 추가 적용에 부합하도록 서열 종류를 선별할 수 있다.

세포주 라이브러리는 또한 동일한 단백질 패밀리에 속하거나 기능 패밀리내에서 서열 상동성을 가지는 단백질 계통 및 주어진 단백질 경로 또는 복합체 또는 시스템에 그의 역할이 한정되는 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 다양한 HIV 단백질에 결합할 수 있는 화합물에 대한 약물 스크리닝의 경우, 각 세포주가 상이한 HIV 단백질을 발현하는 세포주 라이브러리를 제작하여 약물 화합물을 스크리닝하는데 사용할 수 있다.

세포주 라이브러리는 목적하는 활성을 가지는 분비 펩티드 또는 단백질을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 먼저, 펩티드/단백질과 동일한 골격으로 번역된 유출 신호를 추가로 코딩하는 발현 라이브러리(펩티드, 단백질, ESTs, cDNAs 등에 대한)를 사용하여 세포주 라이브러리를 작성한다. 발현된 펩티드/단백질을 증식 배지에 분비시킨다. 특정 활성에 대한 이들 펩티드의 효과를 주어진 적절히 디자인된 분석으로 결정할 수 있다. 세포주로부터의 조직 배양 상등액을 수집하여 활성을 분석하기 위해 시험 세포에 적용할 수 있다.

또한, 발현 라이브러리를 세포에 형질감염시키고, 임의로, 먼저 발현 라이브러리로 형질감염된 세포(예컨대 발현 라이브러리에 포함된 태그에 대한 신호 프로브 사용)를 선별한 후, 세포를 소정의 1 이상의 RNA에 대한 1 이상의 신호 프로브에 노출시켜 세포주 라이브러리를 생성할 수 있다. 이는 세포 내에서 다양한 RNA의 발현을 가능하게 하고, 이들 RNA 중 어느 것이 소정의 1 이상의 RNA의 하류 전사를 상향조절하는지 또는 하향조절하는지를 결정할 수 있도록 해 준다.

9. 1 이상의 단백질에 대한 기능 녹아웃( knock - out ) 세포주 생성

본 발명의 방법은 배양 세포 내에서 기능 녹아웃을 제조하기 위한 수단을 제공한다. 다중 위치로부터 유일 RNA 서열에 대해 RNA 간섭 활성을 가지는 실질적으로 동일한 안티센스 RNA 또는 siRNA를 발현하는 세포를 생성하여 소정의 임의의 한 단백질에 대한 기능 녹아웃 세포주를 생성한다. siRNA를 사용한 본 발명의 임의의 방법이 shRNA를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포에 각각 특정 유전자에 대한 안티센스 RNA 또는 유전자에 대해 RNA 간섭 활성을 가지는 siRNA 중 어느 하나 또는 이 둘 다를 코딩할 수 있는 다중 컨스트럭트를 형질감염시킨다. 여기에서, 각 안티센스 RNA 서열은 유일 태그 서열의 뉴클레오티드 서열로 태그될 수 있다는 점에서만 상이하다. 상이하게 표지된 전 안티센스 RNA의 1 이상을 발현하는 세포를 선별한다. 유사하게, RNA 간섭 활성을 가진 각 siRNA 또는 shRNA의 존재는 각 siRNA 또는 shRNA가 결합된 태그를 검출함으로써 결정될 것이다. 상술한 바와 같이, 형광을 정량하는데 FACS가 사용되기 때문에, 이러한 일면은 임의의 1 이상의 안티센스 서열을 가장 강하게 발현하는 세포를 선별할 수 있게 한다. 표적 RNA를 소정의 발현 수준으로 나타내는 세포, 또는 임의의 개수나 조합으로 발현된 RNA(표적 RNA의 발현 수준을 감소시키는 작용을 한다)의 발현으로 인해 표적 RNA를 거의 또는 완전히 발현하지 않는 세포를 단리할 수 있다.

중요하게는, RNA 간섭 활동을 가지며 동일한 유전자를 표적으로 하는 1 이상의 상이한 안티센스 서열 및 siRNAs가 본 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 신호 프로브 및 FACS를 사용함으로써 발현이 선택되는 일부 안티센스 RNA는 유전자에 대해 메신저 RNA의 특정 영역을 표적화하도록 디자인되지만, 다른 것들은 동일 메신저의 다른 부분을 표적화하도록 디자인될 수 있다. 소정의 단백질이 기능적으로 녹아웃된 세포주를 제조하기 위해, 소정의 동일 유전자에 대해 RNA 간섭 활성을 가지는 유사하거나 상이한 안티센스 RNA 또는 siRNA(검출 불가 수준, 또는 허용되는 낮은 수준으로 소정의 단백질을 발현하는 세포주 생성에 필요하다)를 코딩하는 다수의 유전자 서열을 안정하게 세포 내로 형질감염시킬 수 있다.

더우기, 안티센스 또는 siRNA에 의해 기능적으로 녹아웃될 모든 수의 서열을 표적화하면서, 상술한 방법을 반복함으로써 다수의 단백질이 기능적으로 녹아웃되거나 그의 발현 수준이 감소된 세포주를 생성할 수 있다. 예를 들어, 단백질 복합체의 기능을 연구하기 위해, 상기 복합체를 구성하는 단백질의 하나, 전부 또는 임의의 조합을 녹아웃시키거나 그의 발현 수준을 감소시킬 수 있다.

10. 선택된 택일적으로 스플라이싱된 형태의 1 이상의 유전자만이 기능적으로 녹아웃된 세포주의 생성

단일 유전자의 택일적으로 스플라이싱된 형태는 종종 다른 기능을 가지는 단백질로 번역된다. 본 발명의 방법을 이용하여, 선택된 택일적으로 스플라이싱된 형태의 1 이상의 유전자만이 기능적으로 녹아웃되거나, 그의 발현 수준이 감소된 세포주를 제조할 수 있다. 예를 들어, 세포로부터 제거하고 싶은 유전자의 메신저 RNA 중 택일적으로 스플라이싱된 형태만을 표적화하는 안티센스 또는 siRNA를 디자인함으로써, 택일적으로 스플라이싱된 소정의 유전자의 RNA를 모두 기능적으로 녹아웃시키거나, 소정의 택일적으로 스플라이싱된 메시지를 제외하고 그의 발현 수준을 소정 수준으로 충분히 감소시킬 수 있다.

11. 1 이상의 다른 단백질이 기능적으로 녹아웃된, 1 이상의 RNA 또는 단백질을 발현하는 세포주의 제조

예를 들어, 상호작용하는 것으로 생각되는 특정 군의 단백질에 대해, 안티센스 또는 siRNA(또는 shRNA)의 세포 발현에 의해 1 이상의 소정의 단백질이 기능적으로 녹아웃되거나 그의 발현 수준이 감소된 안정한 형질감염 세포주를 제조함으로써 단백질간의 상호작용을 연구할 수 있다. 그 후, 세포 내에 잔존하는 단백질의 기능을 연구할 수 있지만, 보다 흥미로운 것은, 잔존하는 1 이상의 소정의 단백질을 과다발현시키기 위해 추가 조작에 의해 상기 세포를 추가로 변경시킬 수 있다는 것이다. 또한, 세포 내에서 추가 단백질을 과다발현시키거나, 제거하거나, 그의 발현을 감소시킬 수 있다. 다시 설명하면, 특정 단백질의 과다발현 또는 특정 단백질의 기능적 녹아웃은 세포에 치명적일 수 있다. 본 발명이 해결하고자는 과제를 이하에 설명한다.

전사 조절에 대해 직접 또는 간접적으로 작용하는 DNA를 도입하여 유전자를 무작위적으로 상향-조절 또는 하향-조절하는데 유사한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 제한없이 프로모터 또는 인핸서, 억제제 서열, 또는 1 이상의 RNA에 대해 전사 수준을 조절하는 일부 다른 결합 또는 기능적 활성을 가지는 서열을 포함하는 DNA 서열 중 하나 또는 그의 조합이 세포 내로 형질감염될 수 있다. 이들 성분의 활성은 구성적, 유도성 또는 억제성일 수 있다. 1 이상의 특정 RNA에 대한 신호 프로브가 상기 RNA의 발현 수준이 증가되거나 감소된 세포를 동정 및 단리하는 데 사용될 수 있다. 기술된 방법을 이용한 일부 DNA 서열의 안정한 통합은 유전자 위치로부터의 전사를 무작위적으로 충분히 유도하거나 차단시킬 수 있다. 이러한 세포주 라이브러리는 특정 유전자를 효과적으로 과다발현하거나, 특정 유전자가 녹아웃된 세포를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 1 이상의 RNA를 소정 수준으로 가지는 세포가 이러한 방법에 의해 선별될 수 있다. 다수의 소정의 RNA에 대해 소정 발현 프로파일을 가지는 세포를 단리하기 위해, 필요하다면 이와 같은 절차가 여러번 수행될 수 있다.

12. 형질전환 마우스의 제조

목적에 따라, 배양물내 세포 연구가 충분하지 않을 수 있다. 그러나, 상술한 방법은 또한 배아 줄기 세포의 조작에 대해 자체로 사용될 수 있다. 상술한 방법에 따라, 다수의 단백질 또는 택일적으로 스플라이싱된 형태인 다수 단백질의 일부분에 대해 기능적 녹아웃으로 작용하는 다수의 RNA 또는 단백질을 발현할 수 있는 배아 줄기 세포를 얻을 수 있다. 그 후, 이러한 배아 줄기 세포는 형질전환 동물을 제조하기 위한 기초로 사용될 수 있다.

본원에 개시된 방법에 따라 단리된 세포는 동물에 직접 이식될 수 있거나, 상기 세포의 핵이 다른 수용 세포에 전달된 뒤에 이들 세포가 이식될 수 있다. 본 발명의 한 가지 용도는 형질전환 동물을 제조하는 것이고, 다른 용도는 세포 산물을 합성하거나 분비하는 세포(유기체에서 소정 역할을 수행하도록 가공된)를 유기체에 도입하는 것이나 이들로 제한되지는 않는다.

13. 안정하게 형질감염된 유도성 세포주의 생성

세포 내 특정 단백질 또는 RNA의 과다발현 또는 발현 결실은 치명적이거나 해로울 수 있다. 아직까지, 독성 단백질 또는 RNA를 과다발현하는 세포, 세포의 생존에 필수적인 단백질 또는 RNA(이들이 없으면 생존할 수 없다)가 기능적으로 녹아웃된 세포를 연구하는 것은 상당히 중요할 수 있다. 이를 위해, 세포에 대해 상기 해로운 효과를 가지는 선택된 RNA가 유도 또는 조건부 프로모터의 조절 하에 있는 안정하게 형질감염된 세포를 생성할 수 있다. 이러한 세포주를 단리하기 위해, 일례로, 형질감염된 임의의 약물-선택적 세포를 먼저 유도성 유전자의 전사에 영향을 주도록 최소한으로 유도하고, 그 후 적절한 RNA를 인식하도록 디자인된 신호 프로브를 세포 내로 형질감염시킨 뒤, 세포를 FACS로 분석한다. 얻은 세포는 필요에 따라 독성 RNA가 유도 및 전사되도록 유지된다.

유도 시스템은 독성 RNA의 발현외에도 여러 응용에서 유리할 수 있다. 예를 들어, 동기화된 세포주의 세포 사이클 동안 특정 시점에서 세포 내로 안정하게 형질감염된 유전자 서열의 발현을 유도할 수 있다. 또한, 안정하게 형질감염된 1 이상의 유전자 서열 세트로부터 발현된 산물이 다른 세트로부터 발현된 산물에 작용한다고 생각된다면, 제1 세트의 유전자 서열을 유도 프로모터의 조절 하에 클로닝하고 제2 세트의 유전자 서열을 제2 유도 프로모터의 조절 하에 클로닝할 수 있다. 유도를 다양하게 함으로써, 다른 세트로부터 발현된 산물의 존재 또는 부재 하에 어느 한 유전자 서열 세트에 의해 코딩된 발현 산물을 연구할 수 있다. 일반적으로, 상술한 방법에 의해 세포 내에 도입된 DNA 서열들은 각각 목적 활성을 가진 프로모터 또는 다른 전사 조절자의 조절 하에 놓일 수 있다. 예를 들어, 유도성, 조직-특이성, 시간-특이성 또는 일시적 프로모터, 인핸서 또는 억제제, 또는 세포 또는 세포외 신호에 의해 조절되거나 활성화되거나 억제되는 조절 요소가 사용될 수 있고, 여기에서 세포 또는 세포외 신호는 화합물 또는 화학물질, 다른 세포, 단백질, 펩티드, 호르몬, 신호 분자, 또는 세포에서 분비된 인자, 기관, 조직 또는 세포의 전체 또는 분획 추출물, 또는 환경 샘플의 1 이상을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 이 경우, 세포를 먼저 적절한 수준의 전사 조절제에 노출시킨 뒤, 신호 프로브에 노출시킨다.

14. 생존 세포 내 유전자 재조합의 검출후 비-재조합되거나 상이하게 재조합된 세포의 단리

안정한 세포주 제조에 관여하는 재조합을 겪는 세포를 검출하기 위한 신호 프로브의 용도에 부가하여, 신호 프로브의 용도는 생존 세포 혼합물로부터 다른 특이적 재조합을 겪는 세포를 검출하고 단리하는 것이다. 동일한 원리가 예를 들어 VDJ 재조합, 전위 및 바이러스 게놈 통합을 분석하는데 사용될 수 있다.

세포 재조합에서, 예를 들어, 게놈 DNA의 서열은 다른 서열과 교환될 수 있다. 재조합이 발생하는 영역을 코딩하는 DNA 서열이 RNA로 전사되면, 이러한 과정의 존재가 비재조합 DNA 서열로부터 전사된 RNA 또는 재조합 서열로부터 전사된 RNA를 인식하도록 디자인된 신호 프로브에 의해 검출된다. 또한, 상기 분석은 형광 현미경(또는 생성된 신호를 정량하는 다른 장치)을 이용해서 수행될 수 있다. 재조합 세포를 비재조합 세포로부터 단리하고 싶다면, 세포를 FACS에 적용시켜 세포를 분류하면 된다. 또한, FACS는 다수의 재조합의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 분류하는데 사용될 수 있다.

15. 발현된 RNA 에 기초한 세포 분류

상술한 신호 프로브의 용도는 내부에 편재되거나, 세포-표면에 편재되거나, 분비된 단백질을 코딩하는 RNA 뿐 아니라 세포 내에 존재할 수 있는 다른 RNA의 발현에 기초하여 세포를 분류할 수 있게 한다. 예를 들어, 혼합된 세포 집단으로부터, 내부에 편재화된 소정의 단백질을 생성하는 mRNA를 인식하는 신호 프로브를 디자인함으로써 상기 단백질을 발현하는 세포를 단리할 수 있다. 상기 신호 프로브가 세포 혼합물로 형질감염되고, 세포를 적절히 분류하는데 FACS가 사용될 수 있다. 분류는 여러번 수행될 수 있다.

추가로, 예를 들어 연구자는 1 이상의 특정 단백질의 mRNA 또는 주어진 추가 인자에 반응하여 전사되는 RNA를 발현하는 세포를 단리하거나, 추가된 인자가 1 이상의 단백질 또는 RNA의 전사를 유도하거나 억제하는지를 결정하는 것에 관심을 가질 수 있다. 상기 방법에 의해 시험될 수 있는 추가된 인자는 핵산, 단백질, 펩티드, 호르몬, 신호 분자, 화학적 화합물, 무기 또는 유기 화학물질, 세포, 또는 유기체, 조직 또는 세포로부터 유래된 전체 또는 분획 추출물, 또는 세포 또는 기관으로부터 정제되거나 분리된 생성물, 환경 또는 다른 기원에서 유래한 샘플을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.

시토킨에 반응하여 1 이상의 특정 RNA를 발현하도록 유도된 세포를 단리하기 위해, 예를 들어, 세포 혼합물을 먼저 시토킨으로 유도한 뒤, 각각 소정의 단백질 중 하나를 생성하는 mRNA를 인식하도록 디자인된 신호 프로브로 형질감염시킨다. 일례로, 그 후 FACS를 사용하여 소정의 mRNA를 양의 값으로 나타내는 세포를 단리한다. 일례로, 당업자는 또한 특정 유전자의 발현을 위해 예를 들어 바이러스로 감염된 세포를 분석할 수 있다. 다르게는, 화학 화합물 라이브러리와 같은 화합물 세트 또는 라이브러리, 또는 RNA의 발현 라이브러리를 세포에 적용하여 임의 화합물, 화합물의 혼합물 또는 RNA가 1 이상의 특정 단백질 또는 RNA의 전사를 유도하거나 억제하거나 조절하는지를 결정할 수 있다.

본원에 개시된 방법을 이용하여 다음과 같은 1 이상의 상이한 역할을 가지는 RNA의 존재에 대해 양의 값을 갖는 세포를 검출할 수 있다: 단백질, 융합 단백질, 단백질에 융합된 펩티드, 유출 신호, 유입 신호, 세포 내 편재화된 신호 또는 다른 신호(단백질 또는 펩티드에 융합될 수 있다)를 코딩하는 메신저 RNA; 안티센스 RNA, siRNA, 헤어핀 구조를 형성하고 siRNA와 유사한 활성을 가지는 단길이 RNA; 제한없이 리보좀 RNA, tRNA, hnRNA, snRNA를 포함하는 구조 RNA, 세포 RNA; cDNA 또는 EST에 상응하는 램덤 RNA; 다양한 종으로부터 유래된 RNA, 올리고뉴클레오티드에 상응하는 RNA, 전 세포, 조직 또는 유기체 cDNA 제제에 상응하는 RNA; 다른 핵산, 단백질, 다른 세포 성분 또는 약물 분자에 대해 일부 결합 활성을 가지는 RNA; 다양한 거대분자 복합체에 도입될 수 있는 RNA; 일부 세포 기능에 영향을 줄 수 있는 RNA; 또는 상술한 기능 또는 활성을 가지고 있지는 않지만 세포에 의해 발현될 수 있는 RNA; 바이러스 또는 외래 RNA 링커 RNA에 상응하는 RNA, 또는 1 이상의 RNA를 연결하는 서열; 또는 태그로 작용하는 RNA, 상술한 1 이상의 것에 대한 비변형 돌연변이화, 랜덤화 또는 셔플링된 서열의 조합물 또는 재조합물. RNA는 유도성, 억제성, 조직-특이성, 또는 일시적 프로모터를 포함하나 이들로 제한되지 않는 구조 또는 조건부 프로모터 또는 상술한 1 이상의 것에 대한 비변형 또는 돌연변이화, 램덤화, 셔플링된 서열의 조합물 또는 재조합물의 조절 하에 있을 수 있다. 상술한 RNA는 세포에 DNA 컨스트럭트, 벡터 또는 핵산이 발현되도록 전달하는 다른 전달 방법을 도입함으로써 발현할 수 있다.

16. 핵산의 생체내 검출후 프로테아제 프로브를 이용한 세포의 선별

또한, 본 발명은 신호 프로브와 달리 표적 핵산에 결합하여 단백질분해 활성을 나타내는 신규 형태의 프로테아제 프로브에 관한 것이다. 상기 단백질분해 활성은 검출 목적 및 표적 핵산이 세포 내에 존재하는 세포에서 특정 단백질 서열을 분해하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 단백질을 특이적으로 절단하는 프로테아제는 바이러스 서열의 전사가 활성화되는 시기(잠복감염) 및 예를 들어 프로테아제 프로브가 바이러스 메시지에 대해 지시된 곳에서 활성화될 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 단백질분해 활성-생성 단일 하이브리드화 프로브에 관한 것이고, 이는 본원에서 프로테아제 프로브로 지칭된다. 상기 프로테아제 프로브는 또한 표적 RNA에 대해 상보적인 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드, 및 상호 상보적인 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 프로테아제 프로브는 상술한 프로브와 유사한 방식으로 작동하지만, 신호 프로브와 표적 핵산 서열이 상호작용하여 형광 신호를 생성 또는 변화시키는 대신, 표적의 존재 하에 단백질 분해성으로 된다.

새로운 가능성을 위해 상술한 방법에서 신호 프로브를 프로테아제 프로브로 대체할 수 있다. 프로테아제 프로브에 의해 인식되는 RNA를 발현하는 세포 내로 프로테아제 프로브를 형질감염시키면, 프로페아제 프로브는 그의 표적과 하이브리드화된다. 이는 하이브리드화된 상태에서 단백질 분해효소의 활성화를 발생시키고, 단백질 분해효소는 더 이상 그의 단백질 분해효소 저해제와 인접하지 않게 된다. 상기 프로테아제 프로브에 대한 표적이 존재 하고 인식되는 세포는 손상됨으로써 선별된다. 이러한 mRNA를 발현하지 않는 세포는 전혀 영향을 받지 않는다. 반대로, 프로테아제 프로브는 세포 증식 또는 생존성을 자극하거나, 이에 대해 이로운 영향을 주거나, 표적이 존재 하고 인식되는 세포에 대해 증식 이점을 부여하는 단백질분해 반응을 촉매하도록 디자인될 수 있다.

추가로, 프로테아제 프로브는 다양한 응용에 유용하다. 단백질 분해효소의 활성은 용이하게 측정될 수 있고, 나아가 특정 핵산 표적 서열의 존재 하에서 활성인 단백질 분해효소는 검출 목적 및 치료 목적으로 사용될 수 있으며, 여기에서 예를 들어, 세포 변환, 종양발생, 증식장애 등과 연관된 특정 유전자가 전사되면, 프로테아제 프로브가 전달된 세포는 단백질 분해되어 사멸하게 된다. 예를 들어, 일부 세포가 특정 바이러스에 의해 감염된 세포 혼합물에서, 특정 바이러스 mRNA를 표적화하는 프로테아제 프로브를 세포 내로 도입할 수 있다. 상기 mRNA를 보유하는 세포는 이들이 함유하고 있는 프로테아제 프로브의 단백질분해 활성을 활성화시키고, 이에 따라 상기 세포를 파괴한다.

바람직하게, 저해제와의 상호작용에 의해 효소를 가역적으로 저해하는 단백질 분해효소 저해제는 펩티드 또는 소형 화학물질이지만, 금속 및 금속 킬레이트를 포함하나 이들로 제한되지 않는 다른 분자가 또한 유용하다. 단백질 분해효소 및 단백질 분해효소 저해제의 유용한 쌍의 예는 아미노펩티다제 및 아마스타틴, 트립신-유사 시스테인 프로테아제 및 안티페인, 아미노펩티다제 및 베스타인, 키모트립신 유사 시스테인 프로테아제 및 키모스타틴, 아미노펩티다제 및 디프로틴 A 또는 B, 카복시펩티다제 A 및 EDTA, 엘라스타제-유사 세린 프로테아제 및 엘라스티날, 및 써모리신 또는 아미노펩티다제 M 및 1,10-페난트롤린을 포함하나 이들로 제한되지 않는다.

또한, 다른 상호작용 쌍이 도입된 프로브가 사용될 수 있고, 상호작용 쌍의 한 멤버는 목적 활성을 가지며, 다른 멤버는 표적에 프로브가 결합되지 않은 경우에 상기 활성을 억제하거나 감소시키는 작용을 한다. 표적에 결합되면, 상호작용 쌍의 억제제 멤버가 더 이상 목적 활성을 가진 멤버에 인접하지 못하게 되면서 프로브의 활성이 나타난다.

상술한 내용에 기초하여, 다음의 방법이 수행될 수 있다:

a) 적어도 하나의 RNA를 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 상기 적어도 하나의 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법.

상기 방법은 단리된 세포를 증식시켜 RNA 발현 세포주를 생성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. DNA 컨스트럭트가 형질감염된 세포의 게놈의 다른 위치에 삽입된다면, 다수의 세포주가 생성될 수 있다. 형질감염된 컨스트럭트의 게놈 통합이 게놈의 특정 지역으로 지시되지 않는다면, 통합은 무작위적으로 발생하므로, 각각의 양성 세포는 서로 상이할 것이며, 선별된 RNA에 대해 모두 양성인 다수의 상이한 세포주가 존재할 것이다. 또한, 예를 들어 불멸화, 1차, 줄기 및 생식 세포 또는 세포주와 같은 세포들의 혼합 집단내로 DNA 컨스트럭트가 도입되는 경우, 다수의 세포주가 생성될 수 있다. 또한, 세포는 HeLa, HEK 293T, Vero, Caco, Caco-2, MDCK, COS-1, COS-7, K562, Jurkat, CHO-K1, Huvec, CV-1, HuH-7, NIH3T3, HEK293, 293, A549, HepG2, IMR-90, MCF-7, U-2 OS 또는 CHO를 포함하나 이들로만 제한되지 않는 확립된 세포주로부터 유래될 수 있다. 임의로, DNA 컨스트럭트는 적어도 약물 내성 마커 또는 다른 선별 마커를 추가로 코딩할 수 있고, 상기 방법은 a) 단계 후에 선별 마커를 사용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단리된 세포를 별도로 증식시키거나, 풀링할 수 있다. 세포가 단리되면, 1 이상의 컨스트럭트 또는 1 이상의 발현 라이브러리로 형질감염되었는지에 따라, 단리된 세포를 서로 분리하여 증식시키거나, 풀링할 수 있다.

단리된 세포는 제2 RNA를 발현시키기 위해 추가로 제조될 수 있다. 동시 또는 순차적 방식으로, 제2 RNA를 코딩하는 제2 DNA 컨스트럭트로 세포 또는 세포주를 형질감염시키고; 상기 제2 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키며; 상기 RNA 또는 제2 RNA 중 적어도 하나 또는 둘 모두에 대해 신호를 나타내는 세포를 단리하는 추가 단계를 포함한다. 제1 신호 프로브는 제2 신호 프로브와 동일하거나 상이한 신호를 나타낼 수 있고, 예를 들어, 이들은 동일하거나 상이한 형광단일 수 있다. 둘 이상의 RNA를 발현하는 세포 또는 세포주는 상기 방법을 동시에 또는 순차적으로 반복하여 제조될 수 있다. 제2 DNA 컨스트럭트는 또한 동일하거나 상이한 약물 내성 또는 다른 선별 마커를 함유할 수 있다. 제1 및 제2 약물 내성 마커가 동일하면, 약물 수준을 증가시킴으로써 동시 선별을 수행할 수 있다. 발현 라이브러리를 형성하는 DNA 컨스트럭트를 이용하여 상기 방법을 동시에 또는 순차적으로 반복하여 다수의 세포주를 제조할 수 있고, 여기에서 적어도 세포의 일부는 상이한 RNA를 발현한다.

형질감염된 유전자와 결합된 태그 서열이 신호 프로브의 표적으로 사용되는 관련 방법이 제공되고, 이 방법의 한 적용예는, 예를 들어 신호 프로브가 밀접하게 관련된 RNA 종을 검출하는 경우, 백그라운드로부터 RNA를 동정하는 것이 어려운 세포의 선별을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은,

a) 적어도 하나의 RNA 및 적어도 하나의 태그 서열을 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 RNA가 아닌 태그 서열을 인식하도록 디자인된 신호 프로브가 사용된다는 점만을 제외하고, 전술한 방법과 실질적으로 동일하다. 앞의 방법과 비교하여 본 방법의 이점은 1 이상의 RNA를 발현하는 다수의 상이한 세포주를 제조하는데 있어, 상이한 태그 서열의 개수에 상응하는 소수의 신호 프로브만이 필요하다는 것이다. 임의로, DNA 컨스트럭트는 추가로 적어도 약물 내성 또는 다른 선별 마커를 코딩할 수 있고, 본 방법은 a) 단계 후에 적어도 하나의 약물 또는 상기 마커가 내성을 부여하는 다른 선택제에 대해 내성인 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단리된 세포를 별도로 증식시키거나, 풀링할 수 있다. 세포가 단리되면, 1 이상의 컨스트럭트 또는 1 이상의 발현 라이브러리로 형질감염되었는지에 따라, 단리된 세포를 서로 분리하여 증식시키거나, 풀링할 수 있다.

태그 서열은 신호 프로브에 의해 검출될 RNA 부분으로 발현되는 핵산 서열을 지칭한다. 신호 프로브는 프로브가 태그 서열에 상보적인 부분을 포함하도록 디자인함으로써 태그에 대해 지시될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있고 그에 대해 신호 프로브가 제조될 수 있는 태그 서열의 예는 제한없이 에피토프 태그의 RNA 전사물을 포함하고, 이는 HA(인플루엔자 헤마글루티닌 단백질), myc, his, 단백질 C, VSV-G, FLAG 또는 FLU가 예시되나 이들로 제한되지 않는다. 이들 및 다른 태그 서열은 당업자에게 공지되어 있고, 전형적으로 발현된 단백질 산물로 도입될 수 있는 아미노산 서열에 상응하며, 그들의 존재를 보고하는데 사용될 수 있는 로버스트(robust) 항체 또는 단백질 검출 시약의 사용에 기초하여 종종 선택된다. 본원에 개시된 태그 서열은 태그된 RNA에 의해 코딩되는 단백질 산물을 아미노산 수준에서 변형하거나, 상응하는 항체 또는 단백질 검출 시약을 사용하여 상기 변형된 단백질 생성물의 연속 검출을 보조하기 위해 사용될 수 있는 서열만을 의미하는 것은 아니다. 본원에 사용된 태그 서열은 적어도 신호 프로브에 의해 인식되는 유일한 핵산 서열을 제공한다. 신호 프로브는 다양한 RNA를 검출하기 위한 용도로 기재되어 있다. 이러한 RNA는 어떠한 것이라도 태그로 사용될 수 있다. 태그 서열을 코딩하는 컨스트럭트의 DNA 부분은 적어도 하나의 RNA의 단백질-코딩 부분을 코딩하는 DNA 컨스트럭트의 일부와 함께 동일한 골격에 위치하거나 위치하지 않을 수 있다. 따라서, 태그 서열은 신호 프로브에 의해 검출되도록 번역될 필요는 없다.

태그 서열은 신호 프로브에 대한 표적 부위로 작용하도록 디자인된 다수의 반복 서열을 포함할 수 있다. 이러한 태그 서열은 다수의 신호 프로브 표적 부위를 제공한다. 결과적으로, 많은 수의 신호 프로브가 결합할 수 있다. 이는 신호 프로브에 의해 검출되는 임의의 한 핵산 분자로부터 생성될 수 있는 총 신호를 증가시킴으로써, 신호 대 노이즈의 비를 증가시킨다.

프로브에 대한 표적 서열 이외에, 태그는 태그 발현 세포의 검출을 개선시키기 위해 디자인되거나, 동정되거나, 선별된 1 이상의 추가 서열("헬퍼(helper)" 또는 "헬퍼 서열"로 지칭)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 헬퍼는 태그의 폴딩, 편재화, 또는 2차, 3차 또는 4차 구조에 대한 효과를 포함하지만 이로 한정되지 않는 다수의 효과를 가질 수 있고, 이들 임의 효과 또는 조합 효과는 세포 내에서 표적 서열에 대한 검출을 향상시키거나 증가시키도록 작용한다. 헬퍼는 태그 폴딩 또는 구조에 영향을 주어, 표적 서열이 프로브 결합에 대해 보다 접근성으로 존재 하게 할 수 있다. 이는 변경된 염기-쌍에 의해 발생되거나, 헬퍼와 단백질 또는 다른 세포 또는 도입된 성분간의 결합 상호작용에 의한 것일 수 있다. 헬퍼는 이들을 포함한 서열의 폴딩 또는 구조를 안정화시키거나, 또는 보다 동적으로 만들 수 있다. 또한, 헬퍼는 프로브 결합전, 결합중 또는 결합후에 헬퍼를 포함하는 서열을 분해 측면에서 안정화시키고, 이러한 효과는 서열의 폴딩 또는 구조의 변화로부터 직접 발생되거나, 헬퍼 서열과 단백질 또는 세포 또는 도입된 성분과의 결합에 의해 발생될 수 있다. 또한, 예를 들어, 전사 개시 또는 프로세싱 효율을 증가시키거나, 전사의 미성숙 중지를 감소시키거나, 후-전사 프로세싱 효율을 증가시킴으로써, 헬퍼는 또한 그를 포함하는 서열의 전사를 증가시키는 작용을 할 수 있다.

헬퍼가 어떻게 그의 효과에 기여하는지와 관계없이, 헬퍼 동정에 기능적 접근법을 사용할 수 있고, 임의의 주어진 태그 및 상응하는 프로브에 대해 상이한 헬퍼 서열이 존재할 수 있다. 다수 세트의 태그 및 상응하는 프로브에 대해 작동하는 헬퍼 서열이 또한 기능적으로 동정될 수 있다.

예를 들어, 유전자 서열 및 태그 서열(가변 서열이 유전자와 태그 서열 사이에 삽입된다)을 포함하는 발현 라이브러리를 작제함으로써, 헬퍼로 작용하는 서열을 동정하기 위해 가변 서열을 시험할 수 있다. 유전자가 중지 코돈을 가지는 경우, 가변 서열이 중지 코돈의 하류에 삽입될 수 있다. 추가 가변 서열이 다른 부위에 삽입될 수 있다. 그 후, 발현 라이브러리를 세포 내로 도입하고, 표적 서열에 대한 신호 프로브를 도입함으로써 상기 세포를 분석한다. 상기 조절에서 증가된 신호를 나타내는 세포를 검출한다[여기에서, 대조 신호는 대조 세포 또는 대조 발현 컨스트럭트(예를 들어, 유전자 및 태그 외에 다른 추가 가변 서열을 포함하지 않는 서열)가 도입된 세포에 의해 나타내어지는 신호가다]. 이러한 세포는 예를 들어 FACS에 의해 단리될 수 있고, 상기 세포에 의해 나타내어지는 가변 서열은 단리 후, 경우에 따라 추가로 특성이 조사될 수 있다. 이러한 접근법은 사용되는 유전자, 태그 및 상응하는 신호 프로브의 특정 조합에 대해 헬퍼 서열로 작용하는 서열을 검출하거나 동정하는데 사용될 수 있다. 실질적으로 동일한 접근법이 상응하는 신호 프로브에 대해 적어도 표적 서열을 포함하는 임의의 서열에 대한 헬퍼 서열을 발견하는데 사용될 수 있다(즉, 가변 서열 및 표적 서열 외에 예를 들어 유전자를 포함하지 않는 발현 라이브러리, 유전자, 표적 서열 자체 및 가변 서열 외에 태그 서열을 포함하지 않는 발현 라이브러리가 각각 적절한 헬퍼를 검출하는데 사용될 수 있다).

이 방법에 의해 검출되거나 동정된 헬퍼 서열의 이점은 사용되는 서열 조건에 대해 특이적일 수 있다는 것이다(즉, 특이적 태그, 유전자, 표적 서열 또는 상응하는 프로브). 다양한 서열 조건에 대해 폭넓은 이점을 가지는 보다 다목적의 헬퍼 서열은 예를 들어 상술한 방법에 따라 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 가변 서열에 대한 선별을 반복하여 수행할 수 있고, 헬퍼 서열로 작용하는 가변 서열은 각 라운드에서 단리된 뒤, 다음 라운드에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 이 경우에, 시험을 위한 각 후속 라운드는 발현 벡터를 제조함으로써 수행될 수 있고, 여기에서 종전 라운드로부터 단리된 서열은 제1 라운드의 발현 컨스트럭트에 사용된 것과 상이한 유전자 또는 태그 또는 표적 서열을 포함하는 발현 컨스트럭트를 제조하는데 사용될 것이다. 본원에 개시된 방법은 또한 주어진 다양한 서열 조건에 대한 다목적 헬퍼 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 다목적 또는 보편적인 헬퍼 서열을 동정하는 것은 세포에서 다양한 서열의 검출을 일조하는데 도움이 될 수 있다.

가변 서열에 대한 기원중 하나는 게놈 서열이다. 게놈 서열을 제한 효소로 소화시킴으로써, 발현 라이브러리를 생성하는 클로닝을 위해 얻을 수 있는 다양한 크기의 단편을 얻을 수 있다.

신호 프로브 결합에 대한 태그 서열을 최적으로 제시할 목적으로, 태그 서열은 예측되거나 실험적으로 결정된 2차 구조를 특정 정도로 나타내도록 선택되거나 디자인될 수 있다. 이와 같이, 태그 서열은 적어도 하나의 신호 프로브가 지시된 서열을 적어도 포함하고, 태그 서열은 신호 프로브와 직접 상호작용하지 않도록 선택되거나 디자인된 추가 서열을 추가로 포함한다. 구조적 적응에 따라 가능한 태그 서열을 디자인하는데 핵산 폴딩 추정 알로리즘이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 Nucleic Acids Res . 31:3429-3431 (2003)를 참조하라. 핵산 폴딩 추정 알고리즘은 주어진 서열에 대해 에너지적으로 가장 안정한 다수의 구조를 종종 예측한다. 별도로, 예를 들어 소화된 게놈 DNA를 포함하나 이로만 제한되지는 않는 가변 핵산 서열을 제시하는 서열 라이브러리는 서열이 신호 프로브에 의한 태그 서열의 검출을 돕는지를 결정하거나 동정하기 위해 분석될 수 있다. 이는 태그 서열을 동정하거나 단리하기 위한 기능적 접근법을 제시한다. 이러한 것은 적어도 신호 프로브에 인식되도록 선택되거나 디자인된 공통 서열, 및 적어도 가변 서열을 포함하는 발현 라이브러리를 제조함으로써 이룰 수 있다. 이러한 발현 라이브러리로 세포를 형질감염시킨 뒤, 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키고, FACS로 가장 양성인 세포를 단리할 수 있다. 그 후, 이들 세포에 의해 제시되는 가변 서열을 단리할 수 있다. 예를 들어, PCR 기술에 의해 단리된 세포로부터 상기 서열을 직접 증폭한 뒤, 증폭 산물을 클로닝할 수 있다. 별도로, 단리된 세포를 용해시켜 단리된 세포 내 발현된 가변 서열에 상응하는 DNA 컨스트럭트를 방출시키고, 생성된 물질로부터 이들 컨스트럭트 또는 벡터를 단리 및 증식시킬 수 있다. 예를 들어, 컨스트럭트가 플라스미드 벡터인 경우에, 경쟁 박테리아 세포를 용해 물질로 형질전환시킨 뒤, 박테리아 숙주를 이용해서 플라스미드를 단리 및 증폭시킬 수 있다. 다수의 반복 서열 단위를 포함한 태그 서열과 관련하여, 태그 서열을 포함하는 분자에 존재하는 반복 단위 및/또는 다른 서열간의 상호작용 잠재성으로 인해, 이들 각 단위가 동일한 구조를 채용할 필요는 없다. 임의로 주어진 태그 서열의 구조는 그의 서열 조건에 의해 영향을 받을 수 있다.

일례로, 태그 서열은 역-vav RNA로부터 유래된다. 일례로, 태그 서열은 3-암 접합 구조를 형성한다(도 36). 일례로, 태그 서열은 10-100, 80-100, 90-100, 80-120, 100-2Kb, 2Kb-15Kb의 뉴클레오티드 길이를 가진다. 일례로, 표적 서열은 제1 스템-루프 영역의 스템의 3' 측의 전부 또는 일부로부터, 제1 및 제2 스템-루프 영역 사이의 결합, 제2 스템-루프 영역의 스템의 5' 측의 전부 또는 일부까지의 영역이다(도 36).

일례로, 스템 영역은 8-9개의 염기쌍을 포함하고, 제1 스템-루프 영역은 4-6개의 염기쌍을 포함하며, 제2 스템-루프 영역은 13-17개의 염기쌍을 포함한다(도 37). 일례로, 3개 암의 스템 영역은 비-상보적인 영역을 포함한다. 일례로, 스템 영역 및 제1 스템-루프 영역의 스템은 하나의 미스매치 영역을 추가로 포함하고, 제2 스템-루프 영역은 2-7개의 미스매치 또는 벌지 영역을 추가로 포함한다. 일례로, 스템 영역간의 결합은 총 8-12개의 뉴클레오티드를 가진다(도 37). 일례로, 태그 서열은 도 42 A, B 또는 C에 따른 구조 또는 서열을 포함한다. 일례로, 태그 서열은 도 42 A, B 또는 C에 따른 서열로부터 추정되는 에너지적으로 보다 바람직한 구조를 가진다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 소정의 RNA 및 상술된 태그 서열을 코딩하는 적어도 하나의 DNA를 포함하는 DNA 컨스트럭트를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 DNA 컨스트럭트를 포함하는 벡터 및 세포를 제공한다.

다른 구체예로, 세포주는 적어도 제2 RNA를 발현하도록 제조될 수 있고; 제2 RNA, 제2 태그 서열 및 임의로 제2 선별 마커(예를 들어, 약물 내성 마커)를 코딩하는 제2 DNA 컨스트럭트로 세포주를 형질전환시키는 단계; 임의로, 제2 마커를 전사하는 세포를 선별하는 단계; 제2 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계; 및 제1 및 제2 태그 서열의 둘 다 또는 적어도 하나의 신호를 나타내는 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 두 개의 RNA의 경우, 제2 태그 서열을 코딩하는 DNA 서열의 일부는 또한 제2 RNA의 단백질-코딩 부분을 코딩하는 DNA 서열의 일부와 함께 동일한 골격에 위치하거나 위치하지 않을 수 있다. 제2 RNA는 제1 RNA와 동시에 또는 순차적으로 형질감염될 수 있다. 본 방법이 동시에 수행되고, 동일한 선별 마커(예를 들어, 약물 내성 마커)가 양 컨스트럭트에 사용되는 경우, 고수준의 약물 또는 적절한 선택제가 양 컨스트럭트를 모두 발현하는 세포를 선별하는 데 사용될 수 있다. 더우기, 상기 언급된 단계를 반복함으로써 세포주내에 2 이상의 RNA를 제공할 수 있다.

발현 라이브러리를 형성하는 DNA 컨스트럭트를 사용하여, 동시 또는 순차적인 방식으로 상기 단계를 반복함으로써 다수의 세포주를 생성할 수 있다. 일례로, 발현 라이브러리는 단일 태그 서열을 사용하고, 태그 서열에 상보적인 동일 신호 프로브에 세포를 노출시킨다. 다른 구체예로, 다른 발현 라이브러리는 다른 태그 서열을 사용할 수 있다. 일례로, 각 세포주는 하나의 RNA를 발현하다. 또다른 구체예로, 각 세포주는 복수개의 RNA를 발현한다. 이는 세포를 다수의 DNA 컨스트럭트로 동시에 또는 순차적으로 형질감염시킴으로써 이룰 수 있다. 다수의 DNA 컨스트럭트에 의해 안정하게 형질감염된 세포를 얻을 가능성은 형질감염에 사용되는 DNA 컨스트럭트를 고농도로 도입함으로써 증가시킬 수 있다. 또한, 다수의 DNA 컨스트럭트를 가지는 세포를 얻기 위해, 출발 세포는 이미 제1 DNA 컨스트럭트에 의해 형질감염된 것일 수 있다. 또한, 세포를 형질감염시키기 위해 다수의 상이한 발현 라이브러리를 사용할 수 있다. 각 라이브러리는 상응하는 신호 프로브를 사용하여 검출되는 상이한 태그 서열을 포함할 수 있다. 각 발현 라이브러리는 선별 마커, 예를 들어, 약물 내성 유전자를 포함할 수 있다.

단리된 세포는 개별적으로 단리되거나 풀링될 수 있다. 개별적으로 단리되거나 풀링한 세포를 증식시켜 세포 집단을 만들 수 있다. 세포주는 단리된 세포를 개별적으로 증식시킴으로써 제조될 수 있다. 개별 또는 다수의 세포주는 개별적으로 단리되거나 풀링될 수 있다. 세포주 풀이 목적 활성을 나타내는 경우, 이러한 효과를 가지는 세포주 또는 세포주 세트가 동정될 때까지 추가로 분획화할 수 있다. 이는 각각을 별도로 단리하여 유지할 필요가 없으므로 대량의 세포주 유지를 손쉽게 한다.

a) RNA 및 제1 태그 서열을 코딩하는 제1 DNA; 및 상기 RNA 및 제2 태그 서열을 코딩하는 적어도 하나의 제2 DNA를 세포 내로 도입하는 단계(여기에서, 제1 및 제2 태그 서열은 상이하다);

b) 제1 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브, 및 제2 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 적어도 하나의 상기 신호 프로브의 신호를 나타내는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, RNA를 과다발현하는 세포주를 발생시키는 또다른 방법이 제공된다.

상기 방법은 RNA를 발현하거나 과다발현하는 세포주를 생성하기 위해 단리된 세포를 증식시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. DNA 컨스트럭트가 형질감염된 세포의 게놈중 다른 위치에 통합될 수 있다면, 다수의 세포주가 생성될 수 있다. 형질감염된 컨스트럭트의 게놈 통합이 게놈상의 특정 위치로 지시되지 않는다면, 통합은 무작위로 발생하므로, 각각의 양성 세포는 서로 상이할 것이고 선별된 RNA에 대해 모두 양성인 다수의 상이한 세포주가 존재할 것이다. 임의로, DNA 컨스트럭트는 적어도 선별 마커, 예를 들어 약물 내성 마커를 추가로 코딩할 수 있고, 본 방법은 단계 a) 이후에 선별 마커를 이용하여 세포를 선별하는 단계, 예를 들어 상기 마커가 내성을 부여하는 적어도 하나의 약물에 대해 내성인 세포의 선별 단계를 추가로 포함할 수 있다. 세포가 단리되면, 1 이상의 컨스트럭트 또는 1 이상의 발현 라이브러리로 형질감염되었는지에 따라, 단리된 세포를 상호 분리하여 증식시키거나 풀링할 수 있다.

일례로, 세포는 안티센스 또는 siRNA 또는 shRNA 또는 단백질을 발현한다. 추가로, 특정 단백질(들)을 발현하도록 제조된 세포는 단백질 및 안티센스 RNA 분자를 발현하는 세포를 제조하기 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 당연히, 안티센스 또는 siRNA 또는 shRNA 분자를 발현하는 세포는 본원에 개시된 방법을 이용하여, 추가 단백질을 코딩하는 추가 RNA를 부가하기 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 상응하는 신호 프로브 및 경우에 따라 태그 서열에 의한 단백질 및 안티센스 또는 siRNA 또는 shRNA 분자를 코딩하는 RNA의 동시 형질감염이 또한 수행될 수 있다. 상술한 방법의 다양한 조합이 본원에 포함된다.

유사하게,

a) 적어도 하나의 RNA를 발현할 것으로 예상되는 세포를 제공하는 단계;

b) 적어도 하나의 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

c) 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 방법이 제공된다.

상기 방법은 또한 그의 표적 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브를 사용하여 제2 RNA를 또한 발현하는 세포의 동정에 사용될 수 있고, 제1 및 제2 신호 프로브 각각 또는 이들 둘 다의 형광을 가지는 세포가 단리된다. 2 이상의 RNA의 동시 발현이 또한 성취될 수 있다. 세포가 단리되면, 1 이상의 컨스트럭트 또는 1 이상의 발현 라이브러리로 형질감염되었는지에 따라, 단리된 세포를 상호 분리하여 증식시키거나, 풀링할 수 있다.

a) 적어도 하나의 외인성 RNA를 코딩하는 DNA를 세포 내로 도입하는 단계(여기에서, 상기 세포는 잠재적으로 적어도 하나의 내인성 RNA를 발현할 수 있다);

b) 적어도 하나의 외인성 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 제1 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계;

c) 적어도 하나의 내인성 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제2 신호 프로브에 적어도 세포를 노출시키는 단계(여기에서, 제2 신호 프로브는 제1 신호 프로브와 상이한 신호를 생성한다); 및

d) 신호 프로브가 그들 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 적어도 하나의 상기 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 외인성 RNA 및 하나의 내인성 RNA를 발현하는 세포를 단리하는 또다른 방법이 제공된다.

상기 두 방법은 상기 단리된 세포를 증식시켜 적어도 하나의 외인성 RNA 및 적어도 하나의 내인성 RNA를 발현하는 세포주 또는 다수의 세포주를 발생시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이들 방법은 단백질, 예를 들어 세포 표면-편재 단백질, 세포 내 단백질, 분비 단백질 또는 다른 단백질을 발현하는 RNA에 유용하다. 이들 방법은, 보다 어렵거나 추가 실험이 불가능하도록 세포에 영향을 주는, 단백질 자체에 프로브의 사용을 요구하지 않는다. 다수의 신호 프로브를 사용하여, 단백질을 코딩하는 복수개의 RNA를 단리에 사용되는 기술에 의해 동시에 검출가능한 수까지 동정할 수 있다. 임의로, DNA 컨스트럭트는 적어도 선별 마커, 예를 들어 약물 내성 마커를 추가로 코딩할 수 있고, 본 방법은 단계 a) 이후에 선별 마커를 사용하여 세포를 선별하는 단계, 예를 들어 상기 마커가 내성을 부여하는 적어도 하나의 약물에 대해 내성인 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 단리된 세포를 별도로 분리하여 증식시키거나 풀링할 수 있다. 세포가 단리되면, 1 이상의 컨스트럭트 또는 1 이상의 발현 라이브러리로 형질감염되었는지에 따라, 단리된 세포를 서로 분리하여 증식시키거나, 풀링할 수 있다.

상기 방법에서, 일례로, 세포는 동물에 이식될 수 있다. 일례로, 신호 프로브는 형광 발생 프로브이고, 상기 RNA를 발현하는 세포는 형광을 발한다. 형광을 방출하는 세포를 단리하는 것은 형광 활성화 세포 분류 기술 또는 형광에 기초하여 세포를 단리하는데 사용될 수 있는 임의의 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 일례로, 두 개의 신호 프로브가 RNA 또는 태그 서열을 표적화하는데 사용된다. 제1 프로브의 형광단은 제1 프로브의 것과 동일하거나 상이할 수 있다. 두 개의 형광단이 상이한 경우에, 이들은 유사하거나 다른 방출 파장을 가질 수 있다. 현재, FACS 기술은 분류 과정 동안 상이한 형광단을 최대 7개 까지 검출할 수 있다. 상기 방법은 7개 이하의 상이한 단백질의 발현을 얻기 위해 동시에 반복될 수 있다. 경우에 따라, 7개의 상이한 단백질을 발현하는 세포주는 상기 절차후 더 많은 단백질을 도입시키기 위한 출발점으로 사용될 수 있다. FACS 기술이 발전함에 따라, 더 많은 수의 신호를 해석할 수 있고, 당업자는 FACS를 한번 적용함으로써 더 많은 수의 RNA를 가진 세포를 선별할 수 있다.

당연히, 상기 언급된 방법은,

a) RNA 전사물과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 제1 신호 프로브에 생물학적 샘플을 노출시키는 단계;

b) 생물학적 샘플에서 신호 수준을 정량하는 단계; 및

c) 신호 수준을 적어도 하나의 mRNA 전사물과 상호 연관시키는 단계

를 포함하는, 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 RNA 전사 발현 수준을 정량하는데 사용될 수 있다.

생물학적 샘플은 세포 샘플, 조직 샘플 또는 이들로부터 유래된 제제일 수 있고; 이들은 동결 및/또는 예를 들어, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 또는 신호 프로브를 사용하는 RNA 검출을 방해하지 않는 다수의 공지된 세포 고정제에 의해 고정될 수 있다. 세포 샘플의 제제는 아세포 기관 또는 구역, 미토콘드리아, 세포 기관, 아세포 단편, 세포 내부 또는 세포 외부 물질의 형질막, 막 제제, 이들 중 1 이상으로부터 유래된 핵산 제제, 이들 중 1 이상에 존재하는 임의의 바이러스 또는 다른 바이러스 또는 유기체의 제제, 또는 이들의 어떠한 조합도 포함하나 이들로 제한되지 않는다.

형광 발생 프로브의 일례로, 형광은 형광 현미경 또는 형광-활성화 세포 분류 기술에 의하여 정량될 수 있다. 제2 RNA 전사물에 하이드리드화되는 경우 형광을 나타내는 제2 신호 프로브를 사용함으로써, 추가 RNA 종이 동시에 정량(즉, 정량화)될 수 있다. 상기 방법은 세포 내 과정, 상태 또는 조성을 검출하기 위해 형광 발생 리포터를 사용하는 방법과 동시에 사용될 수 있다. 상기 형광 방법은 TUNEL, 아폽토시스(apoptosis), 괴사, Ca ^{2 +} /이온 플럭스, pH 플럭스, 면역 형광, 기관 표지, 세포 부착, 세포 주기, DNA 함량을 포함하나 이들로 제한되지 않고, 상기 방법은 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-RNA 사이의 상호작용을 검출하기 위해 사용된다. 상기 분석에 사용하기 위해 형광 표지될 수 있는 시약은 단백질(형광 분자 또는 자가형광 단백질으로 표지된); 형광 대사 지시제(C12 레사주린, 세포 분열을 위한 CFSE); 형광 기질 또는 부산물; 형광 표지된 렉틴; 형광 화학물; 케이지된 형광 화합물; 형광 핵산 염료; 형광 중합체, 리피드, 아미노산 잔기 및 뉴클레오티드/사이드 유사체를 포함하나 이들로 제한되지 않는다.

안티센스 또는 siRNA 분자를 세포 내로 도입하는 것은 세포로부터 1 이상의 단백질 또는 RNA 수준을 기능적으로 감소시키거나 제거하는데 유용하다. 상기 방법에 따라, 각각 상술한 방법에 따라 제공되는 예비 선별 단백질 또는 RNA에 대한 다수의 안티센스 또는 siRNA를 세포 내에 제공하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 예비 선별 단백질 또는 RNA의 발현에 기능적으로 효력이 없거나 발현 수준이 감소된 세포를 단리하거나 제조하는 방법이 제공되고, 상기 다수의 안티센스 또는 siRNA는 실질적으로 적어도 하나의 예비 선별 단백질 또는 RNA의 mRNA 전사물의 전부 또는 그와 충분한 수준으로 결합한다. 예비 선별 단백질은 택일적으로 스플라이싱된 형태의 유전자 산물일 수 있다.

유사한 방식으로, 배아 줄기 세포를 사용하여 상술된 단계를 수행하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 예비 선별 단백질 또는 RNA에 대해 기능적으로 발현 효력이 없는 돌연변이이거나, 적어도 하나의 예비 선별 단백질 또는 RNA를 감소된 수준으로 발현하는 형질전환 동물의 제조방법, 및 상기 형질전환 동물을 제조하기 위해 생 배아 줄기 세포를 사용하는 방법이 제공된다.

유사하게, 동일한 세포에 대해 본원에 개시된 방법을 수행하는 것을 포함하는, 적어도 하나의 단백질 또는 RNA 발현에 대해 기능적으로 효력이 없거나 그 수준이 감소되었거나, 또는 적어도 하나의 다른 단백질 또는 RNA를 과다발현하는 세포를 단리하거나 세포주를 제조하는 방법이 제공된다. 유사한 방식으로, 유도 프로모터의 조절 하에 치사 안티센스 또는 siRNA, 또는 전사 수준의 조절을 발생시키는 다른 결합 또는 기능적 활성을 가지는 서열을 발현하는 세포주의 생성방법이 제공된다. 상기 방법은 본원의 방법을 수행함으로써 성취될 수 있고, 형질감염 단계는 최소량의 유도제 또는 화합물의 존재 하에 수행된다.

따라서, 본 발명은,

a) 적어도 제1 단백질 및 적어도 제1 태그 서열을 코딩하는 적어도 하나의 RNA를 코딩하는 적어도 제1 DNA; 및 적어도 하나의 RNA 및 적어도 제2 태그 서열을 코딩하는 적어도 제2 DNA를 세포 내로 도입하는 단계(여기에서, 상기 제1 및 제2 태그 서열은 상이하다);

b) 상기 적어도 제2 단백질 mRNA의 전사물에 결합하거나 이들 전사물을 방해하는 적어도 하나의 안티센스 RNA 또는 siRNA를 코딩하는 적어도 하나의 DNA를 세포 내로 도입하는 단계;

c) 적어도 하나의 제1 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 제1 신호 프로브, 또는 적어도 제2 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 제2 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계;

d) 적어도 하나의 안티센스 RNA 또는 siRNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계; 및

e) 상기 신호 프로브가 그들 각각의 RNA와 하이브리드화하는 경우 적어도 하나의 신호를 생성하는 세포를 단리하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 제1 단백질을 과다발현하고 적어도 제2 단백질에 대해 기능적으로 효력이 없거나 발현이 감소된 세포를 단리하는 방법을 제공한다.

다른 구체예로, 본 발명은,

a) 개별 화합물 또는 화합물 세트를 세포에 첨가하는 단계;

b) 적어도 하나의 예비 선별 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계;

c) 상기 세포의 신호 수준을 정량하는 단계;

d) 화합물이 첨가되지 않은 세포의 신호와 비교하여, 신호의 증가 또는 감소를 나타내는 세포를 정량하는 단계; 및 임의로

e) 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절하는 화합물을 검출하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다.

일례로, 상기 예비 선별 RNA는 세포 게놈에 의해 코딩된다. 일례로, 상기 예비 선별 RNA는 세포로 형질감염되는 DNA 컨스트럭트에 의해 단계 a) 이전에 코딩된다. 일례로, 형질감염된 세포는 상기 RNA를 인식하도록 디자인된 신호 프로브에 노출되고, 상기 세포는 상기 RNA를 발현한다. 일례로, DNA 컨스트럭트는 프로모터 또는 오퍼레이터를 포함하고 억제제, 인핸서, 또는 전사 조절 서열을 코딩한다. 일례로, 예비 선별 RNA는 태그 서열에 연결되고, 신호 프로브는 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성한다.

일례로, 본 발명은,

a) 잠재적으로 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절할 시험 RNA 서열을 코딩하는 적어도 하나의 컨스트럭트를 세포 내로 도입하는 단계;

b) 적어도 하나의 예비 선별 RNA와 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 적어도 하나의 신호 프로브에 상기 세포를 노출시키는 단계;

c) 상기 세포의 신호 수준을 정량하는 단계;

d) 시험 RNA 서열이 없는 세포의 신호와 비교하여, 신호의 증가 또는 감소를 나타내는 세포를 선별하는 단계; 및 임의로

e) 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절하는 시험 RNA 서열을 동정하는 단계

를 포함하는, 적어도 하나의 예비 선별 RNA의 전사를 조절하는 RNA 서열을 동정하는 방법을 제공한다.

이들 세포는 단리되어 세포주로 증식될 수 있다. 이들은 별도로 단리되거나 풀링될 수 있다. 전사 조절은 예비 선별 RNA의 하류 상향 또는 하향 조절일 수 있다. 일례로, 상기 예비 선별 RNA는 게놈에 의하여 코딩된다. 예비 선별 RNA는 세포로 형질감염된 DNA 컨스트럭트에 의해 단계 a) 이전에 코딩된다. 일례로, 형질감염된 세포는 상기 RNA를 인식하도록 디자인된 신호 프로브에 노출되고 상기 세포는 상기 RNA를 발현한다. 일례로, 예비 선별 RNA는 태그 서열에 연결되고, 상기 신호 프로브는 상기 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성한다. 일례로, RNA 서열의 발현 라이브러리가 전사를 조절하는 RNA 서열을 동정하기 위해 사용된다. 일례로, 시험 RNA 서열은 태그 서열에 연결된다. 단계 a)후, 적어도 RNA 서열 또는 태그 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 세포를 단계 b) 이전에 노출시킴으로써 단계 e)가 촉진된다. 시험 RNA 서열 또는 그의 태그 서열에 대해 지시된 신호 프로브에 의해 생성된 신호는 예비 선별 RNA에 대해 지시된 신호 프로브와 상이할 수 있으므로, 세포를 상이한 신호 프로브에 동시 노출시킬 수 있다.

또한, 본 발명은,

a) 재조합 서열의 전사물과 비-재조합 서열의 전사물로 이루어진 군으로부터 선별된 RNA 서열과 하이브리드화하는 경우 검출가능한 신호를 생성하는 신호 프로브에 세포를 노출시키는 단계; 및

b) 상기 RNA 서열을 발현하는 세포를 검출하는 단계

를 포함하는, 생존 세포에서 유전자 재조합을 확인하는 방법을 제공한다.

세포 검출 및/또는 분류는 FACS 또는 형광 현미경에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 본 발명을 예시할 목적으로 주어지는 이후 비제한적인 실시예를 참조로 하여 보다 잘 이해될 수 있다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 보다 상세히 설명하기 위하여 제공된다. 그러나, 이들을 본 발명의 광범위 영역을 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석하여서는 안된다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 등가적인 방법 및 물질이 또한 본 발명을 실시 또는 시험하기 위해 사용될 수 있다.

17. 세포 내로의 신호 프로브의 도입을 유도 또는 향상시키거나, 표적 검출을 증강시키기 위한 시약 또는 화합물의 확인

단백질, 리피드, 중합체, 추출물 또는 화합물, 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이들에만 한정되지 않는 다양한 화학물질을 시험하여 세포 내로 신호 프로브를 도입하기 위해 사용될 수 있는 시약을 확인할 수 있다. 화학물질은 가스, 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 이는 화학물질을 유기 및 수성 용매, 완충 용액 또는 매질 또는 이들의 임의 배합물을 포함하나 이들로만 한정되지 않는 여러 용매내에서 신호 프로브와 1:1,000,000,000 내지 1,000,000,000:1의 다양한 비로 혼합하고, 혼합물을 0℃ 이하 내지 100℃를 초과하는 다양한 온도의 조건 하에서 다양한 정도로 교반하거나, 또는 진탕하지 않는 정도로부터 온화하게 진탕하는 정도에 이르기까지 다양하게 또는 진동 내지 와동시키거나 또는 일정하게 피펫팅하여 광 조건에서 또는 암흑하에 또는 그밖의 다른 다양한 환경 조건으로 1분 내지 48시간의 다양한 시간 동안 배양하여 수행할 수 있다. 이어서, 혼합물을 세포에 적용하고, 프로브 전달을 형광 현미경, 형광 플레이트 판독기 기술 또는 FACS 또는 다른 형광 검출 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 이는 예를 들어 후속한 고출력 분석에 적합한 96,384 또는 1536개의 웰 플레이트내 또는 비드상에서 수행될 수 있다. 비드를 사용하는 경우, FACS를 사용하여 비드를 분석 또는 단리할 수 있으며, 이들이 추가로 코딩되는 경우, 처리된 혼합물의 아이덴티티를 결정하기 위해 분리 비드를 사용할 수 있음에 주목하기 바란다.

사용된 세포는 생존 세포 또는 고정 세포일 수 있으며, 조직 배양 플레이트 또는 비드가 예시되나 이들에 한정되지 않는 고체 표면에 부착된 상태로 제공될 수 있거나, 현탁액일 수 있다. 혼합물을 첨가하기 전에 세포를 각종 완충액 또는 용액을 사용하여 세척할 수 있다. 시약을 세포에 적용한 후, 반응물을 교반 혼합 정도를 달리하여 광 또는 암흑하에 또는 그밖의 다른 다양한 환경 조건 및 여러 온도에서 다양한 시간 동안 배양할 수 있으며, 여기에서 이들 파라미터는 모두 상술된 것으로서, 예컨대 세포 생존성이 유지되어야 한다면 상기 파라미터는 제한될 수 있다. 배양후, 세포를 직접 분석할 수 있거나, 분석전에 상술한 바와 같이 세척할 수 있다.

상술된 방법은 신호 프로브 또는 구성적으로 활성인 프로브를 사용하여 수행될 수 있다(예컨대 형광 발생 프로브의 경우, 퀀처가 없는 프로브가 사용될 수 있다). 또한, 시험할 각 혼합물을 복수개의 세포 샘플을 사용하여 시험할 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 사용된 신호 프로브 표적을 포함하는 것으로 알려진 세포뿐 아니라 대조 세포를 사용하여 시험될 수 있다. 다수의 세포 타입은 혼합된 상태 또는 단리된 상태로 제공될 수 있다. 바람직한 혼합물은 신호 대 노이즈를 증가시키는 것, 예를 들어 대조 세포에 대한 표적을 포함하는 세포 내 신호를 증가시키는 것일 수 있다.

유사하게, 혼합물에 세포가 첨가된 것을 제외하고 실질적으로 동일한 방법이 실시될 수 있다. 예를 들어, 시험될 혼합물을 먼저 시험 챔버, 이를테면 96,384 또는 1536개의 웰 플레이트 또는 비드에 적용하고, 이어서 세포를 적용할 수 있다. 세포를 플레이팅 혼합물에 직접 첨가할 수 있거나, 혼합물을, 예컨대 건조, 가열 또는 증발에 의해 처리한 후 첨가할 수 있다.

관련 방법으로, 화합물을 신호 프로브를 사용하여 세포 내에서 표적 검출 향상 능력에 대해 시험할 수 있다. 이 경우, 신호 프로브를 먼저 세포 내로 도입할 수 있으며, 이때 세포는 표적을 포함하는 것으로 알려진 세포 및 대조 세포 둘 다를 포함할 수 있다. 이어서, 상술된 화학물질 및 가변 조건 및 상술된 파라미터를 사용하여 신호를 향상시키는 그의 능력을 분석할 수 있다. 이 경우 사용된 화학물질은 신호 프로브와 혼합되지 않음에 주목해 주기 바란다. 바람직한 화학물질은 신호 대 노이즈 비의 증가를 검출 또는 확인하기 위한 것, 예를 들어 대조 세포에 대한 표적을 포함하는 세포에서의 신호를 증가시키는 것일 수 있다. 이러한 방법을 이용하여 확인된 화학물질은 세포질내 신호 프로브의 전달을 증가시키거나, 프로브에 의한 검출이 향상되도록(예컨대 표적 접근성을 증가시켜) 표적의 폴딩 또는 구조에 영향을 미치거나, 비특이적 백그라운드 신호를 감소(예를 들어 세포 표면밖에 부착된 신호 프로브의 양을 감소시켜) 시키는 것을 포함하나, 이들에만 한정되지 않는 다수의 메카니즘으로 작용할 수 있다.

각각 표적을 포함하는 것으로 알려진 세포에 적용되는 시험 및 대조 신호 프로브를 사용하고 시험 신호 프로브를 사용하는 경우 대조 신호 프로브에 비해 신호를 증가시키는 화학물질을 분석하여, 세포 내로 신호 프로브를 도입하기 위하여 사용될 수 있거나 표적 검출을 증강시키기 위해 사용될 수 있는 신호 대 노이즈 비를 증가시키는 작용을 하는 화학물질을 또한 검출할 수 있다.

실시예 1

일반적인 프로토콜

출발물질:

신호 프로브를 DNA 컨스트럭트로부터 어떠한 RNA도 발현하지 않는 세포 내로 도입할 수 있거나, 이들을 DNA 컨스트럭트로부터 코딩된 RNA 메시지를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 이들 두 타입의 세포 중 어느 하나에 신호 프로브를 도입하는 방법은 동일하다. 하기 프로토콜은 분석할 세포가 상호 분리가능하고 FACS에 의해 분석될 수 있어야 한다는 점만을 필요로 한다.

1) 본 발명의 명세서를 통해 보다 상세히 기술된 바와 같이, 특이적 RNA 세포 내에서 발현을 나타내지 않거나 발현에 기초하여 조직 세포를 분류하기 위하여, 신호 프로브를 FACS와 함께 사용할 수 있다. 이를 위해, 세포를 먼저, 균질화 및 추가 화학 처리와 같은 익히 확립된 표준 방법으로 상호 분리한다. 그후, 하기 프로토콜에 따라 적절한 신호 프로브를 상기 세포 내로 도입할 수 있다.

2) 이어서, 신호 프로브를 사용하여 세포 집단에 형질감염된 DNA 컨스트럭트에 의해 코딩된 특정 RNA를 발현하는 세포를 선별할 수 있다. 이를 위해, 먼저, 세포 배양물에 목적 RNA를 코딩하는 DNA 컨스트럭트(들)를 형질감염시킨다. 그후, 본 발명의 명세서에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 이들 RNA를 인식하기 위한 신호 프로브를 생성시킬 수 있다. 세포에 DNA 컨스트럭트의 형질감염은 생명공학 회사(Qiagen, Promega, Gene Therapy System, Invitrogen, Stratagenc 등)로부터 입수한 시약 또는 키트 자체를 제조업자의 지시에 따라 사용하는 것을 포함하나, 이로만 한정되지 않는 다양한 방법으로 이룰 수 있다. 각각 항생제 내성을 부여하도록 DNA 컨스트럭트를 선별한다. 이들 DNA 컨스트럭트를 세포에 형질감염시키고, 단시간 동안(보통 24시간) 세포를 회수한 후, DNA 컨스트럭트가 항생제 내성을 부여한 세포만이 생존할 수 있도록 세포를 적절히 항생제 처리한다. 이는 일반적으로 사용한 세포 타입 및 항생제에 따라 3 내지 4일이 소요되며, 때로는 이보다 길다.

시험 결과, 세포 풀이 잔류하고, 이들 모두 항생제 내성을 나타내었으나, 소정의 RNA를 발현하는 것은 단지 소수였다. 목적하는 RNA를 발현하는 세포를 선별하기 위하여, 이후 프로토콜을 수행할 수 있다.

실시예 2

신호 프로브를 사용한 세포 선별

1) 세포 내의 신호 프로브의 형질감염:

RNA 내인성 서열과 하이브리드되거나, 고유 RNA에 첨가된 표적과 하이브리드되는 경우 목적 RNA를 인식하도록 신호 프로브를 디자인하였다. 신호 프로브 디자인은 본 발명의 상세한 설명에 기술되었다.

형질감염은 세포에 DNA 컨스트럭트를 형질감염시키는 방법과 유사한 각종 방식으로 수행될 수 있다. 일부 세포가 다른 방법에 비해 일부 형질감염 방법에 보다 잘 반응하기 때문에, 사용된 방법은 사용된 세포 타입에 준해 선택되어야 한다. 형질감염은 사용한 형질감염 시약의 제조업자 지시에 따라야 하며, 최적화될 필요도 있다. 최적화는 세포 또는 세포 세포질에 형질감염된 물질의 전달을 향상시키는 화학물질로 처리하는 것을 포함한다.

세포 내의 신호 프로브의 형질감염은 사용한 세포 및 형질감염 시약에 따라, 현탁액내 세포상에서 또는 고체 표면상에서 증식하는 세포상에서 수행될 수 있다.

2) 세포에 형광 발생 프로브를 형질감염시킨 후, 세포를 FACS로 분석할 수 있다. FACS는 사용한 임의의 1 이상의 형광 발생 프로브에 양성인 세포를 분류하기 위해 사용될 수 있다. 이는 또한 형광 발생 프로브의 신호 강도에 준해 세포를 분류하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서 연구원은 다양한 수준으로 RNA를 발현하는 세포를 선별할 수 있다.

실시예 3

1 이상의 RNA 를 발현하는 세포주 생성

FACS 선택 후, 양의 값의 세포를 본 발명의 상세한 설명에 보다 상세히 기술된 바와 같이 적절한 배지에 유지할 수 있다. 이들 세포는 소정의 RNA를 발현하는 세포주를 발생시킬 수 있다.

신호 프로브의 농도: 사용할 신호 프로브의 농도는 여러 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 세포 내 검출할 RNA의 풍부성 및 신호 프로브에 대한 상기 RNA의 접근성을 고려하여야 한다. 예를 들어, 검출할 RNA가 매우 소량으로 존재하거나, RNA에 대한 단백질 결합에 의해 또는 RNA의 삼차원 폴딩에 기초해 용이하게 입수할 수 없는 RNA 부분에 존재한다면, 신호 프로브에 의해 인식되는 부위가 완전히 이용가능하고 검출 RNA가 상당히 풍부한 정도로 존재하는 경우보다 많은 신호 프로브가 사용되어야 한다. 사용될 신호 프로브의 정확한 양은 각 응용에 대해 경험에 입각해 결정될 것이다.

이는 상이한 양의 신호 프로브를 상이한 세포군에 도입하고 백그라운드 형광이 낮으면서 신호가 높은 조건(일부 세포가 신호 프로브에 양성적이나 전부가 양성적인 것은 아닌 조건)을 선택하여 이룰 수 있다

실시예 4

신호 프로브에 세포 노출

용액내 또는 표면상에 부착, 부분적으로 부착 또는 침강된 세포를 마이크로인젝션(microinjection), 와동 또는 혼합과 같은 기계적 전단력, 니들 통과 또는 스크래핑, 특정 항생제 또는 세정제 또는 시약 또는 용매의 조합물과 같은 시약을 사용한 투과를 비롯한 세포 로딩 기술, 또는 화학 성질(예컨대 리포좀, 화학약품 또는 단백질에 기초)을 변화시켜 각종 형질감염 시약을 사용하거나, 이들 방법의 1 이상의 조합을 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함하나 이들에만 한정되지 않는, 세포에 분자를 도입하기 위한 다양한 방법으로 FP에 노출시킬 수 있다.

이하, 형질감염 시약에 기초하여 리피드를 사용하는 샘플 프로토콜을 보다 상세히 기술하도록 하겠다.

1. 세포 제조

세포를 FP에 노출시키기 전(세포 플레이팅 방법 1) 또는 노출과 동일한 날(세포 플레이팅 방법 2)에 조직 배양 웰에 플레이팅하거나, FP에 노출시키는 날과 동일한 날에 세포를 마이크로원심분리관으로 옮겼다(세포 플레이팅 방법 3).

세 제조방법 모두가 성공적으로 사용되었다. 세포 플레이팅 방법 1은 배양 웰 표면에 세포가 부착되도록 하기에 충분한 시간을 제공하는 반면, 세포 플레이팅 방법 2는 세포의 추가 처리전에 통과 시간에 따라 세포를 플레이트상에 다양한 처리 정도로 침강시키거나 부착시키고, 세포 플레이팅 방법 3은 주어진 시간 경과후 처리될 수 있지만, 튜브에 형질감염후 임의의 표면에 침강 또는 부착할 시간을 허용하지 않으면서 세포가 직접 처리되도록 한다.

세포를 무혈청 매질 또는 PBS와 같은 완충액으로 1 회 이상 세척할 수 있으나, 다른 완충액도 또한 사용될 수 있다. 일반적으로, 완충액은 다양한 밀리몰 농도로 MgCl ₂ 를 포함한다. 노출 방법에 따라 세척 단계는 생략될 수 있다.

2. FP 시약 제조 및 세포에 노출

시판 형질감염 시약을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 세포 제조시에 추가되는 FP를 제조하였다. 제조업자의 프로토콜은 다수의 파라미터에 대해 사용된 세포 타입, 세포가 처리되어야 하는 융합 또는 농도의 정도, 도입될 특정 분자, 다양한 시약의 조합 비율 및 절대 양 및 수행될 다양한 단계 또는 배양의 시간, 생략할 수 있는 단계 및 다른 변수들을 비롯한 다수의 변수를 실험적으로 결정하는 것이 필요하다고 지시하고 있다. 제조업자의 프로토콜에는 특정 범위가 제시되어 있지만, 프로토콜은 또한 이 범위를 초과할 수 있거나, 또는 다른 파라미터가 그의 성공적인 사용에 최적화될 수 있다고 제안한다. 일반적으로, FP에 세포 노출은 제조업자의 프로토콜에 의한 예비 범위로 제안된 범위내의 조건으로 파라미터들을 사용하여 수행된다.

일반적으로, 제조업자가 제안한 부피 및 농도를 사용하여 FP가 무혈청 배지를 함유하는 튜브에 첨가될 수 있고, 형질감염 시약이 무혈청 배지를 또한 함유하는 제2 튜브에 첨가될 수 있다. 각 튜브의 내용물을 제조업자의 프로토콜에 따라 혼합하고, 배합한 후, 제조업자의 프로토콜에 따른 시간 동안 배양할 수 있다. 이어서, FP를 세포 제제에 적용하고, 다양한 배양 시기후 세포를 분석할 수 있다.

도 32에서 세포에 대한 FP의 노출 프로토콜은 다음과 같다:

세포를 FP에 노출시키기 하루 전에 약 1×10 ⁵ 세포/ml로 웰 당 0.5 ml로 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 사용한 세포는 r-vav를 코딩하는 발현 컨스트럭트에 선택적인 약물로 형질감염된 세포이다.

제1 튜브에서 1 내지 4 mM의 MgCl ₂ 를 함유하는 50 내지 200 ㎕의 무혈청 배지중에 0.625 내지 2.5 ㎕의 20 μM FP 스톡 및 제2 튜브에서 동일 농도의 MgCl ₂ 를 함유하는 동일 부피의 무혈청 배지중에 0.625 내지 2.5 ㎕의 TfX50(Promega)을 배양하여 FP 시약을 제조하였다. 각 튜브의 내용물을 혼합하고, 배합한 후, 실온에서 15 내지 45분간 배양하였다.

세포를 상기 사용된 동일 농도의 MgCl ₂ 에 첨가된 무혈청 배지로 1 회 이상 세척하였다. FP 제제를 세포에 적용할 수 있고, 첨가한 FP 제제의 부피에 따라 세포가 커버되도록 여분의 무혈청 배지와 MgCl ₂ 를 임의로 첨가할 수 있다.

세포를 조직 배양 인큐베이터에서 3 내지 5시간 동안 배양한 후, 분석하고, 관찰전에 임의로 DMSO를 첨가할 수 있다. DMSO는 세포 내의 신호 프로브 전달, 또는 검출될 표적의 폴딩 또는 제시를 도울 수 있다. 다른 용매 또는 화학물질이 또한 세포 또는 세포 세포질에 신호 프로브 전달을 증가시키거나, 신호 프로브에 의한 표적 검출을 향상시킬 목적으로 사용될 수 있다. 표적을 발현하지 않는 세포에 비해 표적을 발현하는 세포에서 표적 검출에 대해 신호 대 노이즈를 증가시키거나 또는 전달 효율을 증가시키는지를 결정하여 용매 및 화학물질의 유익성 또는 적합성을 시험할 수 있으며, 이때 두 세포 타입은 모두 신호 프로브에 노출된다.

표적 서열 6CA4를 포함하는 RNA를 코딩하는 발현 컨스트럭트에 선택적인 약물 및 형질감염되었거나 비형질감염된 세포에 FP16을 첨가한 것을 제외하고, 도 34의 프로토콜을 실질적으로 도 32에 기술된 바와 같이 수행하였다.

도 33(A, B, C)에서 세포에 대한 FP의 노출 프로토콜은 다음과 같다:

4 mM의 MgCl ₂ 가 첨가된 PBS(PBS+4)에서 약 2.5×10 ⁵ 세포/ml로 플레이팅된 약 50 내지 100 ㎕의 세포를 96-웰 플레이트의 웰에 플레이팅하고, 세포를 플레이트 표면상에 침강하기에 충분한 시간이 경과한 후 스프레딩전에 FP에 노출시켰다.

제1 튜브에서 100 ㎕의 PBS+4에서 20 μM의 FP 스톡 2.5 ㎕를 혼합하여 FP 시약을 제조하고, 제2 튜브에서 7 ㎕의 리포펙타민(InVitrogen)을 100 ㎕의 PBS+4에 첨가하였다. 각 튜브 내용물을 혼합하고, 용액을 실온에서 30분간 배양한 다음, 배합하고, 혼합후, 실온에서 15분간 더 배양하였다. 50 ㎕의 FP 제제를 각 웰에 첨가하였다. 무혈청 배지 또는 임의적인 다른 완충액으로 세포를 세척하였다. 세포를 조직 배양 인큐베이터에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후, 분석하였다.

도 33(D, E)에서 세포에 대한 FP의 노출 프로토콜은 4 ㎕의 Plus 시약(InVitrogen)이 FP를 함유하는 튜브에 첨가되는 것을 제외하고, 도 32와 실질적으로 동일하다.

실시예 5

FACS 에 의한 세포 분석 및 단리

세포를 상술된 바와 같이 FP에 노출시키고, 부착되면 표면으로부터 떼어내어 상호 단리되도록 처리한 후(예컨대 트립신을 사용하여 수행하나, 다른 효소 또는 비효소적 처리가 이용될 수 있다), FACS에 적용할 수 있다.

FP에 노출후, FP를 함유하는 용액을 세포로부터 제거하고, 트립신을 세포에 직접 적용할 수 있다. 이 단계 전에 FP에 노출시키는 동안 세포 표면에 연루될 수 있는 임의의 FP 시약 또는 다른 시약을 제거하도록 디자인된 시약을 포함하여, 각종 완충액 또는 시약을 사용하여 세포를 세척할 수 있다. 세포를 완충액(예컨대 혈청 및 마그네슘 함유 배지)에 재현탁시키고, 세포를 예컨대 피펫팅에 의해 추가로 분산시킬 수 있다.

이어서, 세포를 표준 FACS 방법에 따라 FACS로 분석하였다. 세포를 분석하는 경우, FP를 사용하여 대조 세포 및 서열 존재에 대해 표적 서열을 잠재적으로 발현할 세포의 형광 강도를 비교하여, 상기 절차를 거친 세포의 백그라운드 형광을 측정하여 표적 서열을 잠재적으로 발현할 세포가 임의의 형광 변화를 나타내는지를 결정할 수 있다. 이 정보에 기초해 세포를 개별적으로 또는 배치로 분리할 수 있다. 예를 들어, 기존의 기술로 96-웰 플레이트의 한 웰에서 목적 세포를 직접 단리하는 것이 가능하거나, 다수의 목적 세포가 수득될 수 있다.

FACS에서 형광 강도의 역치를 증가 또는 감소시켜 상이한 수준의 형광 신호를 나타내는 세포를 단리할 수 있다. 세포가 실제로 양성이라는 확신을 높이기 위하여 역치를 매우 높게 설정할 수 있거나, 수득한 집단내 양성 세포의 순도가 중요하지 않은 경우, 예컨대 단순히 양성 세포에 대한 단리된 세포를 풍부하게 하려고 하는 경우에는 역치를 낮게 설정할 수 있다.

실시예 6

발현 안정성 결정

시간 경과에 따른 세포 내 1 이상의 유전자의 발현 수준을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 서열을 인식하도록 디자인된 FP를 사용하여 서열 발현에 대해 양성으로 단리된 세포로부터 유래된 세포주가 주어지면, 세포 및 대조 세포를 FP에 노출시키고, FP에 의해 방출된 신호에 대해 두 세포 타입의 형광 강도비를 결정할 수 있다. 이 과정을 경시적으로 반복할 수 있으며, 이때 비율 변화는 FP에 의해 검출되는 서열에 대한 발현의 상대 수준의 변화를 반영할 것이다. 이 과정을 다수의 FP를 사용하여 수행할 수 있다.

실시예 7

태그 서열 디자인

신호 프로브의 표적 서열이 결합에 유사하게 제공되도록 하기 위하여 신호 프로브의 결합에 가장 직접적으로 관여하는 구조 영역면에서 특히 동일하거나 유사한 것으로 추정되는 구조를 가지는 서열을 생성할 목적으로, 태그1에 대한 서열을 사용하여 각 서열이 유일한 신호 프로브에 의해 인식될 수 있도록 두 개의 추가 상이한 서열을 생성하였다. 생성된 두 개의 상이한 각 태그 서열(태그2 및 3)에 대해, 태그1에 대한 원 서열내 표적화 서열을 먼저 변경시키고, 동일 위치에서 상호작용을 보존할 일환으로 변경 서열과 상호작용할 것으로 추정되는 일부 추가 염기에 대해 보상 변경을 행하였다(도 43 및 44). 새로운 서열의 추정 구조를 얻고, 태그1의 추정 구조와 밀접하게 매치하지 않는 경우, 이 구조를 이용하여 추가 변경이 필요한지를 예측하였다. 태그1의 것과 유사한 추정 구조를 가지는 신규 서열이 얻어질 때까지 상호작용 과정을 수행하였다. 이들 서열에 행해진 변경은 염기 치환, 결실 및 첨가를 포함한다.

실시예 8

승온에서 신호 프로브 노출

FP17을 추정하여 상호작용 쌍에 인접한 7개 염기쌍의 상호 상보적인 영역을 형성하였다. 표적 올리고의 존재 하에 배양되는 경우 대조 올리고에 비해 좀 더 강한 형광 신호를 제공하기 위해 FP17에 승온이 필요하다. 예를 들어, 이들을 단순히 90 내지 95℃의 온수에 위치시키는 것으로 가능하다. 여기에 사용된 튜브는 20 μM FP 스톡 5 ㎕, 25mM MgC1 ₂ 1.5 ㎕, 20 μM 올리고 8 ㎕ 및 물 1.5 ㎕로 구성되고 최종 마그네슘 농도가 2.34 mM인 총 16 ㎕이다. 상술된 바와 같이, 사용된 표적 올리고는 TO-FP1이고, 사용된 대조 올리고는 TO-FP18이다.

실시예 9

화학적으로 변형된 신호 프로브

FP1 프로브 서열에 기초한 15개의 화학적으로 변형된 상이한 프로브를 합성하였다. 이들 프로브는 모두 동일한 서열을 가지며 동일한 표적 서열을 지시한다. 프로브를 293T 세포 내로 도입하였다. 이들 세포는 FP1의 표적 서열을 포함하는 태그 서열을 발현한다. FACS를 사용하여 이들 세포로부터의 형광을 분석하였다. 15개의 상이한 프로브를 하기에 나타내었다. FACS 분석 결과를 도 46-60에 나타내었다. 결과는 15개의 프로브가 모두 표적 서열을 발현하는 세포를 검출할 수 있는 것으로 나타났다. 모든 프로브는 화학적 변형을 제외하고, 농도, 전달 방법, 형광단, 퀀처 및 서열이 동일하다.