융합 폴리펩티드의 공번역 전좌를 사용한 파아지디스플레이

융합 폴리펩티드의 공번역 전좌를 사용한 파아지 디스플레이{Phage display using cotranslational translocation of fusion polypeptides}

본 발명은 신규 파아지 디스플레이(phage display) 방법, 그를 위해 사용된 파아지 또는 파아지미드 벡터 및 그렇게 하여 얻은 파아지 입자에 관한 것이다.

박테리오파아지 상에서 폴리펩티드의 디스플레이(파아지 디스플레이)는 대규모의 변이체로부터 소망하는 특성을 갖는 폴리펩티드 추출을 허용하는 선택 수법이다(Russel, in "Phage Display", Clackson, T. and Lowman, HB eds., Oxford University Press, 2004, pp.1-26). 파아지 디스플레이는 조합 항체 또는 펩티드 라이브러리로부터 선택하기 위하여 광범위하게 조사되었다.

지금까지 파아지 디스플레이에 가장 널리 사용된 박테리오파아지는 필라멘트성(filamentous) 파아지이다. 필라멘트성 파아지는 다수의 그램 음성 세균을 감염시키는 세균 바이러스 패밀리를 구성한다. 가장 잘 알려진 필라멘트성 파아지는 대장균( Escherichia coli )를 감염시키는 파아지로서, 이들은 f1/M13/fd 및 IKe이다. 파아지 f1, M13 및 fd는 지금까지 필라멘트성 파아지 디스플레이에 사용되어 왔다. 이들의 게놈은 98% 이상 동일하며 이들의 유전자 산물은 상호교환가능하다.

필라멘트성 파아지 어셈블리(assembly)의 독특한 특징은, 다른 많은 박테리 오파아지의 어셈블리와 대조적으로, 분비 과정에 있다. 피막(coat) 폴리펩티드를 생장하는 파아지에 혼입하는 것은 세포질 막에서 생기며, 발생한 파아지는 이들이 어셈블됨에 따라서 세포로부터 추방된다(Russel et al., 상동). 대장균 세포는 이 과정 중에 용균되지 않는다. 5개의 바이러스성 피막 단백질(pIII, pVI, pVII, pVIII 및 pIX)은, 파아지 입자에 혼입되기 전에, 세포질 막에 삽입된다(도 1). 예컨대, pIII의 주요 부분은 막을 거쳐 원형질막공간(periplasm)으로 전좌(translocated)되는 반면에, C-말단 소수성 꼬리(tail)는 막 중의 단백질에 고정된다.

필라멘트성 파아지 디스플레이에 대한 1개의 전제 요건은 목적하는 폴리펩티드(POI)의 전좌가 세포질 막을 통과하는 것이다. 이것은 보통 POI를 파아지 피막 단백질에 유전적으로 융합시키고 상응하는 융합 폴리펩티드를 전좌시키는 것에 의해 달성된다. 다르게는, POI 및 파아지 피막 단백질은 독립적으로 전좌된다.

이러한 상황하에서 POI는 예컨대 상응하는 파아지 피막 단백질과 함께 디설피드 결합(Cys-디스플레이)의 형성 또는 로이신-지퍼 (pJuFo 시스템)의 형성을 통하여 원형질막공간에 있는 파아지 입자에 안정하게 결합된다. pIII에 대한 융합을 이용하는 통상의 필라멘트성 파아지 디스플레이에 있어서, POI를 포함하는 융합 폴리펩티드의 전좌를 위해 Sec 경로가 이용된다. 이 경로에서, 폴리펩티드가 리보솜에서 먼저 합성된 다음 Sec 전좌에 의해 폴딩되지 않은 상태로 후번역적으로 전좌된다(도 2, (3)-(4)-(5)). 즉, 세포질 막을 통한 전좌는 상당량의 폴리펩티드 사슬이 합성된 후에만 개시된다. 그러나, 파아지 디스플레이의 성공을 위한 전좌 메카 니즘의 공헌은 충분히 밝혀져 있지 않았고, 공번역적 전좌 경로를 이용할 가능성은 종래 기술에서는 아직 연구되지 않았다.

다양한 범위의 크기 및 구조의 세포내(intracellular) 및 세포외(extracellular) 단백질이 필라멘트성 파아지 상에서 기능적으로 디스플레이되었다(Russel et al., 상기 참조). 그럼에도 불구하고, 일부 폴리펩티드는 대부분 잘 알려지지 않은 이유로 인한 개별 특성으로 인하여 디스플레이에 저항한다. 이 때문에 특정 단백질의 디스플레이의 성공을 예상할 수 없게 만든다. 따라서, 사용할 각 단백질에 대한 필라멘트성 파아지에서 디스플레이의 효율을 먼저 시험하는 것이 권장된다. 또한, 파아지 디스플레이를 위하여 조합적 라이브러리를 창제한 경우, 클론 전부가 유사한 효율을 디스플레이하는 것은 아니다; 이것은 cDNA로부터 생성한 라이브러리의 경우 특히 그러하다. 폴리펩티드의 디스플레이 문제는 이들이 파아지 생산 방해, 이들의 원형질막공간 응집, 이들의 단백질 분해, 이들의 대장균에 대한 독성 또는 사용된 전좌 경로에 대한 이들의 부적합성의 결과일 수 있다. 특히, 전좌 이전의 단계는 융합 폴리펩티드를 파아지 입자에 혼입하는 데 영향을 주는 중요한 인자이다. 조기에(prematurely) 폴리펩티드 폴딩되면, 이들은 전좌에 저항할 수 있거나 또는 세포질 독성을 나타낼 수도 있다. 따라서, 단백질이 후번역적으로(posttranslationally)(조기 폴딩의 가능성 허용) 전좌되는지 또는 공번역적으로(cotranslationally)(세포질 폴딩 허용하지 않음) 전좌되는지 여부가 중요하다. 현재의 필라멘트성 파아지 디스플레이 방법은 세포질 막을 통한 융합 폴리펩티드의 전좌를 위한 후번역적 경로를 이용한다(Russel et al., 상기 참조; Paschke, M. and Hohne, W., Gene 350, 79-88, 2005). 따라서, 이들 경로와 부적합한 폴리펩티드는 디스플레이에 저항할 것이므로, 파아지 디스플레이 선택을 아주 비효율적으로 만들거나 불가능하게 만들 수 있다. 예컨대, 파아지 디스플레이에 거의 배타적으로 사용되는 후번역적 Sec 경로는 세포질에서 폴딩되지 않은 상태로 존재할 수 없는 단백질을 본질적으로 전좌할 수 없는데, 이는 Sec 트랜스로콘(translocon) 자체가 폴딩되지 않은 폴리펩티드만을 수송할 수 있기 때문이다(Huber, D., Boyd, D., Xia, Y., Olma, MH, Gerstein, M., and Beckwith, J., J. Bacteriol. 187, 2983-2991, 2005; Paschke et al., 상기 참조).

따라서, 본 발명의 기술적 과제는 후번역적 전좌를 이용하는 것에 의해 비효과적으로 디스플레이되었던 필라멘트성 파아지 상에서 폴리펩티드의 효과적인 디스플레이를 위한 신규한 전좌 방법을 확인하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 파아지 입자 상에서 디스플레이된 목적하는 폴리펩티드(POI)가, 시그널 인식 입자 경로(signal recognition particle pathway)를 기본으로 하여, 그램 음성 세균의 세포질 막을 통하여 공번역적으로 전좌되는 필라멘트성 파아지 디스플레이 방법에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드의 공번역적 전좌에 의한 파아지 디스플레이를 허용한다. 이 방법은 파아지 상에서 디스플레이하기 어려운 것으로 알려진 폴리펩티드, 및 cDNA 라이브러리 및 기타 조합 라이브러리의 단백질, 특히 아주 신속하게 폴딩되고 안정한 단백질 골격(protein scaffold)으로부터 유도되는 경우에 특히 적합하다.

본 발명은 또한 파아지 입자 상에 디스플레이될 POI 및 시그널 인식 입자 경로를 기본으로 하여 공번역적 전좌를 증진하는 N-말단 시그널 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 작제물 파아지 또는 파아지미드 벡터에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 내용에서, 용어 "필리멘트성 파아지 디스플레이"는 필라멘트성 파아지를 기본으로 한 파아지 디스플레이를 지칭한다. 필라멘트성 파아지는 다수의 그램 음성 세균을 감염시키는 세균 바이러스 패밀리를 구성한다. 바람직한 필라멘트성 파아지는 대장균을 감염하는 파아지, 특히 f1/M13/fd 및 IKe이다. 필라멘트성 파아지 디스플레이를 실시하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예컨대 Russel et al., 상기 참조).

본 발명의 내용에서, 용어 "시그널 서열"은 폴리펩티드를 트랜스로카아제(translocase)로 표적화하는 폴리펩티드의 아미노산의 N-말단 스트레치(stretch)를 지칭한다. 대장균에서, N-말단 시그널 서열은 일반적으로 15 내지 52개 아미노산을 포함한다. 대부분의 시그널 서열은 양으로 하전된 N-말단 영역(n-영역), 비극성 소수성 코어 (h-영역) 및 더욱 극성인 C-말단 영역(c-영역)을 함유한다. 이 c-영역은 시그널 펩티다아제에 대한 절단 부위를 함유한다. 시그널 펩티다아제는 전좌 반응 동안 폴리펩티드로부터 시그널 서열을 제거하는 막-결합 프로테아제이다. 18 내지 30개 아미노산을 포함하는 이러한 시그널 서열이 바람직하다. 시그널 서열의 결정은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 이들은 Swiss-Prot 또는 GenBank와 같은 데이터베이스로부터 또는 주석을 단 게놈-와이드 데이터 세트를 이용하여 얻을 수 있다.

본 발명의 내용에서, 용어 "프레단백질(preprotein)"은 N-말단 시그널 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 시그널 서열은 전좌 반응 동안 프레단백질로부터 절단되어 성숙 단백질을 얻는다.

본 발명의 내용에서, 용어 "융합 폴리펩티드"는 N-말단 시그널 서열, 목적하는 폴리펩티드(POI) 및 필라멘트성 파아지 상에서 디스플레이를 허용하는 부가적 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 바람직하게는, 이 부가적 서열은 필라멘트성 파아지 피막(coat) 폴리펩티드 또는 그의 단편을 포함하다. 다르게는, 상기 서열은 적합한 결합에 의해, 예컨대 디설피드 결합(Cys-디스플레이)의 형성에 의해 또는 상응하는 파아지 피막 단백질을 갖는 로이신-지퍼(pJuFo 시스템)의 형성에 의해 원형질공간에 있는 파아지 입자에 POI를 접속시킨다. 다른 전략으로서, POI 및 상응하는 파아지 피막 단백질은 서로 독립적으로 세포질 막을 통하여 전좌된다.

본 발명의 내용에서, 용어 "전좌"는 트랜스로콘에 의해 매개된 생물학적 막을 통한 폴리펩티드의 전좌를 지칭한다(Holland, IB et al., Biochim. Biophys. Acta 1694, 5-16, 2004). 전좌는 후번역적으로 또는 공번역적으로 실시한다. 트랜스로카아제는 트랜스로콘을 통하여 폴리펩티드를 특이적으로 수송하는 효소 또는 효소 복합체이다(Holland et al., 상기 참조).

본 발명의 내용에서, 용어 "Sec 경로"는 Sec 트랜스로콘을 통하여 그램 음성 세균의 세포질 막을 통한 프레단백질의 후번역적 전좌를 위한 단백질 수송 메카니즘을 지칭한다(Holland et al., 상기 참조). Sec 경로는 전좌 이전에 프레단백질을 폴딩되지 않은 상태로 유지하는 분자 쉐퍼론(chaperone), 흔히 SecB에 의해 매개된다. Sec 경로는 그램 음성 세균에서 단백질 전좌의 주요 경로이다.

본 발명의 내용에서, 용어 "SRP 경로"는 Sec 트랜스로콘을 통하여 그램 음성 세균의 세포질 막을 통한 프레단백질의 공번역적 전좌를 위한 단백질 수송 메카니즘을 지칭한다(Schierle, CF, Berkmen, M., Huber, D., Kumamoto, C., Boyd, D., and Beckwith, JJ Bacteriol. 185, 5706-5713, 2003; Huber et al., 상기 참조). SRP 경로는 54-kDa 단백질 동족체(54-동족체; Fth) 및 4.5S RNA로 구성된 리보뉴클레오단백질인 시그널 인식 입자(SRP)에 의해 매개된다. SRP 경로에서, 시그널 서열은 리보솜으로부터 나타나자 마자 SRP와 상호작용한다. SRP, 발생하는 폴리펩티드 및 리보솜으로 구성된 복합체는 SRP-수용체를 통하여 폴리펩티드가 Sec 트랜스로콘을 통하여 공번역적으로 전좌되는 Sec 트랜스로콘으로 전달된다.

Sec 및 SRP 경로는 단백질을 폴딩되지 않은 상태로 막을 통하여 수송하는 Sec 트랜스로카아제에 집중된다. 전좌를 위하여 Sec 경로에 비하여 SRP 경로로 프레단백질을 표적화하는 것을 선호하는 것이 시그널 서열의 아미노산 조성이다(Huber et al., 상기 참조).

본 발명의 내용에서, 용어 "DsbA"는 원형질막 대장균 티올:디설피드 상호교환 단백질 DsbA (Swiss-Prot 수탁번호 P24991)을 지칭한다. DsbA는 SRP 경로의 기질이다(Huber et al., 상기 참조). DsbA는 그의 수송을 억제할 세포질 내의 폴딩을 피하도록 공번역적으로 수송된다.

본 발명의 내용에서, 용어 "TrxA"는 대장균 단백질 티오레독신 1(Swiss-Prot 수탁번호 P00274)을 지칭한다. TrxA는 프레단백질을 SRP 경로 또는 Sec 경로로 표적화하는 시그널 서열을 구별하기 위한 리포터 단백질로서 사용될 수 있다(Schierle et al., 상기 참조; Huber et al., 상기 참조).

본 발명의 내용에서, 용어 "Tat 경로"는 트윈-아르기닌 단백질 전좌(Tat) 경로(Paschke et al., 상기 참조)를 지칭한다. Tat 경로는 Sec 경로 및 SRP 경로와는 기본적으로 상이하다. Sec 트랜스로콘과는 대조적으로, Tat 트랜스로콘은 충분히 폴딩된 단백질만을 수송한다. SRP 경로와는 대조적으로, Tat 트랜스로콘은 후번역적으로 단백질을 통과시킨다.

일 구체예로서, 파아지 입자 상에서 디스플레이할 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드의 시그널 서열은 공번역적 전좌를 증진하는 시그널 서열이다.

목적하는 시그널 서열이 그램 음성 세균의 세포질 막을 통한 공번역적 전좌를 증진하는 여부를 시험하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 목적하는 시그널 서열은 성숙 MalE에 유전적으로 융합된다(Swiss-Prot 수탁번호 P02928, 잔기 27 내지 396). 이 인공 프레단백질은 대장균에서 발현되며 또 생기는 사슬의 공번역적 단백질분해성 과정의 결과는 기재된 바와 같은 2차원적 겔 전기영동법에 의해 분석하였다(Josefsson, L.-G and Randall, LL, Methods Enzymol. 97, 77-85, 1983; Schierle et al., 상기 참조). 프레단백질 사슬이 여전히 생기는 동안 목적하는 N-말단 시그널 서열을 제거하는 것은 폴리펩티드의 합성이 완료되기 전에 전좌가 개시되므로, 전좌는 공번역적임을 나타낸다. 바람직한 시그널 서열은 성숙 MalE에 융합될 때, 공번역적 전좌 수율을 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 증진시킨다. 가장 바람직한 시그널 서열은 공번역적 전좌를 증진시키고 성숙 MalE에 융합될 때 후번역적 전좌를 증진하지 않는 것이다. 다르게는, DsbA로부터 얻은 시그널 서열과 같은 공번역적 전좌를 증진하는 것으로 이미 알려진 시그널 서열이 사용될 수 있다.

다른 특정 구체예로서, 파아지 입자 상에 디스플레이될 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드의 시그널 서열은 시그널 인식 경로를 표적화하는 시그널 서열이다.

그램 음성 세균의 시그널 인식 경로 및 목적하는 시그널 서열이 프레단백질을 SRP 경로로 표적화하는지 여부를 시험하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 시그널 서열에 융합된 TrxA를 SRP 경로로 표적화하여 전좌하는 것은 SRP의 성분을 암호화하는 유전자 ffh (예컨대 ffh77 또는 ffh87 돌연변이 균주)에서 돌연변이를 갖는 대장균을 강하게 억제한다(Schierle et al., 상기 참조; Huber et al., 상기 참조). 따라서, SRP 경로를 표적화하는 이들 시그널 서열은 야생형 대장균의 세포질 막을 통한 TrxA의 전좌를 증진시키지만, ffh 돌연변이 균주에서는 아주 비효과적이다. 시그널 서열은 2개의 분명한 종류로 그루핑될 수 있다: SRP 경로를 표적화하는 것과 SRP 경로를 표적화하지 않는 것. Sec 경로를 표적화하는 시그널 서열은 시그널 서열의 전체적 소수성을 증가시키는 것에 의해, 특히 h-영역의 소수성을 증가시키는 것에 의해 SRP 경로에 다시 보내질 수 있다. 예컨대, 대형 소수성 잔기에 의해 h- 영역에서 극성 또는 소형(Gly 또는 Ala) 아미노산을 교체함으로써 그의 소수성을 단순히 증가시키는 MalE 시그널 서열의 온건한 변화가 단백질을 Sec에서 SRP 경로로 다시 보낸다. 다르게는, SRP 경로를 표적화하는 것으로 이미 공지된 시그널 서열, 예컨대 DsbA로부터의 시그널 서열도 사용될 수 있다. SRP 경로를 사용하는 시그널 서열의 다른 예는 헤모글로빈 프로테아제(Hbp, UniProtKB 수탁번호 088093)와 같은 오토트랜스포터(autotransporter)의 서브셋이다. 특이하게, Hbp 시그널 서열은 비교적 길고(52 아미노산) 또 전통적 시그널 서열 앞에 N-말단 연장부를 함유한다. 또한, Hbp 시그널 서열의 h-영역은 특별히 소수성이 아니다. SecM(Swiss-Prot 수탁번호 P62395)의 시그널 서열은 N-말단 연장부 및 SRP 경로를 표적화하는 것으로 공지된 온화하게 소수성인 h-영역을 포함하는 장쇄 시그널 서열의 일례이다.

특정 구체예로서, 파아지 입자상에 표시할 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드의 시그널 서열은 그램 음성 세균의 세포질 막을 통한 TrxA의 전좌를 증진하는 시그널 서열이다.

다수의 흔히 사용되는 시그널 서열, 예컨대 PhoA(Swiss-Prot 수탁번호 P00634) 및 MalE(Swiss-Prot 수탁번호 P02928)의 시그널 서열은 세포질 막을 통한 TrxA의 전좌를 비효과적으로 증진한다(Schierle et al., 상기 참조). 대조적으로, DsbA 로부터의 시그널 서열은 TrxA의 효과적인 전좌를 증진한다. 목적하는 시그널 서열에 융합된 TrxA를 발현하는 숙주 세포의 세포하(subcellular) 분획은 세포질 막을 통하여 TrxA를 원형질막공간으로의 전좌를 증진시킬 수 있는 시그널 서열을 그렇지 못한 시그널 서열로부터 구별한다(Huber et al., 상기 참조). 원형질 공간 분획 내의 TrxA의 양은 시그널 서열이 TrxA의 전좌를 증진시키는 효율을 나타낸다. 다르게는, DsbA로부터 얻은 시그널 서열과 같은 TrxA의 전좌를 증진시키는 것으로 이미 공지된 시그널 서열이 사용될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 파아지 입자 상에 디스플레이할 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드의 시그널 서열은 TorT, SfmC, FocC, CcmH, Yral, TolB, NikA, Flgl 및 DsbA의 시그널 서열 및 그의 동족체로 구성된 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 구체예로서, 파아지 입자 상에 디스플레이할 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드의 시그널 서열은 TorT, SfmC, TolB 및 DsbA로 구성된 군으로부터 선택된 시그널 서열이다.

본 발명과 관련하여, 용어 시그널 서열의 "동족체"는 시그널 서열의 n-영역, h-영역 및 c-영역의 전체 전하, 소수성 및 절단 특성을 유지하면서 70%, 바람직하게는 80%, 특히 90% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 이러한 동족체의 예는 1, 2, 3, 또는 4개, 특히 1 또는 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열, 1, 2,3 또는 4개의 아미노산이 결실되거나, 1 또는 2개의 아미노산이 부가되거나, 이들 치환, 결실 및 부가의 조합을 갖는 아미노산 서열이다. 아미노산의 치환에서, 비극성 아미노산은 바람직하게는 다른 비극성 아미노산, 예컨대 Ile는 Leu, Val, Ala, Trp, Phe 또는 Met 또는 그 역으로 치환되며, 극성 아미노산은 다른 극성 아미노산, 예컨대 Thr 대신 Ser, Asn 또는 Gln 또는 그 역으로 치환되며, 음으로 하전된 아미노산은 다른 음으로 하전된 아미노산으로, 예컨대 Asp 대신 Glu으로 또는 그 역으로 치환되거나, 또는 양으로 하전된 아미노산은 다른 양으로 하전된 아미노산, 에컨대 Lys 대신 Arg 또는 His으로 또는 그 역으로 치환된다.

예컨대, 아미노산 서열 MKKIWLALAG LVLAFSASA (서열번호: 1)을 갖는 DsbA의 바람직한 시그널 서열의 경우, 아미노산 Lys2대신 Arg, Ala9 대신 Leu, Ala14 대신 Val 및 Ser16 대신 Thr로 치환이 가능하다.

TorT, SfmC, FocC, CcmH, Yral, TolB, NikA, Flgl 및 DsbA의 시그널 서열은 SRP 경로를 표적화하는 것에 의해 TrxA의 공번역적 전좌를 증진시키고, 또 대부분의 경우에서 Sec 경로를 표적화하는 시그널 서열과 비교하여 전체적으로 더 높은 소수성을 보유하는 것으로 공지되어 있다(Huber et al., 상기 참조). 이 단백질들은 다음 Swiss-Prot 수탁번호를 갖는다: TorT P38683, SfmC P77249, FocC P62609, CcmH P33925, Yral P42914, TolB P0A855, NikA P33590, Flgl P0A67S3, 및 DsbA P24991.

소수성 산출만으로는 높은 소수성 범위에 있는 SRP 의존적 및 비-SRP 의존적 시그널 서열을 구별할 수 없다(Huber et al., 상기 참조). 따라서, 소수성 이외의 특징(예컨대 시그널 펩티드의 구조)은 1개 전좌 경로에 대한 선호성에 영향을 준다.

특히 바람직한 구체예로서, 시그널 서열은 DsbA 시그널 서열 또는 DsbA 시그널 서열과 90% 상동성을 보유하는 아미노산 서열이다.

상기 방법은 예컨대 파아지 f1, M13, fd 등, 특히 f1, M13 및 fd를 사용한 필라멘트성 파아지 디스플레이법에 적용될 수 있다.

특히, 본 발명의 방법은,

(a) 그램 음성 세균의 세포질 막을 통한 융합 폴리펩티드의 공번역적 전좌를 증진시키는 N-말단 시그널 서열을 보유하는 융합 폴리펩티드에 대한 발현 카세트를 함유하는 필라멘트성 파아지 또는 파아지미드 벡터를 작성하는 단계;

(b) 목적으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 라이브러리를 단계(a)의 벡터의 발현 카세트에 클로닝하는 것에 의해 파아지 또는 파아지미드 벡터의 조합 라이브러리를 작성하는 단계;

(c) 적합한 그램 음성 세균을 상기 단계(b)의 벡터의 라이브러리를 사용하여 형질전환시키는 단계; 및

(d) 파아지 디스플레이 선택 주기를 실시하여 목적으로 하는 디스플레이된 단백질의 특성을 기본으로 하여 파아지 입자를 분리하는 단계를 포함한다.

단계(a)에서, 필라멘트성 파아지 또는 파아지미드 벡터는 유전자 기술의 표준 방법을 이용하여 작성한다. 예컨대, 확립된 파아지 또는 파아지미드 벡터의 융합 폴리펩티드에 대한 발현 카세트의 일부를 암호화하는 시그널 서열은 표준 DNA 수법을 이용하여 상기 시그널 서열의 코딩 서열에 의해 치환된다. 다르게는, 상기 시그널 서열을 함유하는 융합 폴리펩티드에 대한 발현 카세트를 함유하는 신규 파아지 또는 파아지미드 벡터는 이러한 벡터의 조성에 대한 일반적 지식 및 표준 DNA 합성 및 어셈블리 방법을 이용하여 새롭게 작성할 수 있다(예컨대 Russel et al., 상기 참조). 상기 목적에 유용한 파아지 또는 파아지미드 벡터는 예컨대 pAK100, pComb3, pEXmide3, pHEN1, pJuFo 또는 pSEX이다. 이러한 파아지미드 벡터(pDST23)의 일례는 도 3 및 뒤이은 실시예에 본 발명을 특정 구체예에 한정함없이 본 발명의 예로서 기재되어 있다.

바람직하게는, 단계(a) 중의 융합 폴리펩티드의 시그널 서열은 SRP 경로를 통한 융합 폴리펩티드의 전좌를 증진한다.

보다 바람직하게는, 단계(a) 중의 융합 폴리펩티드의 시그널 서열은 TrxA의 공번역적 전좌를 증진한다.

단계(b)에서, 벡터의 조합 라이브러리를 제조하기 위한 표준 방법이 사용된다. 예컨대, 목적하는 단백질을 암호화하는 조합 DNA 라이브러리는 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이에 의해, DNA 셔플링(shuffling)에 의해, 세포성 mRNA의 증폭을 통한 cDNA의 제조에 의해 또는 콘센서스(consensus) 디자인에 의해 생성된 다음 표준 DNA 수법에 의해 상기 벡터의 발현 카세트에 결찰(ligate)된다.

단계(c)에서, 그램 음성 세균의 형질전환을 위한 표준 방법이 사용된다. 예컨대, 세균은 전기 영동 또는 화학적 수단에 의해 단계(b)의 벡터의 조합 라이브러리에 의해 형질전환된다. 이러한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

단계(d)에서, 표준 파아지 디스플레이 선택 주기를 실시한다. 이러한 파아지 디스플레이 선택 주기는 당업자에게 잘 공지되어 있다(예컨대 Russel et al., 상기 참조).

바람직하게는, 단계(d)의 목적하는 디스플레이되는 폴리펩티드의 특성은 목적하는 표적 분자에 특이적 결합한다. 이 경우, 표적 분자에 POI 결합을 나타내는 파아지 입자는, 각 선택 주기에서 증폭된 파아지 분자를 표면 상에 기능적으로 고정된 표적 분자에 적용하고, 결합되지 않은 파아지 입자를 세척해내고, 결합된 파아지 입자를 용출하고 용출된 파아지 입자를 다음 선택 주기의 파아지 입자의 증폭에 대한 투입물(input)로 사용하는 것에 의해 미관련 폴리펩티드를 나타내는 파아지 입자로부터 분리된다.

본 발명의 내용에서, "(어떤) 시그널 서열" 또는 "(그) 시그널 서열"은 "1 이상", 예컨대 상이한 조성의 1, 2, 3 또는 4개의 단일 서열을 지칭한다. 1 이상의 단일 서열을 사용하는 것이 특히 유리하며 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명은 또한 TrxA의 공번역적 전좌를 증진시키는 N-말단 시그널 서열, 특히 TorT, SfmC, FocC, CcmH, Yral, TolB, NikA, Flgl 및 DsbA의 시그널 서열 및 그의 동족체로 구성된 군으로부터 선택되는 시그널 서열, 바람직하게는 TorT, SfmC, TolB 및 DsbA로 구성된 군으로부터 선택된 시그널 서열에 융합된 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 작제물을 포함하는 파아지 또는 파이지미드 벡터에 관한 것이다. 가장 바람직한 것은 시그널 서열 DsbA 또는 그의 동족체를 포함하는 파아지 또는 파이지미드 벡터이다.

바람직하게는, 상기 융합 폴리펩티드는 파아지 피막 단백질 pIII 또는 pVIII 또는 피막 단백질 pIII의 단편에 융합된 POI를 포함한다. 상기 단편은 예컨대 pIII의 아미노산 250 내지 406을 포함하는 단편이다.

원형질막공간 효소 DsbA의 시그널 서열은 융합된 리포터 단백질을 SRP 경로로 표적화하므로 이들의 공번역적 수송을 향상시킨다. 이것은 비교적 소수성인 DsbA 시그널 서열이 SRP와 상호작용하여 DsbA의 공번역적 전좌를 증진시킴을 의미한다. 따라서, DsbA의 시그널 서열은 실시예 1에 나타낸 바와 같이 다른 단백질에 대한 일반적 시그널 서열로서 사용될 수 있다.

마찬가지로, DsbA의 시그널 서열의 동족체, 및 TorT, SfmC, FocC, CcmH, Yral, TolB, NikA 및 Flgl의 시그널 서열 및 그의 동족체가 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 화합물의 라이브러리, 예컨대 DNA 라이브러리, 특히 cDNA 라이브러리에 적용되기에 특히 적합하다. 파아지 디스플레이에서 사용된 방법과 대조적으로, 본 발명의 방법은 이러한 라이브러리의 발현에 의해 얻어지는 폴리펩티드의 안전한 제시(presentation)를 허용한다.

본 발명의 특정 구체예는 필라멘트성 파이지 디스플레이 방법을 개시하며, 이때 DNA 라이브러리에 의해 암호화된 POI는 파아지 입자 상에서 디스플레이된다. 바람직하게는, DNA 라이브러리에 의해 암호화된 POI에 대한 공번역적 전좌는 TrxA의 공번역적 전좌를 증진시키는 시그널 서열과 같은 시그널 인식 입자 경로를 기본으로 하여 달성된다. 가장 바람직한 것은 반복 단백질의 파아지 디스플레이를 위해 기재된 방법이다.

선택 기술의 사용에 의해, 파아지 디스플레이 선택의 성공은 디스플레이되는 라이브러리 구성원의 다양성에 따라 상당히 달라진다. 대형의 조합적 DNA 라이브러리 그 자체는 라이브러리 구성원의 다양성이 디스플레이될 있음을 보장하지 안는다. 파아지 디스플레이에서, 디스플레이될 폴리펩티드는 이들이 파아지 입자에 혼입되기 전에 세포질막을 통하여 전좌되어야 한다. 현재의 필라멘트성 파아지 디스플레이 방법은 모두 세포질 막을 통한 융합 폴리펩티드의 전좌를 위해 후번역적 경로를 이용한다(Russel et al., 상기 참조; Paschke et al., 상기 참조). 따라서, 이들 경로와 부적절한 라이브러리 구성원은 디스플레이에 저항할 것이므로, 디스플레이되는 라이브러리 다양성을 분명히 감소시킨다.

고려하는 DNA 라이브러리는 모두 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이에 의해, DNA 셔플링에 의해, 또는 콘센서스 디자인에 의해 생성된 것을 포함한 모든 가능한 조합적 DNA 라이브러리이다. 이러한 방법은 결합 특성과 같은 신규 특성을 갖는 라이브러리 구성원을 생성할 것이다; 이들의 일부는 Sec 경로를 이용한 전좌에 부적절할 것이다. 이러한 라이브러리는 펩티드 라이브러리, 항체 라이브러리 또는 다른 골격(scaffold)을 기본으로 한 라이브러리를 암호화하는 DNA 라이브러리를 포함한다(Russel et al., 상기 참조; Nygren, PA and Skerra, AJ Immunol. Methods, 290, 3-28, 2004).

간주될 수 있는 다른 DNA 라이브러리는 cDNA 라이브러리, 특히 진핵생물 기원의 라이브러리이다. cDNA 라이브러리는 세포질 단백질, 막 단백질 및 세포외 단백질을 비롯한 다수의 천연 산출 세포 단백질을 암호화한다. 이들 천연 산출 라이브러리 구성원의 일부는 Sec 경로를 이용한 전좌에 부적합할 수 있다.

또한 고려되는 DNA 라이브러리는 세포내 활성 scFv 단편을 선택하기 위해 사용된 단일사슬 Fv (scFv) 항체(인트라바디(intrabodies))를 암호화하는 것이다. 인트라바디에 대한 요건은 이들이 잘 폴딩되고 또 대장균의 세포질에서 안정한 것이다. 따라서 세포질 안정성 및 잘 폴딩되는 인트라바디는 Sec 경로의 후번역적 메카니즘에 의해 효과적으로 전좌되지 않는다.

또한 고려되는 DNA 라이브러리는 안키린(ankyrin) 반복 단백질, 로이인-리치 반복 단백질, 테트라트리코펩티드 반복 단백질, 펜타트리코펩티드 반복 단백질 또는 아르마딜로/열 반복 단백질을 비롯한 반복 펩티드를 기본으로 한 스캐폴드 라이브러리(scaffold libraries)를 암호화하는 것이다.

바람직한 DNA 라이브러리는 안키린 반복 단백질(DARPin)를 암호화하는 라이브러리이다(Binz, HK, Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, MT, Briand, C., Forrer, P., Grutter, MG, and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol., 22, 575-582, 2004). 파아지 입자 상에 디스플레이되는 DARPin의 예는 실시예에 예시되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 파아지에 관한 것이다.

본 발명은 아주 빠르게 폴딩하고 세포질에 안정한 단백질의 원형질막공간 발현, 특히 DARPin의 원형질막공간 발현에 관한 것이다. 실시예의 파아지미드를 암호화하는 DsbAss 및 DARPin는 비-억제성 대장균에서 DARPin의 효과적인 원형질막공간 발현을 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 다르게는, 원형질막 발현에 사용되는 시그널 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 시그널 서열을 암호화하는 DNA로, 특히 DsbAss를 암호화하는 DNA로 치환하는 것에 의해 표준 원형질막공간 발현 벡터를 개질할 수 있다. 예컨대, DARPin의 효과적인 원형질막공간 발현은 세포질에서 발현하기 아주 어려운 이팩터 단백질, 특히 독소 또는 사이토카인에 융합된 DARPin의 발현에 도움이 된다.

이하에 예시된 새로운 파아지 디스플레이 방법은 디스플레이할 아주 광범위한 범위의 POI를 파아지 입자로 효과적으로 혼입하여서 효과적인 파아지 디스플레이를 가능하게 한다. 전통적인 파아지 디스플레이 방법과 비교한 이 새로운 방법의 주요한 차이점은 디스플레이할 POI를 포함하는 융합 폴리펩티드를 공번역적 SRP 경로로 표적화하는 시그널 서열을 사용하는데 있다(도 2, (1)-(2)). 이렇게 하여, 디스플레이될 POI는 세포질 막을 통하여 효과적으로 원형질막공간으로 전좌되므로, POI를 파아지 입자로 효과적으로 혼입시킨다. 바람직한 융합 단백질은 필라멘트성 파아지 피막 단백질 또는 피막 단백질의 절단된 형태 중의 하나를 포함한다. 이 경우, POI는 전좌 후(도 1) 및 파아지 입자에 혼입되기 전에 파아지 피막 단백질의 소수성 연장부에 의해 세포질 막에 고정된다.

SRP 경로를 표적화하는 시그널 서열의 특정 예는 대장균 단백질 DsbA의 시그널 서열(DsbAss)이다. 예시된 pDST 파아지미드의 모든 다른 요소는 후번역적 Sec 경로를 통하여 디스플레이될 목적하는 폴리펩티드를 표적화하는 PelB의 시그널 서열(PelBss) 또는 PhoA의 시그널 서열(PhoAss)을 갖는 pAK100 시리즈와 같은 전통적인 파아지미드로부터 유도된다(도 2, (3)-(4)-(5)).

실험의 일 시리즈에서, 디스플레이 수율은 PhoAss를 암호화는 pDST 파아지미드 및 DsbAss를 암호화하는 pDST 파아지미드로부터 생산된 파아지 입자 사이를 비교하였다. 파아지 입자는 이하에 기재한 표준 수순에 의해 생산하였으며 CsCl 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 웨스턴 블러팅은 단일 사슬 Fv 항체의 디스플레이의 경우, pDST 파아지미드는 사용된 시그널 서열과 독립적으로 거의 동일한 POI의 디스플레이 수율을 갖는 파아지 입자를 생산함을 나타내었다(도 4A, scFv). 그러나, 이와 대조적으로, 모든 시험한 4개의 DARPin은 PhoAss 함유 pDST 파아지미드를 사용할 때에만 효과적으로 디스플레이될 수 있었고, PhoAss 함유 pDST 파아지미드를 사용할 경우 디스플레이된 단백질 어떤 것도 검출될 수 없었다(도 4A, DARPin). 유사하게, DsbAss 함유 pDST 파아지미드는 폴리펩티드 GCN4 (도 4A), 람다 헤드 단백질 D, TrxA 및 APH(도 4B)의 경우에 상당히 더 높은 디스플레이 수율을 초래하였다. 단백질 Taq 폴리머라제, 파아지 람다 단백질 포스파타아제(λPP)의 경우 약간 더 높은 디스플레이 수율이 관찰되었고 c-jun N-말단 키나아제 2(JNK2, 도 4B)의 경우에서는 디스플레이된 단백질 어떤 것도 검출될 수 없었다. 이것은 DsbAss 함유 pDST 파아지미드를 사용하여 생산된 파아지 입자 상에서 디스플레이 수율은 PhoAss를 사용하는 전통적인 파아지미드에 의해 생산된 파아지 입자 상에서 디스플레이 수율에 적어도 거의 필적하고 있지만, DARPin 및 기타 신속 폴딩되고 열동력학적으로 안정한 단백질을 디스플레이할 때, 현저히 증가된 디스플레이 수율을 나타냄을 보여준다.

이러한 차이점을 정량하기 위하여, 파아지 입자를 파아지 ELISA 실험에 사용하였다. 단백질 APH 및 JNK2를 특이적으로 결합하는 DARPin을 디스플레이하는 파아지 입자를 DsbAss 함유 pDST 파아지미드 또는 PhoAss 함유 pDST 파아지미드로부터 생산된 후 비교하였다. 항-M13 항체를 사용하여 정량된 바와 같이 결합된 파아지 입자를 검출한 것을 기본으로 하여, 100배 이상 증가된 디스플레이 수율이 관찰되었다(도 5).

DsbAss를 사용하여 얻은 더 높은 디스플레이 수율이 선택 실험에 유리하다는 것을 증명하기 위하여, DsbAss 또는 PhoAss를 암호화하는 파아지미드로부터 생산된 3개의 상이한 유형의 파아지 입자를 함유하는 2개의 시험 혼합물을 다양한 희석비율로 혼합하였다. 양쪽 시험 화합물의 경우, 단백질 APH 및 JNK2에 특이적으로 결합하는 DARPin을 디스플레이하는 파아지 입자를 1:10 ⁷ 희석하여 미선택된 DARPin E3_5 및 E3_19를 디스플레이하는 파아지 입자로 혼입시켰다. 이들 2개 시험 혼합물을 표적 단백질 APH 및 JNK2 상에서 표준 파아지 디스플레이 선택을 위한 투입(input) 라이브러리로서 사용하였다(표 2). APH 및 JNK2 특이적 파아지 입자는 DsbAss-암호화 파아지미드로부터 생산된 시험 혼합물로부터 선택 주기당 약 100배 정도 농축될 수 있음에 반하여(시험된 클론의 10% 이상은 오직 2주기의 선택 이후에 이들의 표적에 특이적이었다), PhoAss 함유 파아지미드로부터 생산된 시험 라이브러리로부터는 5 주기의 선택 이후에도 어떠한 농축도 관찰될 수 없었다(특별한 클론이 관찰되지 않음).

다른 실험 시리즈로서, PhoAss, PelBss, DsbAss, TorTss, TolBss 또는 SfmCss를 암호화하는 pDST 파아지미드로부터 생산된 파아지 입자 사이에서의 디스플레이 수율을 파아지 ELISA에 의해 비교하였다. 단백질 APH 및 JNK2를 특이적으로 결합하는 DARPin을 디스플레이하는 파아지 입자는 개별 pDST 파아지미드로부터 생산 이후에 비교하였다. 항 M13 항체를 사용하여 정량된 바와 같이 결합된 파아지 입자의 검출을 기본으로 하여, SRP 의존적 시그널 서열은 Sec-의존적 시그널 서열 PhoAss와 비교하여 700배 까지 증가된 디스플레이 수율이 관찰되었다(도 6).

도 1 : 목적하는 폴리펩티드의 막 삽입 및 디스플레이

N-말단(N), C-말단(C), 목적하는 폴리펩티드(POI); pIII의 N-말단 도메인 (N1, N2), pIII의 C-말단 도메인(CT).

A) 필라멘트성 파아지 입자 상에서 목적하는 폴리펩티드(POI)의 디스플레이는 언제나 세포질 막(cm)을 통하여 POI가 원형질막공간으로 전좌되는 것을 포함한다. 가장 흔히, POI는 피막 단백질 III (pIII) 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드로서 전좌된다. pIII는 2개의 N-말단 도메인 (N1, N2) 및 C-말단 도메인(CT)을 포함한다. 이 특정 예에서, 융합 폴리펩티드는 N-말단 POI 및 C-말단 CT으로 구성된다. 이 융합 폴리펩티드 및 pIII는 전좌 후 및 파아지 입자에 혼입되기 전에 CT 잔기에서 C-말단 소수성 스트레치(stretch)를 통하여 세포질 막에 고정된다. 세포질(cp), 외부 막(om), 세포외 공간(ex).

B) pIII 및 A)의 융합 폴리펩티드를 디스플레이하는 필라멘트성 입자의 간편도. pIII의 N-말단(N1, N2) 및 POI는 CT 성분(moiety)를 통하여 파아지 입자로 혼입된다.

도 2 . 그램 음성 세균의 세포질 막을 통한 폴리펩티드의 전좌

세포질 막(cm)을 통하여 폴리펩티드가 그램 음성 세균의 원형질막공간(pp)으로 전좌되는 것에 대한 공지된 3개의 주요 경로의 간략도. 이들 경로는 SRP 경로, Sec 경로 및 Tat 경로이다. Sec 및 SRP 경로는 Sec 트랜스로콘(translocon) (SecTR)에 의존하는 반면에, Tat 경로는 Tat 트랜스로콘(TatTR)에 의존한다. Sec 및 Tat 경로는 후번역적으로 폴리펩티드를 전좌하는 반면에, SRP 경로는 공번역적으로 폴리펩티드를 전좌한다. Sec 및 SRP 경로는 폴딩되지 않은(uf) 상태로 막을 통하여 단백질을 수송하는 Sec 트랜스로카아제(translocase)에서 수렴한다. 대조적으로, Tat 트랜스로콘은 폴딩된(f) 단백질만을 전좌한다. 시그널 서열(ss)의 아미노산 조성은 이들 경로 중의 하나에 대하여 프레단백질(preprotein)의 표적화를 강하게 선호한다. 전좌 이후에, 시그널 서열은 펩티다아제에 의해 프레단백질로부터 절단된다. SRP 경로는 54-kDa 단백질 동족체 및 4.5S RNA로 구성된 리보뉴클레오단백질인 시그널 인식 입자(SRP)에 의해 매개된다. 이 경로에서, 프페단백질을 Sec 트랜스로콘에 표적화하는 것은 SRP이다. SRP는 리보솜(R)으로부터 생긴 상응하는 시그널 서열을 인식하여 결합하여 리보솜-발생 사슬 복합체를 SRP-수용체(SR)로 전달한 다음 프레단백질이 Sec 트랜스로콘을 통하여 공번역적으로 전좌된다. 조기 세포질 폴딩으로 인한 Sec 경로와 부적합한 폴리펩티드는 번역되는 동안 SRP 경로에 의해 효과적으로 전좌된다. (1) SRP는 리보솜으로부터 생긴 단백질의 소수성 시그널 서열에 특이적으로 결합한다. (2) SRP는 리보솜 생성 사슬 복합체를 SRP-수용체를 통하여 공번역적 전좌가 생기는 Sec 트랜스로콘으로 보낸다. 대부분의 프레단백질은 소수성이 덜한 시그널 서열을 가지며 SecB 의존적 수송을 거친다. (3) 발생하는 폴리펩티드에 대하여 일반적 친화성을 갖는 세포질 샤퍼론(chaperone)인 트리거 인자(TF)는 발생하는 프레단백질의 성숙 영역에 결합하여 번역이 거의 종료될 때까지 결합된 채로 효과적으로 잔존한다. (4) TF 분해에 이어, SecB 와 같은 세포질 인자는 프로단백질을 압출되고 폴딩되지 않은 입체형태로 유지시킨다. (5) 연장된 입체형태를 유지하는 프레단백질은 Sec 트랜스로콘을 통하여 효과적으로 수송된다. (6) 그러나, 프레단백질의 폴딩이 세포질에서 생기면, 단백질은 흔히 분해되거나(10) 또는 Sec 트랜스로콘을 플러그 업할 수 있다. 2중 아르기닌 모티프를 함유하는 시그널 서열을 갖는 프레단백질은 Tat 트랜스로콘으로 된다. (7) DnaK 또는 기타 Tat-특이적 인자와 같은 샤퍼론(TC)과의 조합은 폴딩이 완료될 때까지 시그널 서열을 차단할 것이다(8). 동일한 인자 또는 부가적 인자는 또한 정확한 폴딩을 증진시킬 것이다. Tat 전좌는 프레단백질이 정확하게 폴딩되어야만 진행하며; 그렇지 않으면, 프레단백질은 세포의 단백질분해 기구(9,10)에 의해 분해된다.

도 3 . pDST 파아지미드 벡터 시리즈의 개략적 대표

A) pDST 파아지미드 벡터 시리즈의 발현 카세트의 확대도. 이 발현 카세트는 대장균의 lacZ 유전자의 프로모터/오퍼레이터(lacZ p/o) 요소, 리보솜 결합 부위(도시되지 않음), 시그널 서열(ss)에 대한 코딩 서열 및 표시할 목적하는 폴리펩티드(POI), 서프레서 중지 코돈(TAG), 가소성 글리신/세린 링커(G/S)에 대한 코딩 서열 및 필라멘트성 파아지(CTpIII)의 단백질 III의 C-말단 도메인(아미노산 250-406)에 대한 코딩 서열, 2개의 중지 코돈(TGATAA, 도시되지 않음) 및 전사 종결 요소(도시되지 않음)을 포함한다. POI의 코딩 서열은 Flag-tag (Flag) 및 c-myc-tag(c-myc)를 암호화하는 DNA 서열과 접하고 있다. SRP 경로를 포적으로 하는 시그널 서열의 대표인 DsbA 시그널 서열에 대한 단일 문자 아미노산 서열(dsbAss) 및 Sec 경로를 표적으로 하는 시그널 서열의 대표인 PhoA 시그널 서열에 대한 단일 문자 아미노산 서열(PhoAss)를 도시한다. 이들 시그널 서열은 양으로 하전된 N-말단 영역(n-영역), 비극성 소수성 코어(h-영역) 및 더욱 극성인 C-말단 영역(c-영역)을 함유한다.

B) 파아지미드 pDST23의 개략적 대표. A)에 도시된 요소 이외에, 필라멘트성 파아지 복제 기원(Ff ori), lacZ p/o의 긴밀한 제어를 위해 필요한 lac 리프레서를 생성하는 대장균으로부터 얻은 lac 리프레서 유전자(lacl), 벡터의 세균 복제에 대한 colE1 복제 기점(ColE1 ori), 클로람페니콜-아세틸-트랜스퍼라아제 매개 클로람페니콜 저항성을 암호화하는 항생물질 내성 유전자(cat) 및 제한부위 Xba I, Bam HI, Pst I 및 Eco RI가 도시되어 있다. pDST23에서 암호화된 POI는 고안된 안키린 반복 단백질(DARPin) 3a이다.

도 4 . 웨스턴 블럿 분석에 의한 디스플레이 수율(yield) 대조

각 파아지미드를 사용하여 생성한 A) 및 B) CsCl-정제된 파아지 입자를 SDS-PAGE로 분리하고, PVDF 막 상에 블로팅한 다음 단백질 III의 C-말단 도메인에 특이적인 항체(항-pIII) 또는 Flag-tag에 특이적인 항체(항-FlagM1)를 사용하여 검출하였다. 레인당 적용한 등분량은 규준화되고 5 x 10 ¹¹ 파아지 입자에 상응한다. 다양한 폴리펩티드에 있어서 파아지 입자에서의 디스플레이 수율을 분석하였다. 폴리펩티드의 축약 명칭을 레인의 상단에 표시하고 표 1에 수록된 폴리펩티드를 지칭한다. 또한, 표 1은 파아지 입자를 생성하기 위해 사용된 상응하는 파아지미드를 나타내고 또 발현 카세트의 개략적인 것은 도 3A에 도시한다. 디스플레이 수율을 PhoA 시그널 서열("p"로 표시한 레인) 또는 DsbA 시그널 서열("d"로 표시한 레인) 을 이용하여 상응하는 융합 폴리펩티드를 Sec 경로 또는 SRP 경로에 의해 전좌하는 각 폴리펩티드에 대해 얻은 결과와 비교하였다. 더 강한 밴드는 더 높은 디스플레이 수율을 나타낸다. 마커 단백질의 분자량(kDa)은 블럿의 양측에 표시한다. 항-pIII 블럿의 62 kDa에서의 밴드는 pIII 야생형 단백질에 상응한다.

도 5 . ELISA 분석에 의한 디스플레이 수율 대조

2_3 (속이 비워있는 표시)으로 불리는 cJun N-말단 키나아제 2 (JNK2)-결합 DARPin 또는 3a (속이 채워진 표시)으로 불리는 아미노글리코사이드 키나아제 APH(3')-IIIa (APH)-결합 DARPin을 디스플레이하는 파아지 입자를 각각 면역화된 비오티닐화된 JNK2 또는 APH 단백질을 함유하는 뉴트트라비딘 피복된 및 BSA-차단된 웰에서 배양하였다. 세척 후, 결합된 파아지 입자는 꽃양배추 퍼옥시다아제에 결합된 항-M13 항체를 이용하여 검출하고 용해성 BM Blue POD 기질을 사용하여 가시화하였다. 도시된 데이터는 392 nm에서 측정된 바탕값을 뺀 후 360 nm에서 측정된 y-축 상의 흡수(Abs) 대 x-축 상의 웰 당 인가된 파아지 입자(pp)의 수를 도시한다. 파아지미드 변이체를 암호화하는 DsbA 시그널 서열을 사용하여 생성한 파아지 입자(세모 표시)는 웰당 약 8 x 10 ⁸ 파아지에서 1/2 최대치 시그널을 나타낸 반면에, PhoA 시그널 서열 암호화 변이체로부터 생성된 파아지 입자(정사각형 표시)는 웰당 약 2 x 10 ¹¹ 개 파아지 입자만을 나타내는데, 이는 100배 정도 낮은 디스플레이 수율을 나타낸다. 따라서, 융합 폴리펩티드를 전좌시키기 위해 DsbA 시그널 서열 매개된 SRP 경로의 이용은, PhoA 시그널 서열 매개된 Sec 경로를 이용한 것에 비하여, 디스플레이 수율을 강하게 증가시켰다.

도 6 . ELISA 분석에 의한 디스플레이 수율의 정량

DARPin 2_3 또는 3a를 디스플레이하는 파아지 입자를 도 5에 기재한 바와 같이 분석하였다. 결과는 막대 다이아그램(대수 기준)으로 나타내며, PhoAss 디스플레이 수율은 1로 설정하였다. 사용된 각 시그널 서열에 대한 디스플레이 정도(폴딩 증가)는 OD ₄₅₀ = 0.5의 신호를 나타내는 PhoAss-함유 파아지 입자의 숫자에 대한 OD ₄₅₀ = 0.5의 신호를 나타내는 파아지 입자의 갯수에 상응한다. 에르위니아 카로토보라( Erwinia carotovora ) PelB의 PelBss: 시그널 서열(추정 Sec-의존적 시그널 서열). 대장균 단백질 TorT, TolB 및 SfmC에 대한 SRP-의존적 시그널 서열(TorTss), (TolBss) 및 (SfmCss)를 DsbAss이외에 시험하였다. 700 배 이상의 증가된 디스플레이 수율은 Sec-의존적 PhoAss에 비교하여 SRP-의존적 TorTss에서 얻어졌다. SRP-의존적 TolBss 및 SfmCss는 300배 이상의 증가된 디스플레이 수율을 나타내었다. 추정적 Sec-의존적 PelBss는 오직 1 내지 6배의 디스플레이 수율 증가를 나타내었다.

재료

화합물질은 플루카(스위스 소재)로부터 입수하였다. 올리고뉴클레오티드는 Microsynth (스위스 소재)로부터 구입하였다. 벤트 DNA 폴리머라제, 제한 효소 및 완충용액은 New England Biolabs (USA 소재) 또는 Fermetas(Lithuania 소재)로부터 구입하였다. 헬퍼 파아지 VCS M13은 Stratagene (USA 소재)로부터 구입하였다. 모든 클로닝 및 파아지 증폭은 대장균 XL1-Blue(Stratagene 제조; USA)에서 실시하였다.

분자 생물학

다르게 기재하지 않는 한, 모든 분자 생물학 방법은 기재된 수순에 따라서 실시하였다(Ausubel, FM, Brent, R., Kingston, RE Moore, DD, Sedman, JG, Smith, JA and Stuhl, K. eds., Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, 1999). 간단한 수순은 다음과 같다.

파아지 디스플레이 관련된 방법

다르게 기재하지 않는 한, 모든 디스플레이 관련 방법은 기재된 수순에 따라서 실시하였다(Clarkson, T. and Lowman, HB eds., Phage Display A Practical Approach, New York: Oxford University Press, 2004; Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK eds., Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). 간단한 수순은 다음과 같다.

클로닝

DARPin 3a를 암호화하는 파아지미드 pAK100의 유도체(Krebber, A., Bornhauser, S., Burmester, J., Honegger, A., Willuda, J., Bosshard, HR, and Pluckthun, A., J. Immunol. Methods 201, 35-55, 1997)는 본 연구의 첫번째 파아지미드, pDST23의 클로닝을 위한 출발 지점이었다.

이 pAK100 유도체의 시그널 서열을 치환하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 oDST4 (서열 번호: 5), oDST5 (서열번호: 6), oDST6 (서열번호: 7) 및 oDST8 (서열번호: 8)을 고안하였다. 이들 4개 올리고뉴클레오티드는 대장균 DsbA 시그널 서열을 암호화한다. 대장균 DsbA 단백질은 Swiss-Prot 데이터베이스(수탁번호 P24991)에서 찾아 볼 수 있다. 그의 시그널 서열은 MKKIWLALAG LVLAFSASA (서열번호: 1)이다. 올리고뉴클레오티드 oDST4, oDST5, oDST6 및 oDST8을 어닐링하고 올리고뉴클레오티드 oDST6 및 oDST8을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성한 DNA 단편은 DsbA 시그널 서열을 암호화하며 제한 엔도뉴클레아제 부위 Xba I 및 BamH I과 접하고 있다. 이 DNA 단편을 Xba I 및 BamH I으로 분해시키고 유사하게 처리되고 탈인산화된 pAK100 유도체에 결찰시켰다. 생성한 파아지미드 pDST23 (도 3)을 단리하고 정확한 서열을 DNA 서열결정법에 의해 확인하였다.

PhoA의 시그널 서열(서열번호: 9)을 암호화하는 파아지미드와 대조적인 직접적 실험을 허용하기 위하여, 제2의 파아지미드인 pDST22를 생성하였다. 다시, 4개의 올리고뉴클레오티드- 소위 oDST4p (서열번호: 10), oDST5p (서열번호: 11), oDST6 (서열번호: 7) 및 oDST8p (서열번호: 12)를 어닐링하고 oDST6 및 oDST8p를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성한 DNA 단편은 PhoA 시그널 서열을 암호화하며 제한 엔도뉴클레아제 부위 Xba I 및 BamH I과 접하고 있다. 이 DNA 단편을 Xba I 및 BamH I으로 분해시키고 유사하게 처리되고 탈인산화된 pDST23에 결찰시켰다. 생성한 파아지미드 pDST22을 단리하고 정확한 서열을 DNA 서열결정법에 의해 확인하였다.

이 연구에 사용된 다른 파아지미드는 표 1에 수록하며 다음과 같이 얻었다: 목적하는 단백질의 코딩 서열은 적합하게 고안된 PCR 프라이머 및 주형 DNA를 사용하여, 예컨대 제조된 cDNA 또는 일반적으로 입수가능한 플라미드 DNA를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 이렇게하여 각 코딩 서열의 5'에 BamH I 또는 Bgl II 제한 부위를 도입하며 2개의 제한 부위( EcoR I 및 Pst I)를 각 코딩 서열의 3'에 도입하였다. 이들 PCR 단편을 BamH I 또는 Bgl II 으로 분해하고 또 EcoR I 또는 Pst I으로 분해시킨 다음 유사하게 처리되고 탈인산화된 파아지미드 pDST23 또는 pDST22에 결찰시켰다. 클로닝된 PCR 산물을 포함하는 융합 폴리펩티드에 대한 발현 카세트의 오픈 리딩 프레임은 모든 작제물에서 유지되며, 특히 파아지 단백질 III의 C-말단(CTp3)에 대한 C-말단 융합을 위한 정확한 리딩 프레임이 유지되었다. 목적하는 클로닝된 단백질의 첫번재 및 마지막 아미노산을 표 1에 기재할 뿐만 아니라 GenBank 또는 Swiss-Prot 데이터베이스에서의 수탁번호 또는 참조번호도 기재한다. 모든 파아지미드의 정확한 서열은 DNA 서열결정법으로 확인하였다.

디자인된 안키린 단백질(DARPin) 3a 및 2_3 의 경우, PelBss (pDST80 및 pDST81), SfmCss (pDST86 및 pDST87), TolBss (pDST84 및 pDST85) 및 TorTss (pDST88 및 pDST89)를 암호화하는 파아지미드는 상기 DsbAss 및 PhoAss에 대해 기재한 것과 동일한 클로닝 전략을 이용하여 생성하였다.

파아지 생산 및 정제

1% 글루코오스, 34 ㎍/ml 클로람페니콜 (cam) 및 15 ㎍/ml 테트라사이클린(tet)를 함유하는 5 ml 2 x YT 배지에 목적하는 파아지미드를 갖는 대장균 XL-1 Blue의 단일 콜로니를 접종하고 진탕하면서 30℃에서 철야로 세포를 생장시켰다. 1% 글루코오스, 34 ㎍/ml cam 및 15 ㎍/ml tet를 함유하는 신선한 5 ml 2 x YT 배지에 상기 철야로 배양한 배양물을 1:100 비율로 접종(OD ₆₀₀ ~ 0.04)로 접종하고 37℃에서 진탕하면서 OD ₆₀₀ 0.5까지 생장시켰다. 이 배양물에 VCS M13 헬퍼 파아지를 4 x 10 ¹⁰ pfu (플라크 형성 유닛)/ml (감염다중도 ~ 20)로 감염시키고 이들 세포를 37℃에서 교반없이 배양한 다음 37℃에서 교반하면서 30분간 배양하였다. 이 배지는 원심분리(3500 g, 24℃, 10분)에 의해 세포를 수집함으로써 변경하고 34 ㎍/ml cam, 50 ㎍/ml 카나마이신(kan) 및 0.1 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)를 함유하는 50 ml 2xYT 배지에 펠릿을 재현탁시켰다. 30℃에서 진탕시키면서 14 내지 16시간 동안 생장시킨 후, 세포를 원심분리(5600 g, 4℃, 10분)에 의해 제거하였다. 배양 상층액을 얼음상에서 1시간 동안 1/4 부피의 얼음 냉각 PEG/NaCl 용액 (20% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 6000, 2.5M NaCl)과 함께 배양하였다. 석출한 파아지 입자를 원심분리(5600 g, 4℃, 15분)한 다음 1 ml의 TBS ₁₅₀ (25 mM 트리스/HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5)에 재용해시켰다. 파아지 입자의 정제는 다음과 같이 CsCl 구배 원심분리에 의해 실시하였다. CsCl 용액을 1/2 x 1/2 인치 폴리알로머 튜브(Beckmann 제조, USA, No. 358980)에 전달하고 100000 rpm에서 TLN-100 로터 (베크만 인스트루먼트 제조) 중, 4℃에서 4시간 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 파아지 밴드를 회수하였다. 파아지를 TBS ₁₅₀ 가 3ml 충전된 1/2 x 1/2 인치 폴리카보네이트 튜브 (Beckmann 제조, USA, No. 349622)에 전달하였다. TLA-100 로터 중, 4℃에서 50,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리한 후, 펠릿화된 파아지를 3 ml의 TBS에 재용해시켰다. TLA-100 중에서 50,000 rpm으로 1시간 동안 부가적으로 원심분리 한 후, 파아지 입자를 분광광도계로 정량하였다. 파아지 샘플의 감염 역가는 1% 글루코오스 및 34 ㎍/ml cam을 함유하는 2 x YT 한천 플레이트를 이용하여 대장균 XL-1 Blue 세포 상에서 적정함으로써 결정하였다. 37℃에서 철야로 배양한 후 콜로니를 산출하였다.

파아지 블럿

CsCl 구배에 의해 정제된 5 x 10 ¹¹ 파아지 입자를 환원 조건하에서 15% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) Immobilon-P 전달 막 (밀리포어, USA)에 전기블럿팅에 의해 전달하였다. 이 막을 MTTBS ₁₅₀ (TBS ₁₅₀ , 0.1% Tween 20, 5% 탈지유)를 사용하여 실온(RT)에서 1시간 동안 차단시키고 또 pIII의 C-말단 도메인을 인식하는 쥐의 항-pIII 항체(MoBiTec, 독일, No. PSKAN3)(MTTBS ₁₅₀ 중 1:1000, 실온에서 20분간)를 일차 항체로 사용하여 함께 배양하였다. F(ab') ₂ 단편 염소 항-마우스 IgG 꽃양배추 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(Pierce, USA, No. 31438)(MTTBS ₁₅₀ 중 1:10,000, 실온에서 1 시간)를 이차 항체로 사용하였다. 단백질은 ChemiGlow West 기질(알파 이노테크, USA)을 사용하여 검출하였다. 두번째 실험으로서, 차단된 막은 쥐의 항-FLAG M1 항체(시그마, USA, No. F3040)(MTTBS ₁₅₀ 중 1:5,000, 실온에서 1시간)를 일차 항체로 사용하여 배양하였다. 염소 항-마우스 IgG 알칼리성 포스파타아제 콘쥬게이트 (시그마, USA, No. A3562)(MTTBS ₁₅₀ 중 1:10,000, 실온에서 1시간)를 이차 항체로 사용하였다. 단백질은 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 (BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)(Fluka, 스위스)를 사용하여 검출하였다.

파아지 ELISA

파아지 ElISA는 M13 파아지 입자 상에서 기능적으로 디스플레이된 DARPin의 양을 평가하기 위해 실시하였다. 비오티닐화된 APH 및 JNK2 단백질(Binz et al., 상기 참조)은 다음과 같이 고정화시켰다: TBS ₁₅₀ 중의 뉴크라비딘(66 nM, 100 ㎕/웰; Cocochim, 스위스)은 4℃에서 철야로 배양하는 것에 의해 MaxiSorp 플레이트 (Nunc, 덴마크, No. 442404) 상에 고정시켰다. 이 웰은 실온에서 300 ㎕ BTTBS ₁₅₀ (TBS ₁₅₀ 0.1% Tween 20, 1% BSA)와 함께 1시간 동안 차단시켰다. BTTBS ₁₅₀ 중의 비오티닐화된 APH 및 JNK2 단백질 (100 ㎕, 1 μM)의 결합은 4℃에서 1시간 동안 실시하였다. BTTBS ₁₅₀ 중의 파아지 입자의 희석 시리즈를 웰에 부가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 웰을 300 ㎕ TTBS ₁₅₀ (TBS ₁₅₀ 0.1% Tween 20)으로 5분간 5회 웰을 세척한 후, 결합된 파아지 입자는 항-M13 꽃양배추 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(애머샴 파마시아 바이오테크 제조, UK, No. 27-9421-01) 및 용해성 BM Blue POD 기질 (고체 다이아그노스틱스, 독일, No. 1484281)을 사용하여 검출하였다.

파아지 패닝(Phage panning)

E3_5, E3_19, 3a 및 2_3 디스플레이 파아지 입자는 PhoA 시그널 서열을 함유하는 파아지미드(pDST30, pDST65, pDST22, pDST34)로부터 또는 DsbA 시그널 서열을 암호화하는 파아지미드(pDST32, pDST66, pDST23, pDST37)으로부터 생성하였다. PhoAss 또는 DsbAss를 암호화하는 파아지미드로부터 생성된 파아지 입자의 혼합물을 제조하기 위해 이들 파아지 입자를 사용하였다. 비-결합 DARPin E3_5 및 E3_19를 디스플레이하는 파아지 입자의 1:1 혼합물에, 표적 특이적 DARPin 3a 또는 2_3을 디스플레이하는 파아지 입자를 1:10 ⁷ 희석으로 부가하였다. 비오티닐화된 APH 및 JNK2 단백질은 파아지 ElISA에 기재한 바와 같이 코팅하였다. 각 웰에 0.1 ml의 파아지 입자 혼합물(10 ¹³ cfu/ml)를 0.1 ml BTTBS ₁₅₀ 에 부가하고 2시간 동안 배양하였다. TTBS ₁₅₀ 으로 세척(제1 선택 주기에 대해 3회, 제2 주기에 대해 4회 및 부가적 주기에 대해 5회)하고 또 TBS ₁₅₀ 을 사용하여 세척(제1 선택 주기에 대해 3회, 제2 주기에 대해 4회 및 부가적 주기에 대해 5회)한 후, 파아지 입자를 약 22℃에서 0.2 ml 용출 완충액(0.2 M 글리신/HCl, pH 2.2)으로 15분간 배양하는 것에 의해 용출시킨 다음 37℃에서 0.2 ml 글리신(TBS ₁₅₀ 중의 10 mg/ml)으로 30분간 용출시켰다. 모아진 용출액(2M Tris-염기를 사용한 중화)는 기하급수적으로 증가하고 있는 대장균 XL1-Blue 4ml를 감염시키는데 사용하였다. 37℃에서 교반없이 30분간 처리한 다음, 교반하면서 37℃에서 30분 후, 1% 글루코오스, 34 ㎍/ml cam 및 15㎍/ml tet를 함유하는 2 x YT 한천 플레이트 상에 분포시키고 37℃에서 철야로 생장시켰 다. 1% 글루코오스, 15% 글리세롤, 34 ㎍/ml cam 및 15㎍/ml tet를 함유하는 2 x YT를 사용하여 상기 플레이트로부터 세포를 세척하고 다음 주기 패닝용 파아지 생산을 위해 사용하였다. 각 패닝 주기 후, 9 내지 16회 용출된 파아지 입자의 확인을 실시하였다. 이것은 클론 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의해 파아지 입자의 대장균 감염 및 클론 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 콜로니의 스크리닝을 실시하였다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Zurich <120> Phage display using cotranslational translocation of fusion polypeptides <130> P332A <150> EP05106236.2 <151> 2005-07-08 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala <210> 2 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> E1 - T245 of single-chain Fv binding gpD containing a disulfide bond <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Leu Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Gln Tyr Gly Ser Asp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys Arg Thr 245 <210> 3 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> D13 - Q166 of DARPin 3a binding APH <400> 3 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala Asn Asp 20 25 30 Trp Phe Gly Ile Thr Pro Leu His Leu Val Val Asn Asn Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Ile Glu Val Leu Leu Lys Tyr Ala Ala Asp Val Asn Ala Ser 50 55 60 Asp Lys Ser Gly Trp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Tyr Arg Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Met Asp Tyr Gln Gly Tyr Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Glu Asp Gly 100 105 110 His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Tyr Gly Ala Asp Val Asn 115 120 125 Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp Ile Ser Ile Asp Asn 130 135 140 Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln 145 150 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide derived from transcription factor GCN4 (R249 to R281, E259-, S262P) <400> 4 Arg Met Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Asn Tyr 1 5 10 15 His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oDST4 oligonucleotide <400> 5 agagcatgcg taggagaaaa taaaatgaaa aagatttggc tggcgctggc tgg 53 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oDST5 oligonucleotide <400> 6 tctttgtagt ccgccgatgc gctaaacgct aaaactaaac cagccagcgc cagcc 55 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oDST6 oligonucleotide <400> 7 gctctagagc atgcgtagga g 21 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oDST8 oligonucleotide <400> 8 gcggatccat ctttgtagtc cgccg 25 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9 Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 1 5 10 15 Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oDST4p oligonucleotide <400> 10 agagcatgcg taggagaaaa taaaatgaaa caaagcacta ttgcactggc actcttaccg 60 <210> 11 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oDST5p oligonucleotide <400> 11 ccatctttgt agtcggcttt ggtaacaggg gtgaagagca acggtaagag tgccagtgc 59 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oDST8p oligonucleotide <400> 12 gcggatccat ctttgtagtc ggc 23 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Erwinia carotovora <400> 13 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Met Met Thr Lys Ile Lys Leu Leu Met Leu Ile Ile Phe Tyr Leu Ile 1 5 10 15 Ile Ser Ala Ser Ala His Ala 20 <210> 15 <211> 21 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 15 Met Lys Gln Ala Leu Arg Val Ala Phe Gly Phe Leu Ile Leu Trp Ala 1 5 10 15 Ser Val Leu His Ala 20 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Met Arg Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Phe Met Leu Pro Ala 1 5 10 15 Phe Ser