혈청을 사용하는 ｃＤＮＡ 라이브러리의 선택에 의한 특정종양 항원의 동정 및 진단 영상 기법에서 상기 항원의 용도

혈청을 사용하는 ｃＤＮＡ 라이브러리의 선택에 의한 특정 종양 항원의 동정 및 진단 영상 기법에서 상기 항원의 용도{IDENTIFICATION OF SPECIFIC TUMOR ANTIGENS BY MEANS OF THE SELECTION OF CDNA LIBRARIES WITH SERA AND THE USE OF SAID ANTIGENS IN DIAGNOSTIC IMAGING TECHNIQUES}

조기 진단은 특히 환자의 삶의 질을 상당히 개선시킬 수 있을뿐만 아니라 국가 보건 체계 부문과 환자 자신의 경비 지출을 동시에 절감할 수 있게 하기 때문에 모든 의학 분야에서 중요한 상위에 있으며 매우 희망했던 목적이다.

오늘날에는 이용할 수 있는 다양한 진단 기법들 중에서 소위 비 침습적 기법들, 이중에서도 환자에게 복잡하고 때로는 고통스럽거나 위험한 진단 조사, 예를 들어 샘플을 취하는 조사 및 생검법을 가하지 않고서도 가능한 병리학적 이상의 존재를 확인하는 방법을 나타내는 각종 영상 기법을 선호하는 경향이 있다.

가장 흔히 사용되는 영상 기법들로 전산화 단층 촬영술(TC), 자기 공명(MR) 초음파촬영술(US) 및 섬광조영술을 들 수 있다.

이들 상 포착 기법은 점점 더 효율적인 조영제의 사용을 요한다. 그러나, 상기 기법의 개발은 지금까지 조직 특성화에 대한 신호 특이성 개발의 성공 없이 오직 향상된 감도를 통한 상에 의해 제공되는 해부학적 특성화의 개선만을 겨냥한다. 오늘날 대단히 작은 크기의 해부학적 병변들 조차도 가시화할 수 있지만, 관찰된 병변의 성질에 대한 규명은 여전히 침습적인 유형의 조사를 필요로 한다.

상기 문제에 대한 하나의 해법은 건강한 조직과 병리학적 병변간의 상에 있어서의 콘트라스트 정도를 선택적이고 특이적으로 증가시킬 수 있는 조영제의 개발이다.

공지된 기법에 의해 제공되는 일례로서 조영제의 비히클로서 단클론 항체의 사용이 있으며 이러한 의미의 시도가 SC 및 MR 분야에서 수행되었다. SC 기법의경우 긍정적인 결과가 성취된 반면, 상기 기법은 여전히 추가적인 개선을 필요로 하며 MR에서의 결과는 아직 불만족스럽다. 상기 결과에 대한 유사한 개선의 필요성이 또한 US 분야에서도 인식되고 있다.

종양 항원의 동정은 표적-특이적인 조영제(TSCM)의 제작에 새롭고 보다 나은 시약들을 제공할 수 있다. 다소 특이적인 종양 항원들이 공지되어 있으며, 이들은 실험실 동물에서 항체를 자극하기 위한 항원-면역원으로서 종양 세포를 사용하여 수득되었다. 또한 환자 자신에서의 항체의 형성을 자극하는 다수의 종양 항원들이 공지되어 있다(예를 들어 p53, HER-2/neu). 이러한 유형의 항원들은 대체로 건강한 조직과 종양 조직 사이를 식별하는 마커로서 탁월한 후보들이다. 그러나, 이들의 동정은 통상적인 방법을 사용하는 경우 어렵다.

다양한 유형의 종양을 앓고 있는 환자의 혈청을 사용하는 cDNA 라이브러리의 분석(선별) 방법에 대한 최근의 개발(SEREX로서 공지됨, 재조합 cDNA의 발현을 통한 자가 종양 항원에 대한 혈청학적 분석, PNAS 92, 11810-1995 참조)은 다수의 종양 항원들의 동정을 도출시켰다.

상기 SEREX 기술은 새로운 종양 항원의 동정에 확실히 유용하지만, 매우 힘든 라이브러리 선별 공정, 고도의 배경 소음 및 다량의 물질이 필요하다는 다수의 단점들을 제공한다.

최초의 종양 항원(탄산 탈수효소)이 특성화된 1993년 이래로, 600 개 이상의 상이한 단백질들이 종양에서 특이적으로 발현되었으며 이에 대해 발생된 면역 반응이 확인되었고(M. Pfreundschuch et al. Cancer Vaccine Week, InternationalSymposium, 1998년 10월 5-9일, S03), 이 숫자는 훨씬 더 증가될 예정이다[지금까지 SEREX 데이터베이스는 1695 개의 공개 서열을 함유한다(www.licr.org/SEREX.html)]. 단리된 상기 서열의 20 내지 30%가 아직까지 알려지지 않은 유전자 산물임에 주목하는 것은 흥미롭다.

그러나, 종양의 진단 및 치료를 위한 특정 종양 항원의 동정 기법을 개선하기 위해서 추가의 연구가 필요하다.

발명의 요약

본 발명에 이르러 작은 단백질 도메인들을 상응하는 유전자 정보를 함유하는 박테리오파지의 표면상에 나타내는 라이브러리들의 선택을 기본으로 하는 전략인 SEREX 기법과 파지 표시의 결합이, 혈청을 사용하는 cDNA 표시 라이브러리의 선택에 의한 특정 종양 항원의 동정 방법을 제공함을 발견하였다. 상기 방법을 사용하여 매우 큰(즉 다수의 상이한 서열들을 표시하는) 라이브러리로부터 항원을 동정할 수 있는 것으로 나타났다. 상기에 의해 동정된 항원들은 상기를 조영제의 제조에 사용하거나 또는 특정한 리간드(이는 차례로 조영제의 제조에 사용될 수 있다)를 수득할 수 있게 한다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 혈청을 사용하는 cDNA 표시 라이브러리의 선택에 의한 특정 종양 항원의 동정 방법이며, 상기 선택을 파지 표시 기법을 사용하여 수행함을 특징으로 한다.

본 발명의 목적은 종양 병변의 진단 영상화를 위한 조영제의 제조에 유용한종양 항원의 동정 방법뿐만 아니라 상기에 의해 수득된 조영제를 제공하는 것이다.

상기 조영제를 당해 분야에 널리 공지된 통상적인 과정에 따라 제조할 수 있으며 추가의 설명은 필요하지 않다.

본 발명은 종양을 앓고 있는 대상자로부터 유래된 cDNA 라이브러리의 혈청에 의한 선택을 사용하여 특정 종양 항원을 동정하는 방법, 및 특히 종양의 진단을 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 동물 또는 인체에 직접 사용되지 않는 진단 보조제의 제조 기술 분야에 관한 것이다.

본 발명은 약학 분야에서 산업적인 적용에 적합한 화합물, 그의 제조 방법, 그의 사용 방법, 및 상기 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 기관 및 조직의 병리학적 이상의 탐지 및 진단을 위한 영상 기법과 같은 진단 의학에 유용한 물질에 적합한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다.

특히, 그다지 독점적인 것은 아니지만, 본 발명은 종양 진단 분야에 관한 것이다.

본 발명은 생검법(바람직하게는 신선한) 및 배양된 종양 주 모두로부터 수득된 종양 세포로부터의 cDNA 라이브러리의 제작, 새로운 것들을 포함한, 종양 항원을 동정하기 위한 자가 및 이종 환자 혈청을 사용하는 상기와 같은 라이브러리의 선택(선별), 상기 항원의 특성화, 상기 종양 항원에 대한 특정 리간드(예를 들어 항체, 예를 들어 재조합 인간 항체 또는 인간화된 재조합 쥐 항체)의 제조, 및 상기 제조된 리간드를 포함하는 표적-선택적인 조영제의 제작을 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 유리하게, 상기 개략된 바와 같이 상기 SEREX 기법의 단점을 피하면서 동시에 상기 정의된 파지-표시 기법의 효능을 갖는 SEREX 접근법을 병행한다.

"파지 표시"가 의미하는 것은 당해 분야의 통상적인 숙련가가 이해하는 바와 같이 작은 단백질 도메인들을 상응하는 유전자 정보를 함유하는 박테리오파지의 표면 상에 노출시키는 라이브러리의 선택을 기본으로 하는 전략이다.

본 발명에 따라 수행되는 방법은 하기의 신규하고 유리한 분석 가능성을 최초로 제공한다:

-종양을 앓고 있는 환자들의 혈청을 사용하여 라이브러리를, 그의 복잡성을감소시키는 방식으로 선별에 앞서 선택하여 특정 항원들을 발현하는 클론들을 풍부하게 하여 종양 항원들의 동정에 보다 적은 양의 혈청을 사용한다;

-기술적인 문제로 인해 현 시점에서의 기술 수준으로 실감되는 바와 같이 cDNA 라이브러리의 직접적인 선별은 다수의 클론들(대략 100만개 이상의 클론들)을 분석할 수 없게 하며 따라서 재조합 DNA 기술의 모든 가능성을 이용하는데 부적합하게 만든다. 본 발명에 따른 방법에 의해, 실제로 SEREX에 전통적으로 사용되는 것보다 10 내지 100 배 이상 큰 라이브러리의 제작 및 분석이 가능하며, 따라서 오직 제한된 정도로만 제공되는 항원들조차도 동정할 수 있는 가능성이 증가된다;

-마지막으로, 상이한 환자들의 혈청 또는 혈청 혼합물을 사용하여 후속적인 선택 주기를 수행하는 가능성은 본 발명의 주요 목적들 중 하나를 구성하는 교차 반응성 종양 항원의 동정을 용이하게 한다.

비-방향성 방식으로 클로닝된 cDNA의 라이브러리에서 생산된 단백질의 약 1/6(16.7%)이 정확할 것으로 예상된다. 정확한 번역 산물을 갖는 상기 유형의 라이브러리의 강화가 발현/표시 라이브러리의 진정한 과제이다. 본 발명은 또한 cDNA의 발현을 위한 새로운 벡터와 "프레임 밖" 단백질의 제한된 발현을 갖는 박테리오파지 람다 단백질 D(pD)의 아미노 말단 부분과의 융합부로서 단백질의 표시를 제공한다. 상기 벡터 디자인에 따라, 상기 파지는 그의 ORF("개방 판독 프레임")가 pD의 것과 일치하는 경우에만 표면상에 단백질 단편을 표시한다. 본 발명의 라이브러리에서 클로닝된 DNA의 단편들의 평균 크기는 100 내지 600 bp(염기쌍)이며, 통계학적 이유로 상기 "프레임 밖" 서열들의 대부분은 pD의 번역을 허용하지않고 파지 표면상에 나타나지 않는 정지 코돈을 함유한다. 이 경우에, 야생형 gpD의 람다 게놈의 사본은 캡시드의 조립을 지원한다. cDNA 라이브러리에 대한 새로운 발현/표시 벡터(λKM4)는 cDNA 단편에 의해 암호화되는 재조합 단백질이 박테리오파지 자체의 단백질과의 융합부로서 발현되어 캡시드 상에 나타난다는 점에서 SEREX 실험에 사용된 것(λgt11)과 다르다.

각각의 라이브러리에 대해서, 적합한 수의 세포, 예를 들어 10 ⁷ 세포의 전령 RNA를 통상적인 상업적으로 입수할 수 있는 수단을 사용하여 상응하는 cDNA가 생성되는 것으로부터 정제한다. 이어서 상기를 발현/표시 벡터 λKM4에 클로닝시킨다. 상기 라이브러리의 증폭은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 통상의 기법, 예를 들어 도말, 생육, 용출, 정제 및 농축에 의해 수행된다.

이어서 상기 라이브러리들을 동정된 서열의 선택, "선별" 및 특성화에 필요한 조건을 개발하는데 사용한다.

인간 세포로부터 유래되는 cDNA를 사용하여 제작한 파지-표시 유형의 라이브러리는 캡시드 상에 인간 단백질(일반적으로 종양에서 발현되는)의 일부들을 발현하고 내부에 상응하는 유전자 정보를 함유하는 박테리오파지의 수집물과 특정 혈청의 배양을 기본으로 하는, 친화성에 의한 선택의 이용을 허용한다. 혈청 중에 존재하는 항체와 특이적으로 결합하는 박테리오파지는 고체 지지체에 결합(항체 자체에 의해)된 채로 있고; 다른 한편으로 비 특이적인 것은 씻겨져 나간다는 점에서 쉽게 회수된다.

"선별", 즉 주어진 혈청의 항체와 결합하는 단일 파지 클론의 능력에 대한 직접적인 분석은 오직 라이브러리의 복잡성(즉 상이한 수의 서열들)이 실질적으로 감소될 때인 나중의 단계에서만 선택의 결과로서 수행된다.

선택 전략의 사용은 예를 들어 종양이 있는 환자의 혈청 중에 존재하는 항체와 특이적으로 상호작용하는 특정한 특징에 반응하는 것들을 동정하기 위해서 다수의 상이한 단백질 서열들을 보다 신속하게 분석할 수 있게 한다.

친화성에 의한 선택은 캡시드 상에 인간 단백질(일반적으로 종양에서 발현되는)의 일부들을 발현하고 내부에 상응하는 유전자 정보를 함유하는 박테리오파지의 수집물들과 특정 혈청을 배양하는 것을 기본으로 한다. 상기 혈청 중에 존재하는 항체들과 특이적으로 결합하는 박테리오파지는 상기가 고체 지지체에 (항체 자체에 의해) 결합된 채로 유지되고; 다른 한편으로 비 특이적인 것은 씻겨져 나간다는 점에서 쉽게 회수된다.

"선별", 즉 주어진 혈청의 항체에 결합하는 단일 파지 클론의 능력에 대한 직접적인 분석은 오직 라이브러리의 복잡성(즉 상이한 수의 서열들)이 실질적으로 감소될 때인 나중의 단계에서만 선택의 결과로서 수행된다.

이는 작업 부하를 감소시키며, 특히 각 분석에 대해 혈청을 보다 적은 양으로 사용할 수 있게 한다.

전통적인 cDNA 라이브러리의 직접적인 "선별"은 실제로 다량의 혈청의 사용을 수반하며, 상기 혈청은 생산하기가 항상 쉬운 것은 아니다. 대략 10 ⁶ 개의 독립적인 클론들의 라이브러리를 분석하기 위해서는 미리 선택된(자가) 혈청을 감염된 세균을 갖는 다양한 페트리 디쉬로부터 옮겨진 총 10 ⁶ 개 이상의 파지 플라크를 함유하는 다수의 필터들과 배양해야 할 것이다. 또 다른 혈청을 사용하여 동일한 라이브러리를 분석하는 것은 오직 증폭된 라이브러리를 사용하는 경우에만 가능하며, 이는 10 ⁶ 개의 클론들을 분석하거나, 원래 라이브러리의 복잡성을 상실하거나, 또는 상기 선별을 10 내지 100 배 확장시키고 10 ⁷ 내지 10 ⁸ 개의 클론들을 시험함을 의미한다.

더욱이 상기 전략은 라이브러리에 단지 소량만 존재하거나 낮은 농도로 존재하는 항체에 의해 인식되는 항원들의 동정을 허용하지 않으며 상이한 혈청을 사용하는 다중 분석의 실행도 허용하지 않는다.

다른 한편으로 파지-표시 유형의 라이브러리의 사용은 증폭된 라이브러리의 총 10 ¹⁰ 내지 10 ¹¹ 파지 입자 및 제한된 양의 혈청, 예를 들어 10 ㎕로부터 출발하여, 직접 선별에 앞서 적은 부피(0.1 내지 1 ㎖)로 친화성에 의한 선택을 허용한다. 따라서, 전통적인 라이브러리보다 10 내지 100 배 이상 복잡한 라이브러리를 편리하게 실행시킬 수 있으며, 결과적으로 곤란한 것으로 간주되었던 항원들의 동정 확률이 증가된다. 예를 들어, 2 개의 선택 주기 및 하나의 선별을 82 ㎜ 필터 상에서 수행하는 경우, 혈청의 총체적인 소비는 단지 40 ㎕일 수 있다.

더욱이, 파지-표시 유형의 라이브러리에 대한 분석을 다수의 상이한 혈청을사용하여 잠재적으로 수행할 수 있음은 중요하다. 따라서 동일한 유형의 종양에 걸린 상이한 환자의 혈청 중에 존재하는 항체와 상호작용할 수 있는 항원(교차 반응성 항원)의 동정에 유리한 선택 전략의 사용이 가능하다.

다양한 프로토콜들을 상이한 고체 지지체의 사용을 근거로 채택할 수 있다. 이러한 프로토콜들은 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.

다양한 프로토콜들을 상이한 고체 지지체의 사용을 근거로 사용할 수 있으며, 이들 지지체의 예는 하기와 같다:

-세파로스: 결합된 파지를 갖는 혈청 항체를 면역글로불린을 특이적으로 인식하는 단백질 A로 코팅된 세파로스 수지에 부착시킨다. 상기 수지를 간단한 원심분리 공정에 의해 세척하여 비 특이적인 성분을 제거할 수 있다;

-자석 비드: 결합된 파지를 갖는 혈청 항체를 인간 항-IgC 다클론 항체로 코팅된 자석 비드를 사용하여 회수한다. 상기 비드를 세척하면 상기가 자석이 있는 시험관 벽에 부착된다.

-페트리 디쉬: 결합된 파지를 갖는 혈청 항체를 단백질 A로 미리 코팅시킨 페트리 디쉬에 부착시킨다. 상기 디쉬를 세척액을 간단히 흡인시킴으로써 세척한다.

-본 발명을 이제 실시예와 도면에 의해 보다 상세히 예시할 것이며, 도 1은 벡터 λKM4의 지도를 나타낸다.

파지 및 플라스미드:

플라스미드 pGEX-SN을 합성 올리고뉴클레오티드 K108 5'-GATCCTTACTAGTTTTAGTAGCGGCCGCGGG-3' 및 K109 5'-AATTCCCGCGGCCGCTACTAAAACTAGTAAG-3'의 하이브리드화로부터 나온 DNA 단편을 플라스미드 pGEX-3X의 BamHI 및 EcoRI 부위에 클로닝시킴으로써 제작하였다(Smith DB and Johnson KS Gene, 67(1988) 31-40).

플라스미드 pKM4-6H를 합성 올리고뉴클레오티드 K106 5'-GACCGCGTTTGCCGGAACGGCAATCAGCATCGTTCACCACCACCACCACCACTAATAGG-3' 및 K107 5'-AATTCCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAACGATGCTGATTGCCGTTCCGGCAAACGCG-3'의 하이브리드화로부터 나온 DNA 단편을 플라스미드 pKM4의 RsrII 및 EcoRI 부위에 클로닝시킴으로써 제작하였다.

친화성에 의한 선택

팔콘 플레이트(6 ㎝, Falcon 1007)를 밤새 4 ℃에서 NaHCO ₃ (50 mM, pH 9.6) 중의 1 ㎍/㎖의 단백질 A(Pierce, #21184) 3 ㎖로 코팅하였다. 코팅액을 버린 후에, 플레이트를 37 ℃에서 2 시간 동안 차단 용액(1 x PBS 중의 5% 건조 탈지유, 0.05% 트윈 20) 10 ㎖과 배양하였다. 인간 혈청 10 ㎕를 차단 용액 1 ㎖ 중의 BB4 세균 추출물 10 ㎕ 및 MgSO ₄ 10 ㎕와 함께 서서히 교반하면서 37 ℃에서 30 분간 예비 배양하였다. 라이브러리의 약 10 ¹⁰ 파지 입자를 서서히 교반하면서 37 ℃에서 추가로 1 시간 동안 상기 혈청 용액에 가하였다. 배양 혼합물을 단백질 A로 코팅된 플레이트 상에 도말하고 실온에서 30 분간 방치시켰다. 상기 플레이트를 세척액(1 x PBS, 1% 트리톤, 10 mM MgSO ₄ ) 10 ㎖로 수회 세정하였다. 결합된 파지를 상기 플레이트에 직접 첨가된(플레이트 당 600 ㎕) BB4 세포의 감염에 의해 회수하였다. 용융된 NZY-Top 아가(48-50 ℃) 10 ㎖을 상기 감염된 세포에 가하고 NZY 플레이트(15 ㎝)에 즉시 부었다. 다음 날, 상기 플레이트를 4 ℃에서 4 시간 동안 SM 완충액 15 ㎖과 함께 교반하면서 배양하여 파지를 수거하였다. 상기 파지를 PEG 및 NaCl 침전에 의해 정제하고 4 ℃에서 0.05% 나트륨 아지드가 있는 초기 부피의 1/10의 SM 중에서 보관하였다.

면역선별

세균 배지의 파지 플라크를 4 ℃에서 1 시간 동안 건조 니트로셀룰로즈 필터(Schleicher & Schuell) 상으로 옮겼다. 상기 필터를 실온에서 차단 완충액(1 x PBS 중의 5% 무수 탈지유, 0.05% 트윈 20)으로 1 시간 동안 차단시켰다. 인간 혈청 20 ㎕를 차단 완충액 4 ㎖ 중의 BB4 세균 추출물 20 ㎕, 야생형 람다 파지 10 ⁹ /㎖과 예비 배양하였다. 상기 차단 용액을 버린 후에, 필터를 실온에서 교반하면서 2 시간 동안 혈청 용액과 배양하였다. 상기 필터를 PBS x 1, 0.05% 트윈 20으로 수회 세척하고 1:5000으로 희석된 알칼리성 포스파타제(Sigma A 2064)와 결합된 인간 항-IgG 2 차 항체와 배양하였다. 이어서 상기 필터를 상기와 같이 세척하고, 기질 완충액(100 mM 트리스-HCl, pH 9.6, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl ₂ )으로 간단히 세정하였다. 각각의 필터를 니트로 블루 테트라졸륨 330 ㎎/㎖, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 165 ㎎/㎖을 함유하는 기질 완충액 10 ㎖과 함께 배양하였다. 수 세척에 의해 반응을 정지시켰다.

람다 파지의 대규모 제조(용원 세포로부터)

BB4 세포를 0.2% 말토오즈 함유 LB에서 OD ₆₀₀ = 1.0까지 증식시키고, 원심분리에 의해 회수하고 SM 완충액에 OD ₆₀₀ = 0.2까지 재 현탁시켰다. 100 ㎕의 세포를 낮은 감염 다중성으로 람다로 감염시키고, 실온에서 20 분간 배양하고, 암피실린이 있는 LB 아가 상에 도말하고 32 ℃에서 18 내지 20 시간 동안 배양하였다. 다음 날, 단일 콜로니를 암피실린이 있는 LB 10 ㎖ 중에서 32 ℃에서 교반하면서 배양하였다. 암피실린 및 MgSO ₄ 10 mM이 있는 새로운 LB 500 ㎖에 큰 플라스크 중에서 밤새 배양액 5 ㎖을 접종하고 격렬히 교반하면서 32 ℃에서 OD ₆₀₀ = 0.6까지 증식시켰다. 상기 플라스크를 45 ℃에서 수 욕 중에서 15 분간 배양하고, 이어서 추가로 3 시간 동안 진탕기에서 37 ℃에서 배양하였다. 10 ㎖의 클로로포름을 상기 배양액에 가하여 세포 용해를 완료시키고 혼합물을 진탕기에서 37 ℃에서 추가로 15 분간 배양하였다. 파지를 표준 과정에 따라 용해물 배양액으로부터 정제하였다(Sambrook, J., Fritsch, EF & Maniatis, T.(1989) Molecular Cloning, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

ELISA를 위한 파지 용해물을 유사한 과정에 의해, 그러나 클로로포름의 첨가 없이 용원 세포로부터 제조하였다. NaCl 및 PEG로 침전시킨 후에, 박테리오파지 펠릿을 나트륨 아지드(0.05%)가 있는, 출발 부피의 1/10의 SM 완충액에 재 현탁시키고 4 ℃에서 보관하였다.

람다 ELISA

다중 웰 플레이트(면역플레이트 Maxisorb, Nunc)를 밤새 4 ℃에서 NaHCO ₃ (50 mM, pH 9.6) 중의 0.7 ㎍/㎖ 농도의 항-람다 다클론 항체 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 상기 코팅액을 버린 후에, 플레이트를 차단 용액(1 x PBS 중의 5% 건조 탈지유, 0.05% 트윈 20) 250 ㎕와 배양하였다. 상기 플레이트를 세척 완충액(PBS x 1, 트윈 20)으로 2 회 세척하였다. 차단 완충액과 파지 용해물(1:1)의 100 ㎕ 혼합물을 각 웰에 가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 인간 혈청 1 ㎖을 실온에서 차단 완충액 100 ㎕ 중의 10 ⁹ 플라크 형성 단위(pfu)의 파지 λKM4, 1 ㎕의 토끼 혈청, 1 ㎕의 BB4 추출물, 1 ㎕의 FBS와 함께 30 분 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 파지 용해물과 배양한 후에 세척하고 37 ℃에서 60 분 동안 혈청 용액과 함께 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 세척하고 염소 항-인간 HRP 결합된 항체를 차단 완충액/2 차 항체 혼합물(차단 용액 중의 1:40 토끼 혈청)에 1:20000의 희석비로 가하였다(Jackson ImmunoResearch Laboratories). 30 분 배양한 후에, 플레이트를 세척하고 페록시다제 활성을 TMB 액체 기질 시스템(Sigma) 100 ㎕로 측정하였다. 15 분 전개시킨 후에, 반응을 25 ㎕의 H ₂ SO ₄ (2 M)로 정지시켰다. 플레이트를 자동 ELISA 플레이트 판독기로 판독하고 결과를 A=A _450㎚ - A _620㎚ 로서 나타내었다. ELISA 데이터를 2 개의 독립적인 분석의 평균값으로서 측정하였다.

λKM4의 제작

플라스미드 pNS3785(Hoess, 1995)를 람다 파지에의 후속적인 클로닝을 위해 올리고뉴클레오티드 서열 KT1 5'-TTTA TCTAGA CCCAGC CCTAGG AAGCTTCTCCTGAGTAGGACAAATCC-3'(XbaI 및 AvrII 부위(밑줄)를 가짐) 및 KT2 5'-GGG TCTAGA TAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTC-3'(XabI 가짐)를 사용하여 역 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 역 PCR에서, Taq 폴리머라제와 Pfu DNA 폴리머라제의 혼합물을 사용하여 DNA 합성의 충실도를 증가시켰다. 25 개의 증폭 주기를 수행하였다(95 ℃-30 초, 55 ℃-30 초, 72 ℃-20 분). XbaI 엔도뉴클레아제로 미리 절단시킨 PCR 산물의 자가-연결에 의해 플라스미드 pKM3가 생성되었다. 람다 pD 유전자를 프라이머 K51 5'-CCGCCTT CCATGG GT ACTAGT TTTAAAT GCGGCCGC ACGAGCAAAGAAACCTTTAC-3'(제한 부위 NcoI, SpeI, NotI(밑줄) 함유) 및 K86 5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCC-3을 사용하여 플라스미드 pNS3785로부터 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PCR 산물을 정제하고 NcoI 및 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 pKM3의 상기 NcoI 및 EcoRI 부위에 재 클로닝시켜, 오직 gpD의 5' 말단에 SpeI 및 NotI 제한 부위만을 갖는 플라스미드 pKM4를 생성시켰다. 상기 플라스미드를 XbaI 효소로 절단하고 람다 파지 λDam15imm21nin5(Hoess, 1995)의 XbaI 부위에 클로닝시켰다(도 1).

cDNA 라이브러리의 제작

mRNA를 제작자의 지시에 따라 QuickPrep Micro mRNA 정제 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 10 ⁷ MCF-7 세포(T1 라이브러리) 또는 0.1 g의 충실성 종양 샘플(T4 라이브러리)로부터 단리시켰다. 이중 가닥 cDNA를 TimeSaver cDNA 합성 키트(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 5 ㎍의 폴리(A)+RNA로부터 합성하였다. 랜덤 표지된 프라이밍을 선행 개시된 바와 같이 수행하였다(Santini, 1986). 500 ng의 이중 가닥 cDNA로부터 cDNA 사본의 첫 번째 가닥을 랜덤 표지된 프라이머 5'-GCGGCCGCTGG(N) ₉ -3'를 사용하여 합성하고 두 번째 가닥 cDNA 사본은 프라이머 5'-GGCGGCCAAC(N) ₉ -3'을 사용하여 합성하였다. 최종 cDNA 산물을 3 개의 상이한 판독 프레임을 갖는 SpeI 및 NotI 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 증폭시켜 λKM4 람다 벡터(5'-GCACTAGTGGCCGGCCAAC-3', 5'-GCACTAGTCGGCCGGCCAAC-3', 5'-GCACTAGTCGGGCCGGCCAAC-3' 및 5'-GGAGGCTCGAGCGGCCGCTGG-3')에의 클로닝을 촉진시켰다. 상기 PCR 산물들을 Quiaquick 컬럼(Quiagen) 상에서 정제하고 Microcon 100(Amicon) 상에서 여과하여 작은 DNA 단편들을 제거하고, SepI, NotI 제한 효소들로 절단하고 페놀로 추출한 후에 다시 Microcon 100 상에서 여과하였다.

벡터 λKM4를 SpeI/NotI로 절단하고 탈인산화시키고, 8 개의 연결 혼합물을 각각의 라이브러리로부터 제조하였으며, 이때 상기 각각은 0.5 ㎎의 벡터와 약 3 ng의 삽입물을 함유한다. 4 ℃에서 밤새 배양한 후에, 상기 연결 혼합물을 생체 외에서 람다 패키징 키트(Ready-To-GoTM 람다 패키징 키트, Amersham Pharmacia Biotech)로 패키징하고 100(15 ㎝) NZY 플레이트 상의 상부 아가에서 도말하였다. 밤새 배양한 후에, 상기 파지를 SM 완충액으로 상기 플레이트로부터 용출시키고, 정제하고 농축시키고 7% DMSO SM 완충액 중에서 -80 ℃에서 보관하였다.

삽입물을 갖는 전체 독립적인 클론들로서 계산된 2 개 라이브러리들의 복잡성은 T1 라이브러리의 경우 10 ⁸ 이고 T4 라이브러리의 경우에는 3.6x10 ⁷ 이었다.

친화성에 의한 선택

특정한 종양 항원을 동정하기 위해서, 2 개의 상이한 친화성 선택 과정을 사용하였다. 첫 번째는 양성 혈청(즉 종양 병리상태를 앓고 있는 환자로부터의 것)을 사용하는 2 개의 패닝 주기, 이어서 동일 혈청을 사용하여 수행되는 면역학적 선별 과정, 또는 한편으로 선택된 파지의 혼합물들로부터 랜덤하게 취한 클론들의 분석으로 이루어졌다. 두 번째 과정은 교차반응성 항원의 선택 효능을 증가시키기 위해서 패닝과 선별 모두에 대해, 선택을 위해서 상이한 환자의 혈청 혼합물을 사용하였다.

T1 라이브러리를 10 개의 양성 혈청(B9, B11, B13, B14, B15, B16, B17,B18, B19 및 B20)을 사용하여 선택하여, 단일 선택 순환 후에 상응하는 풀 p9 ^I , p11 ^I , p13 ^I , p14 ^I , p15 ^I , p16 ^I , p17 ^I , p18 ^I , p19 ^I 및 p20 ^I 를 생성시켰다. 이어서 각각의 풀에 상기 언급한 첫 번째 전략에 따라 동일한 혈청을 사용하여 2 차 친화성 선택 순환을 가하여 두 번째 일련의 풀(p9 ^II , p11 ^II , p13 ^II , p14 ^II , p15 ^II , p16 ^II , p17 ^II , p18 ^II , p19 ^II 및 p20 ^II 라 칭함)을 생성시켰다. ELISA에서 시험된 상기 풀들 중 일부는 상응하는 혈청과 증가된 반응성을 나타내었으며, 따라서 상기 라이브러리의 효능 및 친화성 선택 과정이 입증되었다. 증가된 반응성을 갖는 풀(p9 ^II , p13 ^II , p15 ^II , p19 ^II , p20 ^II )로부터 개별적인 클론들을 선택에 사용된 혈청을 사용하는 면역선별에 의해 단리시켰다.

상기 언급한 두 번째 과정을 p13 ^II 풀에 적용시키고, 여기에 B13을 제외한 혈청 혼합물(B11, B14, B15, B16, B17, B18, B19 및 B20)을 사용하는 세 번째 선택 순환을 가하여 교차 반응성 클론들을 선택하였다. 생성된 풀(p13 ^III )을 패닝에 사용된 동일한 혈청 혼합물을 사용하는 ELISA에 의해 분석하였다. 상기 풀로부터의 개별적인 클론들을 혼합물 ΔB13(B11, B14, B15, B16, B17, B18, B19 및 B20)을 사용하는 면역선별에 의해 단리시켰으며, 이는 추가의 양성 클론들을 단리할 수 있게 하였다.

친화성 선택 실험을 또한 본 원에 개시된 동일한 방법에 따라 T4라이브러리(및 또한 상이한 혈청을 사용하는 T1 라이브러리)를 사용하여 수행하였다.

다중 면역학적 선별(픽-블럿 분석)

면역학적 선별에서 양성인 개별적인 파지 클론들을 단리하고 용출된 파지를 배열된 순서로 골라내어(picking) 15 ㎝ 플레이트 상의 세균 밭에서 증식시켰다. 상기 플라크를 니트로셀룰로즈 멤브레인 상으로 옮기고 상이한 양성 및 음성 혈청을 사용하는 분석을 가하였다. 상기 방법을 보다 확고하고 재현 가능하게 만들기 위해서 제네시스 테칸(Genesys Tekan) 로봇 스테이션을 사용하여 상기 플레이트 상의 파지를 골라내고(이는 11x7.5 ㎝의 멤브레인 상에서 최대 396 개까지의 개별적인 클론들, 또는 동일한 플레이트 상에서 반복적으로 골라진 보다 적은 수의 클론들의 분석을 허용하였다), 혈청과 배양하기 전에 상기 멤브레인을 보다 작은 조각들로 절단하였다.

양성 클론들에 대한 특성화

다중 반응성, 또는 건강한 공여자에 비해 종양 환자의 혈청에 보다 큰 특이성을 제공하는 클론들을 연속해서 서열화하고 현재 입수할 수 있는 서열들의 상이한 데이터베이스들(Non-Redundant Genbank CDS, Non-Redundant Database of Genbank Est Division, Non-Redundant Gen-bank+EMBL+DDBJ+PDB 서열들)과 비교하였다.

수득된 서열들을 6 개의 그룹으로 분류할 수 있다:

-공지된 유방 종양 항원의 에피토프를 암호화하는 서열;

-유방 종양 항원 이외의 종양 항원의 에피토프를 암호화하는 공지된 서열;

-자가항원을 암호화하는 서열;

-공지된, 그러나 관련된 것이 종양인지 또는 자가면역 질병인지는 알려지지 않은 단백질을 암호화하는 서열;

-미지의 단백질(예를 들어 EST)을 암호화하는 서열;

-데이터베이스에 아직 존재하지 않는 신규 서열.

81 개의 상이한 서열들이 T1 라이브러리(T1-1 내지 T1-115라 칭함)로부터 동정되었으며, 이중 13%는 미지의 단백질이고 16%는 데이터베이스에 존재하지 않았다. 21 개의 서열이 T4 라이브러리(T4-1 내지 T4-38)로부터 동정되었으며, 이중 40%는 데이터베이스에서 발견되지 않았다. 하기의 표는 예로서, 선택된 클론들 중 일부의 서열을 나타낸다:

클론 T1-52는 결합 단백질 p53의 단편으로서 공지되었으나(Haluska P. et al., NAR, 1999, v. 27, n. 12, 2538-2544), 종양 항원으로서 결코 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 VLVAGQRYQSRSGHDQKNHRKHHGKKRMKSKRSTSLSSPRNGTSGR을 가지며 종양 항원으로서 그의 용도는 본 발명의 일부이다.

클론 T1-17은 악성 중간피종 종양 항원으로서 동정된 DNA-국소이성화효소 II 베타의 단편으로서 공지되었다(Robinson C., et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2000;22:550-56). 본 발명은 상기를 유방암 종양 항원으로서 동정하였다. 상기 클론은 MGTSRAGQLVEELDKVESQEREDVLAGMSGKSSFQRSEGDFLLRSLTSGR을 가지며 유방암 종양 항원으로서 그의 용도는 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T1-32는 하기 서열 MGTSRAGQLHAFPLHSTTLYYTTPSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T1-74는 하기 서열 MGTSRPANREAKQLHHQPHSIELIQSSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T4-2는 하기 서열 MGTSRPANSEVYKPTLLYSSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T4-11은 하기 서열 MGTSGRPTVGFTLDFTVDPPSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T4-19는 하기 서열 MGTSRAGQLYRTTLTYTSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T1-12는 하기 서열 MRYYTATKTYELMLDATTQTSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T1-39는 하기 서열 MRVIDRAQAFVDEIFGGGDDAHNLNQHNSSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T5-8은 AKAP 단백질의 단편으로서 공지되어 있으나, 종양 항원으로서는 결코 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 MGTSRAGQQREQEKKRSPQDVEVLKTTTELFHSNEESGFFNELEALRAESVATKAELASYKEKAEKLQEELLVKETNMTSLQKDLSQVRDHQGRG를 가지며 종양 항원으로서의 그의 용도는 본 발명의 일부이다.

클론 T5-13은 SOS1 단백질의 단편으로서 공지되어 있으나, 종양 항원으로서는 결코 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 AGTSRAGQHAFEQIPSRQKKILEEAHELSEDHYKKYLAKLRSINPPCVPFFGIYLTNLLKTEEGNPEVLKRHGKELINFSKRRKVAEITGEIQQYQNQYCLRVESDIKRFFENLNPMGNSMEKEFEDYLFNKSLEIEPRKPSGR을 가지며 종양 항원으로서의 그의 용도는 본 발명의 일부이다.

클론 T5-15는 EST 단백질 KIAA1735의 단편으로 공지되어 있으나, 종양 항원으로서는 결코 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 MGTSRAGQQERSLALCEPGVNPEEQLIIIQSRLDQSLEENQDLKKELLKCKQEARNLQGIKDALQQRLTQQDTSVLQLKQELLRANMDKDELHNQNVDLQRKLDERTQRP를 가지며 종양 항원으로서의 그의 용도는 본 발명의 일부이다.

클론 T5-18은 mic 종양유전자의 단편(교번 프레임)으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 MGTSRAGQPMSGHGSFQEVPRLHTSAQLRSASLHSEGLSCCQEGQVGQCQSPETDQQQPKMHQPSGR을 가지며 종양 항원으로서의 그의 용도는 본 발명의 일부이다.

클론 T6-1은 단백질 키나제 C-결합 단백질의 단편으로서 공지되어 있으며, 피부 T-세포 림프종 종양 항원으로서 동정되었다(Eichmuller S., et al. PNAS, 2001; 98; 629-34). 본 발명은 상기를 유방암 종양 항원으로서 동정하였다. 상기 클론은 서열 TSRAGQRYEKSDSSDSEYISDDEQKSKNEPEDTEDKEGCQMDKEPSAVKKKPKPTNPVEIKEELKSTPPA를 가지며 유방암 종양 항원으로서 그의 용도는 본 발명의 일부이다.

지금까지 알려지지 않았던 클론 T6-2는 하기 서열 TSRAGQLARIPSVTASEQGRT를가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T6-6은 PI-3-키나제 관련 키나제 SMG-1에 일치하는 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 TSGPANAAPPSADDNIKTPAERLRGPLPPSADDNLKTPSERQLTPLPPAAAK를 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T6-7은 푸코실트랜스퍼라제의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 TSRAGQRELGRTGLYPSYKVREKIETVKYPTYPEAEK를 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T7-1은 EST 단백질 KIAA1288의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 TSVLEPTKVTFSVSPIEATEKCKKVEKGNRGLKNIPDSKEAPVNLCKPSLGKSTIKTNTPIGCKVRKTEIISYPSTSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T9-22는 역 전사효소 동족체 단백질에 유사한(50% 일치) 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 MDLTAVYRTFHPTITEYTFYLTVHGTFSKIDHMIGHKTSLNKSKKTEIISSTLSDHSGIKLESNSKRNPQIHASGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T11-5는 무명의 이론상 막통과 단백질의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 MPIDVVYTWVNGTDLELLKELQQVREQMEEEQKAMREILGKNTTEPTKKRSYFVNFLAVSSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T11-6은 아연 핑거 단백질 258의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 TSGRPTYKVNISKAKTAVTELPSARTDTTPVITSVMSLAKIPATLSTGNTNSVLKGAVTKEAAKIIQDESTQEDAMKFPSSQSSQPSRLLKNKGISCKPVTHPSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T11-9는 가상의 인간 단백질의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 TSRAGQLRFSDHAVLKSLSPVDPVEPISNSEPSMNSDMGKVSKNDTEEESNKSATTDNEISRTEYLCENSLEGKNKDNSSNEVFPQYSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T11-3은 EST 단백질 KIAA0697의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 TSRAGQRKQSFPNSDPLHQSDTSKAPGFRPPLQRPAPSPSGIVNMDSPYGSVTPSSTHLGNFASNISGGQMYGPGAPLGGAPTSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T5-2는 인간 게놈 DNA의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 MGTSRAGQPTSENYLAVTTKTKHKHSLQPSNASISLLGIYPTPSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

클론 T5-19는 EST 단백질의 단편으로서 공지되어 있으나, 결코 종양 항원으로서는 동정되지 않았다. 상기 클론은 서열 TSRAGQRDTQTHAHVSVCVHTPHHTYKYPTSGR을 가지며; 상기는 종양 항원이고 그 자체가 본 발명의 일부이다.

본 발명에 따라, 공지된 단백질의 일부이지만 종양 항원으로서는 공지되지 않았던 서열들이 종양 항원으로서의 그의 용도에 관한 한 본 발명의 목적임이 이해될 것이다. 같은 방식으로, 본 발명의 목적은 상기 서열, 또는 상기 서열을 암호화하는 유전자 산물의 전체 또는 일부의 종양 항원으로서의 용도이다.

픽-블럿 분석에 의해 특성화되고 특이적인 반응성이 유방 종양을 앓고 있는 환자의 혈청에 의해 입증된 파지 클론들을 증폭시키고 이어서 큰 양성 및 음성 혈청 패널에 대해 분석하였다. 상기 ELISA 연구 후에, 특정한 종양 항원에 상응하는 것으로서 간주된 cDNA 클론들을 상이한 세균 발현 시스템(단백질 D 및/또는 GST)에서 이들의 특이성과 선택성을 보다 잘 측정하기 위해서 클로닝시켰다. 융합 단백질을 생산하기 위해서 각각의 클론들을 하기 올리고뉴클레오티드: K84 5'-CGATTAAATAAGGAGGAATAAACC-3' 및 K86 5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCC-3'을 사용하는 PCR에 의해 단일 플라크로부터 증폭시켰다. 이어서 생성된 단편을 QIAGEN 정제 키트를 사용하여 정제시키고, 제한 효소 SpeI 및 NotI로 절단하고 플라스미드 pKM4-6H에 클로닝시켜 6-히스티딘 꼬리를 갖는 D와의 융합 단백질을 생산하거나, 또는 벡터 pGEX-SN에 클로닝시켜 GST와의 융합을 발생시켰다. 이어서 상응하는 재조합 단백질들을 표준 프로토콜에 의해 제조하고 정제시켰다(Sambrook, J., Fritsch, EF & Maniatis, T.(1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

하기의 표는 예로서 파지 또는 융합 단백질 제제의 형태로 분석된, 다수의선택된 클론들의 음성 및 양성 혈청과의 반응성을 제공한다:

종양 세포의 인식 및 따라서 병리학적 이상의 탐지 및 진단을 위해 선택된 종양 항원의 효능을 입증하기 위해서, 마우스를 면역시켜 선택된 다수의 클론들에 대한 항체 반응을 유도하였다.

상기 마우스를 단백질 D와 클론 T1-52, T4-11 및 T4-19의 서열의 융합에 상응하는 융합 단백질 D1-52, D4-11 및 D4-19를 면역원으로서 사용하여, 2 개월의 기간에 걸쳐 7 회의 항원 투여를 제공함으로써 면역시켰다. 매번, 마우스 당 상기 3 개의 단백질 각각에 대해서 CFA 중의 20 ㎍, IFA 중의 20 ㎍, PBS 중의 10 ㎍ 및 4 회의 PBS 중의 5 ㎍의 단백질을 주입(복강 내 또는 피하)하였다. 종양 항원의 서열에 대한 면역 효능을 검사하기 위해서, 상기 면역시킨 동물의 혈청을, 단백질 D에 대한 반응성을 배제시키기 위해 상이한 상황 하에서 클로닝된 동일한 펩티드 서열에 대해 분석하였다.

D1-52의 경우에, 면역된 마우스의 혈청을 GST와의 융합(GST1-52)에 대해 분석하는 반면, D4-11 및 D4-19의 경우에는 상응하는 펩티드 서열을 벡터 pC89(Felici et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310)에 클로닝시키고 이어서 pVIII(섬유상 박테리오파지의 주요 피막 단백질)에의 융합으로서 시험하였다. 상기 면역된 동물의 혈청에 대한 ELISA의 결과는 유효 면역이 D1-52 및 D4-11의 경우에 얻어짐을 보였으며, 따라서 상응하는 혈청을 종양 세포를 인식하는 능력에 대해 분석하였다. 이를 위해서, 세포 주 MCF7을 사용하였으며, FACS에 의한 분석은 상기 두 혈청 중에 존재하는 항체(항-D1-52 및 항-D4-11)가, 예를 들어 난소 종양 세포는 아닌, 유방 종양 MCF7 세포를 특이적으로 인식할 수 있는 반면, 상기 인식 능력이 동일한 마우스로부터의 면역이전혈청 중에는 존재하지 않음을 입증하였다.