포자 표면발현 방법

포자 표면발현 방법{Method for Expression of Proteins on Spore Surface}

유기체 표면에 원하는 펩타이드, 폴리텝타이드 등 단백질류를 표면에 부착하여 발현하는 표면발현기술은 발현된 단백질류의 성질에 따라, 또는 표면발현될 숙주 유기체의 성질에 따라 다양한 생물공학분야에 응용이 가능하다 (Georgiou et al ., 1993, 1997; Fischetti et al ., 1993; Schreuder et al ., 1996). 이러한 표면발현기술은 박테리오파아지, 박테리아, 효모 또는 포유동물세포 등 여러 가지 유기체를 숙주세포로 이용하여 개발되었다.

표면발현기술은 표면에 발현된 단백질의 유전자가 숙주 유기체내에 푀함되어 있기 때문에 표면발현된 숙주 유기체를 표면발현된 단백질의 성질을 이용하여 선택적으로 선별할 수 있고, 선별된 숙주 유기체로부터 원하는 유전자를 쉽게 확보할 수 있으므로, 단백질의 분자적 진화를 위한 강력한 수단을 제공한다는 특징이 있다 (WO 9849286, 미합중국 특허 제 5837500호).

초고속 스크리닝

예를 들면 원하는 결합력을 갖는 항체가 표면발현된 파아지를 고정화된 항원과 결합시키고, 용출하여 파아지를 다시 증식시키면 타켓 항체를 코딩하는 유전자를 파아지로부터 확보할 수 있다 (미합중국 특허 제 5837500호). 이러한 바이오 팬닝법은 항체의 라이브러리를 대량으로 파아지에 표면 발현함으로써 타겟 항체를 선별하는 수단을 제공할 수 있고, 다음과 같은 단계를 포함하는 연속과정으로 이루어진다; (1) 라이브러리를 제조하는 단계; (2) 라이브러리의 표면발현 단계; (3) 고정화된 항원과 결합하는 단계; (4) 결합된 파아지를 용출하는 단계; 최종적으로 (5) 선별된 클론을 중식하는 단계.

상술한 파아지 표면발현기술은 다량의 라이브러리(106-109 변이체)에서 가장 빠르게 원하는 단일 클론 변이체를 획득하는데 유리하여 항체의 초고속 스크리닝 분야에 응용되면서 매우 중요하게 되었다. 항체는 최근 치료, 진단, 그리고 기타 분석 작업에서 수요가 크게 증가되고 있는 중요한 생리활성 단백질이다. 이에, 새로운 물질에 대한 결합력을 갖거나 또는 생화학적 반응을 촉매할 수 있는 항체를 확보하는 것이 중요하게 되었고, 이를 위하여 전통적으로는 하이브리도마 기술을 이용하여 단일클론 항체를 생산하여 왔다. 그러나, 상기 방법은 비용적인 측면에서 고가이고, 시간도 많이 소요되며, 최종적으로 수득할 수 있는 항체의 양이 소량이하는 단점이 있다. 더욱이, 새로운 항체를 탐색하기 위해서는 1010 이상의 항체 라이브러리로부터 찾아야 하기 때문에, 하이브리도마 기술은 새로운 결합력을 갖는 항체를 탐색하는 데는 부적합하다.

한편, 상술한 파아지 표면발현기술을 이용한 바이오 팬닝법 보다 더욱 간단하고 효과적인 방법을 제공하기 위하여, 박테리아나 효모의 표면에 라이브러리를 발현하고 유세포 분석기를 활용하여 신속하게 원하는 타겟 단백질이 표면발현된 세포를 순수 분리하는 기술도 개발되었다. 이 기술에 따르면, 형광물질로 표식된 항원을 표면발현된 세포와 접촉시켜 결합시키고 시간당 108개 이상의 세포를 분석할 수 있는 유세포 분석기를 사용하여 원하는 결합력을 갖는 항체를 순수 분리한다. 프란시스코 등은 이러한 유세포 분석기가 표면발현된 단일클론 항체가 105 이상의 비로 농축될 수 있으며, 최종적으로 79% 이상의 세포가 원하는 세포임을 확인하여 미생물 표면발현기술의 유용성을 보였다 (Daugherty et al ., 1998).

생백신

상술한 표면발현 기술은 항원 또는 그 일부분을 세포 표면에 발현하여 재조합 생백신의 전달 수단을 제공하게 된다. 현재까지 백신은 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 주로 사용하였고, 특히 박테리아의 경우에는 항원을 세포내, 세포막 또는 세포외로 분비 발현하여 숙주세포에 전달하였다. 한편, 표면발현된 생백신은 매우 강력한 면역반응을 나타내고 숙주세포 내에 증식하면서 지속적으로 항원을 발현할 수 있기 때문에, 새로운 백신 전달수단으로서 주목을 받고 있다. 특히 비병원성 대장균이나 살모넬라균의 표면에 병원성 유래의 항원 에피토프를 발현하여 살아있는 상태로 경구 투여할 경우에는 훨씬 지속적이고 강력한 면역반응을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Georgiou et al ., 1997; Lee et al., 2000).

전세포 생물전환

화학적 반응에 사용할 수 있는 효소가 표면에 발현된 전세포를 생물촉매로사용하는 경우에는, 효소의 직접 발현, 분리 및 안정화 등의 과정이 필요 없다는 장점이 있다. 생물전환에 사용되는 효소를 세포내에 발현시키는 경우에는, 세포를 배양하고 회수한 다음, 톨루엔과 같은 화학물질을 사용하여 기질이 투과할 수 있도록 하는 과정이 필수적이다. 또한 지속적으로 사용할 경우 효소가 실활 되거나, 기질과 산물의 물질전달 문제점이 있어서 공정 전체의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.

한편, 상술한 문제점들은 효소를 지속적으로 세포표면에 발현시킴으로써 제거할 수 있다 (Jung et al, 1998a; 1998b). 포스포디에스터라아제가 표면에 발현된 전세포를 이용하여, 독성이 매우 강한 유기인 계열의 파라티온(parathion)과 파라옥손(paraoxon)을 분해한 예는, 효소가 표면발현된 세포가 환경정화공정에 이용될 수 있음을 보여준 전형적인 예이다 (Richins et al., 1997).

항펩타이드 항체

Martineau 등은 대장균의 표면발현기술을 이용하여 항펩타이드 항체를 생산하는 매우 간단한 방법을 보고하였다 (Martineau et al ., 1991). 이 문헌에 개시된 내용을 살펴보면, MalE와 세포외막 단백질인 LamB의 표면돌출부위에 원하는 펩타이드를 발현한 다음, 전세포 또는 분쇄된 세포를 동물에 투여하여 항펩타이드 항체의 생성을 유도하였고, 이러한 방법에 따르는 경우에는 화학적으로 펩타이드를 합성하거나 이를 전달 단백질에 부착하지 않고도 항체를 생산할 수 있게 된다.

전세포 흡착제

흡착 크로마토그라피에 사용되는 항체나 단백질을 적당한 담체에 고정화하기위해서는, 발효를 통한 단백질의 생산, 순수한 상태로의 분리 및 정제 그리고 담체에로의 고정화 과정을 거쳐야 한다. 그러나, 대부분의 경우 이러한 바이오흡착제는 그 생산 공정이 단순치 않다.

한편, 흡착단백질을 미생물의 표면에 발현시켜, 세포전체를 일종의 흡착제로서 개발이 되었다. 가장 잘 공지된 전세포 흡착제는 포유류 항체의 Fc 도메인과 높은 친화성을 갖는 단백질 A가 표면에 자연적으로 발현된 Staphylococcus aureus 이다. 또한, 최근에는 미생물 표면발현기술을 이용하여 메탈로티오네인(metallothionein), 또는 여러개의 히스티딘 잔기와 같은 금속 흡착단백질을 세포표면에 대량 발현하여, 중금속의 제거 및 회수하는 새로운 방법이 발표되었다 (Sousa et al., 1996, 1998; Samuelson et al., 2000). 상기한 방법에 따르면, 종래의 금속 흡착미생물을 이용한 방법보다 훨씬 적극적이고 효과적인 방법으로 오염원으로부터 중금속을 제거 또는 회수할 수 있다.

상술한 바와 같이 어떤 유기체의 표면단백질을 이용하여 외래단백질을 세포 표면에 발현시키기 위해서는 적당한 표면단백질과 외래단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성 되도록 하고, 이들이 안정하게 세포내막을 통과하여 세포표면에 부착되어 유지되도록 해야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 성질을 갖는 표면단백질을 선정하여 표면발현의 모체로 사용해야 할 것이다: 1) 세포내막을 통과할 수 있는 분비 시그날을 갖고, 2) 세포표면에 안정되게 부착될 표적 시그날을 갖으며, 3) 세포 표면에 다량으로 발현되면서, 4) 단백질의 크기에 관계없이 안정적으로 발현되어야 한다 (Georgiou et al., 1993).

따라서 상기한 조건을 만족시키는 표면발현모체를 선택하거나 새로운 재조합 단백질을 만든다면 종래의 표면발현 시스템의 단점을 보완하는 새로운 표면발현 시스템을 개발할 수 있을 것이다. 또한, 표면발현모체 뿐 아니라 표면발현될 숙주세포의 선택도 매우 중요하다.

현재 까지 개발된 표면발현 시스템은 파아지의 표면발현 시스템(Chiswell and McCarferty, 1992), 박테리아 표면발현 시스템 (Georgioll et al., 1993; Little et al., 1993; Georgiou et al., 1997), 그람음성 세균의 표면발현 시스템(Francisco et al., 1992; Fuchs et al., 1991; Klauser et al., 1990, 1992; Hedegaard et al., 1989), 그람양성 세균의 표면발현 시스템(Samuelson et al., 1995; Palva et al., 1994; Sleytr and Sara, 1997). 효모의 표면발현 시스템(Ferguson, 1988; Schreuder et al., 1996) 등이 공지되어 있다.

그러나, 상기 개발된 파아지 표면발현 기술은 파아지 라이브러리로부터 원하는 클론을 농축하기 어렵고, 종종 파아지 표면발현된 라이브러리에서 선별된 항체는 매우 낮은 발현율을 나타내었다. 또한, 그람음성 세균의 표면발현 시스템은 외래 폴리펩타이드를 삽입하면 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못하였고 (Charbit et al., 1987; Agterberg et al., 1990), 숙주세포의 세포외막의 안정성과 생존력이 감소되었다. 한편, 효모의 표면발현 시스템은 사용된 벡터의 형질전환율이 낮아 라이브러리를 표면발현할 때 불리한 점이 있었다.

한편, 현재까지 개발된 표면발현 시스템은 서로 보완적으로 이용되고 있다. 예를 들면 결합력이 우수한 항체 변이체를 선별하기 위하여 먼저 파아지 표면발현기술을 이용하여 1차 선별하고, 세포 표면발현 기술을 이용하여 2차로 증가된 항체 변이체를 선정한다 (Georgiou, 2000). 그러나, 상기 파아지 표면발현 기술은 파아지 라이브러리로부터 원하는 클론을 농축하기 어렵다는 문제점이 있다. 왜냐하면 고정화된 수용체에 결합하고 용출되어야 하는데 파아지 표면에 발현된 항체의 결합활성 (avidity) 영향에 따라 항체의 결합력에 정확하게 의존하지 않을 수 있기 때문이다. 따라서 특히 항체 라이브러리로부터 원하는 항체를 탐색하여 선별할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있다.

표면발현 기술이 가장 많이 연구된 대장균 숙주의 경우는 대부분이 세포외막 단백질을 표면발현 모체로 개발되었는데, 세포외막 단백질이 외래 단백질과 융합하여 과발현되면 세포외막이 구조적으로 불안정하여지고 결과적으로 숙주세포의 생존력이 떨어지는 단점이 있다 (Georgiou et al., 1996). 이러한 단점을 극복하기 위하여 생존력에 영향을 주지 않는 빙핵활성단백질 모체를 이용한 경우가 보고되어 있고, 이를 이용한 생물전환 공정, 효소 라이브러리 표면발현 및 증가된 효소변이체의 탐색이 공지되어 있다 (Jung et al., 1998a, 1998b; Kim et al., 1998, 1999, 2000).

표면에 발현되는 라이브러리의 크기는 숙주세포를 표면발현 벡터로 형질전환하는 방법의 효율에 의해 결정되므로, 대장균을 사용하던 표면발현할 수 있는 라이브러리의 크기가 높은 장점도 있다. 그러나, 그람양성균의 경우 숙주세포가 비교적 단단하고 목적 단백질이 안정하게 발현되지만 형질전환 효율이 낮아 라이브러리 크기는 대장균에 비교하면 낮은 단점이 있다.

지금까지 개발된 표면발현 숙주 유기체는 여러 가지 물리화학적 처리에 민감하여 표면발현된 단백질을 직접 물리화학적 처리를 통하여 선별할 수 없었다. 결합력이 증가한 항체의 변이체를 선별할 때 사용하는 pH의 급격한 변화나 염기농도를 조절하여 용출할 경우 파아지나 박테리아는 배양배지에 재접종을 하면 생존율이 떨어지는 경우가 발생하는 것이 이러한 이유에서 기인한 것이다.

또한 이러한 유기체들은 세포 표면이 매우 복잡하고 물리적으로 약하여 고온 고압과 같은 극한 환경에 적응할 수 없는 단점이 있다. 예를 들면 효소가 표면 발현된 대장균 세포를 이용하여 생물전환 반응에 이용하기 위해서는 전환반응계에서 안정성이 유지되어야 한다. 이러한 문제점을 보완하기 위하여는 대장균의 표면을 특별히 고정화하여야 하지만 만족스러운 것은 아니다 (Freeman et al., 1998).

상술한 바와 같이, 종래의 표면발현 기술은 다양한 유용성 및 적용분야에 따라 숙주 유기체로서 박테리오파아지, 그람음성 도는 그람양성 박테리아, 효모, 섬모류, 포유동물세포를 이용하고, 각각의 유기체의 표면 단백질을 표면발현모체로 이용하고 있으나, 이용되는 숙주 유기체가 실험과정중에 노출되는 화학물질에 대하여 약하고, pH 변화 등과 같은 물리화학적 변화에 내성을 갖지 못하며, 단백질을 표면에 과량 발현하는 경우에는 숙주세포의 표면에 구조적인 문제가 발생되어, 최종적으로는 숙주세포의 생존력이 크게 저하되는 문제점이 있다 (Georgiou et al., 1996).

본 발명은 포자의 표면에 단백질을 발현하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 포자 코트단백질을 표면발현 모체로 이용하는 표면발현 방법, 이를 이용한 단백질의 신속한 개량방법에 관한 것이다.

도 1은 미합중국 특허 제 5766914호에 개시된 방법과 동일한 방법에 의해 분리된 바실러스 서브틸리스 포자의 광학 현미경 사진;

도 2는 레노그라핀 방법으로 순수 분리된 바실러스 서브틸리스 포자의 광학 현미경 사진;

도 3은 본 발명의 재조합 벡터 pCotE-lacZ의 유전자 지도;

도 4는 본 발명의 재조합 벡터 pCotG-lacZ의 유전자 지도;

도 5는 본 발명의 적합한 포자 표면발현용 모체를 확인하기 위한 스크리닝 실험결과를 나타내는 그래프;

도 6은 포자 표면발현된 베타갈락토시다아제에 대한 단백질분해효소의 영향을 나타낸 그래프;

도 7은 배양시간에 따른 표면발현된 베타갈락토시다아제의 활성변화를 나타낸 그래프;

도 8은 단백질이 표면발현된 바실러스 서브틸리스 DB104 균주의 포자에 대한 열안정성을 나타낸 그래프;

도 9는 본 발명의 재조합 벡터 pCSK-cotG-CMCase의 유전자 지도;

도 10은 포자 표면발현된 카복시메틸셀룰라아제의 유세포 분석기를 통한 분석 결과를 나타내는 그래프;

도 11은 포자 표면발현된 레반수크라아제의 유세포 분석기를 통한 분석 결과를 나타내는 그래프;

도 12는 포자 표면발현된 레반수크라아제의 활성을 나타내는 그래프;

도 13은 포자 표면발현된 단일클론 항체의 유세포 분석기를 통한 분석 결과 나타내는 그래프;

도 14는 단쇄 Fv를 표면발현하는 포자에 대한 선별력을 나타내는 그래프;

도 15는 B형 간염 바이러스의 Pre-S 부위에 대한 결합력을 갖는 단일클론 항체 라이브러리의 유세포 분석기를 통한 분석 결과를 나타낸 그래프;

도 16은 GFP의 포자 표면발현을 나타내는 유세포 분석기를 통한 분석결과를 나타낸 그래프; 및

도 17a 내지 도 17d는 개량된 GFP가 표면발현된 포자의 유세포 분석기를 통한 분리 결과를 나타낸 그래프.

본 발명자들은 상술한 기존의 표면발현 기술의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 표면발현 시스템의 숙주로서 포자를 이용하고 표면 발현 모체로서 코트단백질을 이용하는 경우에는 외부의 여러 가지 물리화학적 변화에 매우 안정된 시스템을 얻을 수 있고, 표면발현 시스템이 이용될 수 있는 다양한 분야에 적용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 포자 표면발현 벡터 시스템을 이용한 목적 단백질의 포자 표면 발현방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자 표면발현 벡터 시스템을 이용한 목적 단백질의 개량방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 포자 표면발현 벡터 시스템을 이용한 생물전환 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자 표면발현 벡터 시스템을 이용한 단백질 어레이의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자 표면발현 벡터 시스템을 이용한 척추동물에서 항원에 대한 항체의 생산방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자 표면발현 벡터 시스템을 이용한 전세포 흡착제의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자 표면발현용 미생물 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자 표면발현용 포자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 포자 표면발형용 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명은 여러 가지 물리화학적 처리에 안정한 미생물의 포자를 표면발현하는 유기체로 이용하고, 포자의 코트단백질을 표면발현 모체로 이용한다는 점에 기본 개념이 있다. 본 발명자들이 포자 표면발현 시스템을 선택한 것은 일반적으로 포자가 다음과 같은 매우 우수한 장점들을 포함하고 갖고 있기 때문이다 (Driks, 1999): 1) 열에 대한 매우 안정하다, 2) 방사선에 대해 비교적 안정하다, 3) 독성에 대해 안정하다, 4) 산, 염기에 대해 매우 안정하다, 5) 리소자임에 안정하다. 6) 건조에 내성을 갖고 있다. 7) 유기용매에 대해 안정하다, 8) 표면발현 모체와 목적 단백질의 융합단백질이 숙주세포에서 분비될 필요가 없이 바로 합성되어 포자 외부에서 포자에 부착된다, 9)대사적 활성이 없다, 10) 쉽게 수 시간 안에 포자를 형성할 수 있다.

특히 본 발명에서 이용되는 포자 코트단백질은 세포막을 통과할 필요가 없기 때문에, 상술한 표면발현의 모체의 요건 중 요건 중 분비 신호와 표적 신호를 필요로 하지 않고, 베타갈락토시다아제와 같이 세포막 통과가 어려운 단백질도 생합성하여 포자 외부로부터 차곡차곡 쌓듯이 표면에 발현할 수 있다.

한편, 미합중국 특허 제 5766914호는 바실러스 서브틸리스의 외피 코트단백질인 cotC 또는 내피 코트단백질인 cotD에 리포터 효소인 lacZ를 융합하여 실시한 효소의 분리 정제 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 특허문헌에 개시된 내용을 살펴보면, 표면발현된 것을 증명하기 위해 사용한 포자 순수 분리방법이 순수하게 포자만을 분리한 것으로 보기에는 어려운 방법을 이용하였다. 더욱이, 발현된 효소 역가는 매우 낮았고, 포자의 표면에 효소가 발현되었다는 것을 생화학적, 물리학적또는 면역학적인 방법으로 전혀 증명되지 않았다. 또한, cotD는 내피에 존재하여 70-200 nm 정도 되는 포자 외피로 둘러 쌓여 있기 때문에, 포자 표면에 노출되기는 어렵다. 한편, 좀 더 외부에 위치한 cotC에 융합하여 발현하면 포자에 존재하는 효소의 활성은 cotD (0.0048 U)에 비해 4배 높았으나, 이 역시 0.02 U로 매우 낮은 수준으로 산업적 수준에서 이용하기는 매우 부족한 것이다. 따라서, 상기 문헌에 개시된 내용으로부터는 엄격하게 포자 표면발현 시스템을 이용하였다고 판단할 수 없고, 포자 표면발현 시스템의 이점에 대한 어떠한 발명자의 인식도 없음을 알 수 있다. 즉, 상기 특허 문헌은 포자 표면발현 시스템에 관한 것이라고 할 수 없다. 또한, 미합중국 특허 제5837500호 및 미합중국 특허 제 5800821호도 cotC 또는 cotD가 표면 발현모체로 적합한 것으로 기재되어 있어, 상술한 이유와 동일하게 포자 표면발현시스템에 관한 것이라고 할 수 없다.

더욱이, 상기 미합중국 특허 제 5766914호에 제안된 포자 순수 분리방법에 의하는 경우에는, 절반 이상이 포자를 품고 있는 세포와 포자에 붙어 있는 세포 파쇄부분이 결합되어 있는 상태로 현미경상태에서 관찰되었다(참조: 도 1; 검고 길쭉하게 보이는 것은 포자를 형성하지 않은 세포이며 포자는 흰색의 환형으로 관찰됨). 이러한 사실은 발현된 리포터 효소가 포자 표면에 붙지 않아도 영양세포에 존재하여 활성이 측정되거나, 유세포 분석기를 통해서 분석하면 마치 포자 표면에 발현되어 있는 것으로 예측되는 오류가 나올 수 있다. 그러나, 하기의 본 발명의 실시예와 같이 레노그래핀을 이용한 농도구배 원심분리법을 이용하면 포자를 완전히 순수분리할 수 있고 (참조: 도 2), 이에 포자 표면발현된 효소의 활성만을 측정하게 된다.

한편, 상기 특허문헌과 같이 효소활성이 낮게 나오는 데에는 다음과 같은 원인이 있을 수 있다. 먼저 코트단백질의 발현량 자체가 낮을 수 있다. CotC와 CotD의 경우 최대 발현량이 각각 40 밀러유니트와 147 밀러유니트로 이는 CotE의 6021 밀러유니트와 비교해 매우 낮은 수준이다 (Zheng L and Losick R., J. Mol. Biol . 212:645-660(1990)). 더욱이, 포자표면에 노출 발현된 효소의 양은 보고되지 않았다. 또한, 포자를 형성할 때 외래단백질이 포자 표면에 발현되어 노출되었다 할지라도 세포내에서 활성이 큰 단백질 분해효소에 의해 분해되었을 수 있다. 이는 바실러스 서브틸리스의 포자 형성 시기에서는 다양한 단백질분해효소가 발현되어 숙주세포에서 포자를 형성하기 위한 재구성이 이루어지기 때문이다. 이와 같은 사실은 숙주세포의 단백질분해효소가 결여된 변이주을 사용하여 표면발현된 효소활성이 훨씬 큰 것으로부터 알 수 있다 (참조: 도 7).

cotE 및 spoIVA에 리포터인 GFP (Green fluorescence Protein)의 유전자를 결합시켜 유전자 발현과 발현된 단백질의 포자내 위치 확인 연구 등을 수행한 예도 있다 (Webb et al., 1995; Lewis et al., 1996). 그러나, 상기 문헌에는 최종적으로 발현된 융합단백질이 포자와 결합된 사실을 GFP의 성질을 이용하여 형광현미경으로 확인하였으나, 표면에 노출되어 부착되었는지 여부에 대한 개시는 없다.

코트단백질을 이용한 포자 표면발현의 또 다른 예로는, 항원의 전달수단으로서의 포자를 개시하고 있는 미합중국 특허 제 5800821가 있다. 그러나, 상기 문헌은 포자 표면에 발현된 항원이 표면에 노출됨을 개시하고 있지 않으며, 포자 코트단백질에 부착되어 발현된 포자가 숙수세포에 투입되었을 경우 숙주세포의 면역화반응을 유도할 수 있는지에 대하여 전혀 개시하고 있지 않다.

본 발명자들은 상술한 종래 특허의 문제점을 인식하고, 본 발명의 요지인 포자의 표면발현 시스템을 명확하게 확인하고 이를 개시하기 위해서, 다양한 포자 코트단백질에 대한 표면발현 실험을 하기 실시예에 기재된 바와 같이 효소학적, 면역학적 및 물리화학적 방법으로 실시하여, 표면발현을 확인하였을 뿐만 아니라 포자의 표면발현에 적합한 코트단백질을 선별하고, 최적의 표면발현 시스템을 구현하였다.

본 발명은 (i) 포자 코트단백질 및 목적 단백질의 유전자를 포함하고, 상기 유전자들이 발현되는 경우에는 융합된 상태로 발현되도록 이루어진 유전자 조합체를 포함하는 포자 표면발현용 벡터를 제작하는 단계; (ii) 상기 포자 표면발현용 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (iii) 상기 목적 단백질을 상기 숙주세포의 포자 표면에 발현시키는 단계; 및 (iv) 상기 목적 단백질이 표면에 발현된 포자를 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 포자 표면 발현방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (i) 목적 단백질의 유전자 라이브러리를 구축하는 단계; (ii) 상기 운전자 라이브러리를 코트단백질 유전자와 결합하여 벡터를 제작하는 단계; (iii) 상기 벡터로 포자 형성 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (iv) 상기 형질전환된 숙주세포의 포자를 형성시키고 상기 포자의 표면에 상기 목적 단백질을 표면발현시키는 단계; (v) 상기 목적 단백질이 표면에 발현된 포자를 회수하는 단계; 및 (vi) 소망하는 특성을 갖는 목적 단백질의 변이체가 표면발현된 포자를 스크리닝하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 개량방법을 제공한다.

본 발명은 (i) 목적 단백질의 유전자 라이브러리를 구축하는 단계; (ii) 상기 유전자 라이브러리를 코트단백질 유전자와 결합하여 벡터를 제작하는 단계; (iii) 상기 벡터로 포자 형성 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (iv) 상기 형질전환된 숙주세포의 포자를 형성시키고 상기 포자의 표면에 상기 목적 단백질을 표면발현시키는 단계; (v) 상기 목적 단백질이 표면발현된 포자에 유기용매, 열, 산, 염기, 산화제, 건조, 계면활성제 및 단백질 분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 처리하는 단계; (vi) 상기 목적 단백질이 표면에 발현된 포자를 회수하는 단계; 및 (vii) 상기 처리에 대하여 내성을 갖는 목적 단백질의 변이체가 표면 발현된 포자를 스크리닝하는 단계를 포함하는 포자의 내성을 이용한 목적 단백질의 개량방법을 제공한다.

본 발명은 (i) 생물전환 반응을 수행할 목적 단백질의 유전자 및 포자 코트단백질의 유전자를 포함하고, 상기 유전자들이 발현되는 경우에는 융합된 상태로 발현되도록 이루어진 유전자 조합체를 포함하는 포자 표면발현용 베터를 제작하는 단계; (ii) 상기 포자 표면발현용 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (iii) 상기 목적 단백질을 상기 숙주세포의 포자 표면에 발현시키는 단계; (iv) 상기 목적 단백질이 표면에 발현된 포자를 회수하는 단계; 및 (v) 상기 목적 단백질이 표면발현된 포자를 이용하여 생물전환 반응을 실시하는 단계를 포함하는 생물전환 방법을 제공한다.

본 발명은 (i) 분석하고자 하는 단백질에 대하여 결합력을 갖는 항체 또는항원을 암호화하는 유전자 및 포자 코트단백질의 유전자를 포함하고, 상기 유전자들이 발현되는 경우에는 융합된 상태로 발현되도록 이루어진 유전자 조합체를 포함하는 포자 표면발현용 벡터를 제작하는 단계; (ii) 상기 포자 표면발현용 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (iii) 상기 항체 또는 항원을 상기 숙주세포의 포자 표면에 발현시키는 단계; (iv) 상기 항체 또는 항원이 표면에 발현된 포자를 회수하는 단계; 및 (v) 상기 항체 또는 항원이 표면발현된 포자를 고체 표면에 고정화시키는 단계를 포함하는 단백질 어레이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 (i) 항원을 암호화하는 유전자 및 포자 코트단백질의 유전자를 포함하고, 상기 유전자들이 발현되는 경우에는 융합된 상태로 발현되도록 이루어진 유전자 조합체를 포함하는 포자 표면발현용 벡터를 제작하는 단계; (ii) 상기 포자 표면발현용 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (iii) 상기 항원을 상기 숙주세포의 포자 표면에 발현시키는 단계; (iv) 상기 항원이 표면에 발현된 포자를 회수하는 단계; 및 (v) 상기 항원이 표면발현된 포자의 면역학적 유효량을 포함하는 조성물을 척추동물에 투여하는 단계를 포함하는 척추동물에서 항원에 대한 항체의 생성방법을 제공한다.

본 발명은 (i) 특정 물질에 대하여 친화성을 갖는 단백질의 유전자 및 포자 코트단백질의 유전자를 포함하고, 상기 유전자들이 발현되는 경우에는 융합된 상태로 발현되도록 이루어진 유전자 조합체를 포함하는 포자 표면발현용 벡터를 제작하는 단계; (ii) 상기 포자 표면발현용 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; (iii) 상기 단백질을 상기 숙주세포의 포자 표면에 발현시키는 단계; (iv) 상기 단백질이 표면에 발현된 포자를 회수하는 단계; 및 (v) 상기 단백질이 표면발현된 포자를 담체에 고정화하는 단계를 포함하는 전세포 흡착제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 포자 코트단백질의 유전자는 믹소코커스 ( Myxococcus )를 포함하는 포자형성 그람음성균; 바실러스를 포함하는 포자형성 그람양성균; 포자형성 방선균; 사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae ), 칸디다 ( Candida ) 속과 한세눌라 ( Hansenulla ) 속을 포함하는 포자형성 효모 또는 포자형성 곰팡이 등으로부터 유래된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 상기 포자 코트단백질의 유전자는 포자형성 그람 양성균에서 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 폴리믹사 등을 포함하는 발실러스속 미생물로부터 유래된 것이다.

본 발명에서 이용될 수 있는 상기 포자 코트단백질 유전자는 cotA, cotB, cotC, cotD (W. Donovan et al., J. Mol. Biol ., 196:1-10(1987)), cotE (L. Zheng et al., Genes ＆ Develop ., 2:1047-1054(1998)), cotF (S. Cutting et al., J. Bacteriol ., 173:2915-2919(1991)), cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotK, cotL, cotM, cotS, cotT (A. Aronson et al., Mol. Microbiol ., 3:437-444(1989)), cotV, cotW, cotX, cotY, cotZ (J. Zhang et al., J. Bacteriol ., 175:3757-3766(1993)), spoIVA, spoVID 및 sodA 등을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 포자 코트단백질 유전자는 cotA, cotB, cotC, cotD, cotE, cotF, cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotK, cotL, cotM, cotS, cotT, cotV, cotW, cotX, cotY, cotZ, spoIVA, spoVID 또는 sodA 유전자가 포자 표면발현에 유리하도록 변형된 유전자를 이용할 수도 있다. 이와 같은 코트단백질 유전자의 변형방법은 DNA 셔플링법(Stemmer, Nature , 370: 389-391(1994)). StEP 법 (Zhao, H., et al., Nat. Biotechnol ., 16: 258-261 (1998)). RPR법 (Shao, Z., et al., Nucleic acids Res ., 26: 681-683 (1998)), 분자육종법 (Ness. JE, et al., Nat. Biotechnol ., 17: 893-896 (1999)), ITCHY법 (Lutz S. and Benkovic S., Current Opinion in Biotechnology , 11: 319-324 (2000)), 에러 유발 (error prone) PCR (Cadwell, RC and Joyce, GF, PCR Methods Appl ., 2: 28-33 (1992)), 포인트 돌연변이법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, NY, 1989), 뉴클레오타이드 돌연변이법 (Smith M. Annu. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985)). 조합형 카세트 돌연변이법 (Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985)) 또는 다른 적절한 무작위 돌연변이법을 포함한다.

더욱이, 상기 포자 코트단백질 유전자는 cotA, cotB, cotC, cotD, cotE, cotF, cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotK, cotL, cotM, cotS, cotT, cotV, cotW, cotX, cotY, cotZ, spoIVA, spoVID 또는 sodA 유전자가 포자 표면발현에 유리하도록 포자 코트단백질 유전자의 자체 프로모터를 적절한 다른 프로모터로 대체시킨 것이다. 포자 표면 발현에 유리한 상기 다른 프로모터는 예컨대, 발현양이 많은 cotE 또는 cotG 프로모터를 다른 코트단백질 유전자의 프로모터와 대체시키는 것이 있다.

본 발명에 이용되는 상기 코트단백질 유전자는, 바람직하게는, cotA, cotE, cotF, cotG, cotH, cotJA, cotJC, cotK, cotL, cotM, cotS, cotT, cotV, cotW,cotX, cotY, cotZ, spoIVA, spoVID 또는 sodA이고, 보다 바람직하게는, cotE 또는 cotG이며, 가장 바람직하게는 cotG이다.

본 발명의 방법에 있어서, 코트단백질의 유전자와 목적 단백질의 유전자를 융합할 때, 코트단백질 유전자가 전체 또는 일부 또는 두번 이상 반복된 것을 이용할 수 있고, 또는 두번 이상 반복된 코트단백질 유전자가 동일한 것이거나 서로 다른 것, 또는 목적 단백질 유전자가 하나이거나 두번이상 반복된 것, 또는 두번 이상 반복된 목적 단백질 유전자가 동일한 것이거나 서로 다른 것 등이 가능하고 상기한 어떠한 조합의 경우도 가능하다.

본 발명의 방법에서 제조되는 상기 유전자 조합체는 숙주세포 내에서 플라스미드내에 독립적으로 또는 숙주의 염색체에 끼여 들어가 존재할 수 있음은 당업자에게 자명하다. 또한, 유전자 조합체에 있어서, 코트단백질 유전자 뒤에 목적 단백질 유전자가 연결되거나 또는 목적 단백질 유전자 뒤에 코트단백질 유전자가 연결되거나 또는 코트단백질 유전자 가운데 목적 단백질 유전자가 삽입될 수 있음도 당업자에게 자명한 것이다.

한편, 포자 코트단백질과 목적 단백질이 결합된 융합단백질의 발현유도는 숙주세포에서 발현이 유도될 수 있는 코트단백질 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 목적 단백질 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 숙주 박테리아에서 발현 가능한 적절한 다른 프로모터에 의해 발현될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명의 방법은 모든 단백질에 적용될 수 있고, 예컨대, 효소, 효소저해제, 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 수용체, 신호전달 단백질, 항체, 단쇄 항체, 항원, 부착 단백질, 구조 단백질, 조절 단백질, 독소 단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자, 식물 생체방어 유도 단백질 및 그들의 일부분 (fragment)의 표면발현 및 개량에 이용될 수 있다. 더욱이 적용될 수 있는 단백질은 모노머 단백질 뿐만 아니라, 멀티머 단백질도 포함한다. 멀티머 단백질의 경우는 표면발현된 경우가 매우 드물게 보고 되어 있고, 예컨대 알카라인 포스파타아제는 대장균에서 표면발현을 시도하였으나 세포외막의 내부를 향하여 발현되었다 (Stathopoulus et al., 1996). 하기의 본 발명의 실시예에서 이용된 리포터 효소인 베타갈락토시다제는 활성을 보이기 위해서는 테트라머를 형성해야 하고 지금까지는 어느 표면발현 기술을 이용하더라도 표면에 발현되지 못한 단백질이다. 베타갈락토시다제는 일반적으로 세포막을 통과하지 못할 뿐 아니라 세포막에 독성이 있는 아미노산 서열를 갖는 단편을 포함하고 있어서 세포내에서 합성된 표면발현 모체와 베타갈락토시다제와의 융합단백질이 세포막을 통과하여 세포 표면에 발현되지 못하였다. 따라서 하기의 실시예에 기재된 본 발명의 표면발현 시스템에 의한 베타갈락토시다제의 포자 표면 발현은 놀라운 결과이다.

또한, 본 명세서에서의 용어 " 단백질" 은 펩타이드 결합으로 이루어진 분자, 예컨대, 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 해석된다.

한편, 본 발명에서 이용될 수 있는 숙주는 믹소코커스를 포함하는 포자형성 그람음성균, 바실러스를 포함하는 포자형성 그람양성균, 포자형성방선균, 포자형성 효모 및 포자형성 곰팡이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는숙주는 포자형성 그람양성균이고, 보다 바람직하게는 바실러스 속 미생물이다. 특히, 바실러스 서브틸리스는 다른 포자를 만드는 유기체보다 포자의 형성에 관한 유전학적 지식 및 실험방법이 잘 알려져 있고, 배양방법이 잘 알려져 있기 때문에 본 발명에 유리하다.

본 발명의 방법에 따르면, 포자는 생식이 가능하거나 또는 불가능한 포자를 모두 이용할 수 있다. 포자 표면발현을 이용한 단백질의 개량방법에서는 회수된 포자를 생식 즉 재생하여야 하지만 포자를 목적 단백질의 단순한 전달수단으로 사용할 경우에는 포자를 재생할 필요가 없다. 특히 유전적으로 조작된 유기체로 여겨질 경우에는 사용규제를 받을 수 있으므로 재생이 불가능한 변이주를 사용하는 것이 적합하다. 예컨대, 바실러스 서브틸리스에 있어서는 cwlD 유전자가 결핍된 재생 불가능한 변이주가 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발현방법에 있어서 상기 포자를 회수하는 단계는 숙주세포의 배양시간을 조절하여 목적 단백질이 포자 표면에 최적으로 발현되는 시점에 배양을 정지시켜 회수하여 실시된다. 적합한 배양 시간은 사용되는 균주의 종류에 따라 결정되고, 바실러스 서브틸리스를 숙주로 이용하는 경우에는 16 ∼ 25시간을 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 포자를 회수하는 단계는 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있으나, 보다 바람직하게는 레노그라핀 밀도구배 (renografin gradients) 방법 (CR Harwood, et al ., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley ＆ Sons, New York, p.416(1990))이다.

한편, 외래의 목적 단백질을 표면에 발현하는 포자의 안정성은 하기의 실시예에서 확인된 바와 같이 본 발명의 경우가 매우 높고, 이와 같은 사실은 외래 단백질이 표면에 발현되더라도 포자의 코트단백질이 서로 집결하는 표면구조는 변화가 없음을 나타낸다.

상술한 본 발명의 발현방법에 의해 최종적으로 표면발현된 단백질은 다양한 방법으로 표면에 존재함을 증명할 수 있다. 1) 우선, 포자 표면발현된 단백질에 일차항체를 부착시키고, 형광을 나타내는 화합물로 표식된 이차항체를 반응시켜 포자를 염색한 다음, 형광현미경으로 관찰하거가 유세포 분석기로 분석할 수 있다. 물론 이차항체가 금으로 표식된 경우는 전자현미경으로 관찰할 수 있다. 2) 두 번째 방법은 외부에서 넣어준 단백질 분해효소에 의해서 표면발현된 단백질이 분해되어 효소활성이 감소하거나 형광현미경 또는 유세포 분석기에서 그 신호가 낮아지는 지를 관찰하는 것이다. 3) 세번째 방법은 목적 단백질이 고분자 물질을 기질로 이용하는 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 때 기질이 포자 외피 구조물 사이를 통과할 수 없기 때문에, 측정된 효소활성은 모두 표면에 노출된 효소에 기인한 것으로 증명할 수 있다.

본 발명의 목적 단백질 개량방법에 있어서, 유전자 라이브러리를 구축하는 단계는 DNA 셔플링법(Stemmer, Nature , 370: 389-391(1994)), StEP법 (Zhao, H., et al., Nat. Biotechnol ., 16: 258-261 (1998)), RPR법 (Shao. Z., et al., Nucleic acids Res ., 26: 681-683 (1998)), 분자육종법 (Ness, JE, et al., Nat. Biotechnol ., 17: 893-896 (1999)), ITCHY법 (Lutz S. and Benkovic S., Current Opinion in Biotechnology , 11: 319-324 (2000)), 에러 유발 (error prone) PCR (Cadwell, RC and Joyce, GF, PCR Methods Appl ., 2: 28-33 (1992)), 포인트 돌연변이법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor. NY, 1989), 뉴클레오타이드 돌인변이법 (Smith M. Annu. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985)), 조합형 카세트 돌연변이법 (Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985)) 또는 다른 적절한 무작위 돌연변이법을 이용하여 야생형 목적 단백질의 유전자를 변이시킴으로써 얻을 수 있으나, 이 에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 단백질 개량방법에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 단백질의 활성을 측정하거나 또는 유세포 분석기 (Georgiou, 2000)를 이용하여 신속하게 실시할 수 있다. 단백질의 활성을 이용하는 경우에는 단백질이 발현되는 숙주의 성장을 측정하거나, 또는 단백질에 의해 촉매되는 발색반응을 측정하여 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명의 포자의 내성을 이용한 단백질 개량방법에 있어서, 스크리닝 단계는 단백질의 활성을 이용하거나 또는 단백질 구조의 안정성을 이용하여 신속하게 실시할 수 있다.

상술한 바와 같은 특징을 갖는 본 발명의 단백질 개량 방법을 이용하는 경우에는, 종래의 방법으로는 용이하게 얻을 수 없는, 1) 생물학적으로 발생하지 않는 화학반응을 촉매하는 효소 (예: Diels-Alder 축합반응), 2) 비자연적인 입체 선택성 또는 레지오선택성 (regioselectivity) 활성을 갖는 효소, 3) 유기용매 또는 유기용매-수용액 이상의 용액에서 반응을 촉매할 수 있는 효소, 그리고 4) 고온 고압과 같은 극한 조건에서 반응을 촉매하는 효소 등을 야생형 효소로부터 신속하게 얻을 수 있다.

또한, 결합력이 증가한 항체의 변이체을 선별할 때 사용한느 pH의 급격한 변화나 염기농도를 조절하여 용출할 경우 파아지나 박테리아는 배양배지에 재접종을 하면 생존율이 떨어지는 경우가 발생하는 단점을, 포자 표면발현 시스템을 이용한 본 발명의 단백질 개량방법을 사용하면 해결할 수 있을 것이다.

한편, 표면발현된 효소를 생물전환 공정에 사용할 때에도 고온 및/또는 유기용매 내에서 반응이 이루어지므로, 표면발현 숙주가 극한 조건에서 물리화학적으로 안정하여야 한다. 특히 최근 산업적으로 중요한 화학합성반응은 주로 유기용매내에서의 반응이 많고, 특히 키랄화합물을 합성하거나 라세믹 혼합물로부터의 분해도 매우 혹독한 물리화학적 환경에서 수행하여야 한다. 따라서 표면발현된 효소가 이러한 극한 조건에서 안정해야 하고 이를 표면에 발현하고 있는 유기체도 안정해야 한다. 이러한 측면에서 포자의 표면발현 시스템을 이용하는 본 발명의 생물전환 방법은 특히 우리하다.

한편, 표면발현된 촉매에 의한 화학반응공정이 제안되기는 하였으나 (Georgiou et al., 1993), 표면발현된 촉매를 이용할 경우 표면발현된 숙주세포가 반응공정 동안 안정되지 못하여 가교 결합 화학물질을 이용하여 세포표면을 고정할 필요가 있었다 (Freeman et al., 1996). 본 발명의 생물전환 방법은 상기한 문제점를 해결한다. 본 발명의 방법은 포자 표면에 발현된 촉매를 이용하므로, 표면발현된 촉매 뿐 아니라 포자 자체가 안정하여 특별이 고정화할 필요가 없다. 하기의 실시예에서는 베타갈락토시다아제를 이용한 생물전환 반응이 예시되어 있으나, 본 발명의 방법은 리파아제, 프로테아제, 셀룰라제, 당전이효소, 산화환원효소 및 알돌라아제 등 포자에 표면발현된 어떠한 효소도 이용할 수 있으며, 생물전환 반응이 단일 단계 또는 다단계인 경우에도 적용되며, 생물전환 반응이 수용액상 또는 비수용 액상에서 일어나는 경우에도 적용되고, 포자는 고정 또는 비고정화된 상태에서 이용될 수 있으며, 생물전환이 다른 미생물 또는 효소와 혼합하여 사용할 수 있다는 것은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업자에게 자명하다.

단백질 어레이는 DNA 어레이와 같이 다양한 단백질, 특히 항체들을 고체 표면에 어레이하여 특정 세포에서의 원하는 타켓 단백질의 발현여부, 발현정도 등을 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 단백질 어레이를 제조하기 위해서는 어레이할 단백질을 확보하고, 고체 표면에 단백질을 고정화해야 한다. 단백질 어레이를 이용한 분석 과정에서는 고정화된 단백질과 결합시키고 결합하지 않는 단백질들을 세척시키기 위하여, 고온, 염농도 및 pH의 변화 등 다양한 처리가 이루어지고, 이에 이러한 악환경에서 견딜 수 있는 안정화된 단백질의 고정화가 필요하다.

그러나 많게는 수천개-수만개의 단백질 유전자를 발현벡터에 클로닝하고, 발현하여 분리한 다음, 이를 고체 표면에 고정화하는 일은 매우 많은 작업이 반복적으로 이루어져야 한다. 따라서, 상기 작업을 보다 단순하고 신속하게 할 필요가 있다.

본 발명의 단백질 어레이 제조방법은 상기한 작업을 가장 용이하게 할 수 있는 수단을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 소망하는 단백질이 표면에 노출된포자를 유전자 조합체를 숙주 세포에 도입하고, 표면발현된 포자를 분리한 다음, 이를 고체 표면에 고정화하게 된다. 본 발명의 단백질 어레이의 제조 과정에는 통상적으로 당업계에 이용되는 단백질 어레이의 제조과정이 적용될 수 있다 (참조: WO 0061806, WO 0054046, US 5807754, EP 0818467, WO 9742507, US 5114674 및 WO 9635953). 본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질간 또는 단백질과 리간드간 의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.

본 발명에서 이용될 수 있는 고체 기판은 유리 (예: 작용기가 노출된 유리), Si, Ge, GaAs, GaP, SiO, SiN4, 변형된 실리콘 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오리드, 폴리스틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 나일론, 섬유 또는 이의 조합이다. 상기한 기판에는 단백질의 고정화를 위하여 링커 분자가 부착되기도 하고, 스팟팅이 되지 않은 나머지 부분은 블록킹되는 것이 바람직하다. 한편, 각각의 스팟 (또는 어드레스)에 적용되는 본 발명의 표면발현된 포자의 양은 어레이 형태에 따라 결정된다. 고체 기판에 고정화된 본 발명의 포자와 표면발현된 단백질과 시료의 상호작용은 단백질의 고유 특성 (예: 면역반응성)을 이용하여 검출할 수도 있고, 또는 표면발현된 단백질에 적합한 표식 물질 (예: 형광물질, 발광물질, 방사능 물질, 에피토프)을 결합시켜 표식 물질의 신호 변화를 검출할 수도 있다. 본 발명의 단백질 어레이에 의한 최종적인 결과의 분석은 당업계에서 " 리더" 또는 " 스캐너" 로 공지되어 있는 자동화된 장치를 이용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 항체 생성방법에 이용되는 포자 표면발현용 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 조성물은 바람직하게는 예컨대, 불완전 프로이드 아쥬방 및 완전 프로이드 아쥬방과 같은 아쥬방을 포함한다. 한편, 투여하는 단계는 주사 투여가 바람직하고, 정맥내 투여, 복강내 투여, 피하 투여 및 근육내 투여가 보다 바람직하다. 한편, 충분한 양의 항체를 수득하기 위해서는 투여는 1차 투여후 적합한 시기내에 부스터 투여를 하는 것이 바람직하다.

한편, 흡착 크로마토그라피에 사용되는 항체 또는 폴리펩타이드는 적당한 담체에 고정화하기 위해 발효를 통한 단백질의 생산, 순수한 상태로의 분리정제 그리고 담체에 고정화 과정을 거쳐야 한다. 그러나 대부분의 경우 이러한 바이오흡착제는 그 생산공정이 단순치 않다. 그러나 이러한 문제점들은 효소를 지속적으로 세포표면에 발현시켜 전세포를 이용함으로써 해결할 수 있는 것으로 보고 되어 있다 (Georgiou et al., 1997). 따라서, 본 발명의 포자 표면발현 시스템은 전세포 흡착제의 제조방법으로서 적용될 수 있다.

본 발명은 (i) 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 (ii) cotA, cotB, cotC, cotD, cotE, cotF, cotG cotH, cotJA, cotJC, cotK, cotL, cotM, cotS, cotT, cotV, cotW, cotX, cotY, cotZ, spoIVA, spoVID 및 sodA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종의 포자 코트단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 포자 표면발현용 벡터에 의해 형질전환되고, 상기 유전자가 발현되는 경우에는 목적 단백질 및 코트단백질의 융합 단백질로 발현되는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 포자 표면발현용 미생물 형질전환체을 제공한다.

본 발명의 미생물 형질전환체는 포자 표면발현에 적합하도록 변이된 것이 바람직하고, 예컨대 세포외 분리 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 하여 표면발현된 목적 단백질이 안정하게 유지되도록 변이된 것 또는 미생물 형질전환체가 목적 단백질을 분해하는 세포내 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변이된 것이 바람직하다. 또한 포자형성에 관여하는 조절유전자 (Perego, M., et al., Mol. Microbiol. 19: 1151-1157 (1996))의 변형을 통하여 미생물의 포자형성률을 높이는 것도 바람직하다.

본 발명은 목적 단백질이 포자 표면에 발현된 것을 특징으로 하는 포자 표면발현용 포자를 제공한다. 본 발명의 포자는 생식이 가능 또는 불가능한 것이고, 목적에 따라 둘 중 하나를 선택할 수 있고, 이에 대한 기준은 상술한 바와 같다. 상기 생식이 불가능한 포자는 바람직하게는 유전학적 방법 (Popham DL, et al., J. Bacteriol ., 181: 6205-6209 (1999)), 화학적 방법(Setlow TR, et al., J. Appl. Microbiol ., 89: 330-338 (2000)) 및 물리적 방법(Munakata N, et al., Photochem. Photobiol ., 54: 761-768 (1999))으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 방법 또는 둘 이상의 복합적인 방법에 의해 만들어진다. 상기 포자 생식을 불가능하게 하는 유전학적인 방법은 바람직하게는 상기 포자를 생성시키는 숙주세포의 포자 생식에 관여하는 유전자를 결핍시켜 이루어진다.

한편, 본 발명의 포자는 응집성이 증가되도록 변이된 것이 바람직하고, 그 이유는 산업 스케일에서의 생물전환 반응시 반응 산물과 포자가 쉽게 분리되기 때문이다. 상기 포자의 응집성 증가는 열처리 등을 통하여 이루어질 수 있으나(Wiencek. KM, et al., Appl. Environ. Microbiol ., 56: 2600-2605 (1990)) 기타 물리적 방법이나 화학적 방법 및 유전학적 방법 등을 통하여 포자의 응집성이 증가될 수 있을 것이다.

본 발명은 복제원점; 항생제 내성 유전자; 제한효소 자리; 포자 표면 단백질을 코딩하는 유전자; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 상기 포자 표면 단백질을 코딩하는 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하고, 상기 포자 표면 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 발현되는 경우에는 융합된 상태로 발현되도록 이루어진 것을 특징으로 하는 포자 표면발형용 벡터를 제공한다.

상기 본 발명의 벡터에 있어서, 상기 포자 표면 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 cotA, cotB, cotC, cotD, cotE, cotF, cotG cotH, cotJA, cotJC, cotK, cotL, cotM, cotS, cotT, cotV, cotW, cotX, rotY, cotZ, spoIVA, spoVID 및 sodA로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종의 포자 코트단백질을 코딩하는 유전자이고, 보다 바람직하게는 cotE 또는 cotG이며, 가장 바람직하게는 cotG이다.

본 발명의 벡터에 있어서, 복제원점은 당업계에서 통상적으로 이용되는 다양한 복제원점이 이용될 수 있으며, 본 발명의 벡터가 포자형성 효모 숙주 내로 형질전환되어 이용되는 경우에는, 예컨대, 2μ, ARS, ARS1 또는 ARS2 등의 복제 원점을 포함하고, 바실러스 속 숙수 내로 형질전환되어 이용되는 경우에는, ori 322, ColE1 복제원점, Rep1060 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 벡터에 포함되는 선택 표지로서의 항생제 내성 유전자는 숙주 세포가 바실러스 속미생물과 같은 원핵세포의 경우에는, 카나마이신, 암피실린, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 등과 같은 원핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함한다. 상기 프로모터는 포자 표면 단백질을 코딩하는 유전자 자체의 프로모터를 이용할 수 있고, 또한, 당업계에서 통상적으로 이용되는 숙수 세포에 적합한 프로모터로 대체할 수도 있다.

실시예 Ⅰ : 코트단백질 유전자 선별

Ⅰ-1: 포자 표면 발현벡터의 제작

포자를 구성하는 코트단백질 중 포자 표면발현에 가장 적합한 코트단백질을 선별하기 위하여 코트단백질과 베타갈락토시다아제의 융합단백질을 만드는 유전자재조합체를 다음과 같이 제작하였다:

우선, 프랑스국 파스테르 연구소의 F. Kunst 박사로부터 분양 받은 바실러스 서브틸리스 168 균주 (Kunst F., et al., Nature , 390:249-256(1997))의 DNA를 칼만 등의 방법 (Kalman S., et al., Appl. Environ. Mirobiol . 59, 1131-1137(1993))으로 분리하고, 분리된 DNA를 주형으로 하고, spoIVA는 서열 1 및 2, cotB는 서열 3 및 4, cotC는 서열 5 및 6, cotD는 서열 7 및 8, cotE는 서열 9 및 10, cotG는 서열 11 및 12, cotH는 서열 13 및 14, cotM은 서열 15 및 16, cotV는 서열 17 및 18, cotX는 서열 19 및 20, 그리고 cotY는 서열 21 및 22를 각각 프라이머로 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 중합효소는 베링거만하임사로부터 구입한 Taq 중합효소를 사용하였고, 어닐링은 55℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분, 변성은 94℃에서 30초간으로 하여 총 35 사이클을 수행하였다.

이어, 각각의 PCR 산물을 Bam HI 및 Sal I으로 절단하고, 프랑스국 P. Stragier박사로부터 얻은 플라스미드 pDG1728 (Guerout-Fleury, AM, et al., Gene , 180:57-61(1996))의 Bam HI과 Sal I 위치에 삽입하여 코트단백질과 베타갈락토시다아제의 융합단백질을 발현시킬 수 있는 벡터를 제작하였다. 첨부한 도 3a는 CotE 단백질과 베타갈락토시다아제의 융합단백질에 대한 pCotE-lacZ 발현벡터의 유전자 지도이고, 도 3b는 CotG 단백질과 베타갈락토시다아제의 융합단백질에 대한 pCotG-lacZ 발현벡터의 유전자 지도이다.

한편, 서열 23은 cotE-lacZ의 융합유전자의 서열, 서열 24는 서열 23에 의해 코딩되는 CotE-LacZ 융합단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 23에서 cotE의프로모터 부위는 서열번호 1 ∼ 329까지이고, CotE의 구조 유전자에 해당되는 부위는 서열번호 330 ∼ 872까지이며, 서열번호 873 ∼ 878은 제한효소 절단부위이고 LacZ의 구조유전자에 해당되는 부분은 서열번호 879 ∼ 3902까지이다.

서열 25는 cotG-lacZ의 융합유전자의 서열, 서열 26은 서열 25에 의해 코딩되는 CotG-LacZ 융합단백질의 아미노산 서열이다. 서열 25에서 cotG의 프로모터 부위는 서열번호 1 ∼ 460까지이고, CotG의 구조 유전자에 해당되는 부위는 서열번호 461 ∼ 1045까지이며, 서열번호 1046 ∼ 1051은 제한효소 절단부위이고 LacZ의 구조유전자에 해당되는 부분은 서열번호 1052 ∼ 4075까지이다.

Ⅰ-2: 포자의 순수 분리

완성된 재조합 발현벡터는 바실러스 서브틸리스 DB104 (Kawamura F. and Doi RH, J. Bacteriol . 160: 442-444(1984))에 자연도입법 (CR Harwood. et al ., Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley ＆ Sons, New York, p.416(1990))으로 형질전환하였다.

한편, 바실러스 균주내로 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서 세포접합법 (conjugation), 형질도입법 (transduction) 등을 사용할 수 있다.

이어, 코트단백질과 베타갈락토시다아제의 융합유전자를 염색체내에 포함하는 바실러스 균주를 각각 GYS 배지 ((NH4)2SO4 2 g/ℓ , 효모분말 2 g/ℓ , K2HPO4 0.5 g/ℓ , 포도당 1 g/ℓ , MgSO4·H2O 0.41 g/ℓ , CaCl2·2H2O 0.08 g/ℓ , MnSO4·5H2O 0.07 g/ℓ )에서 약 24시간 동안 진탕배양 (37℃, 250 rpm) 하였고, 그런 다음 레노그라핀 밀도구배 (renografin gradients) 방법 (CR Harwood, etal ., "Molecular Biological Methods for Bacillus." John Wiley ＆ Sons, New York, p.416(1990))으로 순수 포자만을 분리하였다.

Ⅰ-3: 포자 표면발현

상기 실시예에서 분리된 포자 및 바실러스 서브틸리스 DB104의 세포침전물에 대한 베타갈락토시다아제의 활성을 밀러의 방법 (Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, p. 352-355(1972))을 이용하여 측정하였고, 그 결과는 첨부한 도 5와 같다. 첨부 도 5에서, 회색 막대는 세포 침전물, 검은 막대는 순수 분리된 포자의 베타갈락토시다아제 활성을 각각 나타낸 것이고, 1은 대조구 바실러스 서브틸리스 DB104에 대한 것이고; 2는 SpoIVA-LacZ; 3은 CotB-LacZ; 4는 CotC-LacZ; 5는 CotD-LacZ; 6은 CotE-LacZ; 7은 CotG-LacZ; 8은 CotH-LacZ; 9는 CotM-LacZ; 10은 CotV-LacZ; 11은 CotX-LacZ; 그리고 12는 CotY-LacZ 융합단백질을 각각 발현하는 시료에 대한 것이다.

도 5에 나타난 바와 같이, Deits TL(미합중국 특허 제 5766914호)에 의해 사용되었던 cotC 및 cotD는 그 발현양이 대조구와 거의 차이가 없을 정도로 발현양이 현저히 낮아, 표면발현이 거의 이루어지지 않았다. 그러나 cotE 및 cotG는 다른 코트단백질 유전자에 비해 발현양이 상대적으로 높았으며 특히 cotG가 현저히 높았다. 또한, 포자만을 순수 분리한 후 측정한 효소활성에서도 cotG의 경우가 가장 높은 효소활성을 보였는데 이와 같은 사실은 CotG-LacZ 융합단백질이 포자표면에 가장 많이 위치하고 있음을 보여주는 것이다.

따라서, 발현양 및 발현된 융합단백질의 포자표면에 위치한 양 등을 고려할 때 cotG가 포자 표면발현의 모티프로서 가장 유리하다는 것을 확인할 수 있고, 이러한 실험적 결과가 다른 표면발현되는 코트단백질 유전자 역시 포자 표면발현에 사용될 수 있음을 배제하지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

Ⅰ-4: 표면발현된 효소에 대한 단백질분해효소의 영향

상기 실시예에서 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제가 단백질분해효소에 의해 분해되는지 여부를 확인하기 위하여, CotG-LacZ가 표면발현된 순수 분리된 포자를 100 ㎕의 PBS 용액에 현탁하고 프로테아제 K . 프로테아제 타입 XIV 또는 트립신을 각각 10 mg/㎖ 처리하였다. 이어, 베타갈락토시다아제의 활성을 상기 실시예와 동일하게 측정하였고, 그 결과는 첨부 도 6에 나타내어 있다. 첨부 도 6에서 확인할 수 있듯이, 정도의 차이는 있지만 단백질 분해효소에 의해 포자에 표면발현된 베타갈락토시다아제의 활성이 감소되었다. 이와 같은 결과는 포자의 표면에 베타갈락토시다아제가 위치하고 있다는 것을 증명해 준다.

한편, 바실러스 서브틸리스의 세포외로 분비되는 단백질 분해효소 중 두가지 즉 중성 및 알칼리성 단백질 분해효소가 결핍된 DB104 균주, 그리고 7가지가 결핍된 WB700 균주 (Ye, R., dt al., Biotechnology and Bioengineering , 62: 87-96(1999))를 상기 실시예 Ⅰ-1의 pCotG-lacZ 발현벡터로 자연도입법으로 형질전환하고, 형질전환된 각각의 균주의 세포 침전물 및 포자에서의 베타갈락토시다아제의 활성을 상기 실시예 Ⅰ-3과 동일하게 측정하였다 (첨조: 도 7). 도 7에서 볼 수 있듯이, DB104에서는 시간이 경과하면서 효소활성이 급격히 감소한 반면, WB700에서는 시간이 경과해도 효소활성의 감소가 적음을 알 수 있다. 이 결과는 DB104 균주의 경우 포자표면에 발현된 베타갈락토시다아제가 세포외 분비된 단백질 분해효소에 의해 분해가 일어나지만 WB700에서는 세포외로 분비되는 단백질 분해효소가 없으므로 시간이 경과해도 포자표면에 발현된 베타갈락토시다아제가 안정하게 유지됨을 의미한다. 따라서 이 결과 역시 포자의 표면에 효소가 위치하고 있다는 것을 증명해 준다.

실시예 Ⅱ: 포자 생산에서의 배양 시간의 중요성

도 7에서 확인할 수 있듯이, 포자 생산은 특정 시간에 배양을 정지하고 신속히 회수하는 것이 필요하다. 즉, DB104의 경우 24시간 배양 후의 포자의 효소활성보다 38시간 배양 후의 포자의 효소활성이 현저히 감소된다.

따라서, 배양시간 조절을 통해 최대의 표면발현된 효소활성을 갖는 포자를 생산할 수 있다.

실시예 Ⅲ: 베타갈락토시다아제가 표면발현된 포자의 특성 분석

베타갈락토시다아제가 표면발현된 포자의 열에 대한 내성을 다음과 같이 조사하였다: 상기 실시예 Ⅰ-2의 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 분리된 포자100 ㎕를 80℃에서 15분 동안 열처리를 한 후, LB배지에 도말하여 포자의 생존률을 조사하였다 (참조: 도 8). 도 8에서 보는 바와 같이, CotG-LacZ가 표면발현된 포자는 표면발현되지 않은 포자와 동등한 정도로 열 안정성을 나타내었다. 따라서 다른 단백질이 융합된 코트단백질이 표면에 발현되어도 열안전성과 같은 포자의 원래 특성에는 변화가 없음을 알 수 있다. 또한, 본 실험 결과는 효소가 표면발현된 포자를효소원으로 사용하여 고온에서의 화학반응이 가능함을 나타내기도 한다. 한편, 본 실험 결과는 본 발명에 따라 형질전환된 포자가 세포벽 분해효소인 라이소자임 및 용매에 대하여도 포자 특유의 내성을 유지하고 있을 것으로 예상케 하는 자료가 된다. 물론 원래의 포자에 비해서는 약간의 내성 감소는 있을 수 있을 것으로 예상된다.

실시예 Ⅳ: 다양한 효소의 포자 표면발현

Ⅳ-1: 재조합 벡터의 제조

포자에 여러가지 효소를 표면발현하여 이용하기 위해서는 상기한 베타갈락토시다아제 뿐만 아니라, 다양한 목적 단백질이 포자 표면에 발현되는지를 확인할 필요가 있다. 먼저, 플라스미드 pHPS9 (Haima. et al., Gene . 86:63-69(1990))을 Eco RⅠ과 Hind Ⅲ로 절단한 후 클레나우 효소로 블런트 엔드를 만들었다. 이어, 플라스미드 p123T EMBL Z46733)를 Bss HⅡ로 절단한 다음, 멀티플 클로닝 사이트가 포함된 DNA 절편을 상기 블런트 엔드가 형성된 플리스미드에 삽입하여, 하기의 실시예에서 기본 벡터로 사용될 플라스미드 pCSK1을 제작하였다. 그런 다음, 상기 플라드미드 pCSK1을 Bam HⅠ 및 Pst Ⅰ으로 절단하고, PCR로 증폭된 cotG 유전자를 삽입하여 플라스미드 pCSK-cotG를 제작하였다. 이때 cotG 유전자와 목적 단백질 사이에 링크를 만들어 주기 위하여 바실러스 서브틸리스 168 균주의 DNA를 주형으로 서열 27의 cotG-링크 5 프라이머 및 서열 12에 기재된 3 프라이머를 사용하여 cotG 유전자를 PCR로 증폭시켰다.

한편, 상기 과정과는 별도로 벡터에 삽입될 카복시메틸셀룰라아제, 레반수크라아제 또는 리파아제를 코딩하는 유전자를 다음과 같은 방법으로 수득하였다. 카복시메틸셀룰라아제의 경우 pBS1 플라스미드(SH Park et al., Agric. Biol. Chem ., 55:441-448(1991))에 클로닝된 것을 사용하였다. pBS1 플라스미드는 바실러스 서브틸리스 ESE616 균으로부터 클로닝된 카복시메틸셀룰라아제 유전자를 함유하고 있다. 이 pBS1을 주형으로 하여 서열 28 및 29에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 레반수크라아제의 경우는 플라스미드 pSSTS110 (Jung, H.-C., et al., Vat. Biotech ., 16:576-580(1998))을 주형으로 하고 서열 30 및 31에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 리파아제의 경우 플라스미드 pTOTAL (Ahn, J.-H., et al., J. Bacteriol ., 181: 1847-1852(1999))을 주형으로 하고, 서열 32 및 33에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 상기 실시예 1-1과 동일한 조건으로 수행하였다.

그런 다음, 상기 플라스미드 pCSK-cotG를 Pst Ⅰ과 Bam HⅠ효소로 절단하고, cotG 유전자 뒤에 PCR로 증폭된 상기 카복시메틸셀룰라아제, 레반수크라아제 또는 리파아제 유전자를 각각 Pst Ⅰ과 Bam HⅠ효소로 절단 후 삽입하여 CotG와 목적 단백질의 융합단백질이 발현되도록 제조합 벡터를 제조하였다. 첨부한 도 9는 이렇게 제작된 재조합 벡터의 일례로서, CotG와 카복시메틸셀룰라아제의 융합 단백질이 발현되도록 제작된 벡터, pCSK-cotG-CMCase이다. pCSK-cotG-CMCase 벡터로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 DB104를 바실러스 서브틸리스 GFSD18이라 명명하고, 이를 국제기탁기관인 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 11월 16일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 0887BP로 부여받았다.

한편, 서열 34는 cotG-CMCase 융합유전자의 서열이고, 서열 35는 서열 34에 의해 코딩되는 CotG-CMCase의 아미노산 서열이다. 서열 34에서 cotG의 프로모터 부위는 서열번호 1 ∼ 460까지이고, CotG의 구조 유전자에 해당되는 부위는 서열번호 461 ∼ 1045까지이며, 서열번호 1046 ∼ 1084는 연결부위이고 CMCase의 구조 유전자에 해당되는 부위는 서열번호 1085 ∼ 2491까지이다.

Ⅳ-2: 재조합 벡터의 발현 및 이의 확인

상기 과정에서 제작된 재조합 벡터들은 상기 실시예 Ⅰ-2와 동일한 방법으로 바실러스 서브틸리스 DB104에 형질전환하였다. 이어, 형질전환된 균주를 각각 GYS 배지에서 약 24시간 동안 진탕배양 (37℃, 250rpm)한 후 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리하고, 분리된 포자들에 대해 카복시메틸셀룰라아제(Kim, et al., Appl. Environ. Microbiol ., 66: 788-793(2000)), 레반수크라아제 (Jung, et al., Nat. Biotech ., 16: 576-580(1998)) 및 리파아제의 활성을 측정하였다. 리파아제의 활성은 PBS 용액에 현탁된 포장에 10%의 올리브 기름을 혼합하여 48시간 동안 반응시킨 다음, 상등액에 큐프릭산 0.2 ㎖을 처리하여 715 nm의 파장에서 흡광도를 조사하여 측정하였다.

카복시메틸셀룰라아제의 활성은 대조구에서는 0 mU였지만 효소가 표면발현된 포자에서는 175 mU로 효소활성이 나타났다. 한편, 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체 (Kim, et al., Appl. Environ. Microbiol ., 66: 788-793 (2000))를 이용하여, 유세포 분석기(FACSort, 미합중국 Becton Dickinson 사)로 분석한 결과, pCSK-cotG-CMCasc로 형질전환된 포자의 표면에서 카복시메틸셀룰라아제가 검출되었다 (참조: 도 10).

또한, 레반수크라아제의 활성은 재조합 벡터로 형질전환된 포자에서 높게 나타났고 (참조: 도 12), 레반수크라아제에 특이적으로 결합하는 항체(Jung, et al., Nat. Biotech ., 16: 576-580(1998))를 이용하여 상기 카복시메틸셀룰라아제와 동일하게 유세포 분석기로 분석한 결과, 재조합 벡터로 형질전환된 포자의 표면에서 레반수크라아제가 검출되었다 (참조: 도 11).

한편, 리파아제의 활성은 재조합 벡터로 형질전화된 포자에서 A715=0.14 값이 측정되어, 그 활성을 확인할 수 있었다.

상기 실험 결과를 통하여, 베타갈락토시다아제 뿐만 아니라 다른 다양한 효소 역시 포자 표면에 발현될 수 있으며, 본 실시예에서 보여준 효소 이외의 어떠한 효소도 포자 표면에 발현시킬 수 있다는 것이 확인되었다.

한편, 본 실시예와 실시예 Ⅰ에 의하면, 코트단백질 유전자와 목적단백질 유전자가 융합된 유전자 재조합체가 숙주 세포의 염색체 내에 삽입되어 있거나 또는 플라스미드에 존재해도 포자 표면발현이 가능하며, 목적단백질 유전자가 코트단백질 유전자의 앞이나 중간에 위치하거나, 코트단백질 유전자가 전체 또는 일부 혹은 두번 이상 반복된 것을 포함하거나, 목적 단백질 유전자가 한번 또는 두번 이상 반복된 것을 포함하거나, 두번 이상 반복된 코트단백질 및 목적 단백질 유전자가 동일한 것을 포함하는 것이 가능하다는 것은 출원시의 기술 수준에서 당업자에게 예측 가능한 일이다.

더불어, 코트단백질 자체 프로모터 이외에 다른 프로모터를 사용하여 코트단백질과 목적단백질의 융합단백질을 발현시키는 것 또한 출원시의 기술 수준에서 당업자에게 충분히 예측 가능한 일이다. 또한 코트단백질 유전자와 목적 단백질 유전자의 융합유전자를 포함한 어떠한 벡터라도 본 발명이 포자 표면발현에 이용될 수 있는 것도 본 명세서에 개시된 내용으로부터 출원시의 기술 수준에서 당업자에게 충분히 예측 가능한 일이다.

실시예 1에서 예시된 베타갈락토시다아제는 테트라머로 알려져 있고(U. Kar sson et al., J. Ultrastruct Res ., 10:457-469(1964)), 본 실시예의 여러 효소는 모노머이므로 모노머 또는 멀티머 모두 본 발명의 포자 표면발현 방법에 이용될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 Ⅴ: 항체의 포자 표면발현 및 방향성 진화를 위한 탐색

효소 이외의 단백질도 포자에 표면발현되는지를 입증하기 위하여 항체를 포자 표면발현하는 실험을 다음과 같이 실시하였다:

Ⅴ-1: 단쇄 Fv의 표면발현을 위한 재조합 벡터의 제조

바실러스 서브틸리스의 포장의 표면 단백질인 CotG의 C-말단에 B형 간염바이러스의 Pre-S2 부위 (참조: 서열 36)에 대한 결합력을 갖는 단쇄 Fv 유전자를 연결하였다. 단쇄 Fv 유전자를 얻기 위해 단쇄 Fv 유전자를 포함하는 플라스미드 pAScFv101 (WO 9737025)를 주형으로 하여 서열 37 및 38에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 바이오니아로부터 구입한 Taq 중합효소를 사용하였고, 어닐링은 55℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분, 변성은 94℃에서 30초간으로 하여 총 30 사이클을 수행하였다. 이어, 각각의 PCR 산물을 제한효소인 Apa I과 Nhe I으로 절단한 후 포자 표면 발현벡터, pSCK-CotG의 동일 부위에 연결한 다음(pCSK-CotG-scFv), 대장균 JM109에 Inoue 등의 방법으로 형질전환시켰다(Inoue, H., et al., Gene , 96: 23-28(1990)). 대장균에서 염기성 파쇄방법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor, NY, 1989)으로 포자 표면발현 벡터들를 분리한 후 상기 실시예 I-2와 동일하게 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법으로 도입하였다.

Ⅴ-2: 유세포 분석기를 이용한 단쇄 Fv의 표면발현의 확인

표면발현된 단쇄 Fv가 B형 간염바이러스의 Pre-S2에 대한 결합력을 갖는 지를 유세포 분석기를 이용하여 다음과 같이 측정하였다.

우선, 유세포 분석기 측정을 위해 B형 간염바이러스의 Pre-S2 펩타이드를 형광물질인 플루오레신 (PanVera사)으로 플루오레신 숙시니미딜 에스터를 이용한 커플링방법으로 표지하였다.

한편, 상기 실시예 Ⅴ-1에서 형질전환된 균주들을 클로람페니콜이 5㎍/㎖ 포함된 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 8-10 시간 전배양한 다음, 포자 형성배지인 GYS 액체 배지에 1% 접종하여 37℃에서 24시간 이상 배양하여 배양액을 수득하였다. 이어, 레노그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리하고, 비특이적 결합을 배제하기 위해 3% 스킴밀크를 함유하는 PBS에서 순수 포자 100 ㎕를 블록킹한 다음, 플루오레신 표지된 Pre-S2 펩타이드 10 ㎕와 결합시켰다. 그런 다음, 상기 실시예 Ⅳ와 동일하게 유세포 분석기를 이용하여 플루오레신 표지된 Pre-S2 펩타이드가 결합된 포자를 확인하였다 (참조: 도 13). 도 13에서 확인할 수 있듯이, Pre-S2 펩타이드에 대한 단일클론 항체가 포자의 표면에서 항원에 대한 결합력을 그대로 유지하면서 성공적으로 발현됨을 볼 수 잇다.

상기 실험 결과에 따르면, 포자 표면발현에는 효소 뿐만 아니라 항체도 발현될 수 있으며 이와 같은 사실을 통해 효소 및 항체 이외에 호르몬, 호르몬 유사체, 효소 저해제, 신호전달 단밸질 혹은 그의 일부분, 항체 혹은 그의 일부분, 항원 단백질, 부착 단백질, 구조 단백질, 조절 단백질, 독소 단백질, 식물 생체방어 유도 단백질 등 어떠한 단백질도 포자의 표면에 발현될 수 있다는 것을 파악할 수 있다.

Ⅴ-3: 유세포 분석기를 이용한 단쇄 Fv가 표면발현되는 포자의 선별

표면발현된 단쇄 Fv가 B형 간염바이러스의 Pre-S2에 대한 결합력을 갖는 지를 유세포 분석기를 이용하여 다음과 같이 측정하였다.

상기 실시예 V-3에서 형질전환된 균주들을 LB 액체배지(클로람페니콜 5 ㎍/㎖ 포함)에 접종하여 37℃에서 8-10 시간 전배양한 후 포자형성 배지인 GYS 액체 배지에 1% 접종하여 37℃에서 24시간 이상 배양하여 배양액을 수득하였다. 이어, 수득된 배양액 50 ㎖을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고, 균체만을 회수하여 20% 레노그라핀 (Sigma사) 500㎕에 현탁시켰다. 그런 다음, 세포 현탁액 100 ㎕를 에펜도르프 튜브에 미리 담아 놓았던 50% 레노그라판 500 ㎕ 위에 천천히 흘려 넣어 층을 만든 후, 10,000 g에서 30분간 원심분리하여, 세포는 20% 레노그라핀 층에 남아있고 포자는 펠릿으로 가라앉아 순수하게 포자만을 분리하였다.

포자에 잔존하는 레노그라핀을 제거하기 위해 증류수로 3번 세척한 후 PBS버퍼에 현탁시켰다. 이어, 단쇄 Fv를 표면발현하는 포자와 발현하지 않는 포자를 각각 1:103 및 1:105의 비율로 혼합한 다음, 상기 실시예 Ⅴ-2와 유사하게 플루오레신으로 형광표지된 B형 간염바이러스의 Pre-S2 펩타이드 및 유세포 분석기를 이용하여 B형 간염 바이러스의 Pre-S2 부위에 대한 결합력을 나타내는 포자만을 수집하였다.

그런 다음, 유세포 분석기로 선별된 단쇄 Fv를 표면발현 하는 포자와 발현하지 않는 포자를 각각 LB 아가 플레이트 및 LB + 클로람페니콜(5 ㎍/㎖) 아가 플레이트에서 배양하여 형성되는 콜로니 형성수를 계산함으로써 선별정도를 측정하였다. 단쇄 Fv를 표면발현하는 포자는 재조합 벡터내의 클로람페니콜 내성 유전자에 의해 내성을 나타낸다.

도 14는 각각의 비율에서 단쇄 Fv를 표면발현하는 포자의 선별도를 보여준다 (선별도 = 유세포 분석기 분리 후의 단쇄 Fv를 표면발현하는 포자 비율/유세포 분석기 분리 전의 단쇄 Fv를 표면발현하는 포자 비율). 유세포 분석기 분리 전의 단쇄 Fv를 표면발현하는 포자비율이 10-5일 경우, 선별력이 4,000 이상으로 나타났고, 이러한 결과는 실제 포자에 다양한 항체 라이브러리를 표면발현하고 유세포 분석기를 통해 결합력이 보다 증가된 항체를 선별할 수 있음을 보여주는 것이다.

V-4: 포자 표면발현된 단쇄 Fv의 방향성 진화

단쇄 Fv 라이브러리를 포자 표면에 발현하기 위해 B형 간염 바이러스의 Pre-S2 부위에 대한 결합력을 갖는 단쇄 Fv를 코딩하는 유전자에 대한 에러 유발 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 상기 실시예 Ⅴ-1에서 사용한 플라스미드 pAScFv101를 주형으로 하고 서열 37 및 38에 기재된 프라이머를 사용하였다. 이들 프라이머0.3 μ M와 주형 DNA 5 ng를 반응용액 (10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 7mM MgCl2, 0.01% (w/v) 젤라틴)에 넣고 여기에 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 0.15 mM MnCl2, 바이오니아사로부터 구입한 Taq 중합효소 5U을 넣어 총 100㎕의 반응액을 준비하였다. 반응조건은 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 50℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분으로 하여 총 13 사이클을 수행하였다.

이어, 각각의 PCR 산물을 제한효소인 Apa I과 Nhe I으로 절단한 후 포자 표면 발현벡터, pCSK-CotG의 동일 부위에 연결한 다음, 대장균 JM109에 Inoue 등의 방법으로 형질전환시켜 라이브러리를 구축하여다.

상기 라이브러리를 갖는 대장균에서 염기성 파쇄방법으로 포자 포면 발현 벡터들를 분리한 다음, 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법으로 도입하였다. 이어, B형 간염 바이러스의 Pre-S2 부위에 대한 결합력을 갖는 단쇄 Fv의 라이브러리를 상기 실시예 Ⅴ-2와 동일한 방법으로 포자 표면에 발현시켰다.

그런 다음, 상기 실시예 Ⅴ-2와 동일한 방법에 따라 플루오레신 표지된 Pre-S2 펩타이드 및 유세포 분석기를 이용하여, B형 간염 바이러스의 Pre-S2 부위에 대한 표면 발현된 단쇄 Fv의 결합력의 변화를 확인하였다(참조: 도 15).

도 15에서 볼 수 있듯이, 형광이 증가된 즉 결합력이 증가된 단쇄 Fv 변이체를 표면발현하는 포자가 분리되었다. 이러한 실험 결과는 본 발명의 방법을 이용하는 경우에는, 개선된 특성을 갖는 단백질 변이체를 용이하게 제조 및 선별할 수있음을 나타낸다.

실시예 Ⅳ: 목적단백질이 표면발현된 포자를 이용한 생물전환

효소를 이용한 트랜스글리코실레이션 반응의 장점은 반응 기질의 보호/탈보호 과정 없이 위치 특이적으로 글리코시드 결합을 형성할 수 있다는 것이다. 효소를 이용하여 글리코시드 결합을 형성하는 방법으로는 1) 보편적으로 얻기 쉬운 글리코시드 가수분해효소인 글리코시다아제를 촉매로 이용한 미수계에서 가수분해의 역반응 (reverse hydrolysis)을 유도하는 방법과 2) 물에 의한 글리코시드의 분해 대신 수용체 알코올로 치환시키는 트랜스글리코실레이션 방법이 연구되어 왔다 (G. Ljunger et al., Enzyme Microb. Technol ., 16:1808-1814(1994); T. Usui et al., Carbohydr. Res ., 244:315-323(1993); R. Lopez et al., J. Org. Chem ., 59:737-745(1994)). 상기 종래의 방법의 경우에는, 합성 수율을 높이고 가수분해반응을 억제하기 위해 일반적으로 유기용매를 첨가한다. 그런, 사용되는 유기용매는 효소의 불활성화를 유도하기 때문에 고수율 합성이 어렵다. 따라서 유기용매상에서 글리코시다아제의 불활성화를 억제하는 것이 글리코실레이션 수율 증가에 필수적이다.

본 실시예는 글리코시다아제를 소수성의 바실러스 포자에 표면발현시켜 유기용매에서 효소 안정성을 증가시키고 트랜스글리코실레이션 수율을 높이는 것을 예시하기 위한 것이다.

Ⅵ-1: 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제의 유기용매 안정성

단백질 형태로 분리된 베타갈락토시다아제 (Sigma)와 바실러스 포자에 표면발현된 베타갈락토시다아제 각각을 Tris-HCl 완충용액 (pH 7.5) 500㎕에 분산시킨 다음, 다음 표 1에 기재된 다양한 유기용매를 동일한 부피로 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 혼합한 다음, 잔존의 활성을 상기 실시예 Ⅰ-3에 기재된 밀러의 방법을 이용하여 측정하였다 (참조: 표 1).

상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 포자에 표면발현된 베타갈락토시다아제가 유리된 형태 (free-form)의 베타갈락토시다아제에 비해 여러 가지 유기용매에 대해서 안정성이 높게 나타났다.

Ⅵ-2: 포자 표면발현된 베타갈락토시다아제를 이용한 물-유기용매 이상계에서의 트랜스글리코실레이션 반응

이상계에서의 트랜스글리코실레이션 반응을 시험하기 위하여, 보편적인 글리코시다아제 중 하나인 베타갈락토시다아제의 트랜스글리코실레이션을 모델반응으로하였다 (참조: 반응식 1).

우선, 락토스를 10 mM 포스페이트 완충요액 (pH 5.1)에 1 M이 되도록 용해시킨 용액 1㎖과 5-페닐-1-펜타놀을 헥산에 10 mM되도록 용해한 용액 10 ㎖을 혼합하여 반응 용액을 제조하였다. 이어, 상기 혼합 용액에 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제 (240 유니트; 1 유니트는 37℃에서 1분동안에 1 μ mol의 ONPG( ο -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)를 가수분해하는데 필요한 효소량으로 정의하였다)와 단백질 형태의 베타갈락토시다아제 (240 유니트)를 각각 넣어준 후 30℃에서 교반시켜 48시간 동안 반응시켰다.

활성 측정 결과, 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제의 경우에는 5-페닐펜틸 β-D-갈락토피라노시드가 21% 수율로 합성되었으나, 유리된 형태의 베타갈락토시다아제는 락토스의 가수분해 반응만 관찰되고, 트랜스글리코실레이션 반응은 관찰되지 않았다. 이는 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제는 유기용매에서의 안정성이 증대되었기 때문이다. 실제로, 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제의경우 72시간 반응 후에도 활성이 약 5% 가량 남아 있었으나, 유리된 형태의 베타갈락토시다아제의 경우에는 모든 효소가 불활성화 되었다. 또한 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제가 트랜스글리코실레이션 반응이 유리한 또 다른 이유는 바실러스 포자의 소수성 성질 때문으로, 포자 표면에 발현된 베타갈락토시다아제가 물과 유기용매 계면에 존재하기 때문에 물에 용해되어 있는 유리 형태의 베타갈락토시다아제보다 가수분해반응이 억제되는 효과를 얻을 수 있기 때문이다.

본 실시예에서 예시한 베타갈락토시다아제 뿐만 아니라, 리파아제 및 프로테아제 등 포자에 표면발현된 어떠한 효소라도 생물전환 반응에 이용될 수 있으며, 이러한 생물전환 반응은 단일 단계 또는 다단계로 구성될 수 있고, 생물전환 반응이 수용액상 또는 비수용액상에서 실시될 수 있으며, 적합한 단백질이 표면발현된 포자가 고정 또는 비고정화된 상태에서 생물전환반응이 실시될 수 있고, 본 발명에서의 생물전환 시스템이 다른 미생물 또는 효소와 혼합된 상태에서 이용될 수 있다는 것은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업자는 파악할 수 있다.

실시예 Ⅶ: 항원의 포자 표면발현

생체내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 포자에 펴면발현시키는 경우에는 그 자체를 생백신으로 이용할 수 있다. 바실러스 서브틸리스는 식품발효 등에 오랫동안 사용되어져 왔던 균주로 인체에 해를 끼치지 않는 안전한 균주로 공지되어 있다 (Sonenshein AL, et al., Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria. American Society for Microbiology , Washington, p871(1993)).

우선, 상기 실시예 Ⅰ-1에서 제작된 바실러스 서브틸리스 코트단백질의 발현벡터 pCotG-lacZ에 B형 간염 바이러스의 표면 항원의 유전자를 삽입하고, CotE-항원의 융합단백질이 제조되도록 한다. 이어, 제작된 재조합 벡터를 바실러스 서브틸리스에 형질전환시키고, 형진전환체를 GYS 배지에서 배양한다. 그런 다음, 배양액으로부터 레노그라핀 밀도구배 방법을 이용하여 항원이 표면 발현된 포자를 순수분리한다.

실시예 Ⅷ: 목적 단백질이 표면발현된 포자를 이용한 단백질 개량

본 발명의 포자 표면발현 시스템을 이용하여 목적 단백질을 초고속으로 스크리닝할 수 있는 방법 및 이를 이용한 목적 단백질의 개량방법을 예시하기 위하여 GFP(Green Fluorescence protein)를 대상으로 하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

Ⅷ-1: GFP-포자 표면 발현 벡터의 제작

우선, 상기 실시예 Ⅵ-1에서 제작된 pCSK-CotG 벡터에 gfp 유전자를 삽입하여 이를 포자 표면 발현하기 위하여 다음과 같이 서브클로닝하였다.

야생형 GEP보다 35배 더 밝은 형광을 보이면서 FITC 필터에서 감지되는 EGFP (Excit./Emis. Maxima (nm): 488/509; Clontech, 미합중국)와 UV에 의해 감지되는 GFPuv (Excit. /Emis. Maxima (nm): 395/509; Clontech, 미합중국)의 유전자를 cotG 유전자에 융합시키기 위하여, 각각의 프라이머를 제조하였다. 추후의 유전자 조작과정이 용이하도록 egfp 유전자를 얻기 위한 프라이머 세트 (참조: 서열 39 및 40)에는 Nhe Ⅰ과 Hind Ⅲ 제한효소 자리를 도입하였고, gfpuv 유전자를 얻기 위한 프라이며 세트 (참조: 서열 41 및 42)에는 Pstr Ⅰ과 Eco RⅠ 제한효소 자리를 도입하였다.

상기한 프라이머 및 Pfu Turbo 중합효소 (Stratagene, 미합중국)를 사용하여 PCR (MJ Research PTC-100TM Programmable Thermal Controller; 95℃ 30초, 55℃ 20초, 72℃ 2분, 25 사이클)을 수행하여 pEGFP-C1 (Clontech, 미합중국) 및 pGFPuv (Clontec, 미합중국) 벡터로부터 각각 egfp (800 bp)와 gfpuv (720 bp) 유전자를 증폭하였다.

이어, egfp 유전자는 Nhe Ⅰ/ Hind Ⅲ로, gfpuv 유전자는 Pst Ⅰ/ Eco RⅠ 제한효소로 각각 처리하여 Nhe Ⅰ/ Hind Ⅲdhk Pst Ⅰ/ Eco RⅠ로 각각 처리된 pCSK-CotG 벡터와 연결하여 pCSK-CotG-EGFP 및 pCSK-CotG-GEPuv 벡터를 제작하였다.

Ⅷ-2: GFP-포자 표면발현 벡터의 발현 및 그의 확인

제작된 상기 벡터 각각을 바실러스 서브틸리스 DB104 균주에 각각 자연도입법으로 형질전환시켰다. 이어, 클로람페니콜이 5 ㎍/㎖ 포함된 LB 아가 배지에서 형질전환체들을 선별하였다. 선별을 통해, EGFP-포자 표면발현 재조합 균주인 바실러스 서브틸리스 DB104-SDG-EGFP와 CFPuv-포자 표면발현 제조합 균주인 바실러스 서브틸리스 DE104-SDG-GFPuv를 수득하였다. 더불어 대조구조 pCSK 벡터만으로 형질전환된 균주인 바실러스 서브틸리스 DS104-SDC와 CotG 단백질만이 발현되도록 형질전환된 균주인 바실러스 서브틸리스 DB104-SDG도 확보되었다.

GFP의 포자 표면발현 여부를 분석하기 위하여, 상기 수득한 바실러스 서브틸리스 DB104-SDC, -SDG, -SDG-EGFP 및 -SDG-GFPuv 각각의 균주들을 클로람페니콜이 5 ㎍/㎖, 포함된 LB 액체배지에 접종한 다음, 상기 실시예 Ⅴ-4와 동일한 방법으로포자를 분리하였다.

이어, 분리된 포자에 대하여 상기 실시예 Ⅳ 유사한 방법으로 유세포 분석기로 GFP 형광을 측정함으로써, GFP 단백질의 포자 표면발현 여부를 분석하였다 (참조: 도 16). 도 16에서 (1)은 DB104-SDC, (2)는 DB104-SDG, (3)은 DB104-SDG-GFPuv, 그리고 (4)는 DB104-SDG-EGFP의 포자에 대한 그래프이다.

도 16에서 볼 수 있듯이, FITI 형광필터셋에서 EGFP-포자 표면발현 재조합 균주인 DB104-SDG-EGFP와 GFPuv-포자 표면발현 재조합 균주인 DB104-SDG-GFPuv의 포자에서 발광하는 형광의 세기가 대조구인 pCSK 벡터만 형질전환된 균주인 DB104-SDC와 CotG 단백질만이 발현되도록 형질전환된 균주 DB104-SDG의 포자에서 발광하는 형광보다 훨씬 높아진 것을 확인할 수 있다. 위의 실험결과 대조구 포자에 비해 EGFP 또는 GFPuv 단백질이 표면발현된 포자들의 형광을 나타내는 피크가 확연히 이동된 것으로 보아, EGFP 또는 GFPuv 단백질이 성공적으로 포자의 표면에 발현된 것을 확인할 수 있었다.

Ⅷ-3: GFP의 개량

본 발명의 포자 표면발현 시스템을 이용하여 GFP를 개량하고자 우선, gfpuv 유전자가 포함된 pGFPuv 벡터(Clontech, 미합중국)를 주형으로 하여 서열 42 및 43의 프라이머를 사용하여 에러 유발 PCR을 수행하였다. 상기 프라이머 0.3 μM와 주형 DNA 5 ng를 반응용액 (10 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 7 mM MgCl2, 0.01% (w/v) 젤라틴)에 넣고 여기에 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 0.15 mM McCl2, 바이오니아사로부터 구입한 Taq 중합효소 5U을 넣어 총 100 ㎕의반응액을 준비하였다. 반응조건은 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 50℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분으로 하여 총 13 사이클을 수행하였다.

Pst Ⅰ/ Eco RⅠ 제한효소를 상기 pCSK-CotG-GFPuv벡터에 처리하여, gfpuv 유전자를 완전히 배제시킨 다음, 상기 PCR 산물들을 동일 부위에 연결시키고, 이를 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법으로 형질전환시켜 다양한 gfpuv 유전자가 포자의 표면에 발현된 라이브러리 시스템을 구축하였다. 그런 다음, 포자 표면에 발현된 gfpuv 라이브러리를 포자 형성 배지인 GYS 배지에 접종한 다음, 상기 실시예 Ⅴ-4와 동일한 방법으로 순수 포자만을 분리하였다. 그리고 나서, 분리된 포자에 대하여 유세포 분석기로 GFP 형광을 측정하여, 개량된 GFF 변이체를 스크리닝하였다 (참조: 도 17a 내지 도 17d). 도 17a는 바실러스 서브틸리스 DB104-SDC, 도 17b는 바실러스 서브틸리스 DB104-SDG-GFPuv, 도 17c는 바실러스 서브틸리스 DB104-SDG-EGFP, 그리고 도 17d는 바실러스 서브틸리스 DB104-SDG-GFP 에러 유발 PCR을 이용하여 구축된 gfp 라이브러리에 대한 유세포 분석기 실험 결과이다.

대조구인 EGFP-포자 표면발현 재조합 균주인 DB104-SDG-EGFP와 GFPuv-포자 표면발현 재조합 균주인 DB104-SDG-GFPuv의 포자에서 내는 형광의 세기보다 더 강한 형광을 내는 포자들을 분리하고자 도 17d의 GFP 라이브러리 포자 중에서 DB104-SDG-EGFP와 DB104-SDG-GFPuv의 포자에서 내는 형광보다 더 강한 형광을 띄는 부분 (R1 부분)의 포자들을 분류하는 실험을 여러 번 수행하였다.

상기한 방법을 이용하여 GFP 단백질의 형광이 강해지거나 파장이 변화된 변이체 등 개량된 GFP를 초고속으로 선별할 수 있다.

실시예 Ⅷ: 목적 단백질이 표면발현된 포자를 이용한 단백질 어레이

슬라이드글라스 표면에 알데히드 활성기가 코팅되어 있는 단백질 어레이용 고체 표면(BMS사, 독일국)에 상기한 방법으로 B형 간염 바이러스 표면항원에 대한 단일클론항체가 표면발현된 포자의 106-109개를 자동화 어레이 장치를 이용하여 부착한다. 이는 포자 표면의 단백질에 존재하는 아미노기와 슬라이드글라스 표면의 알데히드기가 반응하여 쉬프-베이스를 형성함으로서 고체 표면에 공유결합 형태로 부착되는 것이다. 비록 부착된 면에서는 표면발현된 목적 단백질이 고체 표면에 부착되어 활성을 상실하여도 표면에 노출된 포자의 표면에 발현된 목적 단백질은 일정한 방향성을 갖을 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질간 또는 단백질과 리간드간 의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.

실시예 Ⅸ: 항원이 표면발현된 포자를 이용한 항체의 생성

상기 실시예 Ⅶ에서 수득한 B형 간염 바이러스의 표면항원이 표면발현된 포자를 PBS에 현탁하고, 동일부피의 완전 프로이드 아쥬방을 첨가한다. 이어, 상기 혼합액을 교반하여 유탁액으로 한 다음, 주사기를 이용하여 6 내지 8 주령의 BALB/c 마우스에 정맥내 투여를 한다. 투여를 한 다음, 4주가 되는 날에 2차 투여를 한다. 그리고 나서, 약 2-3번 정도 더 부스터 투여를 하여 항체 생성을 유도한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 포자 표면 발현 방법은 외부의 물리화학적 변화에 대하여 내성, 발현할 수 있는 단백질 종류의 다양성, 숙주의 생존성 및 스크리닝의 방법의 신속성이 크게 증대되는 효과가 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참고되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 요지가 보다 명확하게 설명된다.

상기에서 본 발명의 바람직한 구현예를 상설하였고, 본 발명의 요지에서 이탈하지 않는 범위에서 당업자는 본 발명의 변형 및 변화를 할 수 있다는 것은 자명하며, 본 발명의 범위는 하기의 청구항 및 그의 균등물에 의해 결정된다.

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