포자 외막단백질을 이용한 목적단백질의 표면발현 방법

포자 외막단백질을 이용한 목적단백질의 표면발현 방법{Method for Whole Surrounding Surface Display of Target Proteins Using Exosporium of Bacillus cereus Group}

본 발명은 고초균 포자의 최외곽 표면인 포자 외막단백질(exosporium)에 목적단백질을 발현하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 포자외막 단백질을 표면발현 모체로 이용하여 세포 및 포자의 표면에 목적단백질을 표면발현하는 방법, 상기 방법에 의해 목적단백질이 표면에 발현된 세포 또는 포자를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질 어레이의 제조방법, 항체의 생성방법, 혼합물로부터 특정물질을 분리하는 방법 및 생물전환방법에 관한 것이다.

유기체 표면에 원하는 펩타이드, 폴리펩타이드 등 단백질을 세포표면에 부착하여 발현하는 표면발현기술은 발현된 단백질의 성질에 따라, 또는 표면발현될 숙주 유기체의 성질에 따라 다양한 생물공학분야에 응용이 가능하다 (Fischetti et al. , Curr. Opin. Biotechnol., 4:603-10, 1993; Schreuder et al. , TIBTECH, 14:115-20, 1996; Georgiou et al. , TIBTECH, 11:6-10, 1993; Nature Biotechnol., 15:29-34, 1997). 이러한 표면발현기술은 박테리오파아지, 박테리아, 효모 또는 포유동물세포 등 여러 가지 세포 유기체를 숙주세포로 이용하여 개발되었다.

본 기술은 표면에 발현된 단백질의 유전자가 숙주 유기체내에 포함되어 있기 때문에 표면발현된 단백질의 성질을 이용하여 표면발현된 숙주 유기체를 선택적으로 선별할 수 있고, 선별된 숙주 유기체로부터 발현되는 유전자를 쉽게 확보할 수 있으므로, 단백질의 분자적 진화를 위한 단백질 개량 수단을 제공한다는 특징이 있다 (WO 98/49286, US 5,837,500).

파아지 표면발현기술은 다량의 라이브러리 (10 ⁶ ~10 ¹² 변이체)에서 가장 신속하게 원하는 단일 클론 변이체를 획득하는 데 유리하여 항체의 초고속 스크리닝에 응용되면서 매우 중요하게 되었다. 항체는 하이브리도마 기술을 이용하여 단일클론 항체를 생산되고 있으나, 이러한 방법은 생산비용이 고가이고, 소요시간도 길며, 회수할 수 있는 항체의 양이 비교적 적다는 단점이 있다. 더욱이, 10 ¹⁰ 이상의 항체 라이브러리로부터 새로운 항체를 탐색해야 하기 때문에, 새로운 결합력을 갖는 항체를 탐색하는 목적으로서 하이브리도마 기술은 부적합하다.

한편, 상술한 파아지에서의 표면발현기술을 이용한 바이오패닝법보다 간단하고 효과적인 방법을 제공하기 위하여, 박테리아나 효모의 표면에 라이브러리를 발현하고 유세포 분석기를 활용하여 신속하게 원하는 목적단백질이 표면발현된 세포를 순수 분리하는 기술도 개발되었는 데, 형광물질로 표식된 항원을 표면발현된 세포와 접촉시켜 결합시키고 시간당 10 ⁸ 개 이상의 세포를 분석할 수 있는 유세포 분석기를 사용하여 원하는 결합력을 갖는 항체를 순수 분리하였다. 표면발현된 단일클론 항체를 유세포 분석기를 이용하여 10 ⁵ 이상의 비로 농축될 수 있으며, 최종적으로 79% 이상의 세포가 원하는 세포였음을 확인하여 미생물 표면발현기술의 유용성을 확인하였다 (Daugherty et al. , Protein Eng., 11:825-32, 1998).

미생물, 더 자세하게는 박테리아, 더욱 상세하게는 고초균의 포자는 정상적인 생장조건에서는 생성되지 않는다. 포자는 성장정지기에서 생성되기 시작하며 영양세포 (vegetative cell)내에서 형성되어 영양세포가 파괴된 후 세포밖으로 노출된다. 이렇게 생성된 포자는 구조적으로 균일하고 안정하며 주위 환경의 악영향, 예를 들면 자외선, 방사선, 열, 독성 화합물, 유기용매 (solvent) 등에 저항성을 가지고 있어서 여러 가지 방면에 응용이 가능하다. 또한, 세포성장에 적합한 환경이 되면 포자가 다시 발아하여 성장을 지속함으로 세포유기체의 증폭 및 수획이 용이하다.

표면발현기술은 세포표면에 발현된 효소를 이용하기 위한 단백질 어레이의 제조방법에 이용될 수 있다. 본래 단백질 칩 기술은 제한효소, 페록시다제, 포스파타제 및 단백질 키나아제 등의 여러 종류의 효소 및 항원-항체반응을 칩 상에서 분석하는 기술이다 (US 2002/0055186 A1; WO 01/83827 A1; Braunwalder A. et al., Anal. Biochem., 234:23-6, 1996; Houseman B. et al. Nature Biotechnol., 20:270-4, 2002; Ruud M. et al., Nature Biotechnol., 18:989-94, 2000). 특히, 본 기술은 포자외막에 발현된 융합단백질과의 단백질간 상호작용, 항원과 항체 반응, 단백질과 리간드간 결합반응을 통해 대량검색, 생화학적 분석, 신약 후보물질 분석, 질병 진단 등에 응용할 수 있다. 그러나, 칩 상에 서로 다른 종류의 항체를 고정하고, 형광체가 표지된 항원 혼합물과 반응시켰을 때, 항체의 60%만이 정량적인 결과를 나타냈으며, 단지 23%만이 정성적인 결과를 나타냈다고 보고되어 있다 (MacBeath G. et al., Science, 289:1760-3, 2000; Haab B. et al., Genome Biol. 2:research 0004, 2001).

이온 결합을 이용하여 생체분자의 배향성 (orientation)을 분자수준에서 조절하면서, 균일하고 안정된 생체분자의 단일층을 칩 표면에 형성시키는 기술을 이용하여 시료를 분석할 수 있다 (US 2002/0055125 A1; US 6,406,921; Paul J. et al., JACS, 122:7849-50, 2000; RaVi A. et al., Anal. Chem., 73:471-80, 2001; Benjamin T. et al., TIBTECH, 20:279-81, 2002).

예를 들어, 포자 외막단백질에 원하는 단백질을 융합된 형태로 발현시킨다. 이후, 알데히드 기능기가 코팅되어 있는 칩에 반응시켜 고정시킴으로써, 발현 단백질의 활성을 유지시키거나 특정 부위를 비오틴화시켜 아비딘 처리된 칩 상에서 일정방향으로 고정하여 보다 안정적이고 활성적인 상태를 유지시킬 수 있다 (Zhu et al., Science, 293:2101-5, 2001; Marie-Laure L. et al., JACS, 124:8768-69, 2002). 또한, 외막단백질에 융합된 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질 및 태그(폴리 시스테인, 라이신, 히스티딘 등)를 사용하여 융합된 형태로 발현시키고 고정시킨 후, 단백질과 단백질간 상호작용 및 항원-항체간 반응을 이용하여 단백질 정제, SPR (surface plasmon resonace) 및 FACS (fluorescence activated cell sorter)에 활용하였다 (Hentz et al., Anal. Chem., 68:3939-44, 1996; Hodneland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99:5048-52, 2002; Kukar et al., Anal. Biochem., 306:50-4, 2002; US 6,117,976). 또 이러한 특성은 배향성을 가지고 선택적으로 표면에 결합하기 때문에 표면발현된 목적단백질 또는 포자를 바이오멤즈 및 패터닝에 이용할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 기술은 표면에 발현된 단백질의 유전자가 숙주 유기체내에 포함되어 있기 때문에 표면발현된 단백질의 성질을 이용하여 표면발현된 숙주 유기체를 생물전환 촉매로 이용할 수 있다. 화학적 반응에 사용할 수 있는 효소가 표면에 발현된 전세포를 생물촉매로 사용하는 경우에는, 효소의 직접 발현, 분리 및 안정화 등의 과정이 필요없다는 장점이 있다. 생물전환에 사용되는 효소를 세포내에 발현시키는 경우에는, 세포를 배양하고 회수한 다음, 톨루엔과 같은 화학물질을 사용하여 기질이 투과할 수 있도록 하는 과정이 필수적이다. 또한 지속적으로 사용할 경우 효소가 활성을 잃거나, 기질과 산물의 물질전달 문제점이 있어서 전체 공정의 생산성이 저하되는 문제점이 있다.

한편, 상술한 문제점들은 효소를 지속적으로 세포표면에 발현시킴으로써 해결될 수 있다 (Jung et al, Nature Biotechnol., 16:576-80, 1998). 포스포디에스터라아제가 표면에 발현된 전세포를 이용하여, 독성이 매우 강한 유기인 계열의 파라티온 (parathion)과 파라옥손 (paraoxon)을 분해한 예는, 세포에 표면발현된 효소가 환경정화공정에 이용될 수 있음을 보여준 일례이다 (Richins et al., Nature Biotechnol., 15:984-7, 1997).

포자 외막단백질은 포자 표면의 최외곽에 존재하기 때문에 포자 표면발현시 포자의 코트단백질의 구조에 영향을 주지 않고 포자 전체를 목적단백질로 에워싸는 효과를 나타낼 수 있고 또한 그람 양성균과 그람 음성균을 포함한 박테리아의 세포 표면발현에도 포자 외막단백질을 이용하여 세포표면발현에 이용될 수 있다.

특히, 바실러스 안뜨라시스의 bclA 유전자가 코딩하는 포자 외막단백질은 반복적인 아미노산구조를 갖는 콜라겐 유사 영역 (collagen-like region)을 지니고 있다. 21 개의 아미노산 서열 (GPT)5GDTGTT이 하나에서 여덟 개까지 숙주세포의 종류에 따라 다양하게 반복적인 영역을 포자 외막단백질의 중간 위치에 가지고 있다 (Sylvestre et al., Mol. Microbiol., 45:169-78, 2002; J. Bacteriol., 185:1555-63, 2003). 이를 다양한 크기로 이용하여 표면발현 시스템으로 이용이 가능하여 바실러스 속의 포자외막 표면발현 뿐만 아니라 그람 양성균과 그람 음성균에서의 세포표면 발현에도 이용할 수 있다. 또한 바실러스 세레우스 군의 포자 외막단백질 (exosporium)을 이용하여 목적단백질을 세포 및 포자의 표면에 발현시킬 수 있다는 사실은 아직까지 보고되지 않았으므로 이를 이용하여 포자외막에 목적단백질을 융합발현하면 표면발현이 가능할 것이다.

이를 입증하기 위하여 바실러스의 카복시메틸셀룰라아제를 bclA 유전자와 융합하여 발현한 후 표면 발현 여부를 확인하고자 한다. 여기서 바실러스 세레우스 군은 바실러스 츄린겐시스와 바실러스 안뜨라시스를 포함하여 통칭하는 것으로서 포자 바깥쪽에 느슨한 풍선모양의 포자외막을 형성하는 데, 다른 몇몇 바실러스 속이나 클로스트리디움 속에서도 발견된 바 있다 (Desrosier, JP and JC Lara., J. Gen. Microbiol., 130:935-40, 1984).

바실러스 안뜨라시스의 포자 외막단백질을 코딩하는 bclA 유전자 (Sylvestre et al., Mol. Microbiol., 45:169-78, 2002)를 포함하여 바실러스 츄린겐시스의 inhA 와 inhB 유전자 (Grandvalet et al., Microbiol., 147:1805-13, 2001), 바실러스 세레우스의 포자 외막단백질을 코딩하는 exsB, exsC, exsD, exsE, exsF, exsG, exsH, exsJ, 그리고 exsY 유전자 (Todd et al., J. Bacteriol., 185:3373-8, 2003)를 포자 표면발현 모체로 이용하고 목적단백질을 융합발현하는 포자외막 표면발현 시스템 및 세포 표면발현시스템을 구현할 수 있다. 특히, 바실러스 안뜨라시스의 bclA 유전자가 코딩하고 있는 포자 외막단백질은 전체 단백질의 중간위치에 (GPT)5GDTGTT로 구성된 21개의 아미노산이 숙주세포에 따라 한 번에서 여덟 번의 반복되는 서열구조로 되어 있으므로 포자 바깥쪽에 매우 안정적인 형태로 존재할 것이다 (Sylvestre et al., J. Bacteriol., 185:1555-63, 2003).

상술한 표면발현기술은 항원 또는 그 일부분을 세포 표면에 발현하여 항체를 생성하게 함으로써 이를 이용한 재조합 생백신의 전달 수단을 제공하게 된다. 현재까지의 백신은 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 주로 사용하였고, 박테리아의 경우에는 항원을 세포내, 세포막 또는 세포외로 분비 발현하여 숙주세포에 전달하였다. 한편, 표면발현된 생백신은 매우 강력한 면역반응을 나타내고 숙주세포 내에 증식하면서 지속적으로 항원을 발현할 수 있기 때문에, 새로운 백신 전달수단으로서 주목을 받고 있다. 특히 비병원성 대장균이나 살모넬라균의 표면에 병원성 유래의 항원 에피토프를 발현하여 살아있는 상태로 경구 투여할 경우에는 훨씬 지속적이고 강력한 면역반응을 나타내는 것으로 알려져 있어서 항원-항체 생성을 유도하는 방법으로 사용될 수 있다 (Georgiou et al. , Nature Biotechnol., 15:29-34, 1997; Lee et al., Nature Biotechnol., 18:645-8, 2000).

Martineau 등은 대장균의 표면발현기술을 이용하여 항펩타이드 항체를 생산하는 매우 간단한 방법을 보고하였다 (Martineau et al. , Bio/Technol., 9:170-2, 1991). 그 내용을 살펴보면, MalE와 세포외막 단백질인 LamB의 표면돌출부위에 원하는 펩타이드를 발현한 다음, 전세포 또는 분쇄된 세포를 동물에 투여하여 항펩타이드 항체의 생성을 유도하였고, 이러한 방법에 따르는 경우에는 화학적으로 펩타이드를 합성하거나 이를 전달 단백질에 부착하지 않고도 항체를 생산할 수 있게 된다.

상술한 표면발현기술은 여러 혼합물로부터 특정물질을 분리하는 방법에 이용될 수 있다. 흡착 크로마토그라피에 사용되는 항체나 단백질을 적당한 담체에 고정화하기 위해서는 발효를 통한 단백질의 생산, 순수한 상태로의 분리 및 정제, 그리고 담체에의 고정화 과정을 거쳐야 한다.

흡착단백질을 미생물의 표면에 발현시켜, 세포전체를 일종의 흡착제로 이용하는 기술이 개발되었는데 전세포 흡착제로서 잘 알려진 것은 포유류 항체의 Fc 도메인과 높은 친화성을 갖는 단백질 A가 표면에 자연적으로 발현된 Staphylococcus aureus 가 그 실례이다. 또 최근에는 미생물 표면발현기술을 이용하여 메탈로티오네인 (metallothionein), 또는 여러 개의 히스티딘 잔기와 같은 금속 흡착단백질을 세포표면에 대량 발현하여, 중금속의 제거 및 회수하는 새로운 방법이 발표되었다 (Sousa et al., Nature Biotechnol., 14:1017-20, 1996; J. Bacteriol., 180:2280-4, 1998; Samuelson et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:1243-8, 2000). 상기한 방법에 따르면, 종래의 금속 흡착미생물을 이용한 방법보다 훨씬 효과적인 방법으로 오염원으로부터 중금속을 제거 또는 회수할 수 있다.

상술한 바와 같이, 특정 유기체의 외막단백질을 이용하여 외래단백질을 세포 표면에 발현시키기 위해서는 적당한 표면단백질과 외래단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성되도록 하고, 이들이 안정하게 세포내막을 통과하여 세포표면에 부착되어 유지되도록 해야 한다.

이를 위해서는 다음과 같은 성질을 갖는 표면단백질을 선정하여 표면발현의 모체로 사용해야 할 것이다: 첫째, 세포내막을 통과할 수 있는 분비 신호 (secretion signal)를 N-말단에 가지고 있고, 둘째, 세포 외막 표면에 안정적으로 부착될 수 있는 표적 신호 (targeting signal)를 가져야 하며, 셋째, 세포의 성장에 악영향을 끼치지 않는 범위 내에서는 세포표면에 다량으로 발현되어 단백질의 활성이 높게 나타날 수 있으면서, 마지막으로, 단백질의 크기에 관계없이 안정적으로 발현되어 다양한 반응에 이용될 수 있어야 한다 (Georgiou et al., TIBTECH, 11:6-10, 1993). 이러한 표면발현 모체는 숙주세포의 표면에 외막단백질의 N-말단이나 C-말단, 또는 단백질의 중앙에 삽입되도록 유전적으로 조작이 필요하다. 포자외막에 발현된 모든 단백질이 표면발현모체와 연결된 융합단백질의 합성이 필수적이다. 따라서 야생형 단백질이 아닌 변형된 목적단백질이 포자외막 단백질에 융합발현되는 것이다.

현재까지 숙주세포의 표면단백질을 표면발현 모체로 사용하여 목적단백질을 표면발현할 수 있는 표면발현 시스템은 파아지 (Chiswell et al., TIBTECH, 10:80-4, 1992), 박테리아 (Georgiou et al., TIBTECH, 11:6-10, 1993; Little et al., TIBTECH, 11:3-5, 1993; Georgiou et al., Nature Biotechnol., 15:29-34, 1997; Jung et al., Nature Biotechnol., 16:576-80, 1998; Xu et al., Appl. Environ. Microbiol., 65:5142-7, 1999; Lee et al., TIBTECH, 21:45-52, 2003), 그람음성 세균 (Hedegaard et al . , Gene 85:115-24, 1989; Fuchs et al., Bio/Technol., 9:1369-72, 1991; Francisco et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89:2713-7, 1992; Klauser et al., EMBO J., 9:1991-9, 1990; J. Mol. Biol., 234:579-93, 1993), 그람양성 세균 (WO 94/00581; Samuelson et al., J. Bacteriol., 177:1470-6, 1995; Sleytr et al., TIBTECH, 15:1-9, 1997), 효모 (Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem., 57:285-320, 1988; Schreuder et al. , TIBTECH, 14:115-20, 1996) 등이 공지되어 � ��다.

상기 개발된 파아지 표면발현 기술은 파아지에 표면발현된 라이브러리에서 선별된 항체가 매우 낮은 발현율을 나타내었다. 또한, 그람음성 세균의 표면발현 시스템은 외래 폴리펩타이드를 삽입하면 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못하였고 (Charbit et al., J. Immunol., 139:1644-58, 1987; Agterberg et al., Gene, 88:37-45, 1990), 숙주세포의 세포표면의 안정성과 생존력이 감소되었다. 표면발현 기술이 가장 많이 연구된 대장균 숙주의 경우 대부분이 세포표면 단백질을 표면발현 모체로 개발되었는데, 세포표면 단백질이 외래단백질과 융합하여 과발현되면 세포표면이 구조적으로 불안정하여지고 결과적으로 숙주세포의 생존력이 떨어지는 단점이 있다 (Georgiou et al., Protein Eng., 9:239-47, 1996).

한편, 미생물의 포자표면에 목적단백질을 노출하여 발현하고자한 시도로서는 포자의 코트단백질과 융합하여 목적단백질을 포자표면에 발현하였다. US 5,766,914는 바실러스 서브틸리스의 외피 코트단백질인 CotC, 또는 내피 코트단백질인 CotD에 리포터 유전자인 lacZ 가 코딩하는 효소인 베타갈락토시다아제 (β-galactosidase)를 융합하여 실시한 효소의 분리 정제 방법을 개시하고 있다. 또한, CotC 또는 CotD가 포자표면 발현모체로 적합한 것으로 기재되어 있지만 실험적 증명을 보이지 못하였다 (US 5,837,500; US 5,800,821).

미생물 포자표면에 노출하여 발현하고자한 다른 시도가 US 2002/0150594 A1에 개시되어 있다. CotC와 CotD를 비롯하여 CotA, CotB, CotE, CotF, CotG, CotN, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ를 이용한 코트단백질을 포자표면 발현모체로 이용하여 박테리아와 바이러스 병원성 항원을 표면발현하여 생백신으로 이용하고 산업용 단백질의 표면발현에도 이용했다.

또한, WO 02/46388에서도 CotE와 CotG를 비롯하여 CotA, CotB, CotC, CotD, CotF, CotH, CotJA, CotJC, CotK, CotL, CotM, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, SpoIVA, SpoVID, SodA를 이용한 코트단백질을 포자표면 발현모체로 이용하여 바실러스 서브틸리스의 포자표면에 목적단백질을 발현하였다.

이러한 결과는 목적단백질의 표면발현을 위해 표면발현 모체와 융합단백질을 만들어야 하는데 여러 코트단백질중 하나의 코트단백질을 표면발현 모체로 이용하는 문제로 융합단백질의 발현양이 적을 수 있다. 이럴 경우 단백질 어레이의 제조, 항체의 제조 및 전세포 생물전환반응 공정의 효율이 떨어지게 된다. 과발현될 경우에는 포자의 구조적인 변형을 초래하거나, 원래 포자가 가지고 있는 고유의 물리·화학적 특성이 달라질 우려가 있다. 또한 표면발현 모체와 융합단백질을 통한 목적단백질의 표면발현은 표면발현 모체가 세포 및 포자의 표면에 삽입되는 정도에 의존하여 발현되기 때문에 표면발현되는 양에 한계가 있다.

상술한 바와 같이, 종래의 포자표면 발현기술은 표면발현 모체에 발현되는 목적단백질의 발현양이 한계가 있을 수 있고, 단백질을 포자표면에 과량 발현하는 경우에는 숙주세포의 표면에 구조적인 문제가 발생되어, 최종적으로는 숙주세포의 생존력 또는 환경에 대한 내성이 크게 저하되는 문제점이 있다.

삭제

본 발명자들은 상술한 기존의 포자 표면발현 기술의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 포자 표면발현의 유전적 담체로 세포 또는 포자를 이용한 새로운 단백질 표면발현방법을 발명함에 있어서 구조적으로 안정한 표면발현 모체로서 고초균의 포자 외막단백질을 이용하고, 포자 외막단백질에 융합된 목적단백질이 과량발현되어도 고유한 구조가 변형되지 않은 채 표면발현될 수 있어 유전자담체의 생존력이나 환경에 대한 내성이 변하지 않음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 표면발현 모체로서 포자 외막단백질을 필요로 하고 목적단백질을 포자의 최외곽에 에워싼 형태로 발현시키는 포자표면 발현방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 세포표면 발현 모체로서 포자 외막단백질을 필요로 하고 목적단백질을 세포 표면에 발현시키는 세포표면 발현방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조되고 목적단백질이 표면에 발현된 세포 또는 포자를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질 어레이의 제조방법, 척추동물에서 항체를 생산방법, 생물전환 방법, 혼합물로부터 특정물질을 분리하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유전자 담체에 포자 외막단백질을 이용한 표면발현 방법을 이용하고 이를 통해 목적단백질의 개량방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 포자 외막단백질 유전자를 함유하는 표면발현용 벡터 및 표면발현용 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 또는 포자의 표면에 목적단백질이 포자 외막단백질과 융합된 형태로 발현된 단백질 복합체를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 포자 외막 단백질을 코딩하는 유전자를 선별하는 단계; (b) 목적단백질이 포자 외막 단백질과 융합된 상태로 발현되도록 목적단백질의 유전자와 포자 외막 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 발현벡터를 제작하는 단계; (c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 발현벡터로 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물 숙주세포를 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적단백질을 숙주세포 또는 숙주세포의 포자 표면에 발현하는 단계; 및 (e) 목적단백질이 표면에 발현된 세포 또는 포자를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적단백질을 세포 또는 포자 표면에 발현하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고 목적단백질이 표면에 발현된 세포 또는 포자를 기질 표면에 고정화시키는 것을 특징으로 하는 단백질 어레이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 단백질 어레이는 고체 기질상에 단백질이 고정되어 있는 것으로 단백질 칩, 바이오멤즈 및 세포 또는 포자의 패턴을 포괄하는 개념으로 사용한다.

본 발명은 또한, 상기방법에 의해 제조되고 항원이 표면에 발현된 세포 또는 포자를 인간을 제외한 척추동물에 투여하여 면역반응을 유도하고, 상기 면역반응에 의해 생성된 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 척추동물에서 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고 효소활성을 갖는 목적단백질이 표면에 발현된 세포 또는 포자를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물전환 방법을 제공한다. 표면발현된 화학반응 촉매 물질로는 효소, 촉매항체 등 화학반응을 촉매할 수 있는 어떠한 물질도 포자 외막단백질에 융합발현되는 방법에 의해 표면발현되어 화학반응에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고 결합도메인이 표면에 발현된 세포 또는 포자를 혼합물과 접촉하는 것을 특징으로 하는 혼합물로부터 특정물질을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 복제원점, 항생제 내성 유전자, 제한효소 자리, 포자 외막단백질 유전자 및 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자가 숙주세포 내에서 발현될 경우, 포자 외막단백질에 융합되어 포자 또는 세포 표면에 발현이 가능하도록 이루어진 유전자 재조합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자가 숙주세포 내에서 발현될 경우, 포자 외막단백질에 융합되어 포자 또는 세포 표면에 발현이 가능하도록 이루어진 유전자 재조합체 또는 상기 발현벡터로 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물을 형질전환하여 수득되는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 목적단백질이 포자외막 단백질과 융합된 형태로 세포 또는 포자 표면에 발현되어 있는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 포자 외막 단백질을 코딩하는 유전자를 선별하는 단계; (b) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; (c) 상기 목적단백질의 변이체가 포자 외막 단백질과 융합된 상태로 발현되도록 목적단백질의 유전자 변이체 라이브러리와 포자 외막 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계; (d) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물 숙주세포를 형질전환하는 단계; (e) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 포자 또는 세포 표면에 발현하는 단계; 및 (f) 개량된 형질을 갖는 목적단백질이 발현된 포자 또는 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 목적단백질의 개량방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 목적단백질의 변이체가 포자 외막 단백질과 융합된 상태로 발현되도록 목적단백질의 유전자 변이체 라이브러리와 포자 외막 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계; (c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물 숙주세포를 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 표면에 발현시킨 포자 라이브러리를 얻는 단계; (e) 상기 목적단백질 변이체가 표면발현된 포자에 유기용매, 열, 산, 염기, 산화제, 건조, 계면활성제 및 단백질 분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법으로 처리하는 단계; (f) 상기 처리에 대하여 내성을 갖는 목적단백질의 변이체가 포자외막에 표면발현된 포자를 스크리닝하는 단계; 및 (g) 스크리닝된 포자를 적절한 배지에서 배양하여 소망하는 특성을 갖는 목적단백질의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 회수하는 단계를 포함하는 포자의 내성을 이용한 목적단백질의 개량방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 목적단백질을 코딩하는 유전자의 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; (b) 상기 목적단백질의 변이체가 포자 외막 단백질과 융합된 상태로 발현되도록 목적단백질의 유전자 변이체 라이브러리와 포자 외막 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 유전자 재조합체를 제작하는 단계; (c) 상기 유전자 재조합체 또는 상기 유전자 재조합체를 포함하는 벡터로 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모 및 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물 숙주세포를 형질전환하는 단계; (d) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 유전자 변이체 라이브러리를 표면에 발현시킨 포자 라이브러리를 얻는 단계; (e) 상기 목적단백질 변이체가 표면발현된 포자에 유기용매, 열, 산, 염기, 산화제, 건조, 계면활성제 및 단백질 분해효소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법으로 처리하는 단계; (f) 상기 처리 후 일정양의 단백질 분해효소를 처리하는 단계; (g) 상기 단백질 분해효소에 대하여 내성을 갖는 목적단백질의 변이체가 포자외막에 표면발현된 포자를 스크리닝하는 단계; 및 (h) 스크리닝된 포자를 적절한 배지에서 배양하여 소망하는 특성을 갖는 목적단백질의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 회수하는 단계를 포함하는 포자의 내성을 이용한 목적단백질의 개량방법을 제공한다.

본 발명의 단백질 개량방법에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 목적단백질의 활성을 이용하거나 또는 목적단백질에 라벨링된 물질을 인식하는 단백질을 이용하거나 또는 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드를 이용하거나 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하며 목적단백질에 결합하는 라벨링된 리간드를 이용하거나 또는 목적단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시되는 것이 유세포분석기를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 개량방법도 포함한다.

유전자담체중 미생물, 특히 고초균의 포자는 일반적으로 다음과 같은 매우 우수한 장점들을 포함하고 있다. 열에 대해 매우 안정하다; 방사선에 대해 비교적 안정하다; 독성에 대해 안정하다; 산 및 염기에 대해 매우 안정하다; 리소자임 (lysozyme)에 안정하다; 건조에 내성을 갖고 있다; 유기용매에 대해 안정하다; 대사적 활성이 없다; 쉽게 수 시간 안에 포자를 형성할 수 있다 (Driks, A., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63:1-20, 1999).

본 발명은 이러한 우수한 성질을 갖는 고초균의 포자를 유전자담체로 선택하고 포자 외막단백질이 세포내에서 형성될 시기나 이전에 표면발현할 목적단백질이 융합발현되어 최종적으로는 세포내에서 형성된 미생물포자의 외막과 목적단백질이 융합된 형태로 코트단백질의 바깥쪽에 에워싸는 형태로 표면발현되는 방법으로 기존의 포자표면보다 새로운 표면발현방법을 실현하게 된다. 본 발명은 표면발현을 위해 사용되는 표면발현 모체로 사용해야 하는 포자 외막단백질을 필요로 하기 때문에, 포자의 최외곽인 외막단백질 표면에 노출 발현되어 최종적으로 숙주세포가 분해된 후, 포자가 숙주세포로부터 노출되어 목적단백질이 포자외막에 발현된 포자를 회수하여 사용할 수 있는 방법을 제공한다.

따라서, 현재까지 알려진 표면발현 기술은 모두 표면단백질중의 하나 또는 몇 개를 활용한 형태로 목적단백질이 표면발현되어 세포 또는 포자의 표면구조가 변형될 수 있는 데 비하여 본 발명은 유전자담체의 포자의 코트단백질이 아닌 포자의 최외곽에 외막단백질을 목적단백질과 융합하여 숙주세포 내부 또는 외부로 발현하면 자연스럽게 유전자담체에 에워싸진 형태로 표면발현할 수 있는 새로운 표면발현방법을 제공한다.

본 발명에서 유전자담체중 세포가 미생물 특히 그람음성균, 그람양성균, 방선균, 효모, 곰팡이로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며 본 발명의 바람직한 구현예에서, 포자외막에 표면발현을 위한 숙주세포로는 믹소코커스 ( Myxococcus )를 포함하는 포자형성 그람음성균; 바실러스를 포함하는 포자형성 그람양성균; 포자형성 방선균; 사카로마이세스 세레비시애 ( Saccharomyces cerevisiae ), 칸디다 ( Candida ) 속과 한세눌라 ( Hansenulla ) 속을 포함하는 포자형성 효모 또는 포자형성 곰팡이 등으로부터 유래된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 포자외막 표면발현을 위한 숙주세포는 포자형성 그람 양성균에서 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 바실러스 츄린겐시스, 바실러스 안뜨라시스 및 바실러스 세레우스를 포함하는 바실러스 세레우스 군과 및 바실러스 서브틸리스 등을 포함하는 바실러스 속 미생물로부터 유래된 것이다.

특히, 바실러스 세레우스 군은 바실러스 서브틸리스의 포자와는 다르게 포자의 코트 바깥쪽에 포자외막 (exosporium)을 형성하는 특징을 가지고 있으므로 이를 이용한 포자 표면발현기술을 의미하는 것이며 포자외막을 형성하지 않는 다른 미생물에서도 발현되어 표면발현 모체로 사용이 가능하다는 것은 당업자에게 자명하다.

또, 바실러스 세레우스 군은 유전적인 정보가 많이 알려지고 있고 배양방법이 잘 알려져 있기 때문에 본 발명에 유리하다. 도 1은 본 발명에 따른 목적단백질이 포자외막의 표면에 발현된 모식도를 나타낸 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 목적단백질을 세포내 또는 외에 발현할 때, 목적단백질 유전자가 하나이거나 두 번 이상 반복된 것, 또는 두 번 이상 반복된 목적단백질 유전자가 동일한 것이거나 서로 다른 것 등이 가능하고 상기한 어떠한 조합의 경우도 가능하다.

본 발명의 방법에서 제조되는 유전자는 숙주세포 내에서 플라스미드내에 독립적으로 또는 숙주의 염색체에 삽입되어 존재할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

한편, 목적단백질의 발현 유도는 숙주세포에서 발현이 유도될 수 있는 프로모터에 의해 발현되거나 또는 목적단백질 유전자의 프로모터에 의해 발현되거나 또는 숙주 박테리아에서 발현가능한 적절한 다른 프로모터에 의해 발현될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.

본 발명의 방법은 모든 단백질에 적용될 수 있고, 예컨대, 효소, 효소저해제, 호르몬, 호르몬 유사체, 항체, 신호전달단백질, 단쇄항체, 항원, 펩타이드, 폴리펩타이드, 결합단백질, 결합도메인, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 각종 조절 인자 및 그들의 일부분 등을 포함하는 단백질의 표면발현 및 개량에 이용될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 포자는 생식이 가능하거나 또는 불가능한 포자를 모두 이용할 수 있다. 포자 외막단백질을 이용한 표면발현방법을 통해 단백질을 개량할 때에는 회수된 포자를 생식, 즉 재생하여야 하지만 포자를 목적단백질의 단순한 전달수단으로 사용할 경우에는 포자를 재생할 필요가 없다. 특히 유전적으로 조작된 유기체로 여겨질 경우에는 사용규제를 받을 수 있으므로 재생이 불가능한 변이주를 사용하는 것이 적합하다.

예컨대, 또는 바실러스 세레우스에 있어서의 gerN 유전자, 바실러스 안뜨라시스에 있어서의 gerX 유전자 시리즈가 결핍된 재생 불가능한 변이주 및 바실러스 서브틸리스에 있어서의 cwlD , rec223 그리고 gerA, gerB, gerC 및 gerD 유전자 시리즈가 결핍된 재생 불가능한 변이주가 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발현방법에 있어서 상기 포자를 회수하는 단계는 숙주세포의 배양배지를 선별하고 배양시간을 조절하여 목적단백질이 포자외막 표면에 최적으로 발현되는 시점에 배양을 정지시켜 회수하여 실시된다. 배양배지로서는 2× SG 배지 및 기타 등등의 포자형성 유도배지 (Harwood et al. , Molecular Biological Methods for Bacillus , John Wiley & Sons, NY, p.393~9, 1990)를 사용하는 것이 바람직하며, 적합한 배양 시간은 사용되는 균주의 종류에 따라 결정되고, 바실러스 세레우스 군을 숙주로 이용하는 경우에는 36 ~ 60 시간을 배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 있어서, 포자를 회수하는 단계는 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있으나, 보다 바람직하게는 유로그라핀 밀도구배 (urografin gradients) 방법 (Harwood et al. , Molecular Biological Methods for Bacillus , John Wiley & Sons, NY, p.416, 1990)이다.

상술한 본 발명의 발현방법에 의해 최종적으로 포자외막에 표면발현된 단백질은 다양한 방법으로 표면에 존재함을 증명할 수 있다. 우선, 포자외막에 표면발현된 단백질에 일차항체를 결합시키고, 형광을 나타내는 화합물로 표식된 이차항체를 반응시켜 포자를 형광염색한 다음, 형광현미경으로 관찰하거가 유세포 분석기로 분석할 수 있다. 물론 이차항체가 금으로 표식된 경우는 전자현미경으로 관찰할 수 있다. 두 번째 방법은 외부에서 넣어준 단백질 분해효소에 의해서 표면발현된 단백질이 분해되어 효소활성이 감소하거나 형광현미경 또는 유세포 분석기에서 그 신호가 낮아지는 지를 관찰하는 것이다. 세번째 방법은 목적단백질이 고분자 물질을 기질로 이용하는 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 때 기질이 포자 외피 구조물 사이를 통과할 수 없기 때문에, 측정된 효소활성은 모두 표면에 노출된 효소에 기인한 것으로 증명할 수 있다.

단백질 어레이는 DNA 어레이 또는 DNA 칩과 같이 다양한 단백질, 특히 항체들을 고체 표면에 어레이하여 특정 세포에서의 원하는 목적단백질의 발현여부, 발현정도 등을 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 단백질 어레이를 제조하기 위해서는 어레이할 단백질을 확보하고, 고체 표면에 단백질을 고정화해야 한다. 단백질 어레이를 이용한 분석과정에서는 고정화된 단백질과 결합시키고 결합하지 않는 단백질들을 세척시키기 위하여, 고온, 염농도 및 pH의 변화 등 다양한 처리가 이루어지고, 이에 이러한 악환경에서 견딜 수 있는 안정화된 단백질의 고정화가 필요하다.

그러나 많게는 수 천 내지 수 만개의 단백질 유전자를 발현벡터에 클로닝하고, 발현하여 분리한 다음, 이를 고체 표면에 고정화하는 일은 매우 많은 작업이 반복적으로 이루어져야 한다. 따라서, 상기 작업을 보다 단순하고 신속하게 할 필요가 있다.

본 발명의 단백질 어레이의 제조방법은 상기한 작업을 가장 용이하게 할 수 있는 수단을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 원하는 단백질이 표면에 노출된 포자를 유전자 조합체를 숙주 세포에 도입하고, 포자외막에 표면발현된 포자를 분리한 다음, 이를 고체 표면에 고정화하게 된다. 본 발명의 단백질 어레이의 제조과정에는 통상적으로 당업계에 이용되는 제조방법이 적용될 수 있다 (WO 00/61806; WO 00/54046; US 5,807,754; EP 0818467; WO 97/42507; US 5,114,674 및 WO 96/35953). 본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질과 단백질간 또는 단백질과 리간드간 및 항원과 항체간의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.

본 발명에서 이용될 수 있는 고체 기판은 유리 (예: 작용기가 노출된 유리), Si, Ge, GaAs, GaP, SiO, SiN ₄ , 변형된 실리콘 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오리드, 폴리스틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 나일론, 섬유 또는 이의 조합이다. 상기한 기판에는 단백질의 고정화를 위하여 링커 분자가 부착되기도 하고, 스팟팅이 되지 않은 나머지 부분은 블록킹되는 것이 바람직하다.

한편, 각각의 스팟 (또는 어드레스)에 적용되는 본 발명의 포자외막 표면발현된 포자의 양은 어레이 형태에 따라 결정된다. 고체 기판에 고정화된 본 발명의 포자와 포자외막 표면발현된 단백질과 시료의 상호작용은 단백질의 고유 특성 (예: 면역반응성)을 이용하여 검출할 수도 있고, 또는 포자외막에 표면발현된 단백질에 적합한 표식 물질 (예: 형광물질, 발광물질, 방사능 물질, 에피토프)을 결합시켜 표식 물질의 신호 변화를 검출할 수도 있다. 본 발명의 단백질 어레이에 의한 최종적인 결과의 분석은 당업계에서 “스캐너” 또는 “리더”로 공지되어 있는 자동화된 장치를 이용하여 실시할 수 있다.

바이오멤즈 및 패터닝의 경우 고체 표면에 세포 및 포자에서의 원하는 목적단백질의 발현여부, 발현정도 등을 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 확보된 목적단백질을 고체 표면에 고정화해야 한다. 이를 위해 고온, 염농도 및 pH의 변화 등 다양한 처리가 이루어지고, 이에 이러한 악환경에서 견딜 수 있는 안정화된 단백질의 고정화가 필요하다.

본 발명의 바이오멤즈 및 패턴 형성방법에 따르면, 목적단백질이 표면에 노출된 포자를 유전자 조합체를 숙주 세포에 도입하고, 포자 외막단백질에 표면발현된 유전자담체를 분리한 다음, 이를 고체 표면에 고정화하게 된다. 본 발명의 바이오멤즈 및 패터닝 방법의 제조과정에는 통상적으로 당업계에 이용되는 방법이 적용될 수 있다 (WO 00/61806; WO 00/54046; US 5,807,754; EP 0818467; WO 97/42507; US 5,114,674 및 WO 96/35953).

본 발명의 방법에 의해 제조된 바이오멤즈 및 패턴 생성 방법은 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질과 단백질간 또는 단백질과 리간드간 및 항원과 항체간의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성 및 바이오센서 등에 이용될 수 있다.

본 발명의 목적단백질 개량방법에 있어서, 유전자 라이브러리를 구축하는 단계는 DNA 셔플링법 (Stemmer, Nature, 370:389-91, 1994), StEP법 (Zhao, H. et al., Nat. Biotechnol., 16: 258-61, 1998), RPR법 (Shao, Z. et al., Nucleic Acids Res., 26:681-3, 1998), 분자육종법 (Ness, JE et al., Nat. Biotechnol. 17:893-6, 1999), ITCHY법 (Lutz S. et al., Cur. Opi. Biotechnol., 11:319-24, 2000), 에러 유발 (error-prone) PCR (Cadwell, RC et al., PCR Methods Appl., 2:28-33, 1992), 포인트 돌연변이법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989)을 이용하여 야생형 목적단백질의 유전자를 변이시킴으로써 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 단백질 개량방법에 있어서, 상기 스크리닝 단계는 단백질의 활성을 측정하거나 또는 유세포 분석기 (Georgiou, G., Adv Protein Chem., 55:293-315, 2000)를 이용하여 신속하게 실시할 수 있다. 단백질의 활성을 이용하는 경우에는 단백질이 발현되는 숙주의 성장을 측정하거나, 또는 단백질에 의해 촉매되는 발색반응을 측정하여 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명의 포자의 내성을 이용한 단백질 개량방법에 있어서, 스크리닝 단계는 단백질의 활성을 이용하거나 또는 단백질 구조의 안정성을 이용하여 신속하게 실시할 수 있다.

상술한 바와 같은 특징을 갖는 본 발명의 단백질 개량 방법을 이용하는 경우에는, 종래의 방법으로는 용이하게 얻을 수 없는, 생물학적으로 발생하지 않는 화학반응을 촉매하는 효소 (예: Diels-Alder 축합반응), 비자연적인 입체 선택성 또는 레지오선택성 (regioselectivity) 활성을 갖는 효소, 유기용매 또는 유기용매-수용액 이상의 용액에서 반응을 촉매할 수 있는 효소, 그리고 고온 고압과 같은 극한 조건에서 반응을 촉매하는 효소 등을 야생형 효소로부터 신속하게 얻을 수 있다.

또한, 결합력이 증가한 항체의 변이체을 선별할 때 사용하는 pH의 급격한 변화나 염기농도를 조절하여 용출할 경우 박테리아는 배양 배지에 재접종을 하면 생존율이 떨어지는 경우가 발생하는 단점을, 포자 표면발현 시스템을 이용한 본 발명의 단백질 개량방법을 사용하면 해결할 수 있을 것이다

한편, 표면발현된 효소를 생물전환 공정에 사용할 때에도 고온 및/또는 유기용매 내에서 반응이 이루어지므로, 표면발현 숙주가 극한 조건에서 물리화학적으로 안정하여야 한다. 특히, 최근 산업적으로 중요한 화학합성 반응은 주로 유기용매내에서의 반응이 많고, 특히 키랄화합물을 합성하거나 라세믹 혼합물로부터의 분해도 매우 혹독한 물리화학적 환경에서 수행하여야 한다. 따라서, 표면발현된 효소가 이러한 극한 조건에서 안정해야 하고, 이를 표면에 발현하고 있는 유기체도 안정해야 한다. 이러한 측면에서 포자외막에 표면발현하는 시스템을 이용하는 본 발명의 생물전환 방법은 특히 유리하다.

한편, 표면발현된 촉매에 의한 화학반응공정이 제안되기는 하였으나 (Georgiou et al., TIBTECH, 11:6-10, 1993), 표면발현된 촉매를 이용할 경우 표면발현된 숙주세포가 반응공정 동안 안정하지 못하여 가교 결합 화학물질을 이용하여 세포표면을 고정할 필요가 있었다 (Freeman et al., Biotechnol. Bioeng., 62:155-9, 1999). 본 발명의 생물전환 방법은 상기한 문제점들을 해결한다. 본 발명의 방법은 포자외막에 표면발현된 촉매를 이용하므로, 표면발현된 촉매 뿐 아니라 포자 자체가 안정하여 특별히 고정화할 필요가 없다.

하기의 실시예에서는 베타갈락토시다아제를 이용한 생물전환 반응이 예시되어 있으나, 본 발명의 방법은 리파아제, 프로테아제, 셀룰라제, 당전이효소, 산화환원효소 및 알돌라아제 등 포자에 표면발현된 어떠한 효소도 이용할 수 있으며, 생물전환 반응이 단일 단계 또는 다단계인 경우에도 적용되며, 생물전환 반응이 수용액상 또는 비수용액상에서 일어나는 경우에도 적용되고, 포자는 고정 또는 비고정화된 상태에서 이용될 수 있으며, 생물전환이 다른 미생물 또는 효소와 혼합하여 사용할 수 있다는 것은 본 명세서에 개시된 내용으로부터 당업자에게 자명하다.

본 발명의 항체 생성방법에 이용되는 포자외막 표면발현용 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 조성물은 바람직하게는 예컨대, 불완전 프로이드 아쥬방 및 완전 프로이드 아쥬방과 같은 아쥬방을 포함한다. 한편, 투여하는 단계는 주사 투여가 바람직하고, 정맥내 투여, 복강내 투여, 피하 투여 및 근육내 투여가 보다 바람직하다. 한편, 충분한 양의 항체를 수득하기 위해서는 투여는 1차 투여후 적합한 시기내에 부스터 투여를 하는 것이 바람직하다.

한편, 흡착 크로마토그라피에 사용되는 항체 또는 폴리펩타이드는 적당한 담체에 고정화하기 위해 발효를 통한 단백질의 생산, 순수한 상태로의 분리정제 그리고 담체에 고정화 과정을 거쳐야 한다. 그러나 대부분의 경우 이러한 바이오흡착제는 그 생산공정이 단순치 않다. 그러나 이러한 문제점들은 효소를 지속적으로 세포표면에 발현시켜 전세포를 이용함으로써 해결할 수 있는 것으로 보고되어 있다 (Georgiou et al., Nature Biotechnol., 15:29-34, 1997). 따라서, 본 발명의 포자외막 표면발현 시스템은 전세포 흡착제의 제조방법으로서 적용될 수 있다.

본 발명의 미생물 형질전환체는 포자외막 표면발현에 적합하도록 변이된 것이 바람직하고, 예컨대 세포외 분비 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 하여 포자외막에 표면발현된 목적단백질이 안정하게 유지되도록 변이된 것 또는 미생물 형질전환체가 목적단백질을 분해하는 세포내 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변이된 것이 바람직하다. 또한, 포자형성에 관여하는 조절유전자 (Perego, M. et al., Mol. Microbiol., 19:1151-7, 1996)의 변형을 통하여 미생물의 포자형성율을 높이는 것도 바람직하다.

본 발명은 목적단백질이 포자외막에 발현된 것을 특징으로 하는 포자외막 표면발현용 포자를 제공한다. 본 발명의 포자는 생식이 가능 또는 불가능한 것이고, 목적에 따라 둘 중 하나를 선택할 수 있고, 이에 대한 기준은 상술한 바와 같다. 상기 생식이 불가능한 포자는 바람직하게는 유전학적 방법 (Popham DL et al., J. Bacteriol., 181:6205-9, 1999), 화학적 방법 (Setlow TR et al., J. Appl. Microbiol., 89:330-8, 2000) 및 물리적 방법 (Munakata N. et al., Photochem. Photobiol., 54:761-8, 1991)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 방법 또는 둘 이상의 복합적인 방법에 의해 만들어진다. 상기 포자 생식을 불가능하게 하는 유전학적인 방법은 바람직하게는 상기 포자를 생성시키는 숙주세포의 포자 생식에 관여하는 유전자를 결핍시켜 이루어진다.

한편, 본 발명의 포자는 응집성이 증가되도록 변이된 것이 바람직하고, 그 이유는 생물전환 반응시 반응 산물과 포자가 쉽게 분리될 수 있는 장점이 있기 때문이다. 상기 포자의 응집성 증가는 열처리 등을 통하여 이루어질 수 있으나 (Wiencek KM et al., Appl. Environ. Microbiol., 56:2600-5, 1990) 기타 물리적 방법이나 화학적 방법 및 유전학적 방법 등을 통하여 포자의 응집성이 증가될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합벡터의 제조

포자의 최외곽을 구성하는 포자외막에 여러 가지 목적단백질을 표면발현하기 위해서는 유전자재조합벡터를 다음과 같이 제작하였다.

우선, 미국 BGSC ( Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)로부터 얻은 pDG1662를 Pst I과 Sal I으로 절단하고 pBR322의 동일한 부위를 삽입하여 pTJS7을 제조하였다. 바실러스의 복제원점 (replication origin)을 재조합벡터 내에 삽입시키기 위해 서열 1과 서열 2를 프라이머로 이용하고 바실러스 서브틸리스 168(BGSC 168)의 DNA를 주형으로 사용한 PCR에 의해 바실러스의 복제원점을 수득하였다. 상기 수득·증폭된 DNA와 pTJS7을 Eco RI과 Pst I로 절단한 부위를 동일한 제한효소로 절단하여 연결함으로서 pTJSB9를 제조하였다. pTJSB9를 Nde I과 Sph I으로 절단하고 동일한 부위에 인공적으로 서열 3과 같이 멀티클로닝싸이트를 합성하여 삽입함으로서 pSD1을 재조합벡터로 제작하였다. 이 벡터는 하기에 사용되는 포자 외막단백질을 발현하기 위해 멀티클로닝 사이트를 이용하는 데 사용하였다.

실시예 2: 포자 외막단백질의 클로닝

포자의 최외곽을 구성하는 포자 외막단백질과 융합하고자 하는 목적단백질을 클로닝하기 위해 유전자 재조합체를 다음과 같이 제작하였다.

우선, 미국 BGSC ( Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)로부터 얻은 바실러스 츄린겐시스 이스라엘렌시스 4Q7 (BGSC 번호: 4Q7) 균주의 DNA를 칼만 등의 방법 (Kalman, S. et al. Appl. Environ. Microbiol., 59:1131-37, 1993)으로 분리하고, 분리된 DNA(서열 4)를 주형으로 하고, 서열 5의 프라이머 IAP1과 서열 6의 프라이머 IAP2를 사용하여 PCR로 포자 외막단백질 유전자를 증폭하였다. 상기 PCR시 중합효소는 베링거만하임으로부터 구입한 Taq 중합효소를 사용하였고, 변성은 94℃에서 1분, 어닐링은 56℃에서 1분, 그리고 연장반응은 72℃에서 3분으로 하여 총 30사이클을 수행하였다.

상기에서 PCR 산물로서 얻어진 포자 외막단백질의 유전자를 Sal I 및 Nhe I으로 절단하고, 상기 실시예 1의 플라스미드 pSD1의 동일 부위에 삽입한 후 pS-InhA를 제조하였다. 도 2는 바실러스 츄린겐시스의 포자 외막단백질의 유전자를 함유하는 발현벡터(pS-InhA)를 나타낸 것이다.

실시예 3: 카복시메틸셀룰라아제의 포자외막 표면발현

바실러스 서브틸리스 포자의 코트단백질을 이용하여 표면발현한 방법은 이미 제시된 바 있다 (US 5,766,914; US 2002/0150594A1; WO 02/055561; WO 02/46388; Isticato, R. et al., J. Bacterol., 183:6294-301, 2001). 그러나, 바실러스 세레우스 군의 포자 외막단백질 (exosporium)을 이용하여 목적단백질을 포자의 표면에 발현시킬 수 있다는 사실은 아직까지 보고되지 않았다. 바실러스 세레우스 군의 포자는 최외곽에 면역 저해제로 알려진 포자외막을 가지고 있으므로 (Gerhardt, P. et al., J. Bacteriol., 88:1774-89, 1964; Edlund, T. et al., Infect. Immunol., 14:934-41, 1976) 이를 이용하여 포자외막에 목적단백질을 융합발현하면 표면발현이 가능할 것이다. 이를 입증하기 위하여 바실러스의 카복시메틸셀룰라아제를 바실러스 츄린겐시스의 포자 외막단백질에 융합발현하여 바실러스 서브틸러스 DB104 (Kawamura F. and Doi RH, J. Bacteriol., 160: 442-444, 1984)와 바실러스 츄린겐시스 4Q7(BGSC 4Q7)에 형질전환하여 포자형성 유도배지에서 배양후 포자를 추출하고 효소활성을 측정하였다.

카복시메틸셀룰라아제 (CMCase)의 포자외막 표면발현을 위해 바실러스 서브틸러스 ( Bacillus subtilis) 168 균(BGSC 168)으로부터 얻은 카복시메틸셀룰라아제 유전자를 클로닝하였다. 카복시메틸셀룰라아제를 클로닝하기 위해 바실러스 서브틸리스 168 균주의 DNA를 칼만 등의 방법으로 분리하고, 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열 7의 프라이머 INCM-1와 서열 8의 프라이머 INCM-2를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에서 중합효소는 Taq 중합효소를 사용하였고, 변성은 94℃에서 1분, 어닐링은 56℃에서 1분, 그리고 연장반응은 72℃에서 1분 30초로 하여 총 30사이클을 수행하였다.

이어, PCR 산물을 Nhe I 및 Kpn I으로 절단하고, 상기 실시예 2의 플라스미드 pS-InhA에 삽입하였다. 이렇게 제작된 플라스미드 pS-InhA-CMCase를 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법 (Harwood, et al. , Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons, NY, p.416, 1990)으로 형질전환하였고, 바실러스 츄린겐시스 4Q7에 전기천공법 (Bone, EJ et al., FEMS Microbiol. Lett., 49:171-7, 1989)으로 형질전환하였다.

이어, 형질전환된 바실러스 서브틸리스 균주를 2× SG 배지 (Nutrient broth 16g/ℓ, KCl 2g/ℓ, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.5g/ℓ, 1M Ca(NO ₃ ) ₂ ·2H ₂ O 1ml/ℓ, 0.1M MnCl ₂ ·4H ₂ O 1ml/ℓ, 1mM FeSO ₄ 1ml/ℓ, 포도당 1g/ℓ)에서 약 48시간 동안 진탕배양 (37℃, 250rpm)하고, 바실러스 츄린겐시스 균주는 2× SG 배지에서 약 60시간 동안 진탄배양 (30℃, 250rpm)하여 유로그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리하였다.

분리된 포자들에 대해 카복시메틸셀룰라아제의 활성을 측정하였는데 효소반응은 0.1 M 포타시움포스페이트 (potassium phosphate, pH 6.0)에 포자가 600 nm의 파장에서 약 1.5 정도로 현탁된 포자용액 100㎕에 1%(w/v) 카복시메틸셀룰로오즈가 녹아있는 용액 (0.1 M 포타시움포스페이트 (potassium phosphate, pH 6.0) 200㎕를 첨가하고 50℃에서 40 분간 반응하였다. 반응이 끝난 후 반응용액에 DNS (1% 3,5-Dinitrosalicylic acid, 1% NaOH, 20% Sodium potassium tartrate, 0.2% Phenol, 0.05% NaHSO ₃ ) 용액 900㎕를 첨가하고 5 분간 가열한 후 찬물에 식혔다. 다시 원심분리를 통해서 나온 상등액을 575nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 표면발현된 카복시메틸셀룰라아제의 활성 검정 그래프를 도 3에 나타내었다. 카복시메틸셀룰라아제의 활성은 바실러스 서브틸리스에서의 경우 대조구에서는 8mU이었지만, 효소가 포자외막에 표면발현된 포자에서는 13.5mU이었다. 고초균인 바실러스 츄린겐시스의 포자외막에 표면발현된 카복시메틸셀룰라아제의 활성 검정 그래프를 도 4에 나타내었다. 바실러스 츄린겐시스의 경우 대조구에서는 6 mU이었지만, 효소가 포자외막에 표면발현된 포자에서는 65 mU의 효소활성을 나타냈다.

한편, 카복시메틸셀룰라아제에 특이적으로 결합하는 항체 (Kim, et al., Appl. Environ. Microbiol., 66:788-93, 2000)를 이용하여 유세포 분석기 (FACSCalibur, Becton Dickinson Co., USA)로 분석한 결과, pS-InhA-CMCase로 형질전환된 바실러스 서브틸리스의 포자표면(도 5)과 바실러스 츄린겐시스의 포자표면 (도 6)에서 카복시메틸셀룰라아제가 검출되었다. 도 5는 고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 카복시메틸셀룰라아제가 표면발현된 여부를 알기 위해 유세포분석기 (flow cytometer)를 통한 분석결과를 나타낸 그래프이고, 도 6은 고초균인 바실러스 츄린겐시스의 포자외막에 카복시메틸셀룰라아제가 표면발현된 여부를 알기 위해 유세포분석기를 통한 분석결과를 나타낸 그래프이다.

실시예 4: 베타갈락토시다아제의 포자외막 표면발현

베타갈락토시다아제 (β-galactosidase)의 포자외막 표면발현을 위해 야생형 대장균 K-12(ATCC 25404)의 DNA를 칼만 등의 방법으로 분리한 후, 분리된 DNA를 주형으로 하고, 서열 9의 프라이머 INLZ-1와 서열 10의 프라이머 INLZ-2를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에서 중합효소는 베링거만하임으로부터 구입한 Taq 중합효소를 사용하였고, 변성은 94℃에서 1분, 어닐링은 56℃에서 1분, 그리고 연장반응은 72℃에서 3분으로 하여 총 30사이클을 수행하였다.

이어, PCR 산물을 Nhe I 및 Kpn I으로 절단하고, 상기 실시예 2의 플라스미드 pS-InhA에 삽입하였다. 이렇게 제작된 플라스미드 pS-InhA-LacZ를 바실러스 서브틸리스 DB104에 자연도입법 (Harwood, et al. , Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons, NY, p.416, 1990)으로 형질전환하였고, 바실러스 츄린겐시스 4Q7에 전기천공법 (Bone, EJ et al., FEMS Microbiol. Lett., 49:171-7, 1989)으로 형질전환하였다.

이어, 형질전환된 바실러스 서브틸리스 균주를 2× SG 배지 (Nutrient broth 16 g/ℓ, KCl 2g/ℓ, MgSO ₄ ·7H ₂ O 0.5 g/ℓ, 1 M Ca(NO ₃ ) ₂ ·2H ₂ O 1 ml/ℓ, 0.1M MnCl ₂ ·4H ₂ O 1ml/ℓ, 1mM FeSO ₄ 1ml/ℓ, 포도당 1g/ℓ)에서 약 48시간 동안 진탕배양 (37℃, 250rpm)하고, 바실러스 츄린겐시스 균주는 2× SG 배지에서 약 60시간 동안 진탄배양 (30℃, 250rpm)하여 유로그라핀 밀도구배 방법으로 순수 포자만을 분리하였다.

분리된 포자들에 대해 베타갈락토시다아제의 활성을 밀러의 방법 (Miller et al., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, p.352-5, 1972)을 이용하여 측정하였다. 도 7은 고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 표면발현된 베타갈락토시다아제의 활성 검정 그래프이다.

한편, 베타갈락토시다아제에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 유세포 분석기 (FACSCalibur, Becton Dickinson Co., USA)로 분석한 결과, pS-InhA-LacZ로 형질전환된 바실러스 서브틸리스의 포자표면에서 베타갈락토시다아제가 검출되었다. 도 8은 고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 베타갈락토시다아제의 발현된 여부를 유세포분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

예언적 실시예 1: 바실러스 세레우스 군의 포자외막 표면발현

바실러스 세레우스와 매우 유사한 종으로서는 바실러스 안뜨라시스와 바실러스 츄린겐시스가 있는 데 이들은 모두 포자의 바깥쪽에 포자 외막을 형성하고 있다. 이들 포자 외막을 코딩하고 있는 유전자를 이용하여 표면발현에 이용하고자 하는 데 다음과 같다. 바실러스 안뜨라시스의 bclA 유전자(서열 11 내지 서열 22: Sylvestre, et al., Mol. Microbiol., 45:169-78, 2002; Sylvestre, et al., J. Bacteriol., 185:1555-63, 2003)는 GXX 콜라겐-유사 반복영역 (collagen-like repeating region)을 구성하는 글리코단백질 (glycoprotein)인 포자 외막단백질을 코딩하고 있고, 바실러스 세레우스의 exsB, exsC, exsD, exsE, exsF, exsG, exsH, exsJ, 그리고 exsY 유전자(서열 23 내지 서열 31: Todd, et al., J. Bacteriol., 185:3373-8, 2003)가 포자 외막단백질을 코딩하고 있다.

우선, KCTC 3561로부터 얻은 바실러스 안뜨라시스 균주의 DNA를 주형으로 하고, 서열 32의 프라이머 bclA1과 서열 33의 프라이머 bclA2를 사용하여 PCR로 포자 외막단백질 유전자를 증폭하였다. 상기 PCR시 중합효소는 베링거만하임으로부터 구입한 Taq 중합효소를 사용하였고, 변성은 94℃에서 1분, 어닐링은 56℃에서 1분, 그리고 연장반응은 72℃에서 1분으로 하여 총 30사이클을 수행하였다.

상기에서 PCR 산물로서 얻어진 포자 외막단백질의 유전자를 Sal I 및 Nhe I으로 절단하고, 상기 실시예 1의 플라스미드 pSD1의 동일 부위에 삽입한 후 pS-bclA를 제조하였다. 상기 pS-bclA에 목적단백질의 유전자를 삽입한 다음, 세포를 형질전환한 다음, 배양할 경우 목적단백질을 세포나 포자 표면에 발현시킬 수 있다.

바실러스 안뜨라시스 (KCTC 3561)의 bclA 유전자 이외에 바실러스 세레우스 (KCTC 1092)의 exsB, exsC, exsD, exsE, exsF, exsG, exsH, exsJ, 그리고 exsY 유전자를 포자표면발현 모체로 이용할 경우에도 목적단백질을 세포나 포자 표면에 발현시킬 수 있다.

예언적 실시예 2: 포자 외막단백질을 모체로 한 카복시메틸셀룰라아제의 세포 표면발현

바실러스 안뜨라시스의 bclA 유전자가 코딩하는 포자 외막단백질은 반복적인 아미노산구조를 갖는 콜라겐 유사 영역 (collagen-like region)을 지니고 있다. 21 개의 아미노산 서열 (GPT)5GDTGTT이 하나에서 여덟 개까지 숙주세포의 종류에 따라 다양하게 반복적인 영역을 포자 외막단백질의 중간 위치에 가지고 있다 (Sylvestre et al., Mol. Microbiol., 45:169-78, 2002; J. Bacteriol., 185:1555-63, 2003). 이를 다양한 크기로 이용하여 표면발현 시스템으로 이용이 가능하여 바실러스 속의 포자외막 표면발현 뿐만 아니라 그람 양성균과 그람 음성균에서의 세포표면 발현에도 이용할 수 있다.

예언적 실시예 3: 목적단백질이 표면발현된 유전자담체를 이용한 단백질 어레이

슬라이드글라스 표면에 알데히드 활성기가 코팅되어 있는 단백질 어레이 및 단백질 칩용 고체 표면 (CEL Associates Co., USA)에 특정 항원에 대한 단일클론 항체가 표면발현된 유전자담체 106-109개를 자동화 어레이장치를 이용하여 부착한다. 이는 유전자담체 표면의 단백질에 존재하는 아미노기와 슬라이드글라스 표면의 알데히드기가 반응하여 쉬프-베이스 (schiff-base)를 형성함으로서 고체 표면에 공유결합 형태로 부착되는 것이다. 비록 부착된 면에서는 포자외막에 표면발현된 목적단백질이 고체 표면에 부착되어 활성을 상실하여도 유전자담체의 포자외막에 발현된 목적단백질은 일정한 방향성을 가질 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 어레이는 단백질 칩, 바이오멤즈 및 패터닝 방법을 이용하여 진단용 키트, 유전자 발현분석, 단백질과 단백질간 또는 단백질과 리간드간 및 항원과 항체간의 상호반응 분석, 대사과정 분석, 신규 효소 탐색 또는 개량된 효소의 탐색, 조합 생화학합성 및 바이오센서 등에 사용될 수 있다.

예언적 실시예 4: 목적단백질이 표면발현된 유전자담체를 이용한 항체 생성방법

생체내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 항원을 유전자담체에 표면발현시키는 경우에는 이를 이용해 항체생성을 유도할 수 있다.

우선, 숙주세포 내에서 복제가 가능한 플라스미드에 항원을 코딩하는 유전자를 발현이 가능한 형태로 삽입하고 이를 이용해 숙주세포를 형질전환시킨다. 형질전환된 숙주세포는 적절한 배지에서 배양하여 유전자담체에 항원을 포자외막에 표면발현한다. 항원이 표면발현된 유전자담체를 버퍼에 현탁하고, 동일부피의 완전 프로이드 아쥬방을 첨가한다. 이어, 상기 혼합액을 교반하여 유탁액으로 한 다음, 주사기를 이용하여 6 내지 8 주령의 BALB/c 마우스에 정맥내 투여를 한다. 투여를 한 다음, 3~4주가 되는 날에 2차 투여를 한다. 그리고 나서, 약 2~3번 정도 더 부스터 투여를 하여 항체 생성을 유도한다.

예언적 실시예 5: 목적단백질이 포자외막에 표면발현된 포자를 이용한 생물전환

유기용매상에서 효소를 이용한 생물전환반응은 지난 수년간 보고되어왔다 (Zaks, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82:3192, 1985; Klibanov, AM, CHEMTECH, 16:354, 1986). 이러한 반응계에서는 효소의 불활성화 없이 반응을 수행하는 것이 필수적이다. 이를 위해 일반적으로 효소의 고정화를 수행하였다 (Mustranta, A. et al., Enz. Microb. Technol., 15:133, 1993; Reetz, MT et al., J. Biotechnol. Bioeng., 49:527, 1996). 상기 보고들에 의하면 효소를 고정화한 경우, 유리된 효소에 비해 유기용매상에서 효소의 안정성이 증가되었으며 합성 반응속도 또한 증가됨을 보고하고 있다. 상기 실시예 3 또는 실시예 4에서 성공적으로 포자외막에 목적단백질이 발현되었으므로 이를 이용해 상기 참고문헌 (Zaks, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82:3192, 1985)과 동일한 방법으로 생물전환 반응을 할 수 있다.

예언적 실시예 6: 목적단백질이 표면발현된 유전자담체를 이용한 혼합물로부터 특정물질을 분리하는 방법

결합도메인이 포자외막에 표면발현된 유전자담체를 이용하여 혼합물로부터 특정물질을 분리할 수 있다. 먼저 결합도메인을 코딩하는 유전자에 대한 에러 유발 PCR을 수행한다. PCR 반응은 목적단백질 유전자가 포함된 플라스미드 혹은 염색체를 주형으로 하고 목적단백질 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용한다. 이들 프라이머 0.3μM와 주형 DNA 5ng를 반응용액 (10mM Tris (pH 8.3), 50mM KCl, 7mM MgCl ₂ , 0.01% (w/v) 젤라틴)에 넣고 여기에 0.2mM dGTP, 0.2mM dATP, 1mM dCTP, 1mM dTTP, 0.15mM MnCl ₂ , 바이오니아사로부터 구입한 Taq 중합효소 5U을 넣어 총 100㎕의 반응액을 준비한다. 반응조건은 변성은 94℃에서 30초, 어닐링은 50℃에서 30초, 연장반응은 72℃에서 1분으로 하여 총 25사이클을 수행한다.

이어, 각 숙주세포에서 복제가 가능한 플라스미드에 상기의 PCR 산물을 발현이 가능한 형태로 삽입한 후 숙주세포에 라이브러리를 구축한다. 상기 표면발현용 벡터 라이브러리로 숙주세포를 형질전환시키고 상기 결합도메인 변이체를 숙주세포 내에서 발현하여 상기 유전자담체 표면에 발현시킨 유전자담체 라이브러리를 얻은 후 소망하는 특성을 갖는 결합도메인의 변이체가 포자외막에 표면발현된 유전자담체를 스크리닝한다. 스크리닝된 유전자담체를 분리하고 증식하여 결합도메인이 포자외막에 발현된 유전자담체를 생산한 후 상기 결합도메인이 포자외막에 발현된 유전자담체를 혼합물과 접촉시켜 특정물질을 분리할 수 있다.

본 발명은 유전자담체의 포자 외막단백질과 목적단백질의 융합발현을 통해 유전자담체에 표면발현방법을 제공하고, 단백질 어레이의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 척추동물에서 항원에 대한 면역반응을 유도하는 방법 및 혼합물로부터 특정물질을 분리하는 방법을 제공하고, 목적단백질의 개량방법을 제공한다. 한편, 본 발명은 유전자담체에 포자외막 표면발현용 벡터 및 재조합 미생물을 제공한다. 본 발명의 유전자담체에 포자외막 표면발현 방법은 발현할 수 있는 단백질 종류의 다양성을 나타냄과 동시에 표면발현되는 목적단백질의 발현양이 기존기술과 비교할 때 증가되며, 목적단백질이 표면발현된 유전자담체의 구조적 안정성, 숙주의 생존성 및 스크리닝의 방법의 신속성이 크게 증대되는 효과가 있다.

도 1은 목적단백질이 포자외막의 표면에 발현된 모식도를 나타낸 것이다.

도 2는 바실러스 츄린겐시스의 포자 외막단백질의 유전자를 함유하는 발현벡터(pS-InhA)를 나타낸 것이다.

도 3은 고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 표면발현된 카복시메틸셀룰라아제의 활성 검정 그래프이다.

도 4는 고초균인 바실러스 츄린겐시스의 포자외막에 표면발현된 카복시메틸셀룰라아제의 활성 검정 그래프이다.

도 5는 고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 카복시메틸셀룰라아제가 표면발현된 여부를 알기 위해 유세포분석기 (flow cytometer)를 통한 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 고초균인 바실러스 츄린겐시스의 포자외막에 카복시메틸셀룰라아제가 표면발현된 여부를 알기 위해 유세포분석기를 통한 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 표면발현된 베타갈락토시다아제의 활성 검정 그래프이다.

도 8은 고초균인 바실러스 서브틸리스의 포자외막에 베타갈락토시다아제의 발현된 여부를 유세포분석기를 통해 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Whole Surrounding Surface Display of Target Proteins Using Exosporium of Bacillus cereus Group <130> P03-204 <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for repB cloning in bacillus subtilis 168 genomic DNA <400> 1 ggaattcaaa gcacctgaaa ag 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for repB clining in Bacillus subtilis 168 genomic DNA <400> 2 aactgcagct actctttaat aaa 23 <210> 3 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence for multicloning site in pSD1 <400> 3 catatggtcg acctgcaggc ggccgcgcta gcgaattcac tagtgatatc gaattcccgc 60 ggccgccatg gcggccggga gcatgc 86 <210> 4 <211> 2388 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis <220> <221> gene <222> (1)..(2388) <223> Bacillus thuringiensis israelensis 4Q7 DNA of immune inhibitor A <400> 4 atgaacaaga aaccgttcaa agttttgtca tcaatcgctt taacagctgt at taggcctt 60 tcattcggag ctggcactca atctgcatat gctgaaacgc ctgtgaataa aacagctacg 120 agcccagttg atgatcattt aattccggaa gaacgtttag cagatgcgct aaaaaaacgt 180 ggggtaattg attcgaaggc ttcagagaca gaaacaaaga aagcagtcga aaagtatgta 240 gagaacaaaa agggtgaaaa ttctggaaaa gaagcagcaa atggggacca gcttacgaaa 300 gatgcatccg actttttaaa gaaagtaaaa gatgcgaaag cagacacgaa agaaaaatta 360 aatgaaccag caacagggac acctgcagcg acaggcccag ttaaaggcgg actaaatggt 420 aaagtgccaa cttctccagc aaaacaaaaa gactataacg gtgaagttcg taaagacaaa 480 gtactcgttt tacttgtaga gtacgctgac tttaaacata ataatatcga caaagagcct 540 ggatatatgt attctaacga ttttaataaa gaacattatg aaaaaatgtt attcggcaac 600 gagccattca cattagatga tggaagcaaa atcgaaacat ttaaacaata ttacgaagag 660 caatctggtg gtagttacac agtggacgga acagttacaa aatggttaac agtttctggt 720 aaagctgctg attacggtgc agatgctgct acaggtcatg ataataaagg accaaaaggg 780 ccacgtgatt tagtaaaaga tgcattaaaa gcagctgtag atagtggtat tgatttatca 840 gagtttgatc aatttgatca atacgatgta aatggtgatg gaaataaaaa tcaaccagat 900 ggtttaat cg atcaattaat gattattcat gcgggtgttg gacaagaagc aggcggtggt 960 aaattaggcg atgatgcaat ttggtcgcac cgttggacag ttggaccaaa gccattccca 1020 attgaaggta cacaagcgaa agttccatat tggggcggaa agatggcagc atttgactac 1080 acaattgaac cagaagatgg agcggttggt gtattcgcac atgaatatgg tcacgattta 1140 ggtcttccag atgagtacga tacacaatat agtggtcaag gtgagccgat tgaagcttgg 1200 tctattatga gtggcggaag ctgggctggt aaaatcgctg gaacgacgcc aacgagtttc 1260 tcaccacaaa ataaagagtt tttccaaaaa acaattggtg gtaactgggc aaatatcgta 1320 gaagtagatt acgagaaatt aaataaaggt atcggtctag cgacatattt ggatcaaagt 1380 gttacgaaat cagatcgacc aggtatgatt cgtgttaact taccagataa agatgttaaa 1440 acaattgagc cagcatttgg taaacaatat tattacagca caaaaggtga cgatcttcat 1500 acgaagatgg aaacaccgtt gtttgattta acgaatgcaa cgaatgcaaa atttgatttc 1560 aagtcattat atgagattga agcaggttat gatttccttg aagtacacgc tgtaacagaa 1620 gatggtaaac aaacgttaat tgaaagactt ggcgagaaag caactagtgg aaatgcagat 1680 tcgacaaatg gaaaatggat tgacaaatca tatgatttaa gtcaattcaa aggcaagaaa 1740 gtaaaattaa catt tgatta cattactgat ggtggtttag cattaaatgg attcgctctt 1800 gataatgctt cattaacagt agatggtaaa gtagtattct ctgatgatgc agaaggtaca 1860 ccacaattaa aattagatgg tttcgttgta tctaacggaa cagaaaagaa aaaacataac 1920 tactatgttg agtggagaaa ctatgctggg gcagataacg cgttgaaatt tgctcgcggt 1980 ccagtattta acactggtat ggttgtatgg tatgcagatt cagcttatac agataactgg 2040 gttggtgtac atccaggaca cggtttcctt ggtgttgttg attctcatcc agaagcaatt 2100 gttggtactt taaatggtaa accaacagtt aagagcagta cacgattcca aatcgctgat 2160 gctgcgttct cattcgacaa aacgccagct tggaaagttg tatctccaac gcgtggaaca 2220 tttacgtatg atggcttagc aggcgtaccg aagtttgatg attcgaaaac gtatattaat 2280 caacagattc cagatgcagg acgtatttta ccgaagcttg gtttaaaatt tgaagtagta 2340 ggacaagctg atgataattc tgcaggtgct gttcgtttat atcgttaa 2388 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer IAP1 <400> 5 cttatcttta ctagtatgta attcctccct aattatcgg 39 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer for IAP2 <400> 6 ccgagctcgt cgacatgt aa ttcctcccta at 32 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR prmer INCM-1 <400> 7 ctagctagcg cagggacaaa aacgcca 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer INCM-2 <400> 8 ggggtaccct aatttggttc tgttcc 26 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer INLZ-1 <400> 9 atagctagcc acggttacga tgcgccc 27 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer INLZ-2 <400> 10 ggggtacctt atttttgaca ccagac 26 <210> 11 <211> 672 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(672) <223> bclA of Bacillus anthracis strain ATCC4229 <400> 11 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccaactgg accaactggg ccaactgggc caactggaga cactggtact 180 actggaccaa ctgggccaac tggaccaact gggccaactg gtgctaccgg actgactgga 240 ccgactggac cgactgggcc atccggacta ggacttccag caggactata tgcat ttaac 300 tccggtggga tttctttaga tttaggaatt aatgatccag taccatttaa tactgttgga 360 tctcagtttg gtacagcaat ttctcaatta gatgctgata ctttcgtaat tagtgaaact 420 ggattctata aaattactgt tatcgctaat actgcaacag caagtgtatt aggaggtctt 480 acaatccaag tgaatggagt acctgtacca ggtactggat caagtttgat ttcactcgga 540 gcacctatcg ttattcaagc aattacgcaa attacgacaa ctccatcatt agttgaagta 600 attgttacag ggcttggact atcactagct cttggcacga gtgcatccat tattattgaa 660 aaagttgctt aa 672 <210> 12 <211> 735 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(735) <223> bclA of Bacillus anthracis strain CIP5725 <400> 12 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactggacca 180 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact gggccaactg gagacactgg tactactgga 240 ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggtgctac cggactgact 300 ggaccgactg gaccgactgg gccatccgga ctaggacttc cagcaggact ata tgcattt 360 aactccggtg ggatttcttt agatttagga attaatgatc cagtaccatt taatactgtt 420 ggatctcagt ttggtacagc aatttctcaa ttagatgctg atactttcgt aattagtgaa 480 actggattct ataaaattac tgttatcgct aatactgcaa cagcaagtgt attaggaggt 540 cttacaatcc aagtgaatgg agtacctgta ccaggtactg gatcaagttt gatttcactc 600 ggagcaccta tcgttattca agcaattacg caaattacga caactccatc attagttgaa 660 gtaattgtta cagggcttgg actatcacta gctcttggca cgagtgcatc cattattatt 720 gaaaaagttg cttaa 735 <210> 13 <211> 762 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(762) <223> bclA of Bacillus anthracis strain RA3 <400> 13 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tggaccaact gggccaactg gaccaactgg gccaactggg 240 ccaactggag acactggtac tactggacca actgggccaa ctggaccaac tggaccaact 300 gggccaactg gtgctaccgg actgactgga ccgactggac cgactgggcc at ccggacta 360 ggacttccag caggactata tgcatttaac tccggtggga tttctttaga tttaggaatt 420 aatgatccag taccatttaa tactgttgga tctcagtttg gtacagcaat ttctcaatta 480 gatgctgata ctttcgtaat tagtgaaact ggattctata aaattactgt tatcgctaat 540 actgcaacag caagtgtatt aggaggtctt acaatccaag tgaatggagt acctgtacca 600 ggtactggat caagtttgat ttcactcgga gcacctatcg ttattcaagc aattacgcaa 660 attacgacaa ctccatcatt agttgaagta attgttacag ggcttggact atcactagct 720 cttggcacga gtgcatccat tattattgaa aaagttgctt aa 762 <210> 14 <211> 762 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(762) <223> bclA of Bacillus anthracis strain 7611 <400> 14 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tggaccaact gggccaactg gaccaactgg gccaactggg 240 ccaactggag acactggtac tactggacca actgggccaa ctggaccaac tggaccaact 300 gggccaactg gtgctaccgg act gactgga ccgactggac cgactgggcc atccggacta 360 ggacttccag caggactata tgcatttaac tccggtggga tttctttaga tttaggaatt 420 aatgatccag taccatttaa tactgttgga tctcagtttg gtacagcaat ttctcaatta 480 gatgctgata ctttcgtaat tagtgaaact ggattctata aaattactgt tatcgctaat 540 actgcaacag caagtgtatt aggaggtctt acaatccaag tgaatggagt acctgtacca 600 ggtactggat caagtttgat ttcactcgga gcacctatcg ttattcaagc aattacgcaa 660 attacgacaa ctccatcatt agttgaagta attgttacag ggcttggact atcactagct 720 cttggcacga gtgcatccat tattattgaa aaagttgctt aa 762 <210> 15 <211> 762 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(762) <223> bclA of Bacillus anthracis strain ATCC6602 <400> 15 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tggaccaact gggccaactg gagacactgg tactactgga 240 ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggaccaac tgga ccaact 300 gggccaactg gtgctaccgg actgactgga ccgactggac cgactgggcc atccggacta 360 ggacttccag caggactata tgcatttaac tccggtggga tttctttaga tttaggaatt 420 aatgatccag taccatttaa tactgttgga tctcagtttg gtacagcaat ttctcaatta 480 gatgctgata ctttcgtaat tagtgaaact ggattctata aaattactgt tatcgctaat 540 actgcaacag caagtgtatt aggaggtctt acaatccaag tgaatggagt acctgtacca 600 ggtactggat caagtttgat ttcactcgga gcacctatcg ttattcaagc aattacgcaa 660 attacgacaa cttcctcatt agttgaagta attgttacag ggcttggact atcactagct 720 cttggcacga gtgcatccat tattattgaa aaagttgctt aa 762 <210> 16 <211> 789 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(789) <223> bclA of Bacillus anthracis strain 6183 <400> 16 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg 240 ccaactggac caactgggcc aactg ggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact 300 gggccaactg gaccaactgg accaactggg ccaactggtg ctaccggact gactggaccg 360 actggaccga ctgggccatc cggactagga cttccagcag gactatatgc atttaactcc 420 ggtgggattt ctttagattt aggaattaat gatccagtac catttaatac tgttggatct 480 cagtttggta cagcaatttc tcaattagat gctgatactt tcgtaattag tgaaactgga 540 ttctataaaa ttactgttat cgctaatact gcaacagcaa gtgtattagg aggtcttaca 600 atccaagtga atggagtacc tgtaccaggt actggatcaa gtttgatttc actcggagca 660 cctatcgtta ttcaagcaat tacgcaaatt acgacaactc catcattagt tgaagtaatt 720 gttacagggc ttggactatc actagctctt ggcacgagtg catccattat tattgaaaaa 780 gttgcttaa 789 <210> 17 <211> 789 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(789) <223> bclA of Bacillus anthracis strain 9602 <400> 17 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg 240 ccaactggac caactgggcc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact 300 gggccaactg gaccaactgg accaactggg ccaactggtg ctaccggact gactggaccg 360 actggaccga ctgggccatc cggactagga cttccagcag gactatatgc atttaactcc 420 ggtgggattt ctttagattt aggaattaat gatccagtac catttaatac tgttggatct 480 cagtttggta cagcaatttc tcaattagat gctgatactt tcgtaattag tgaaactgga 540 ttctataaaa ttactgttat cgctaatact gcaacagcaa gtgtattagg aggtcttaca 600 atccaagtga atggagtacc tgtaccaggt actggatcaa gtttgatttc actcggagca 660 cctatcgtta ttcaagcaat tacgcaaatt acgacaactc catcattagt tgaagtaatt 720 gttacagggc ttggactatc actagctctt ggcacgagtg catccattat tattgaaaaa 780 gttgcttaa 789 <210> 18 <211> 789 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(789) <223> bclA of Bacillus anthracis strain CIPA2 <400> 18 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccg actgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg 240 ccaactggac caactgggcc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact 300 gggccaactg gaccaactgg accaactggg ccaactggtg ctaccggact gactggaccg 360 actggaccga ctgggccatc cggactagga cttccagcag gactatatgc atttaactcc 420 ggtgggattt ctttagattt aggaattaat gatccagtac catttaatac tgttggatct 480 cagtttggta cagcaatttc tcaattagat gctgatactt tcgtaattag tgaaactgga 540 ttctataaaa ttactgttat cgctaatact gcaacagcaa gtgtattagg aggtcttaca 600 atccaagtga atggagtacc tgtaccaggt actggatcaa gtttgatttc actcggagca 660 cctatcgtta ttcaagcaat tacgcaaatt acgacaactc catcattagt tgaagtaatt 720 gttacagggc ttggactatc actagctctt ggcacgagtg catccattat tattgaaaaa 780 gttgcttaa 789 <210> 19 <211> 1113 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(1113) <223> bclA of Bacillus anthracis strain CIP53169 <400> 19 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta cc accgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg 240 ccaactggac caactgggcc gactgggcca actggaccaa ctgggccgac tgggccaact 300 ggaccaactg ggccaactgg agacactggt actactggac caactgggcc aactggacca 360 actggaccaa ctgggccaac tggagacact ggtactactg gaccaactgg gccaactgga 420 ccaactggac caactgggcc gactggaccg actgggccga ctgggccaac tggaccaact 480 gggccgactg ggccaactgg accaactggg ccaactggag acactggtac tactggacca 540 actgggccaa ctggaccaac tggaccaact gggccaactg gagacactgg tactactgga 600 ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggaccaac tgggccaact 660 ggtgctaccg gactgactgg accgactgga ccgactgggc catccggact aggacttcca 720 gcaggactat atgcatttaa ctccggtggg atttctttag atttaggaat taatgatcca 780 gtaccattta atactgttgg atctcagttt ggtacagcaa tttctcaatt agatgctgat 840 actttcgtaa ttagtgaaac tggattctat aaaattactg ttatcgctaa tactgcaaca 900 gcaagtgtat taggaggtct tacaatccaa gtgaatggag tacctgtacc aggtactgga 960 tcaagtttga tttcactcgg agcacctatc gttattcaag caattacgca aattacgaca 1020 actccatcat tagttgaagt aattgttaca gggcttggac tatcactagc tcttggcacg 1080 agtgcatcca ttattattga aaaagttgct taa 1113 <210> 20 <211> 1176 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(1176) <223> bclA of Bacillus anthracis strain CIP8189 <400> 20 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac ccttcctacc 120 ggaccaactg ggccgactgg accgactggg ccgactgggc caactggacc aactgggccg 180 actgggccaa ctggaccaac tgggccaact ggagacactg gtactactgg accaactggg 240 ccgactgggc caactggacc aactgggcca actggagaca ctggtactac tggaccaact 300 gggccaactg gaccaactgg gccgactggg ccaactggac caactgggcc gactgggcca 360 actggaccaa ctgggccaac tggagacact ggtactactg gaccaactgg gccaactgga 420 ccaactggac caactgggcc aactggagac actggtacta ctggaccaac tgggccaact 480 ggaccaactg gaccaactgg gccgactgga ccgactgggc cgactgggcc aactggacca 540 actgggccga ctgggccaac tgg accaact gggccaactg gagacactgg tactactgga 600 ccaactgggc caactggacc aactggacca actgggccaa ctggagacac tggtactact 660 ggaccaactg ggccaactgg accaactgga ccaactgggc caactggacc aactgggcca 720 actggtgcta ccggactgac tggaccgact ggaccgactg ggccatccgg actaggactt 780 ccagcaggac tatatgcatt taactccggt gggatttctt tagatttagg aattaatgat 840 ccagtaccat ttaatactgt tggatctcag tttggtacag caatttctca attagatgct 900 gatactttcg taattagtga aactggattc tataaaatta ctgttatcgc taatactgca 960 acagcaagtg tattaggagg tcttacaatc caagtgaatg gagtacctgt accaggtact 1020 ggatcaagtt tgatttcact cggagcacct atcgttattc aagcaattac gcaaattacg 1080 acaactccat cattagttga agtaattgtt acagggcttg gactatcact agctcttggc 1140 acgagtgcat ccattattat tgaaaaagtt gcttaa 1176 <210> 21 <211> 1338 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <220> <221> gene <222> (1)..(1338) <223> bclA of Bacillus anthracis strain Sterne CIP7702 <400> 21 atgtcaaata ataattattc aaatggatta aaccccgatg aatctttatc agctagtgca 60 tttgacccta atcttgtagg acctacatta ccaccgatac caccatttac 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gene <222> (1)..(859) <223> exsB of Bacillus cereus <400> 23 attccactaa gtacattgga tgaacaaaaa aatcatatga aggcagcatg ttttctcatc 60 ccttctcagt tctcttcctt caatgtatgc gccttttctt gtccatacat ccgcaatcat 120 ctatttatat aaaattacac tcttgtcctg ttcagaaaga tgcctacata catatcatgt 180 taaggaaaaa gaataccttt tcactttaat acatgataag gaggatttct atgaaacgtg 240 atattagaaa agctgtcgaa gaaatcaaaa gtgctgggat ggaggatttc ttacaccaag 300 atccaagtac ttttgaatgc gatgatgata aattcactca tcatcattgt acaactggat 360 gtaaatgtac aactgggggt aaatgtccaa gaacaagatg tactcgcgtg aaacattgta 420 cgttcgttac aaaatgtacg catgtgaaaa aatggacatt tgttacgaaa tgtactcgtg 480 tacgtgttca aaaatggacg ttcgttacga aagtaacgcg tagaaaagaa tgcgtattag 540 ttacgaaacg tactcgcaga aaacattgta cattcattac aaaatgcata cgctttgaaa 600 agaaattttt ctggacaaaa cgaagtttct gtaaaaaatg cgaattcttc cctaacagac 660 acggtggctc ttgcgatgat tcatgtgatc atggtaaaga ctgtcacgat agcggacaca 720 aatggaatga ttgcaaaggc ggacataaat tcccatcttg caaaaataag aaattcgatc 780 acttctggta taaaaaacgt aactgct 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