효모 표면 발현 벡터를 이용하여 변이 리파제를스크리닝하는 방법 및 신규 변이 리파제

효모 표면 발현 벡터를 이용하여 변이 리파제를 스크리닝하는 방법 및 신규 변이 리파제{Method for screening of a lipase having improved enzymatic activity using yeast surface display vector and the lipase}

본 발명은 효모 표면 발현벡터를 이용하여 변이 리파제를 스크리닝하는 방법 및 그 산물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 리파제의 유전자를 표면 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 2) 상기 단계 1의 발현 벡터의 리파제 유전자를 주형으로 변이 유도 PCR을 수행하여 변이 유전자를 제조하는 단계; 3) 상기 단계 2를 통해 증폭된 변이 유전자를 표면 발현 벡터와 함께 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및 4) 상기 단계 3의 형질전환체 표면에 발현된 변이 리파제의 활성을 측정하여 활성이 뛰어난 변이 리파제를 스크리닝하는 단계를 포함하는 변이 리파제 스크리닝 방법 및 그 산물에 관한 것이다.

리파제(lipase)는 카르복실릭 에스터 수산화효소(carboxylic ester hydrolase)로 식품 산업, 미세화합물 합성, 계면 활성제 사업 등에 많이 이용되는 효소이다. 많은 미생물 유래의 리파제 중 캔디다 앤타크티카( Candida antarctic a)유래의 리파제 B는(이하 'CALB'라 약칭한다) 317개의 아미노산으로 구성되어 있으며 α/β수산화 효소의 형태를 가진다.

CALB는 광학이성질체의 선별 및 폴리에스터 합성(Anderson et al ., Biocatal. Biotransform., 1998 , 16, 181)에서 산업적으로 중요성을 가지며, CALB는 2가 알콜(sec-alcohol) 및 2가 아민을 특이적으로 광학 전환할 수 있어(Rotticci et al ., Chembiochem., 2001 , 2, 766) 의약품 및 농약 등의 제조에 다양하게 이용된다.

최근 몇 년간 새로운 백신의 생산, 각종 항원과 항체의 스크리닝, 유용한 효소의 세포 표면으로의 고정화 등의 목적으로 박테리오파지를 포함한 세균과 효모 등의 단세포 생물의 세포 표면에 외래단백질을 발현시키는 연구가 활발히 진행되어 널리 이용되고 있다. 효모인 사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae )를 이용한 단백질의 세포 표면 발현에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있는데, 효모는 고등 진핵세포와 세포내 분비시스템을 이용하여 외래 단백질을 활성이 있는 형태로 배지로 분비시킬 수 있어, 유전자 재조합 기술을 이용해 유용한 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주로서의 이용성이 증대되고 있다. 효모의 표면 발현을 위해서 대표적 세포벽 단백질인 α-어글루티닌(α-agglutinin)에 관한 연구(Schreuder et al ., Yeast. , 1993 , 9, 399)가 수행되었으며, α-어글루티닌 또는 기타의 세포벽 단백질을 이용하여 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase), 글루코아밀레이즈(glucoamylase), 리파제(lipase), 큐티네이즈(cutinase)등의 다양한 효소가 세포의 표면에 안정적으로 발현되었다.

또한, 여러 효소를 한 세포 내에 동시에 발현함으로써 산업적으로 유용한 생촉매(biocatalyst)의 개발이 가능한 것으로 보고된 바 있다(Murai et al . , Appl. Microbiol. Biotechnol ., 1999 , 51, 65). 식품이나 의약품 소재의 생물전환을 위한 미생물유래의 생물촉매는 현재까지 세포 내에서 발현된 효소를 세포 파쇄하고 분리하여 담체에 고정화한 후 사용하거나 톨루엔등과 같은 침투성 용매를 처리하여 사용해 왔는데, 상기의 방법은 공정상의 비용이 많이 들고 사용 중 효소가 불활성화되는 문제가 있어 공정 전체의 생산성이 저하되는 문제가 있었다.

최근 사카로마이세스 세레비시애를 이용한 표면 발현을 이용하여 원하는 단백질을 발현하는 세포를 선별하는 방법에 관하여 많은 연구가 이루어지고 있는데, 효모는 진핵세포로서 고등동물과 유사한 단백질의 공정 과정을 가지고 있으며, 크기가 커서 유세포분석기(FACS) 등에 의해 세포의 선별이 가능하여, 미세한 차이를 보이는 세포를 서로 구별해내는 것이 가능하다는 장점이 있다(VanAntwerp and Wittrup., Biotechnol. Prog., 2000 , 16, 31). 또한, 표면 발현 효모를 이용하여 라이브러리를 구축하고 세포를 선별할 경우, 유전자 조작이 용이하여 쉽게 라이브러리를 구축할 수 있으며, 발현량의 차이가 나는 점을 극복할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 표면 발현을 통하여 활성이 증가된 효소를 선별한 경우 표면 발현에 가장 적합한 효소를 선별하게 됨으로서 표면발현 효소의 이용가능성을 더욱 증대시킬 수 있다. 현재까지 효모의 표면에 항체 및 항원, T 세포 수용체 등을 발현하여 친화도가 증진된 균주를 유세포분석기를 이용하여 선별한 경우는 많이 있으나(Schreuder et al ., Vaccine. , 1996 , 14, 383, Kieke et al ., Protein. Eng., 1997 , 10, 1303, Kieke et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. US A., 1999 , 96, 5651), 아직까지 효소의 활성을 선별한 예는 보고된 바 없고, 단지 대장균에서 슈도모나스( Pseudomonas sp.) 유래의 빙핵 활성 단백질을 매개체로 이용한 표면 발현으로 활성이 증진된 카르복시메틸 셀룰레이즈(carboxymethyl cellulase)를 선별한 예만이 보고된 바 있다(Kim et al ., Appl. Environ. Microbiol., 2000 , 66, 788).

본 발명자들은 이전에 산업적으로 유용하게 사용되던 메탄올 자화 효모의 일종인 한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha ) 균주를 대상으로 신규한 세포벽 부착 매개 단백질을 분리하고 이를 이용하여 목표 단백질을 세포 표면에 발현시키는 신규한 표면 발현 시스템을 개발하였다(PCT/KR00/00819). 상기 한세눌라 폴리모르파는 강력한 프로모터를 가진 산업용 균주로서 외래 단백질 생산이 매우 뛰어나며, 균주의 생육이 빠르고 고온 및 유기 용매에서의 안정성을 가지고 있어 리파제 등의 효소 생산 및 생물 반응계에 매우 적합한 균주이다.

이에, 본 발명자들은 산업적으로 유용하게 사용되는 생물 촉매인 리파제를 대량으로 생산하기 위해, 목표 단백질을 세포 표면에 발현시키는 표면 발현 시스템(PCT/KR00/00819)을 이용하여 캔디다 앤타크티카( Candida antarctica ) 리파제 B의 변이 라이브러리를 제조하고, 상기 변이주 중에서 리파제 활성이 매우 우수한 변이주를 선별하였으며, 상기 변이주로부터 변이 리파제 단백질을 대량 생산하는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 효모 표면 발현 벡터를 이용하여 변이 리파제를 스크리닝하는 방법, 상기 방법을 이용하여 획득한 리파제의 변이 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 이용해 변이 리파제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 리파제의 유전자를 표면 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 2) 상기 단계 1의 발현 벡터의 리파제 유전자를 주형으로 변이 유도 PCR을 수행하여 변이 리파제 유전자를 제조하는 단계; 3) 상기 단계 2를 통해 증폭된 변이 유전자를 표면 발현 벡터와 함께 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및 4) 상기 단계 3의 형질전환체 표면에 발현된 변이 리파제의 활성을 측정하여 활성이 뛰어난 변이 리파제를 스크리닝하는 단계를 포함하는 변이 리파제 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 획득한 서열번호 14 로 기재되는 캔디다 앤타크티카 리파제 B의 219번 루이신 및/또는 278번 루이신이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이 리파제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 변이 리파제 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 리파제의 유전자를 표면 발현 벡터에 클로닝하는 단계;

2) 상기 단계 1의 발현 벡터의 리파제 유전자를 주형으로 변이 유도 PCR을 수행하여 변이 유전자를 제조하는 단계;

3) 상기 단계 2를 통해 증폭된 변이 유전자를 표면 발현 벡터와 함께 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및

4) 상기 단계 3의 형질전환체 표면에 발현된 변이 리파제의 활성을 측정하여 활성이 뛰어난 변이 리파제를 스크리닝하는 단계를 포함하는 변이 리파제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 '표면 발현 벡터'라 함은 세포의 표면에 외래 단백질을 안정적으로 발현시키는 벡터를 의미한다.

본 발명에서 표면 발현 벡터에 클로닝 하기 위해 사용한 리파제는 캔디다 앤타크티카( Candida antarctica )에서 유래한 서열번호 14 로 기재되는 캔디다 앤타크티카 리파제 B(Candida antarctica lipase B)를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 표면 발현 벡터는 형질전환체의 표면에 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로서, 프로모터 유전자, 분비신호서열을 코딩하는 유전자, 리파제 유전자 또는 변이 리파제 유전자, 표면 발현 매개 유전자 및 터미네이터 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 표면 발현 벡터의 프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1, GAL10, SED1, MOX, TEF 및 TPI로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하고, 상기 분비신호서열을 코딩하는 유전자는 MFα, PHO5, SUC2, AMY, SED 및 킬러톡신으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하며, 상기 표면 발현 매개 유전자는 리파제를 세포표면에 발현하게 하는 인자로, 세포벽을 구성하는 유전자인 SED1, PIR2, TIP1, CWP1, GAS1 및 WSC1로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하며 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단계 3에서 형질전환시키기 위해 사용한 숙주세포는 캔디다( Candida ), 디베리오마이세스( Debaryomyces ), 한세눌라( Hansenula ), 클루이베로마이세스( Kluyveromyces ), 피키아( Pichia ), 스키조사카로마이세스( Schizosaccharomyces ), 야로이야( Yarrowia ) 및 사카로마이세스( Saccharomyces ) 속 등의 효모류, 아스퍼질러스( Aspergillus ), 페니실리엄( Penicillium ) 및 라이조퍼스( Rhizopus ) 속 등의 사상 균류 또는 에셔리키아( Escherichia ) 및 바실러스( Bacillus ) 속 등의 세균류를 사용할 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상세한 설명에서는 구체적으로, 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁된 수탁번호 KCTC 0824BP, KCTC 0825BP, KCTC 0826BP, KCTC 0827BP 및 KCTC 0828BP 형질전환체에 도입된 표면 발현벡터를 사용하였다(특허출원 2000-42939).

본 발명의 스크리닝 방법으로 리파제 유전자를 표면 발현벡터에 클로닝하고 변이유도 PCR을 수행하여 리파제 유전자 변이를 유도한 후 숙주세포에 형질전환시켜 발현시키면, 상기 변이 리파제가 형질전환체의 표면에 위치한다. 이와 같이 형질전환체 표면에 발현된 변이 리파제의 활성을 측정하면 고활성의 변이 리파제를 신속하고 간편하게 스크리닝할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법에 의해 획득한 서열번호 14 로 기재되는 캔디다 앤타크티카 리파제 B의 219번 루이신 및/또는 278번 루이신이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변이 리파제 단백질을 제공한다.

본 발명은 서열번호 14 로 기재되는 캔디다 앤타크티카( Candida antarctica ) 리파제 B(이하, "CALB"라 약칭한다)의 219번 아미노산 및/또는 278번 아미노산이 치환된 변이 단백질을 제공한다.

본 발명의 변이 단백질은 서열번호 14 로 기재되는 CALB의 219번 아미노산인 소수성 아미노산 루이신을 글루타민, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 및 글루탐산로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 아미노산으로 치환시킨 것이 바람직하고, 루이신을 글루타민으로 치환시킨 서열번호 11 로 기재되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 변이 단백질은 서열번호 14 로 기재되는 CALB의 278번 아미노산인 루이신을 프롤린, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환시킨 것이 바람직하고, 루이신을 글루타민으로 치환시킨 서열번호 9 로 기재되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 변이 단백질은 서열번호 14 로 기재되는 CALB의 219번 아미노산인 루이신을 글루타민, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 및 글루탐산로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 아미노산으로 치환시키고, 278번 아미노산인 루이신을 프롤린, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환시킨 것이 바람직하고, 루이신을 글루타민으로 치환시키고, 278번 루이신을 프롤린으로 치환시킨 서열번호 10 으로 기재되는 것이 더욱 바람직하다.

CALB의 219번째 루이신은 표면으로 노출되어 있는 아미노산으로 소수성을 가지는데 상기 루이신이 친수성 아미노산으로 치환되면 물에서의 안정성이 높아지므로, 변이 단백질의 효소활성이 증가될 것이다. 또한, CALB의 278번 아미노산인 루이신은 CALB의 10번째 α헬릭스에 존재하는데 이 부위는 리파제 활성 부위의 뚜껑 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다(Uppenberg et al ., Structure., 1994 , 2, 293). 10번 α헬릭스에는 다수의 소수성 아미노산이 포함되어 있는데 이곳의 루이신이 프롤린으로 치환되면 아미노산의 헬릭스 구조를 보다 안정화하고 다른 방향으로의 꺽임 구조를 생성할 수 있으며, 이로 인해 활성부위의 노출 정도를 변화시켜 활성이 증가될 것이다. 또한 278번 루이신은 활성 부위의 표면에 존재하는 전하를 띈 223번의 아스파라긴산과 188번의 글루탐산과 인접한 위치에 존재하는데 상기의 루이신이 프롤린으로 치환된 경우 소수성 말단이 차지하는 공간이 줄어들어 활성부위의 공간이 넓어져 그 공간에 물분자가 끼어들 수 있는 구조가 형성되어 이 물 분자에 의해 기질이 안정적으로 활성 부위에 존재할 수 있게 하여 활성이 증가될 것이다.

리파제 변이 단백질을 생산하는 형질전환체의 세포 배양 상등액으로 효소의 활성을 측정하여 비교한 결과, 서열번호 9 , 서열번호 10 및 서열번호 11 로 기재되는 아미노산 서열을 가진 변이 단백질은 기질에 대한 친화도는 동일하나, 야생형 CALB에 비해 각각 5배, 10배 및 3배의 효소 활성을 나타내었다( 표 3 참조).

또한 본 발명의 리파제 변이 단백질을 표면에 발현하는 형질전환체의 전세포 분획으로 효소의 활성을 측정하여 비교한 결과, 서열번호 9 및 서열번호 10 으로 기재되는 아미노산 서열을 가진 변이 단백질은 야생형 CALB에 비해 모두 5배의 활성이 증가하였다( 표 1 참조).

따라서, 본 발명의 리파제 변이 단백질은 정상적인 리파제에 비하여 높은 효소 활성을 가진다.

또한, 본 발명은 상기 리파제 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자는 CALB의 219번 아미노산을 글루타민, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 및 글루탐산로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 아미노산으로 치환시킨 변이 단백질을 코딩하는 유전자인 것이 바람직하고, 서열번호 8 로 기재되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 유전자는 CALB의 278번 아미노산을 프롤린, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환시킨 변이 단백질을 코딩하는 유전자인 것이 바람직하고, 서열번호 6 으로 기재되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 유전자는 CALB의 219번 아미노산을 글루타민, 글루타민, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴산 및 글루탐산로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 아미노산으로 치환시키고, 278번 아미노산을 프롤린, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환시킨 변이 단백질을 코딩하는 유전자인 것이 바람직하고, 서열번호 7 로 기재되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 리파제 변이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 리파제 변이 단백질을 세포 표면에 발현시키는 벡터로 제조할 수 있다.

본 발명의 리파제 변이 단백질을 세포 표면에 발현시키는 벡터는, 프로모터 유전자, 분비신호서열을 코딩하는 유전자, 변이 리파제 유전자, 표면 발현 매개 유전자 및 터미네이터 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 표면 발현 벡터의 프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1, GAL10, SED1, MOX, TEF 및 TPI로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하고, 상기 분비신호서열을 코딩하는 유전자는 MFα, PHO5, SUC2, AMY, SED 및 킬러톡신으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하며, 상기 표면 발현 매개 유전자는 리파제를 세포표면에 발현하게 하는 인자로, 세포벽을 구성하는 유전자인 SED1, PIR2, TIP1, CWP1, GAS1 및 WSC1로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하며 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 변이 단백질을 코딩하는 유전자인 서열번호 6 , 서열번호 7 또는 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제조하였다.

또한, 본 발명은 상기 표면 발현 벡터를 숙주세포에 도입시킨 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 형질전환체는 상기 리파제 변이 유전자를 포함하는 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입한 것으로, 본 발명에서 사용되는 숙주세포로는 캔디다( Candida ), 디베리오마이세스( Debaryomyces ), 한세눌라( Hansenula ), 클루이베로마이세스( Kluyveromyces ), 피키아( Pichia ), 스키조사카로마이세스( Schizosaccharomyces ), 야로이야( Yarrowia ) 및 사카로마이세스( Saccharomyces ) 속 등의 효모류, 아스퍼질러스( Aspergillus ), 페니실리엄( Penicillium ) 및 라이조퍼스( Rhizopus ) 속 등의 사상 균류 및 에셔리키아( Escherichia ), 바실러스( Bacillus ) 속 등의 세균류를 사용할 수 있고, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 숙주세포로 효모를 사용하였는데 구체적으로는 한세눌라 폴리모르파 DL1-L, 한세눌라 폴리모르파 A16 또는 사카로마이세스 세레비시애 Y2805를 숙주세포로 사용하여 형질전환체를 제조하였다. 본 발명에서는 서열번호 6 및 서열번호 7 로 기재되는 리파제 유전자를 각각 포함하는 발현벡터로 한세눌라 폴리모르파 DL-1을 형질전환시킨 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 한세눌라 폴리모르파/pLGK Lip10 및 한세눌라 폴리모르파/pLGK Lip14라 명명하고, 이를 2002년 7월 31일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10320BP 및 KCTC 10321BP).

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 변이 리파제 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체는 숙주세포의 배양 적온에 비하여 5℃ 내지 20℃ 더 낮은 온도에서 배양하여 단백질을 생산하는 것이 바람직하다.

상기 형질전환체가 한세눌라인 경우 25℃ 내지 30℃인 것이 바람직하고, 사카로마이세스의 경우 20℃ 내지 25℃인 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 한세눌라 폴리모르파 DL1-L의 경우 25℃에서 배양하였을 때 효소 활성이 높은 리파제를 생산하였고, 한세눌라 폴리모르파 A16의 경우 25℃에서, 사카로마이세스 세레비시애 Y2805의 경우 20℃에서 배양한 경우 가장 높은 효소 활성을 나타내고, 높은 생산량을 나타내는 리파제를 생산하였다( 도 6 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> CALB를 발현하는 벡터 및 형질전환체의 제조

본 발명자들은 CALB를 한세눌라 폴리모르파( H. polymorpha )의 표면에 발현시키거나 또는 세포 외로 분비시키는 벡터를 제조하였다.

구체적으로, CALB를 세포 외로 분비시키는 벡터를 제조하기 위해 캔디다 앤타크티카의 유전체로부터 서열번호 1 및 서열번호 2 로 기재되는 프라이머를 이용한 중합효소연쇄반응을 통하여 CALB 유전자를 획득하였다. CALB 합성을 위한 중합효소연쇄반응은 pfu 중합효소(스트라타진 사, 미국)를 이용하여, 94℃에서 3분동안 반응시키고, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 반응을 15회 수행하고, 72℃에서 10분간 반응하는 조건으로 수행하고, 염기서열 분석을 통하여 유전자를 확인하였다. 한세눌라 폴리모르파 발현벡터인 AMIpL1(Agaphonov et al ., Yeast , 1999 , 15, 541)에 GAPDH 프로모터(Sohn et al ., Appl. Microbiol. Biotechnol ., 1999 , 51, 800), 킬러톡신 분비신호서열(killer toxin signal sequence)(Sor and Fukuhara., Curr. Genet ., 1985 , 9, 147)이 삽입된 벡터의 평활화한 Kpn I 및 Bam HI 부위 내에, CALB 유전자를 Sap I으로 절단하여 평활화한 후 Bam HI을 이용하여 절단한 유전자를 삽입하여 도 1 에서 보는 바와 같은 벡터를 제조한 후 "pGK-Lip*"로 명명하였다.

또한, 본 발명자들은 CALB를 표면에 발현하는 벡터를 제조하기 위해 캔디다 앤타크티카의 유전체로부터 서열번호 1 및 서열번호 3 으로 기재되는 프라이머로 상기와 동일한 중합효소연쇄반응을 이용하여 획득한 CALB 유전자를 상기와 동일한 방법으로 절단하여 AMIpL1벡터에 삽입한 후 벡터 pGK LipF를 제조하였다. pGK LipF의 BamH I과 Hind Ⅲ 절단 부위에 CWP1 유전자 유래의 표면 발현 매개체인 CwpF(PCT/KR00/00819)를 삽입하여 제조된 표면 발현 벡터는 "pGK-Lip-CwpF"라 명명하였다.

상기의 방법으로 제조한 CALB를 세포외로 분비하는 벡터(pGK-Lip*) 및 CALB를 표면에 발현하는 벡터(pGK-Lip-CwpF)를 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하여(Hill et al ., Nucl. Acids. Res ., 1991 , 19, 5971) 최소 합성 배지(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 기질 및 2% 포도당)에서 형질전환주를 선별하였다. 상기 방법으로 획득한 균주는 1% 트리뷰티린을 포함한 YPD 평판 배지(1% 효모 추출액, 2% 펩톤 및 2% 포도당)에 옮겨 균주 주변의 환의 크기를 측정하여 형질전환체의 활성을 확인하였다.

그 결과 균주 주변에 활성환이 나타나는 것을 확인함으로써 CALB가 발현함을 확인하였다.

<실시예 2> 세포내 재조합( In-vivo recombination) 방법을 이용한 라이브러리(library) 구축

본 발명자들은 CALB의 변이주 라이브러리를 구축하기 위하여 사카로마이세스 세레비시애 ( S. cerevisiae) 에서 보고된 바 있는 세포내 재조합 방법(Abecassis et al ., Nucleic. Acids. Res., 2000 , 28, E88)을 한세눌라 폴리모르파에 응용하여 CALB 라이브러리를 구축하였다.

세포내 재조합이란, 벡터의 양말단 부위와 상동성을 가지도록 합성된 삽입 절편 부분을 벡터와 함께 형질전환하여 세포 내에서 재조합에 의해 완전한 벡터가 만들어지도록 하는 방법이다. 세포내 재조합 방법을 이용할 경우, 대장균에서 미리 라이브러리를 제조할 필요가 없어 간단하고 효율적이며, 대장균에 유독한 유전자의 라이브러리를 구축하고자 할 경우에 용이하게 사용이 가능하다.

CALB를 표면에 발현하는 벡터인 pGK-Lip-CwpF를 Eco RI/ Pst I으로 절단하여 얻어진 약 5 kb 절편을 젤을 통하여 회수한 후 형질전환을 위한 벡터로 사용하였다. 벡터 절편과 HARS36 부위 100 bp가 교차하도록 제작된 서열번호 4 및 서열번호 5 의 프라이머를 이용하고 pGK-Lip-CwpF를 주형으로 사용하여 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용한 중합효소연쇄반응으로 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 수행하여 획득한 삽입 절편 100 ng을 벡터 100 ng과 함께 한세눌라 폴리모르파 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하였다.

그 결과 획득한 형질전환 균주를 무작위로 선별하여 1% 트리뷰티린을 포함한 YPD 평판 배지상에서 리파제 활성을 측정함으로써 균일한 활성을 지닌 라이브러리가 제조됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> CALB의 변이주 라이브러리 구축

본 발명자들은 CALB의 변이주 라이브러리를 구축하기 위하여, 변이유도 중합효소연쇄반응(error-prone PCR) 방법과 세포내 재조합 방법을 이용하였다.

CALB를 표면에 발현하는 벡터인 pGK-Lip-CwpF를 주형으로 하여 서열번호 4 및 서열번호 5 의 프라이머를 사용하여 변이유도 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 변이유도는 PCR 랜덤 변이유도 키트(클론텍 사, 미국)를 이용하여 1 kb 당 2 내지 5개의 변이를 유도하도록 하였으며 얻어진 DNA 절편은 젤에서 해당 크기의 절편을 절단하여 회수한 후 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용하여 서열번호 4 및 서열번호 5 의 프라이머로 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 수행하였다.

상기의 방법으로 얻어진 삽입 절편과 pGK-Lip-CwpF를 Eco RI/ Pst I으로 절단하여 얻어진 약 5 kb 절편인 벡터를 각각 100 ng씩 혼합하여 한세눌라 폴리모르파 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하였다.

그 결과 약 1 ×10 ⁴ 개의 형질전환 균주를 획득하였다.

<실시예 4> CALB의 변이주 선별

본 발명자들은 상기 실시예 3의 과정으로 제조된 CALB 변이주 라이브러리에서 높은 리파제 활성을 가지는 CALB 변이주를 선별하고자 하였다.

상기 실시예 3에서 획득한 변이주 라이브러리 중 약 7,000개의 균주를 각각 1% 트리뷰티린을 포함한 YPD 평판 배지에 접종하여 24 시간 배양 후 큰 활성환을 보이는 균주 23 주를 1차 선별하였다. 평판 배지에서 1차 선별된 균주는 YPD 액체 배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 배양한 후 5,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 분획과 배양 상등액을 분리하였다. 상기 세포 분획은 50 mM pH 7.5의 트리스 완충액에 현탁하여 세척한 후 동량의 동일 완충액으로 현탁하였다.

리파제의 활성을 측정하기 위하여 ρ-나이트로페닐 팔미테이트(ρ-nitrophenyl palmitate)(이하 'pNPP'라 약칭함)를 기질로 사용하였는데, 10 ㎕ 10mM pNPP, 40 ㎕ 에틸 알콜, 950 ㎕ 50 mM pH 7.5 의 트리스 완충액이 조합된 반응액에 100 ㎕의 세포현탁액을 첨가한 후 25 ℃에서 2 시간 반응한 후 405 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 pNPP를 기질로 사용한 리파제 활성 측정 방법은 pNP기와 팔미테이트가 연결된 pNPP가 리파제에 의해 팔미테이트로부터 pNP기가 절단되어 나오면서 유리된 pNP기가 405 nm에서 흡광하는 정도를 측정하는 방법이다.본 발명에서 리파제의 활성 1 unit는 1 분당 1 uM의 pNP기를 유리시키는 효소의 활성으로 정의하였다.

그 결과 전세포 분획에서 높은 활성을 나타내는 균주 Lip14, Lip10 및 Lip23을 최종 선별하였다.

<실시예 5> CALB 변이주의 분석

본 발명자들은 상기 실시예 4에서 최종적으로 획득된 3종의 변이주로부터 변이 유전자를 분석하였다.

CALB 변이 유전자를 회수하기 위하여 변이주의 유전체를 분리한 후 이를 주형으로 하여 서열번호 4 및 서열번호 5 의 프라이머로 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용하여 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 상기 획득한 DNA 절편은 젤로부터 회수하여 염기 서열 분석을 실시하였다.

그 결과 Lip10 및 Lip14의 염기 서열은 각각 서열번호 6 및 서열번호 7 이고, 그로부터 유추된 아미노산의 서열은 각각 서열번호 9 및 서열번호 10 이었다. 아미노산 서열에서 Lip10 및 Lip14의 경우 278 번째 루이신이 프롤린으로 치환된 변이가 확인되었으며, Lip14의 경우에는 추가적으로 219 번째 루이신이 글루타민으로 치환된 변이도 보유하고 있었다( 도 2 ).

278번 루이신의 경우 CALB의 10 번째 α 헬릭스에 존재하는데 이 부위는 리파제 활성 부위의 뚜껑 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다(Uppenberg et al. , structure., 1994, 2, 293). 10번째 α헬릭스에는 다수의 소수성 아미노산이 포함되어 있고 루이신도 이들 중 하나인데 이 아미노산이 프롤린으로 치환된 경우 아미노산의 헬릭스 구조를 보다 안정화하고 다른 방향으로의 꺽임 구조를 생성할 수 있으며, 이로 인하여 활성부위의 노출 정도를 변화시켜 활성이 증가한 것으로 추정된다. 또한 278번 루이신은 활성 부위의 표면에 존재하는 전하를 띈 아미노산인 아스파라긴산 223번과 글루탐산 188번과 인접한 위치에 존재하는데 이 아미노산이 프롤린으로 변화한 경우 소수성 말단이 차지하는 공간이 줄어듦으로서 전하를 띈 아미노산인 아스파라긴산 223번과 글루탐산 188번이 위치하는 공간이 더 넓어지게 될 수 있어 활성 부위의 변화를 가져올 수 있다. 또한 넓어진 공간에 물 분자가 끼어들 수 있는 구조가 형성되는데 이 물 분자에 의해 기질이 보다 안정적으로 활성 부위에 존재할 수 있어 활성의 증가를 가져올 수 있을 것이다( 도 3 ). 219번 루이신의 경우 표면으로 노출되어 있는 아미노산으로 소수성을 가지는 데 이 아미노산이 친수성인 글루타민으로 변화하였다. CALB는 표면이 거의 소수성 아미노산으로 이루어진 효소로서 단백질의 표면에 이러한 친수성 아미노산이 위치함으로써 형태의 변화를 가져올 수도 있을 것이며, 물에서의 안정성을 보다 증가시킬 수도 있을 것이다. Lip23의 경우 CALB 유전자 말단 부위에 종말 코돈을 보유하고 있어 분비형 리파제를 생산함으로서 리파제 활성이 증대된 것으로 확인되었다.

<실시예 6> CALB 변이주의 활성 측정

본 발명자들은 상기 실시예 4에서 선별한 CALB 변이주를 이용해 리파제의 효소 활성을 측정하였다.

유전자를 세포 표면에 발현하게 하기 위한 벡터를 제조하기 위해 변이주 및 야생형 CALB 발현균주의 유전체를 분리한 후 이를 주형으로 하여 서열번호 4 및 서열번호 5 의 프라이머로 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용하여 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 상기 획득한 DNA 절편은 EcoR I/ Cla I으로 절단한 후 단일 카피 삽입벡터(single copy integration vector)인 AMIpLD1 벡터(Agaphonov et al ., Yeast., 1999, 15, 541)에 GAPDH 프로모터와 함께 삽입하여 유전자를 표면에 발현하는 벡터를 제조하고 이를 'pLGK-Lip10-CwpF' 및 'pLGK-Lip14-CwpF'라 명칭하였다.

또한 유전자를 세포 외로 분비하도록 발현하는 벡터를 제조하기 위해 변이주 및 야생형 균주의 유전체를 서열번호 1 및 서열번호 2 의 프라이머로 PCR 프리믹스 키트(바이오니아 사, 한국)를 이용하여 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 1분간 반응을 25회 수행하고 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응을 수행하여 DNA 절편을 획득하였다. 상기의 DNA 절편을 AMIpLD1 벡터의 Eco RI/ Bam HI 위치에 GAPDH 프로모터와 함께 삽입하여 pLGK-Lip10* 및 pLGK-Lip14* 벡터를 제조하였다.

상기의 각각의 벡터는 염기서열 분석을 통하여 야생형 및 변이형 CALB가 삽입된 것을 확인한 후 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하고 서던 블롯(Southern blot) 분석을 통하여 유전체의 LEU2 의 위치로 단일 카피로 삽입되었음을 확인하였다. 획득한 형질전환 균주를 각각 1% 트리뷰티린을 포함한 평판 배지에 접종한 후 37℃에서 24 시간 배양하여 활성환을 관찰하여 활성의 증가를 확인하였다( 도 4 ). 형질전환 균주는 다시 YPD 액체 배지에서 16 시간 배양한 후 원심분리를 통하여 배양 상등액 분획과 전세포 분획을 분리하여 pNPP를 기질로 사용하여 활성을 측정하였다.

그 결과 리파제 활성은 표면 발현 균주의 전세포 활성은 두 가지의 변이주 모두 약 5배 증가하였으며, 분비형으로 발현하였을 경우 배양 상등액의 활성은 Lip10의 경우 야생형에 비하여 약 5배, Lip14의 경우 야생형에 비하여 약 10배 증가하였음을 확인하였다( 표 1 ).

또한, CALB를 분비하는 균주의 배양상등액을 12%의 SDS-PAGE로 분석하여 실버 염색(silver-staining)으로 확인하였다( 도 5 ). Lip10을 발현하는 균주는 야생형 CALB를 발현하는 균주와 동일한 양의 CALB 밴드를 보이는 데 반하여 Lip14를 보유한 균주는 다른 균주에 비해 많은 양의 CALB 단백질 밴드를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 분비형 Lip14가 Lip10에 비하여 2 배 이상 높은 리파제 활성을 보이는 것은 단백질의 분비량이 많기 때문이었다. 또한 표면 발현형에서 이들 균주가 활성의 차이를 보이지 않는 것으로 볼 때, 외래 단백질을 표면 발현할 경우 항상 일정량의 단백질만이 표면으로 이동하여 분비량 및 생산량의 차이를 극복한 것으로 보인다.

<실시예 7> 변이주로부터의 CALB의 정제 및 특성 분석

본 발명자들은 변이 CALB의 특성을 보다 정확히 분석하기 위하여 야생형 CALB 및 변이 CALB를 분리 정제하였다.

분비형 CALB를 포함한 각각의 균주를 YPD 배지에서 18 시간 배양한 후 5,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 배양 상등액을 회수하고 울트라필트레이션(Ultrafiltration)을 통하여 10배 농축한 후 단백질 용액에 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate)를 1 M의 농도가 되도록 첨가하였다. 상기 방법으로 회수된 용액을 1 M 암모늄 설페이트가 포함된 50 mM, pH 6.5의 포스페이트 완충액으로 포화되어있는 부틸 세파로즈 CL-4B 컬럼(파마시아 사, 미국)으로 통과시킨 후 100% 물을 이용하여 농도를 낮추어가면서 단백질을 용출하였다. 상기 용출된 단백질 분획 중 리파제 활성을 나타내는 분획을 회수한 후 다시 울트라필트레이션을 이용하여 농축하고 슈퍼덱스-G200 젤 여과 컬럼 크로마토그래피(파마시아 사, 미국)를 이용해 정제하여 Lip10, LIP14 및 야생형 리파제(Lip wt)의 정제된 각각의 단백질을 획득하였다.

정제된 단백질을 이용하여 pNPP를 기질로 사용할 경우의 Km과 Kcat을 측정함으로써 변이 단백질과 야생형 단백질을 비교 분석하였다. pNPP를 농도별로 첨가한 리파제 반응액을 제조한 후 각각 10 ㎕의 단백질 용액을 첨가하여 시간당 pNP기의 유리에 의한 405 nm에서의 흡광도의 증가치를 이용하여 최초 속도값( Vi )을 측정하였다.

최초 속도값을 이용하여 미켈리스-멘텐 방정식을 적용하여 얻어진 각 단백질의 Km값을 계산한 결과, Lip10과 Lip14의 경우 모두 거의 증가되지 않았다. 각 단백질의 Kcat값은 각각 6.3배, 8배 증가하여 Lip10과 Lip14이 기질 친화도의 큰 변화 없이 활성이 증가했다( 표 2 ). 또한, 각 단백질을 50℃에서 10 분간 방치한 후 잔존 활성을 측정하여 단백질의 열 안정성을 실험한 결과 변이 단백질과 야생형 단백질간의 열 안정성에 큰 차이가 없었다. 또한 (R,S)-아세틸 이스터(Acetyl ester)를 기질로 하여 광학선별성(stereoselectivity)을 측정한 결과, 야생형과 변이 단백질간의 차이을 보이지 않아 광학 선별성에도 큰 차이가 없는 것으로 확인되었다.

따라서 각 변이 단백질은 안정성의 변화 없이 효소의 활성이 5 배 이상 증가했다.

<실시예 8> 부분변이 도입(site-directed mutagenesis)을 이용한 변이 특성 분석

본 발명자들은 변이 단백질의 특성 변화가 직접적으로 아미노산의 변화에 의한 것인지 확인하기 위해 부분변이 도입을 이용해 변이 특성을 분석하였다.

Lip10과 Lip14에 공통으로 존재하는 L278P(278번 루이신이 프롤린으로 치환)변이와, Lip14에 단독으로 존재하는 L219Q(219번 루이신이 글루타민으로 치환)변이를 야생 유전자에 부분 변이도입을 위한 효소연쇄 중합반응을 통하여 제조한 후 그 영향을 분석하였다. 부분 변이도입을 위해 서열번호 15 , 서열번호 16 , 서열번호 17 및 서열번호 18 로 기재되는 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응은 CALB 야생형 유전자를 주형으로하여 pfu 중합효소를 이용하여, 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 반응을 15회 수행하고, 72℃에서 10분간 반응하는 조건으로 수행하였다.

L278P 변이 유전자를 합성하기 위해서 야생형 유전자를 주형으로 서열번호 2 및 서열번호 17 로 기재되는 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 유전자를 합성하고, 서열번호 4 및 서열번호 18 로 기재되는 프라이머를 이용하여 유전자를 합성한 후 상기 두 개의 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 2 및 서열번호 4 로 기재되는 프라이머로 중합효소연쇄반응을 하여 상기 두 절편을 연결하였다. 상기의 중합효소연쇄반응의 조건은 각 유전자 절편 각 5 ㎕, 프라이머 각 3 ㎕를 첨가하고 Ex Taq 중합효소(다카라 사, 일본)를 이용하여 94℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 90초간 반응을 20회 수행하고, 72℃에서 7분간 반응하는 조건으로 하였다. 상기 방법으로 합성된 유전자는 Eco RI/ Cla I으로 절단하여 pLGK-Lip-CwpF 벡터의 동일 부위에 삽입하고 'pLGK-LP'로 명명하였다.

L219Q 변이를 도입한 서열번호 8 로 기재되는 유전자를 합성하기 위해서는 야생형 유전자를 주형으로 서열번호 2 및 서열번호 15 로 기재되는 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 유전자를 합성하고, 서열번호 4 및 서열번호 16 으로 기재되는 프라이머를 이용하여 유전자를 합성한 후, 상기 각 유전자 절편을 혼합한 후 이 혼합액을 주형으로 하여 서열번호 2 및 서열번호 4 로 기재되는 프라이머로 상기와 동일한 조건의 중합효소연쇄반응을 하여 두 절편을 연결하였다. 상기의 방법으로 합성된 유전자는 Eco RI/ Cla I으로 절단하여 pLGK-Lip-CwpF벡터의 동일 부위에 삽입하고 'pLGK-LQ'로 명명하였다.

L278P와 L219Q 변이를 모두 도입한 유전자를 획득하기 위해서는 pLGK-LP유전자를 주형으로 하여 서열번호 2 및 서열번호 15 그리고 서열번호 4 및 서열번호 16 으로 기재되는 프라이머를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 유전자를 합성한 후 상기와 동일한 방법으로 'pLGK-LPQ'를 제조하였다. 각각의 벡터는 한세눌라 폴리모르파 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하였다. 상기 획득한 형질전환 균주는 YPD 배지에서 18시간 배양한 후 배양 상등액을 회수하여, 상기와 동일한 방법으로 리파제 활성을 측정하였다.

그 결과, LP 및 LPQ의 경우, Lip10 및 Lip14와 동일한 활성의 증가를 나타내었다( 표 3 ). 또한 서열번호 11 로 기재된 아미노산으로 구성된 LQ의 경우에도 야생형 유전자에 비하여 약 3 배 더 높은 리파제 활성을 보였는데, LQ의 활성 증가를 분석하기 위하여 각각의 균주의 배양 상등액을 SDS-PAGE을 통하여 비교해 본 결과, LQ의 경우 LPQ와 동일한 단백질 생산량을 보였다( 도 5 ).

따라서 L219Q 변이가 주로 단백질의 생산량을 증가시키며, L278P 변이는 단백질의 비활성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Kcat의 값으로 미루어 볼 때 Lip14는 Lip10에 비하여 단백질의 양적 증가 이외의 활성 증가 효과를 보여 L219Q 변이가 복합적인 역할을 할 수 있는 것으로 보인다.

<실시예 9> 배양온도에 따른 CALB의 발현 변화

본 발명자들은 CALB의 최적 배양 조건을 확립하기 위해 배양온도를 달리하여 CALB의 활성을 측정하였다.

pLGK-Lip14*를 포함한 한세눌라 폴리모르파 DL1-L균주를 다양한 온도에서 배양하여 활성을 측정하였다. 균주는 YPD 배지에 초기 흡광도(600 nm)가 1 이 되도록 접종한 후 20℃, 25℃, 30℃ 또는 37℃에서 배양하면서 배양 상등액을 회수하여 활성을 측정하였다. 활성 측정은 pNPP를 기질로 사용하고, 50mM pNPP 25 ㎕, 에틸 알콜 450 ㎕, 50 mM 트리스 완충액(pH 7.5) 9500 ㎕가 조합된 반응액 200 ㎕에 적절하게 희석된 10 ㎕의 세포배양 상등액을 첨가한 후 25℃에서 반응하면서 405 ㎚에서의 Vi 를 측정하였다. 리파제의 활성 1 AU(임의 단위, arbitrary unit)는 위의 조건에서의 Vi 값으로 정의하였다.

그 결과 각 온도에서의 리파제 활성 및 생육은 25℃에서 가장 높은 활성을 보였고, 37℃에서 생육할 경우 오히려 시간이 지남에 따라 급속한 활성의 저하를 보이는 것을 확인할 수 있었다( 도 6a ).

이는 세포가 사멸기에 들어가면서 세포에서 분비되어 나온 단백질 분해효소(protease)에 의한 영향으로, 이와 같은 현상이 상대적으로 적은 것으로 알려진 한세눌라 폴리모르파 A16(CBS4732의 유도체) 균주를 이용하여 동일한 실험을 반복하였다. 한세눌라 폴리모르파 A16 균주에 pLGK-Lip14* 플라스미드를 상기와 동일한 방법으로 형질전환한 후 얻어진 형질전환 균주를 YPD 배지에 초기 흡광도(600 nm)가 1 이 되도록 접종한 후 25℃, 30℃ 및 37℃에서 배양하면서 배양 상등액을 회수하여 활성을 측정하였다.

그 결과 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주에 비해 한세눌라 폴리모르파 A16 균주에서는 리파제의 활성감소가 거의 없었으며 저온에서 배양할수록 더 많은 리파제를 발현하는 것을 확인할 수 있었다( 도 6b ). 따라서, 25℃에서 30 시간 배양할 경우 480 AU의 효소를 생산할 수 있어 가장 높은 활성의 리파제를 회수할 수 있었다.

<실시예 10> 사카로마이세스 세레비시애에서의 CALB의 발현

효소의 최적 생산을 위하여 사카로마이세스 세레비시애에 변이 CALB를 발현하였다.

Lip14번 유전자는 서열번호 2 및 서열번호 12 의 프라이머를 이용하여 효소연쇄 중합 반응으로 합성한 후 YEGα HIR525벡터(Choi et al ., Appl. Microbial. biotechnol. , 1994 , 42, 587)의 Eco RI/ Bam HI 부위에 서열번호 13 으로 기재되는 α-아밀라제 분비신호서열과 Nde I으로 융합하여 연결하였다. 상기의 방법에 의해 제조된 벡터를 사카로마이세스 세레비시애 Y2805(MATα pep4::HIS3 prb-Δ1.6R can1 his3-20 ura3-52) 균주에 Li/TE 방법을 이용하여 형질전환하였으며, 형질전환 균주는 SC-URA(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 기질, 2% 포도당 및 우라실을 제외한 각종 아미노산) 배지를 이용하여 선별하였다. 상기 선별된 균주는 1% 트리뷰티린이 포함된 YPDG(1% 효모 추출액, 2% 펩톤, 0.5% 포도당 및 1.5% 갈락토오스) 배지에서 배양하면서 리파제 활성을 측정하였다.

그 결과 배지상에서 활성환을 확인할 수 있었으며, 확인된 균주는 YPDG 액체 배지에 접종하여 30℃에서 24 시간 발현한 후 활성을 측정하였다.

또한 한세눌라 폴리모르파와 동일한 온도 효과가 있는지의 확인을 위하여 각각 20℃와 30℃에서 배양하면서 배양 상등액을 회수한 후 활성을 비교 분석하였다.

그 결과 20℃에서 발현할 경우 720 AU로 30℃에서 발현한 경우에 비하여 10 배 이상 높은 활성을 나타내었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 변이 리파제를 스크리닝하는 방법은 높은 활성의 변이 리파제를 생산하는 형질전환체를 용이하게 제조할 수 있으며, 상기 형질전환체에서 제조된 변이 리파제는 형질전환된 세포의 표면에 고정화되고, 재생산이 가능할 뿐만 아니라 대량 생산이 가능하므로, 식품 산업, 미세 화합물 합성 및 계면 활성제 사업 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1 은 CALB 분비 벡터(pGK-Lip*)와 CALB 표면 발현 벡터(pGK-Lip-CwpF)를 나타낸 그림이다.

pGPD : GAPDH 프로모터,

KT : 킬러톡신 분비신호서열,

tUK : 알려지지 않은 터미네이터(Kang et al ., Yeast, 1998 , 14, 371),

c : HARS36의 유전체 말단 부위,

BD : 벤트(bent) DNA 도메인,

ARS : HARS36의 자기복제서열 및

Rep : HARS36의 텔로머릭 반복서열 ( Sohn et al ., J. Bacteriol., 1996 , 178, 4420).

도 2 는 CALB 변이주 Lip10 및 Lip14의 아미노산을 야생형(Lip wt)과 비교한 도면이다.

도 3 은 CALB 변이주의 활성 부위 구조를 야생성과 비교하여 나타낸 그림이다.

A : 야생형 리파제의 활성 부위 구조이고,

B : 변이 리파제의 활성 부위 구조이다.

도 4 는 변이 CALB의 활성을 평판 배지상에서 확인한 그림이다.

레인 1 : Wt; 야생형 한세눌라 폴리 모프파 DL1 균주,

레인 2 : Lip-CwpF; 리파제를 표면에 발현하는 벡터(pLGK-Lip-CwpF)를 포함하는 균주,

레인 3 및 4 : Lip10-CwpF 및 Lip14-CwpF; Lip10 및 Lip14의 표면 발현 벡터 (pLGK-Lip-CwpF)를 포함한 균주,

레인 5 : Lip*; 리파제의 분비형 벡터(pLGK-Lip*)를 함유한 균주 및

레인 6 및 7 : Lip10 및 Lip14; 변이 리파제 Lip10 및 Lip14의 분비형 벡터(pLGK-Lip*)를 함유한 균주.

도 5 는 CALB 발현 변이주의 배양 상등액을 전기영동한 사진이다.

레인 1 : Lipwt* 균주,

레인 2 : Lip10* 균주,

레인 3 : Lip14* 균주,

레인 4 및 5 : LP 변이주,

레인 6 및 7 : LQ 변이주 및

레인 8 및 9 : LPQ 변이주.

도 6a 은 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주의 배양 온도 변화에 따른 CALB의 리파제 활성을 비교한 그래프이다.

도 6b 는 한세눌라 폴리모르파 A16 균주의 배양 온도 변화에 따른 CALB의 리파제 활성을 비교한 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for the screening of lipase having improved enzymatic activity using yeast surface display vector and its product <130> 2p-06-79 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB primer 1 <400> 1 ggctcttcag ccactccttt ggtgaag 27 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB primer 2 <400> 2 gcggatcctc agggggtgac gat 23 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB primer 3 <400> 3 gcggatccgg gggtgacgat gccggag 27 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD-err primer <400> 4 gcagagctaa ccaataagg 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-0 primer <400> 5 tgcagttgaa cacaaccac 19 <210> 6 <211> 1023 <212> DNA <213> Candida antarctica <220> <221> sig_peptide <222> (-51)..(-1) <223> secretion signal <400> 6 atgaatatat tttacatatt tttgtttttg ctgtcattcg ttcaaggtac cgccac tccc 9 ttggtgaagc gtctgccttc cggttcggac cctgcctttt cgcagcccaa gtcggtgctc 69 gatgcgggtc tgacctgcca gggtgcttcg ccatcctcgg tctccaaacc catccttctc 129 gtccccggaa ccggcaccac aggtccacag tcgttcgact cgaactggat ccccctctct 189 gcgcagctgg gttacacacc ctgctggatc tcacccccgc cgttcatgct caacgacacc 249 caggtcaaca cggagtacat ggtcaacgcc atcaccacgc tctacgctgg ttcgggcaac 309 aacaagcttc ccgtgctcac ctggtcccag ggtggtctgg ttgcacagtg gggtctgacc 369 ttcttcccca gtatcaggtc caaggtcgat cgacttatgg cctttgcgcc cgactacaag 429 ggcaccgtcc tcgccggccc tctcgatgca ctcgcggtta gtgcaccctc cgtatggcag 489 caaaccaccg gttcggcact cactaccgca ctccgaaacg caggtggtct gacccagatc 549 gtgcccacca ccaacctcta ctcggcgacc gacgagatcg ttcagcctca ggtgtccaac 609 tcgccactcg actcatccta cctcttcaac gggaagaacg tccaggcaca ggctgtgtgt 669 gggccgctgt tcgtcatcga ccatgcaggc tcgctcacct cgcagttctc ctacgtcgtc 729 ggtcgatccg ccctgcgctc caccacgggc caggctcgta gtgcagacta tggcattacc 789 gactgcaacc ctcttcccgc caatgatctg actcccgagc aaaaggtcgc cgcggctgcg 849 ctcccggcgc cgg cggctgc agccatcgtg gcgggtccaa agcagaactg cgagcccgac 909 ctcatgccct acgcccgccc ctttgcagta ggcaaaagga cctgctccgg catcgtcacc 969 ccc 972 <210> 7 <211> 1023 <212> DNA <213> Candida antarctica <220> <221> sig_peptide <222> (-51)..(-1) <223> secretion signal <400> 7 atgaatatat tttacatatt tttgtttttg ctgtcattcg ttcaaggtac cgccactcct 9 ttggtgaagc gtctgccttc cggttcggac cctgcctttt cgcagcccaa gtcggtgctc 69 gatgcgggtc tgacctgcca aggtgcttcg ccatcctcgg tctccaaacc catccttctc 129 gtccccggaa ccggcaccac aggtccacag tcgttcgact cgaactggat ccccctctct 189 gcgcagctgg gttacacacc ctgctggatc tcacccccgc cgttcatgct caacgacacc 249 caggtcaaca cggagtacat ggtcaacgcc atcaccacgc tctacgctgg ttcgggcaac 309 aacaagcttc ccgtgctcac ctggtcccag ggtggtctgg ttgcacagtg gggtctgacc 369 ttcttcccca gtatcaggtc caaggtcgat cgacttatgg cctttgcgcc cgactacaag 429 ggcaccgtcc tcgccggccc tctcgatgca ctcgcggtta gtgcaccctc cgtatggcag 489 caaaccaccg gttcggcact cactaccgca ctccgaaacg caggtggtct gacccagatc 549 gtgcccacca ccaacctcta ctcggcgacc gacgagatc g ttcagcctca ggtgtccaac 609 tcgccactcg actcatccta ccttttcaac ggaaagaacg tccaggcaca ggctgtgtgt 669 gggccgcagt tcgtcatcga ccatgcaggc tcgctcacct cgcagttctc ctacgtcgtc 729 ggtcgatccg ccctgcgctc caccacgggc caggctcgta gtgcggacta tggcattacg 789 gactgcaacc ctcttcccgc caatgatctg actcccgagc aaaaggtcgc cgcggctgcg 849 ctcccggcgc cggcggctgc agccatcgtg gcgggtccaa agcagaactg cgagcccgac 909 ctcatgccct acgcccgccc ctttgcagta ggcaaaagga cctgctccgg catcgtcacc 969 ccc 972 <210> 8 <211> 1023 <212> DNA <213> Candida antarctica <220> <221> sig_peptide <222> (-51)..(-1) <223> secretion signal <400> 8 atgaatatat tttacatatt tttgtttttg ctgtcattcg ttcaaggtac cgccactcct 9 ttggtgaagc gtctgccttc cggttcggac cctgcctttt cgcagcccaa gtcggtgctc 69 gatgcgggtc tgacctgcca gggtgcttcg ccatcctcgg tctccaaacc catccttctc 129 gtccccggaa ccggcaccac aggtccacag tcgttcgact cgaactggat ccccctctct 189 gcgcagctgg gttacacacc ctgctggatc tcacccccgc cgttcatgct caacgacacc 249 caggtcaaca cggagtacat ggtcaacgcc atcaccacgc tctacgctgg ttcgggcaac 309 aacaagcttc ccgtgctcac ctggtcccag ggtggtctgg ttgcacagtg gggtctgacc 369 ttcttcccca gtatcaggtc caaggtcgat cgacttatgg cctttgcgcc cgactacaag 429 ggcaccgtcc tcgccggccc tctcgatgca ctcgcggtta gtgcaccctc cgtatggcag 489 caaaccaccg gttcggcact cactaccgca ctccgaaacg caggtggtct gacccagatc 549 gtgcccacca ccaacctcta ctcggcgacc gacgagatcg ttcagcctca ggtgtccaac 609 tcgccactcg actcatccta cctcttcaac ggaaagaacg tccaggcaca ggctgtgtgt 669 gggccgcagt tcgtcatcga ccatgcaggc tcgctcacct cgcagttctc ctacgtcgtc 729 ggtcgatccg ccctgcgctc caccacgggc caggctcgta gtgcagacta tggcattacg 789 gactgcaacc ctcttcccgc caatgatctg actcccgagc aaaaggtcgc cgcggctgcg 849 ctcctggcgc cggcggctgc agccatcgtg gcgggtccaa agcagaactg cgagcccgac 909 ctcatgccct acgcccgccc ctttgcagta ggcaaaagga cctgctccgg catcgtcacc 969 ccc 972 <210> 9 <211> 341 <212> PRT <213> Candida antarctica <220> <221> SIGNAL <222> (-24)..(-8) <223> secretion signal <400> 9 Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly -24 -20 -15 -10 Thr Ala Thr Pro Leu V al Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala -5 1 6 Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly 11 16 21 Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr 26 31 36 Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser 41 46 51 56 Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met 61 66 71 Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr 76 81 86 Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp 91 96 101 Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser 106 111 116 Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys 121 126 131 136 Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro 141 146 151 Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg 156 161 166 Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser 171 176 181 Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp 186 191 196 Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys 201 206 211 216 Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe 221 226 231 Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala 236 241 246 Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn 251 256 261 Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro 266 271 276 Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp 281 286 291 296 Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser 301 306 311 Gly Ile Val Thr Pro 316 <210> 10 <211> 341 <212> PRT <213> Candida antarctica <220> <221> SIGNAL <222> (-24)..(-8) <223> secretion signal <400> 10 Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly -24 -20 -15 -10 Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala -5 1 6 Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly 11 16 21 Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr 26 31 36 Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser 41 46 51 56 Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met 61 66 71 Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr 76 81 86 Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp 91 96 101 Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser 106 111 116 Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys 121 126 131 136 Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro 141 146 151 Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg 156 161 166 Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser 171 176 181 Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp 186 191 196 Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys 201 206 211 216 Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe 221 226 231 Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala 236 241 246 Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn 251 256 261 Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro 266 271 276 Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp 281 286 291 296 Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser 301 306 311 Gly Ile Val Thr Pro 316 <210> 11 <211> 341 <212> PRT <213> Candida antarctica <220> <221> SIGNAL <222> (-24)..(-1) <223> secretion signal <400> 11 Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly -24 -20 -15 -10 Thr Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala -5 1 6 Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly 11 16 21 Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr 26 31 36 Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser 41 46 51 56 Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met 61 66 71 Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr 76 81 86 Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp 91 96 101 Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser 106 111 116 Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys 121 126 131 136 Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro 141 146 151 Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg 156 161 166 Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser 171 176 181 Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp 186 191 196 Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys 201 206 211 216 Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe 221 226 231 Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala 236 241 246 Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn 251 256 261 Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro 266 271 276 Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp 281 286 291 296 Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser 301 306 311 Gly Ile Val Thr Pro 316 <210 > 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CALB primer 4 <400> 12 ctcatatgct accttccggt tcggac 26 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a-amylase secretion signal <400> 13 Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala 1 5 10 15 Ala Pro Ala Leu Ala 20 <210> 14 <211> 317 <212> PRT <213> Candida antarctica <400> 14 Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu 1 5 10 15 Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys 20 25 30 Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe 35 40 45 Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr 65 70 75 80 Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 85 90 95 Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln 100 105 110 Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu 115 120 125 Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu 130 135 140 Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile 165 170 175 Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro 180 185 190 Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys 195 200 205 Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His 210 215 220 Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala 225 230 235 240 Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr 245 250 255 Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val 260 265 270 Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly 275 280 285 Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe 290 295 300 Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro 305 310 315 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LQ53 primer <400> 15 gctgtgtgtg ggccgcagtt cgtcatcg 2 8 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LQ35 primer <400> 16 gcatggtcga tgacgaactg cggcccacac 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LP53 primer <400> 17 gtcgccgcgg ctgcgctccc ggcgccggcg 30 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LP35 primer <400> 18 ctgcagccgc cggcgccggg agcgcagcc 29