Method for screening a peptide display library using a mini-cell display |
|||||||
申请号 | JP2002571815 | 申请日 | 2002-03-06 | 公开(公告)号 | JP4295513B2 | 公开(公告)日 | 2009-07-15 |
申请人 | チルドレンズ メディカル センター コーポレーション; | 发明人 | サミー アシュカー,; | ||||
摘要 | |||||||
权利要求 | 結合パートナーに結合されたミニ細胞宿主を同定するための方法であって、以下の工程: (a)外膜を含むミニ細胞宿主中の融合タンパク質を発現する工程であって、ここで、該融合タンパク質が、キメラ遺伝子によってコードされ、該キメラ遺伝子が、以下: 該外膜への該融合タンパク質の結合を媒介する、シグナル配列と脂質改変部位とを含むRickettsia rickettsiiの17K抗原のN末端フラグメントをコードするDNAフラグメント、および 第2ペプチドをコードするDNAフラグメント、 を含む、工程; (b)該工程(a)のミニ細胞宿主を、結合パートナーに接触する工程;および (c)該結合パートナーに結合される該ミニ細胞宿主を同定する工程、 を包含する、方法。 請求項1に記載の方法であって、以下の工程: (d)前記結合したミニ細胞宿主または結合していないミニ細胞宿主を単離する工程、をさらに包含する、方法。 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記第2ペプチドをコードするDNAフラグメントが、DNAライブラリー由来である、方法。 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記結合パートナーが、炭水化物、糖、核酸分子、ペプチド、タンパク質、金属、無機分子および合成薬物からなる群より選択される方法。 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記結合パートナーが、レセプター、リガンド、抗体、ビタミン、補因子、酵素、およびニューロメディエーターからなる群より選択される、方法。 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記ミニ細胞株が、グラム陰性細菌 由来である、方法。 請求項 6に記載の方法であって、ここで、前記グラム陰性細菌が、E. coli、Salmonella typhimurium、S. anatum、S. enteritidis、S. pullorum、S. senftenberg、S. worthington、Vibrio cholera、Erwinia amylovora、およびHaemophilus influenzaeからなる群から選択される、方法。 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記ミニ細胞株が、グラム陽性 細菌由来である、方法。 請求項8に記載の方法であって、ここで、前記グラム陽性細菌が、Bacillus subtilisである、方法。 請求項1に記載の方法であって、以下の工程: (d)前記融合タンパク質をコードするDNAフラグメントを単離する工程;ならびに (e)該単離されたDNAを、分析方法に供する工程であって、該分析方法が、DNA塩基組成の決定、DNA塩基配列の決定、分子量の決定、および該配列内の2次構造の決定からなる群より選択される、工程、 を、さらに包含する、方法。 請求項1に記載の方法であって、ここで、前記Rickettsia rickettsiiの17K抗原のN末端フラグメントは、Rickettsia rickettsiiの17K抗原のオープンリーディングフレームの最初の213ヌクレオチドを含む、方法。 請求項1に記載の方法であって、前記融合タンパク質の発現が、誘導性プロモーターエレメントによって制御される、方法。 請求項12に記載の方法であって、ここで、前記誘導性プロモーターエレメントが、lac、tac、およびtrpからなる群より選択される、方法。 請求項1に記載の方法であって、以下の工程: (d)前記ミニ細胞宿主から前記第2ペプチドを切断する工程、 をさらに包含する、方法。 請求項2に記載の方法であって、以下の工程: (e)前記ミニ細胞宿主から前記第2ペプチドを切断する工程、 をさらに包含する、方法。 請求項15に記載の方法であって、以下の工程: (f)前記ミニ細胞宿主から切断された前記ペプチドを単離する工程;ならびに (g)該単離されたペプチドを、アミノ酸組成の決定、アミノ酸配列の決定、等電点の決定、および分子量の決定からなる群より選択される方法に供する工程、 を、さらに包含する、方法。 請求項16に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号40、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号52、および配列番号53からなる群より選択される、方法。 請求項16に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号33、配列番号34、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号41、配列番号42、配列番号49、配列番号50、および配列番号51からなる群より選択される、方法。 請求項16に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号17、配列番号18、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号31、および配列番号32からなる群より選択される、方法。 請求項16に記載の方法であって、ここで、前記単離されたペプチドが、配列番号7、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号19、配列番号35、および配列番号36からなる群より選択される、方法。 請求項3に記載の方法であって、ここで、前記第2ペプチドをコードするDNAフラグメントが、少なくとも3アミノ酸長である、方法。 ミニ細胞DNAライブラリーの多様性を増加させるための方法であって、該ミニ細胞 中の DN Aを変異させて、次いで、結合についてスクリーニングする工程を包含 し、ここで該ミニ細胞ライブラリーを構成する該ミニ細胞は、キメラ遺伝子産物によってコードされる該ミニ細胞の外膜上に融合タンパク質を発現し、該キメラ遺伝子産物は、該外膜への該融合タンパク質の結合を媒介する、シグナル配列と脂質改変部位とを含むRickettsia rickettsiiの17K抗原のN末端フラグメントをコードするDNAフラグメント、および第2ペプチドをコードするDNAフラグメントを含む、方法。 請求項22に記載の方法であって、ここで、前記変異誘発が、インビボである、方法。 請求項23に記載の方法であって、ここで、前記インビボでの変異誘発が、以下の工程: (a)誘導性遺伝子融合を含む発現ベクターを、mut遺伝子中に変異を有するミニ細胞株中に形質転換する工程;および (b)発現ベクターの複製を誘導するために、該ミニ細胞株にヌクレオチドを加える工程、 を包含する、方法。 請求項24に記載の方法であって、ここで、前記mut遺伝子内の変異によって、ミニ細胞株において、正常な速度より速い速度の自然変異誘発が与えられる、方法。 請求項23に記載の方法であって、ここで、前記インビボ変異誘発が、以下の工程: (a)誘導性遺伝子融合を含む発現ベクターを、アミノアシル−tRNAシンテターゼ遺伝子中に変異を有するミニ細胞株中に形質転換する工程;ならびに (b)タンパク質合成を誘導するために、該ミニ細胞株に、L−アミノ酸およびアミノ酸アナログを補充する工程、 を包含する、方法。 請求項26に記載の方法であって、ここで、前記アミノアシル−tRNAシンテターゼ遺伝子中の変異によって、tRNAがアミノ酸アナログを認識し、結合し、そして転移させる能力が、与えられる、方法。 請求項26に記載の方法であって、前記アミノ酸アナログが、ヒドロキシアミノ酸、またはその誘導体、オルニチン、アジトリプトファン、およびD−アミノ酸からなる群より選択される、方法。 ミニ細胞DNAライブラリーをスクリーニングするための方法であって、以下の工程: (a)ミニ細胞ライブラリーを標的に接触させる工程であって、ここで、前記標的が、固体支持体上に固定される、工程;および (b)ミニ細胞ライブラリーの結合したメンバーを結合していないメンバーから分離し、それによって、該標的に結合するペプチドをコードするDNAが豊富なライブラリーを作製する、工程であって、ここで該ミニ細胞ライブラリーを構成する該ミニ細胞は、キメラ遺伝子産物によってコードされる該ミニ細胞の外膜上に融合タンパク質を発現し、該キメラ遺伝子産物は、該外膜への該融合タンパク質の結合を媒介する、シグナル配列と脂質改変部位とを含むRickettsia rickettsiiの17K抗原のN末端フラグメントをコードするDNAフラグメント、および第2ペプチドをコードするDNAフラグメントを含む、工程を包含する、方法。 請求項29に記載の方法であって、以下の工程: (c)発現ベクターDNAを、結合したミニ細胞または結合していないミニ細胞から単離する工程; (d)該単離されたDNAをインビトロで変異誘発させる工程; (e)変異誘発されたDNAをミニ細胞株に形質転換する工程; (f)タンパク質融合の発現を誘導する工程; (g)該工程(c)のミニ細胞宿主を標的に接触させる工程;および (h)該標的に結合したライブラリーにおけるミニ細胞を、該標的に結合しなかったミニ細胞から分離する工程、 を包含する、方法。 請求項29に記載の方法であって、ここで、前記固体支持体マトリクスが、アガロース、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、セルロース、中性キャリアおよびイオン性キャリア、ならびにアクリルポリマーからなる群より選択される、方法。 請求項29に記載の方法であって、ここで、前記標的が、炭水化物、糖、ペプチド、タンパク質、核酸分子、無機分子および合成薬物からなる群より選択される方法。 請求項29に記載の方法であって、ここで、前記標的が、レセプター、リガンド、抗体、ビタミン、補因子、酵素、金属およびニューロメディエーターからなる群より選択される、方法。 組換え発現ベクターであって、Rickettsia rickettsiiの17K抗原のオープンリーディングフレームに遺伝的に融合された誘導性プロモーターエレメントを含む、ベクター。 請求項34に記載のベクターであって、ここで、前記Rickettsia rickettsiiの17K抗原のオープンリーディングフレームが、シグナル配列を含む、ベクター。 請求項35に記載のベクターであって、ここで、前記シグナル配列が、17K抗原のオープンリーディングフレームの最初の213ヌクレオチド内でコードされる、ベクター。 請求項36に記載のベクターであって、ここで、前記213ヌクレオチドフラグメントが、第2ペプチドをコードするDNAに遺伝的に融合される、ベクター。 請求項37に記載のベクターであって、ここで、前記遺伝的融合の発現が、キメラタンパク質を生成する、ベクター。 請求項35に記載のベクターであって、ここで、前記誘導性プロモーターエレメントが、lac、lacUV5、tac、およびtrpからなる群より選択される、ベクター。 ミニ細胞を精製するための方法であって、密度勾配超遠心分離によって、細胞全体からミニ細胞を分離する工程を包含し、ここで、該勾配が、線状スクロース勾配から作製され 、ミニ細胞ライブラリーを構成する該ミニ細胞は、キメラ遺伝子産物によってコードされる該ミニ細胞の外膜上に融合タンパク質を発現し、該キメラ遺伝子産物は、該外膜への該融合タンパク質の結合を媒介する、シグナル配列と脂質改変部位とを含むRickettsia rickettsiiの17K抗原のN末端フラグメントをコードするDNAフラグメント、および第2ペプチドをコードするDNAフラグメントを含む、方法。 |
||||||
说明书全文 | (関連出願の引用) (発明の分野) (発明の背景) 潜在的なレセプター、酵素、または抗体の相互作用ペプチドのライブラリーを開発するためにペプチドまたはヌクレオチドを使用する方法にはいくつか例がある。 過去20年の間にわたって、これらのライブリーは、異なるファージまたは細菌の表面においてランダムなペプチドの発現を可能にする系に取り込まれてきた。 多くの刊行物が、選択された標的に結合することについて、ポリペプチドのライブラリーを生産およびスクリーニングするためにファージディスプレイ技術を使用することを報告してきた。 以下を参照のこと:例えば、 Cwirla et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,6378−6382 (1990);Devlin et al. ,Science 249,404−406 (1990),Scott & Smith,Science 249,386−388 (1990);米国特許第5,571,698号(Ladner et al)。 ファージディスプレイ法の基本的概念は、スクリーニングされるべきポリペプチドをコードするDNAと、標的ポリペプチドとの間の物理的会合の確立である。 この物理的会合は、ファージ粒子によって提供される。 このファージ粒子は、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入するキャプシドの部分として、そのポリペプチドをディスプレイする。 ポリペプチドとその遺伝的材料との間の物理的会合の確立は、異なるポリペプチドを有する非常に多数のファージの同時の大量スクリーニングを可能にする。 標的に親和性を有するポリペプチドをディスプレイするファージはその標的に結合し、そしてこれらのファージは、その標的へのアフィニティースクリーニングによって濃縮される。 これらのファージからディスプレイされたポリペプチドの正体は、そのそれぞれのゲノムから決定され得る。 次いで、これらの方法を用いると、所望の標的について結合親和性を有するとして同定されるポリペプチドは、従来の手段によってバルクで合成され得る。 標的分子と相互作用するペプチドを選択するための方法を提供することに加えて、ファージディスプレイは、哺乳動物細胞の表面上のインテグリンタンパク質に結合するファージコートタンパク質に遺伝的に融合されたペプチドを用いて標的細胞に繊維状ファージを指向させるために用いられてきた。 ファージディスプレイの方法は、遺伝子治療適用において多大な影響を有し、そして特定の様式で標的細胞に対して試みられてきた。 表面に発現された外来タンパク質を入手するための別のアプローチは、外来タンパク質についてのキャリアとして細菌のネイティブ膜タンパク質を使用することである。 一般に、細菌表面においてタンパク質を固定する方法を開発する多くの試みは、得られるハイブリッドもまた表面上に局在化されるという希望を持って、細胞の外側に通常露出するネイティブタンパク質に対して所望の組換えポリペプチドの融合に焦点が当てられてきた。 しかし、ほとんどの場合、外来タンパク質は局在化を阻害する。 従って、融合タンパク質は、細胞表面に到達し得ない。 これらの融合物は、誤った細胞配置をするか、または分泌タンパク質ドメインが周辺質に面して膜に固定されるようになるかのいずれかである。 以下を参照のこと:Murphy,et al. ,J. Bacteriol. ,172:2736 (1990)。 細菌ディスプレイ方法における最近の進展は、ピリンタンパク質(TraA)またはその一部、およびピリ繊毛を形成し得る細菌宿主細胞の外側表面においてライブラリーペプチドをディスプレイする異種ポリペプチドを含む融合タンパク質を用いてこの課題を解決してきた。 以下を参照のこと:米国特許第5,516,637号(Huang et al)。 ピリ繊毛は、細菌の細胞表面に固定され、そして天然に溶媒暴露される。 あるいは、FLITRX TM (Invitrogen Corp.)のランダムペプチドライブラリーは、細菌鞭毛タンパク質FliCおよびチオレドキシンTrxAを用いて、コンフォメーション的に拘束される様式でE. coliの表面上にドデカマーのランダムペプチドライブラリーをディスプレイする。 以下を参照のこと:Lu et al. ,BioTechnology,13:366(1995)。 これらの系は、抗体エピトープマッピング、生細菌ワクチン送達系の開発および構築、ならびに環境浄化の目的および診断のための全細胞生体吸着剤の生成に適用されてきた。 腫瘍に由来する上皮細胞上の腫瘍特異的な標的に結合するペプチド配列もまた、FLITRX TM系を用いて同定された。 以下を参照のこと:Brown et al. ,Annals of Surgical Oncology,7(10):743(2000)。 ファージおよび細菌のディスプレイ系は、新たなまたは増強された結合特性で標的分子に結合し得る新たなペプチドを見出すためのユニークな経路を提供してきたが、考慮する必要があるいくつかの重要な制限がある。 このペプチドが遺伝学的に融合されるファージコートタンパク質の構造コンフォメーションにおける最小限の変化に寛容である。 より大きなペプチドインサート(100アミノ酸を超える)がコートタンパク質およびそれゆえファージアセンブリの機能を破壊するときに問題が生じる。 異種ペプチドは、フィンブリアおよび鞭毛フィラメントの両方を用いて細菌上にディスプレイされてきた。 インサートのサイズの束縛は、これらの系の適用性にも影響を与える。 今日まで、フィンブリアにおいてディスプレイされる最大のペプチドは、50〜60アミノ酸の範囲にあるが、他方、Escherichia coliのFliCフラゲリンに融合される接着ペプチドの機能的発現は、302アミノ酸に拘束されるようである。 以下を参照のこと:Westerlund−Wikstrom 2000。 アミノ酸アナログを用いて化学的に反応性の残基を置換し、そして合成ペプチドの安定性を改善し、ならびにその標的についての薬物ペプチド化合物の親和性を調節してきた。 ファージおよび細菌のディスプレイ系の限界は、インビボでペプチドライブラリーにアミノ酸アナログを取り込むことがこれらの系ではできないことにある。 インビボでは、アミノ酸アナログは、必須タンパク質に天然のアミノ酸を取り込むために用いられる細胞機構および成長しつつある目的のペプチド鎖を破壊する。 ファージおよび細菌のディスプレイは、両方とも、生存について必須であるタンパク質を合成し、ペプチドライブラリーを合成し、そしてその目的のペプチドを有するファージまたは細菌のプールを増殖または増幅させる、細菌細胞のタンパク質合成機構に依存する。 技術的に厄介なプロトコルは、ペプチド配列にアミノ酸アナログを取り込むために頻繁に用いられるインビトロ翻訳方法を試みる場合に時間の浪費であり得る。 ファージまたは細菌のプールを増幅する方法は、目的のペプチドの発現を必要とする。 細菌細胞に対して毒性であり、そしてそれゆえ致死的であるペプチドは、ファージまたは細菌のディスプレイ系においてスクリーニングされ得ない。 このことは、そうでなければ目的であったであろう可能性のある大きなペプチドセグメントを除去する。 ファージおよび細菌のディスプレイはまた、細胞増殖および細胞の生存について最適な条件を維持するために、厄介かつ時間を浪費する技術に依存する。 細菌細胞は、比較的大きく、そして標的と相互作用するペプチドについてスクリーニングする間注意しなければならない。 アフィニティークロマトグラフィーは、結合ペプチドから非結合ペプチドを分離するために一般に用いられる方法であり、そしてカラムにおける細胞の詰まりおよび非特異的な保持を防止するために注意しなければならない。 候補ペプチドをディスプレイするファージは、概して、増殖または増幅され、従ってそのファージのパッケージングタンパク質および目的のペプチドを合成するために細菌の細胞の転写、翻訳および複製の機構の使用を必要とする。 細菌細胞に感染させること、ファージを採集すること、およびいくつかの回数再感染させることは、非常に時間がかかることである。 細菌細胞ディスプレイ系はまた、プラスミドによってコードされるペプチドの世代ごとの安全な継代および続いての再スクリーニングを保証するために最適な増殖条件を必要とする。 オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発を利用して、選択されたペプチドがさらに特徴付けられてきた。 一般に、オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発を用いて、非常に特異的な変異が目的の遺伝子に導入される。 その遺伝子に導入されるべき特定の変異の選択は、他の相同タンパク質の活性または機能における変異の効果を記載する公開された報告に通常基づくが、変異または置換の効果を予測することは依然として困難である。 インビボでペプチドライブラリーの自然変異頻度を増大させることがしばしば有利である。 細菌表面にディスプレイされたペプチドの集団の多様性を増大させることは、特定の効果を伴うペプチドを同定するための非常に有用な道具であることが示されてきた。 自然変異は、ペプチドライブラリーに対する進化的圧力を維持し、そしてユニークな配列のスクリーニングを最大化する。 細菌(例えば、E.coli)の遺伝学を使用する、DNA配列のクローニングおよび増幅の複雑でない性質に従順なディスプレイシステムが、ライブラリー内のペプチドの変動性およびサイズを増大させるために、所望される。 オリゴヌクレオチド配列へのアミノ酸アナログをインビボで取り込んで、その結果、その遺伝的特性および生化学的特性を変更することを可能にする、新規なペプチドライブラリーを系内に作製する必要がある。 ファージまたは細菌のディスプレイシステムにおいて、他の方法で、それらの毒性によって除去され得るペプチドを生成する必要がある。 インビボでオリゴヌクレオチドを操作し、そして細胞生存力のための最適な成長条件を確実にするための要件を軽減する必要もある。 従って、本発明の目的は、変更された機能活性および結合活性を有する新規なペプチド基質の系統的な調製のための効率的かつ迅速な方法を提供し、当該分野で現在実施されているファージディスプレイ法および細菌ディスプレイ法に固有の欠点を解決することである。 (発明の要旨) プラスミドまたは発現ベクターをコードしたオリゴヌクレオチド融合産物または遺伝子融合産物は、好ましくは、「ディスプレイミニ細胞」と称されるものを形成するミニ細胞外膜に局在化される。 簡潔にいうと、この方法は、最初にライブラリーを構築する工程からなり、ここで、このライブラリーは、遺伝子融合体に作動可能に連結した誘導性転写調節因子を含む複製可能な発現ベクターからなり、ここで、この遺伝子融合体は、以下: この第1の遺伝子の3'末端は、第2の遺伝子またはオリゴヌクレオチドの5'末端に連結され、それによってキメラ遺伝子を形成する。 このキメラ遺伝子は、キメラタンパク質をコードする。 第1の遺伝子と第2の遺伝子との間の連結は、リンカー分子またはオリゴヌクレオチドを介して、直接的であっても間接的であってもよい。 第2の遺伝子またはオリゴヌクレオチドは、変性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、当該分野で周知の方法、または他の増幅方法によって構築されたランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーから得られる。 特定の実施形態において、この第1の遺伝子が、302アミノ酸長より大きいタンパク質をコードする大きなオリゴヌクレオチドの融合に従順な外膜タンパク質またはその一部をコードすることが所望される。 Rickettsia rickettsiiの17K抗原が、好ましい。 1実施形態において、融合タンパク質の発現は、誘導性DNA調節エレメント、例えば、lacプロモーター、tacプロモーター(lacリプレッサーによって調節されるハイブリッドtrp−lacプロモーター)、trpプロモーター、またはlacUV5プロモーターによって調節される。 他の適切な細菌プロモーターも同様に使用され得る。 誘導性プロモーターを使用することによって、オリゴヌクレオチド融合体は、インデューサーの添加まで、静止したままである。 これによって、遺伝子産物の産生のタイミングの制御が可能となる。 この方法は、第2の遺伝子内の1つ以上の選択された位置において発現ベクターを変異する工程をさらに包含し、それによって、第2の遺伝子によってコードされた関連基質ペプチドのファミリーを形成する。 次いで、適切な宿主ミニ細胞株は、発現ベクターDNA調製物で形質転換される。 この方法はまた、獲得されたプラスミドDNAの複製の誘発およびミニ細胞における対応するペプチドの制御された発現を提供する。 必要に応じて、この方法は、変異誘発遺伝子表現型を示す適切な宿主ミニ細胞株を形質転換すること、および獲得されたプラスミドDNAを複製するためのミニ細胞の後の誘導からなる。 この方法は、細菌ミニ細胞株を示す変異誘発遺伝子表現型を生成する工程をさらに含む。 DNA修復に重要な遺伝子内の変異体は、代表的に、変異誘発遺伝子表現型を有する。 例えば、DNAのメチル指向ミスマッチ修復に重要な遺伝子内の変異体(mutS、mutL、およびmutHと称される)は、その自然変異頻度を約1000倍増加させる。 親細菌細胞へのこれらの変異体の1つ、2つ、または全ての3つの取り込みは、無核ミニ細胞集団内のペプチドディスプレイライブラリーのインビボ多様化を生じる。 ミニ細胞は、それらの外側表面上でペプチドのライブラリーを発現するために後に誘発される。 次いで、この前選択された標的分子は、ディスプレイミニ細胞と接触され、このペプチドライブラリーは、当該分野で十分に確立された方法によって結合活性についてスクリーンされる。 前選択された標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖、核酸、金属、または非タンパク質有機分子(例えば、薬物、ビタミンもしくは補助因子)、神経媒介物質(neuromediator)、細胞レセプターもしくは細胞レセプター複合体、ステロイド、前選択された分子もしくはそのアナログに対する天然アクセプター結合部位を模倣するペプチド、またはレセプター複合体の個々のタンパク質であり得る。 別の実施形態において、機能的スクリーニングアッセイは、例えば、目的のペプチドと関連した阻害プロセス、刺激プロセス、または応答プロセスに関する生化学活性を確立するために組み込まれる。 標的分子に結合するこれらのミニ細胞は、結合しないミニ細胞から分離される。 必要に応じて、ミニ細胞上にディスプレイされたペプチドは、ディスプレイライブラリーの発現の前、間、または後に、放射性同位体、ローダミン、またはFITCのような分子または化合物で標識され得る。 これは、目的の結合ペプチドの後の同定を容易にするのに役立つ。 例えば、標的分子に有用な抗体は、相互作用する複合体を免疫沈降するために使用され得る。 目的のペプチドが放射標識される場合、この複合体は、オートラジオグラフィー、当該分野で十分に確立された方法によって、容易に識別され、視覚化され得る。 必要に応じて、このミニ細胞は、インビボで合成されるペプチド内に取り込まれるように、アミノ酸アナログで外因的に補充され得る。 未結合メンバーから分離された結合ミニ細胞ライブラリーメンバーは、ここで、富化したライブラリーを表す。 この富化したライブラリーのオリゴヌクレオチドを含む発現ベクターは、標的に対する融合タンパク質の変更された特異性についてスクリーニングするために、再び、単離され得、変異誘発され得、そしてディスプレイされ得る。 あるいは、この富化したライブラリーは、再び、よりストリンジェントな条件下で、結合能力について試験され得、結合するライブラリーは、結合しないライブラリーから分離され、そしてこのライブラリーはさらに富化される。 この方法は、標的分子に結合したミニ細胞または結合しなかったミニ細胞のいずれかについても一回以上繰り返され得る。 この結合したミニ細胞は、標的分子および情報を抽出するために単離されたペプチドコード発現ベクターから容易に溶離され得る。 次いで、ペプチドのDNA配列、DNA塩基組成、分子量、および/または任意の第2の構造体がこの配列内に存在するかどうかが、決定され得る。 必要に応じて、この方法は、ディスプレイタンパク質から目的のペプチドを遊離する工程であって、後のアミノ酸分析のために、このディスプレイタンパク質にペプチドが遺伝学的に融合される、工程を包含する。 ペプチドライブラリーのアミノ酸分析は、当該分野で周知の方法によって、自動化分析器によって実施される。 当業者はまた、ペプチドの、アミノ酸組成、アミノ酸配列、等電点、および分子量を決定し得る。 次いで、これらのペプチドは、所望の活性についてさらにスクリーニングされ得る。 さらに合理的な操作はまた、特異的なアミノ酸を欠失し、付加し、または置換するために、あるいは、診断学的スクリーニングアッセイにおける使用のためにペプチドを標識するために、または固定化するために、実施され得る。 (発明の詳細な説明) (A)Min変異) 細菌のミニ細胞株の重要な要素としては、ミニ細胞の表現型を付与する遺伝子中の変異が挙げられる。 この変異は、好ましくは、遺伝的にクリーンなゲノムバックグラウンドにある(所望の表現型を付与するこれらの変異のみが、それ以外には野生型のバックグラウンド中に存在する)。 (B)変異因子の変異) ペプチドライブラリーは、min遺伝子(例えば、minC)の1つにおける変異を利用、および変異遺伝子をmutS細胞株に形質導入することによって、インビボでさらに多様化され得る。 新しく作製された細胞株(MsMc)は、mutSおよびminC遺伝子の両方における変異を収容する。 塩化カルシウム形質転換またはエレクトロポレーションのような技術を用いて、オリゴヌクレオチドを収容するプラスミドは、新しい細胞株中に導入され得る。 形質転換された細胞株は、細胞外でヌクレオチドを添加することによって、プラスミドDNAを複製するように誘導され得、そしてこうする際に、ミニ細胞の複製機構は、コピーまたは複製される1000塩基あたり約1塩基対の割合でミス塩基対のヌクレオチドを組み込みまたは置換する。 それ故、5×10 8個の細菌が、生成ごとに10 5個の新しい配列を生成する。 次いで、プラスミドは、さらなるディスプレイのために非変異ミニ細胞株に移動され得る。 (C)アミノ酸アナログ組み込み) (II.プラスミド構築) (III.ペプチド融合構築) ミニ細胞の表面上にディスプレイされる融合(キメラ)タンパク質は、一般にプラスミド発現ベクター中にクローン化され、ここで、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子が、発現される。 (A)第一遺伝子) 好ましいペプチドは、R. rickettsiiの17K抗原オープンリーディングフレーム(ORF)の最初の71アミノ酸(213ヌクレオチド)からなり、シグナル配列ならびに脂質改変部位を含む。 この213塩基対のオリゴヌクレオチド(配列番号6)は、この最初の213ヌクレオチドの重複領域に対応する異なる領域のプライマーをアニーリングすることによってアセンブリされて、DNAのコンカテマーを形成し得る。 続いて、このコンカテマーの一本鎖部分は、当該分野で公知の精製酵素によって二本鎖へと変換される。 次いで、得られる二本鎖DNAは、適切なプラスミド発現ベクターへとクローニングされて、誘導性調節プロモーターエレメントに対する遺伝融合物を作製し得る。 このようなプロセスを用いて、ミニ細胞の外膜に局在するペプチドをコードする任意の核酸配列をクローニングし得る。 膜タンパク質コード配列(例えば、17K抗原ORFの最初の71アミノ酸をコードする213ヌクレオチドフラグメント)は好ましくは、プロモーターの下流で、かつ目的のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド(第二遺伝子)の上流に配置される。 ミニ細胞の発現機構によって認識される任意の終結配列を用いて、転写を終結させ得る。 細菌DNA配列(およびプラスミドDNA配列)は、2つの基本的型の転写終結(因子独立性および因子依存性(RNAポリメラーゼが、終結するためにまさにその配列以外を必要とするか否かに基づく))のうちの一方に依存することが当該分野で周知である。 このような終結部位は、開示される構築物に適用可能である。 (B)標的化されるべきペプチド(第二遺伝子)) プライマー配列は、特定のシリーズのヌクレオチドまたはそれらの等価なIUBコードから作製され得る(例えば、R{A、G}、W{A、T}、K{G、T}、M{A、C}、S{G、C}、V{A、G、C}、D{A、G、T}、H{A、C、T}、B{G、C、T}およびN{A、G、C、T})。 多くのシステムが、DDDDという入力配列が、各位置でA、GまたはTが取り込まれる可能性が等しい4塩基プライマー配列に対応するように、IUB曖昧コードを認識するようにプログラムされている。 一端構築されたら、ランダム化プライマーは、それらの配列内に、他のプライマーに対する相補性領域を含む。 相補性プライマーはアニーリングして、一本鎖ギャップがヌクレオチドおよびポリメラーゼを用いてフィルインされたヌクレオチド配列のコンカテマーを形成して、ランダム化二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。 次いで、この二本鎖オリゴヌクレオチドは、発現プラスミド中に、誘導性プロモーターおよび好ましくは17K抗原の下流にクローニングされて、キメラ遺伝子融合物を形成し得る。 あるいは、オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いてインビトロで変異誘発され得る。 オリゴヌクレオチド、プラスミド内にコードされるオリゴヌクレオチド、またはベクターもしくはプラスミド中にオリゴヌクレオチドを保有する遺伝子融合物のインビトロ変異誘発は、部位特異的またはランダムであり得る。 次いで、変異誘発されたプラスミドを用いて、発現のその後の誘導およびコードされるペプチドの結合活性についてのスクリーニングのために、ミニ細胞またはミニ細胞株を形質転換し得る。 別の好ましい実施形態では、細菌ミニ細胞株は、新たに構築されたプラスミドで形質転換される。 形質転換方法としては、例えば、ファージトランスフェクション(例えば、P1、λまたはM13)、エレクトロポレーション、および形質転換が挙げられる。 親ミニ細胞株が形質転換され、そのプラスミド上の選択マーカーによって選択され、そしてそのプラスミドを保有するミニ細胞が親株から単離されることが好ましい。 あるいは、親株から単離されたミニ細胞は、直接的に形質転換され得る。 (IV.ミニ細胞の単離およびディスプレイ誘導) (B)プラスミドDNAの複製) (C)キメラタンパク質発現の誘導) (V.スクリーニングされるべきペプチドと、標的分子または結合分子(「結合パートナー」)との間の相互作用) (VI.未結合のミニ細胞からの、結合したミニ細胞の分離) (VII.ペプチド分析) ペプチドはまた、正確なアミノ酸配列について分析され得る。 例えば、ペプチドのN末端が修飾され、切断され、そして分析され、そのためにペプチドを1アミノ酸短くする、古典的なエドマン分解方法は、アミノ酸レベルでの情報を抽出するための1つの方法である。 質量分析法は、より洗練された技術であり、そしてアミノ酸アナログを組み込んだペプチドの分析を受け入れやすい。 質量分析法は、ヘリウムガスを利用して、ペプチドをランダムに切断し、そして、生成されたフラグメントの質量についてのその後の分析を比較して、配列を明らかにする。 次に、ペプチド配列を使用して、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを決定および/または設計し得る。 (VIII.オリゴヌクレオチド(第2の遺伝子)分析) 一旦単離されると、プラスミド発現ベクターは、目的のペプチドをコードする遺伝子内の特定の変異の効果を研究するために、インビトロで変異誘発され得る。 そのような効果は、遺伝学的に、または生化学的に、以下に考察するようにアッセイされ得る。 プラスミドおよびベクターの部位特異的変異誘発およびランダムな変異誘発は、当該分野において十分に確立されている。 別の実施形態において、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドライブラリーを、ディスプレイ「シャペロン」DNAと融合するために適切なベクターを使用する。 好ましいシャペロンDNAは、Rickettsia rickettsiiの17K抗原をコードする。 (IX.活性についてのペプチドのスクリーニング) 実施例9において実証されるように、細胞表面において見出され、そして腫瘍転移に必要なレセプターに結合するいくつかの(第2の遺伝子)ペプチドが、このシステムを使用して同定された。 これらの可能性のある転移ブロッキングペプチドを、生化学的にアッセイされ得る、レセプターに対する特定の応答を生じることについて、さらに評価した。 ペプチドとの相互作用の前後において、レセプターによって保持される放射性同位元素標識したリン酸塩の量をアッセイすることによって、ペプチドが、インビトロにおいて、レセプターの自己リン酸化に対して影響することが、示された。 このことは、分子生物学の分野の標準的な技術を用いることによって示され得る。 細胞表面レセプターのリン酸化に影響することによって、単離されたペプチドは、これらレセプターが制御する細胞プロセスの活性に、直接的に影響し得る。 インビトロにおいて単離されたペプチドの翻訳後修飾またはペプチド修飾を可能にする方法が、当該分野において十分に確立されている。 そのような改変としては、アシル化、メチル化、リン酸化、硫酸化、プレニル化、グリコシル化、カルボキシル化、ユビキチン化、アミド化、酸化、ヒドロキシル化、アミノ酸側鎖へのセレノ基の付加(例えば、セレノシステイン)、および蛍光標識が挙げられるが、これらに限定されない。 さらに、インビトロでの分析を用いて、細胞の生存に対するペプチドの影響について研究し得る。 生体の細胞プロセスを中断、刺激、または減少するいずれかのペプチドを使用して、培養中の細胞(例えば、腫瘍細胞)に影響を与え得る。 一旦影響を与えて、細胞増殖および生存を、当該分野において公知の方法によって分析する。 多くの細胞は、自己破壊の遺伝子によって媒介された形態であるプログラムされた細胞死を受け得る。 この現象を、当該分野において一般にアポトーシスという。 頻繁に、アポトーシス細胞は、その生化学的、形態学的、および分子的特徴における変化によって認識され得る。 形態学的変化としては、細胞形状の変化、細胞の萎縮、細胞の剥離、アポトーシス体、核の断片化、核包膜変化および細胞表面構造の喪失が挙げられるが、これらに限定されない。 生化学的変化としては、タンパク質分解、タンパク質の架橋、DNA変性、細胞の脱水、ヌクレオソーム内の切断、および遊離カルシウムイオンの上昇が挙げられ得る。 そのような特徴は、当該分野において十分に確立された方法によって容易に同定され得る。 開示されたミニ細胞ディスプレイ法によって単離されたペプチドを、そのような生理学的プロセスおよび生化学的プロセスに対するそれらの影響について、試験する。 細胞がもはや生存しない場合(すなわち、細胞が死滅する場合)、その膜は透過性となり、そして膜が透過性となることは、光の散乱の変化としてそれ自体が明らかとなる。 この光の散乱は、細胞の細胞質の屈折率の変化に起因し得る。 透過性となった膜を通過し得るDNA染色色素の使用は、死滅細胞、生存細胞、およびアポトーシス細胞の同定を補助する。 フローサイトメトリーおよび/または蛍光細胞分析分離装置(FACS分析)を、目的の細胞を分離するために蛍光色素を使用するプロトコルに組み込み得る。 フローサイトメトリーは、サンプルから目的の粒子を、仕分けするか、または物理的に分離し得る。 従って、FACS分析(フローサイトメトリーの1つのタイプ)は、目的の細胞または粒子の、不均一な集団からの物理的な分離として規定され得る。 当業者は、死滅細胞、生存細胞、およびアポトーシス細胞を区別し得る。 なぜなら、これら各々は、例えば、DNA色素に対するその透過性が異なるからである。 2つの広範に使用されるDNA色素(Hoechst33342およびヨウ化プロピジウム(propidium)(PI))は、死滅した細胞に浸透し得る。 生存細胞は、いずれの色素も保持しないが、アポトーシス細胞は、Hoechstを保持するが、PIを保持しない。 蛍光顕微鏡観察によって、視覚的に生存細胞およびアポトーシスを受ける細胞から死滅細胞を視覚的に分離し得る。 これら異なる細胞からの蛍光発光はまた、フローサイトメトリーおよび/またはFACS分析を介して、その分離を可能にする。 これらのアッセイにおいて使用される代表的な着色剤としては、ヨウ化プロピジウム、Hoechst33342、7AADおよびTO−PRO−3が挙げられる。 アポトーシスの間の膜変化の段階も、同様に分析し得る。 これらの変化は、アポトーシスの初期段階から中間段階の間の、ホスファチジルセリン(PS)の細胞膜内側部分から外側への転位を含む。 FITCを用いて、標識したアネキシンVを使用して、PSを検出し得る。 アネキシンVは、Ca ++依存性リン脂質結合タンパク質である。 また、死滅細胞は、アネキシンVに結合しない。 生存細胞はまた、アネキシンに結合しない。 アポトーシス細胞は、アネキシンに結合する。 PSを分析するこの方法を、PIを用いてDNAを染色する上記方法と組み合わせて、それによって生存細胞、死滅細胞、および/またはアポトーシス細胞の異なるプロファイルを得ることができる。 上で言及したように、アポトーシスの特徴は、DNAの分解である。 この分解は、通常、エンドヌクレアーゼに依存性の活性化Ca/Mgによって行われる。 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)は、ビオチン化した、BrdUまたはジゴキシゲニン標識化ヌクレオチドの、DNA鎖切断に付加する。 続いて、ビオチンによって外因的に添加されたストレプトアジピン、または蛍光色素標識化抗ジゴキシゲニン抗体の結合を使用して、DNA分解を検出し得る。 この方法により、アポトーシスを細胞周期状態と相関することができる。 取り込まれ得る別のDNA結合色素は、レーザ色素スチリル−751(LDS−751)である。 さらに、生存細胞または死細胞の染色パターンとは異なる染色パターンを提示する、アポトーシス細胞の能力を利用し得る。 レーザ捕捉顕微解剖(LCM)は、種々の組織由来の純粋な細胞を獲得するために使用される、比較的新しい技術である。 単離された組織を使用して、ペプチドを内在化させたかまたはペプチドを外面レセプターに結合した細胞に対して、そのペプチドが有し得る効果を同定し得る。 移動フィルムを特定の組織切片の表面に塗布した後、続いて、パルス化したレーザビームを作動させ得る。 このレーザビームは、目的の細胞のすぐ周辺のフィルムを活性化させる(形態学的変化は、容易に同定され、細胞は、これに基づいて選択され得る)。 このフィルムは、内在する細胞を、融解して融合する。 次いで、このフィルムは取り除かれ得、そしてフィルム内に含まれない残存する細胞が後に残る。 一旦、細胞が単離されると、次いで、この細胞由来のDNA、RNAまたはタンパク質が精製され得る。 LCMを介する細胞の単離は、その細胞に損傷を与えない。 なぜなら、レーザエネルギーが、フィルムによって吸収されるからである。 この特定の技術は、前で言及した、蛍光分子を使用する、タンパク質の任意の検出方法と組み合わせて、有用であり得る。 動物モデルを使用するインビボ分析を使用して、インタクトな系内でのペプチドの効果を決定する。 例えば、免疫学の分野において、ペプチドは、動物に投与され得、その末梢血単球は、そのペプチドに対する抗体の産生において使用される。 ウイルスタンパク質の場合において(例えば、ウイルスベクター、治療ウイルス、およびウイルスカプシド送達組成物とともに使用するために)、保持されるべき所望の特徴としては、ウイルス粒子またはカプシド内で構築する能力、および細胞を感染させるかまたは細胞に侵入する能力が挙げられ得る。 このような特徴は、ウイルスタンパク質の送達特性が目的である場合に有用である。 開示される方法の1つの適用は、ペプチドの同定および開発、ならびにその後の遺伝子置換療法および/または遺伝子増強療法における使用のための、これらのペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの同定および開発である。 例えば、腫瘍の転移性伝播に関与するレセプターを特異的に標識する抗腫瘍ペプチドを同定する。 標的と相互作用するペプチドは、ミニ細胞技術を使用して、首尾良く単離および同定されている。 浸潤複合体は、細胞活性において顕著な役割(例えば、アクチンの調節、および標的細胞内でのマイクロフィラメントの再配置、従って、偽足形成において重要な役割を果たすこと、ならびにDNA合成およびDNA複製を停止すること)を果たすことが示されている。 次いで、DNA複製の阻害は、アポトーシスに対して直接影響する。 浸潤複合体はまた、正常細胞増殖および異常細胞増殖(例えば、癌細胞転移および癌細胞複製)も調節する。 細胞漸増および細胞運動の、走化性、移動および他の様式もまた、浸潤複合体との細胞性相互作用によって調節される。 例えば、卵の受精は、このような相互作用によって阻害または増強され得る。 本明細書中に記載される方法および材料を使用して、当業者は、浸潤複合体が標的として、正常にかまたは異常に結合するタンパク質を使用して、この複合体を単離し得る。 例えば、MCP−1、RAMF(ヒアルロン酸に対するレセプター)、グリコサミノグリカン(GAG)、およびオステオポンチン(CD44スプライス改変体を単離するため)を使用して、複合体全部または複合体の一部を単離し得る。 この単離された複合体を使用して、本明細書中に記載されるミニ細胞ライブラリー技術を用いて、活性化のインヒビターについてスクリーニングし得る。 あるいは、浸潤複合体活性に結合し、かつこの複合体活性を阻害するかまたは増強するペプチドが、開示のミニ細胞ディスプレイ技術を使用して、同定され得る。 本発明はさらに、以下の非限定的な実施例および添付の図面によって、以下に記載される。 (実施例1:ミニ細胞ディスプレイのための、17K抗原融合プラスミドの構築) プライマーを、10mM Tris(pH8.5)中に、100nmol/μlの濃度まで溶解し、次いで、各10μlを混合し、80℃まで5分間加熱し、25℃まで冷却し(下降時間;1時間)、そして25℃にて1時間インキュベートした。 アニールしたオリゴヌクレオチドを、クレノウで満たし、そして制限消化の前に、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製した。 得られた2本鎖DNAを、XbaI/BamHIで切断し、pZHA1.3のXbaI/BamHI内で、14℃にて一晩ライゲーションして、pZHA2.0を形成した。 プライマー1の太字の小文字は、Xba1の認識部位を表わす。 プライマー4の太字の小文字の塩基は、BamHI認識部位を表わす。 太字の大文字の塩基は、アニーリングの際に二本鎖配列を生成するのに使用される相補的な塩基を表わす。 プライマー1は、プライマー2のみに相補的な塩基を含む。 プライマー2は、プライマー1およびプライマー3に相補的な塩基を含む。 プライマー3は、プライマー2およびプライマー4に相補的な塩基を含む。 プライマー4は、プライマー3のみに相補的な塩基を含む。 (実施例2:ライブラリーの構築) 1mMの各プライマーを、5mM MgCl 2 、0.5mM dNTPおよび5UのTacポリメラーゼを含有する、100μlの10mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)において、個別にインキュベートした。 反応物を、80℃まで5分間加熱し、25℃まで冷却し(下降時間;1時間)、そして40℃にて15分間インキュベートした。 この手順を、5サイクル行った。 5日目のサイクルの後、10μlの各反応ミックスを、以下のように、他の反応からの10μlのサンプルと2つ1組にして混合した。 各反応物の全容量を、5mM MgCl 2 、0.5mM dNTPおよび5Uのtacポリメラーゼを含有する、Tris緩衝液(pH8.0)を用いて100μlに調節し、上記のようにサイクルした。 5日目のサイクルの後、新たな5μlの100mM dNTPミックスを、各チューブに加え、連鎖反応を、さらに10サイクル続けた。 42本全てのチューブ(最初の6つのプライマーおよび36の対ごとのチューブ)からの反応混合物を混合し(以下の表を参照のこと)、そして相補性領域のアニーリングから生成した二本鎖オリゴヌクレオチドを、上記のように精製した。 次いで、この精製した二本鎖オリゴヌクレオチドを、10μgのpZHA2.0(予めSmaIで消化し、そしてdTTPおよびターミナルトランスフェラーゼで末端を付着され(5'T突出部を作製され)ている)と共に、13℃で一晩インキュベートし、そして連結した。 ミニ細胞E. coli株DS410を、得られたプラスミドpDIP1.0の5μgで形質転換した。 この形質転換した細菌を、200μg/mlのアンピシリンを含む10mlのLBブロス中で一晩インキュベートした。 この培養物は、ディスプレイライブラリーを提示した。 (実施例3:ミニ細胞の精製および標識) (実施例4:ミニ細胞の標識および発現の誘導) (実施例5:生物活性ペプチドについてのライブラリーのスクリーニング) a. 標的レセプターを免疫沈降させる b. このレセプターを免疫プレートに固定する c. このプレートを、新たに単離したミニ細胞と共にインキュベートする d. 結合していないミニ細胞を洗浄除去する e. ミニ細胞をこのプレートから溶出し、そして2回目のスクリーニングのために、単離したプラスミドを、新たなミニ細胞株DS410に形質転換する。 次いで、選択された「陽性」クローンを、二次ライブラリーに構築する。 三次ライブラリーを、3回目のスクリーニングから構築し得、そして選択されるペプチドを、機能的スクリーニングアッセイにおいて使用して、特定の活性のペプチドをさらに単離し得る。 (実施例6:単離されたディスプレイペプチドのアミノ酸分析) (表1 ディスプレイライブラリーのアミノ酸分析) 3を含むPBS)を用いる回数。 ペレットを、約50μl(または1回より多い分析が、単一のサンプルについて行われる場合、それ以上)のFACS緩衝液での最終洗浄から懸濁する。 約50μlの細胞懸濁物を、10μlの抗体溶液に添加し、そして穏やかに懸濁する。 使用に適切な抗体濃度を、この工程の前に決定する。 この懸濁物を約30分間にわたって氷上に置く。 次いで、細胞をFACS緩衝液で2〜3回洗浄し、そして200〜300μlのFACS緩衝液中に懸濁する。 細胞を、(約1:100の細胞:ミニ細胞(minicell)の比で)FITC標識ミニ細胞(PBS中、2O.D./mlで)と共に、室温で15分間インキュベートする(生/死の識別のために、約10μlのヨウ化プロピジウム(PI)溶液(ストック溶液、10μg/ml)を添加する)。 細胞が固定されている場合、PIは添加しなかった。 これらの細胞は、FACS緩衝液で2〜3回洗浄し、そして200〜300μlのFACS緩衝液中に懸濁されると、分析の用意ができる。 これらの細胞は、測定の時点で生きていても固定されていてもよいが、単分散(単一細胞)懸濁物中にある。 これらの細胞は、懸濁物の微細な流れを連続的に流すことによって、レーザビームを介して一列縦隊で通過する。 各細胞は、いくらかのレーザ光を散乱し、そしてまた、レーザによって励起された蛍光を放射する。 サイトメーターは、代表的に、各細胞について、いくつかのパラメータ(細胞の直径にほぼ比例する散乱強度についての低い角度、細胞内の顆粒構造の量にほぼ比例する直角(90度)の散乱強度、およびいくつかの波長での蛍光強度)を同時に測定する。 光の散乱自体は、非常に有用である。 これは、蛍光データから、死細胞、細胞凝集および細胞細片を除外するために一般に使用される。 これは、血液白血球サンプル中の顆粒球由来の単球から、リンパ球を識別するのに十分である。 蛍光強度は、代表的に、各細胞について、いくつかの異なる波長で同時に測定される。 蛍光プローブは、細胞の特定の成分の量を報告するために使用される。 蛍光抗体は、しばしば、特定の表面レセプターの密度を報告するために使用され、従って、導入遺伝子を発現する細胞を含む分化した細胞型の亜集団を識別するために使用される。 これらを蛍光にすることによって、表面レセプターに対するディスプレイライブラリーの結合が、測定され得る。 細胞内成分(総DNA/細胞(細胞周期の分析を可能にする)、分析、新たに合成されたDNA、DNAまたはmRNA中の特定のヌクレオチド配列、線維状アクチンおよびそれに対する抗体が入手可能である任意の構造を含む)がまた、蛍光プローブによって報告され得る。 フローサイトメトリーがまた、細胞内遊離カルシウム、膜電位、pHまたは遊離脂肪酸における迅速な変化をモニタリングし得る。 フローサイトメーターは、フルイディクス、レーザオプティックス、電子検出器、アナログ/デジタル変換器およびコンピューターを含む。 このオプティックスは、ビームに集束されたレーザ光を、数細胞直径だけ送達する。 このフルイディクスは、細胞ストリームを水力学的に、ある不確実性の細胞直径の小さな画分に、そしてこの中に集束し、そして選別器中で、トラムを破壊して、均一なサイズの液滴にして、個々の細胞を分離する。 このエレクトロニクスは、散乱した蛍光のかすかな閃光を定量し、そしてコンピューター制御下で、目的の細胞を含む液滴を電気的に荷電し、その結果、この細胞は、分離試験管または培養ウェルの方に歪められ得る。 このコンピューターは、1サンプルあたりの細胞数(千)のデータを記録し、そしてこのデータを図解的に表示する。 (実施例8:幹細胞に結合するペプチドについてのスクリーンディスプレイライブラリー) この時点で、細胞の大きなロゼットは、DYNABEAD TMインキュベーションの後に、目で見えるはずである。 この混合物を、HBSSで5mlにし、そして製造者の仕様書に従って、マグネット上に配置する。 結合したビーズを洗浄し、スピンし、そして上清を新しいチューブに移し、そして再びスピンする。 抗ラットIgG PEを添加し、氷上で20〜30分間インキュベートし、そして2回洗浄する。 ラットIgGのブロック溶液(約50μl)を添加し、そして氷上で、約15分間インキュベートする。 Thy1.1、c−KitおよびSca−1の染色カクテルを使用して、混合物を再懸濁し(マウス1匹あたり約100μlを使用し、滴定により決定される抗体希釈物を使用する)、そして4℃で30分間インキュベートする。 死んだ細胞および死にかけの細胞を、染色培地中のヨウ化プロピジウム(1μg/mlのPI)で標識する。 この手順は、一般に、2〜5×10 5の結合ペプチドを生じる(平均5000幹細胞/マウス)。 (実施例9:生体活性ペプチドおよびミニ細胞ディスプレイおよび活性アッセイから誘導される機能) 本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」および「the」は、その文脈が明らかにそうでないことを明記しない限り、複数の言及を含むことに注意すべきである。 従って、例えば、「宿主細胞(a host cell)」との言及は、複数のこのような宿主細胞を含み、「抗体(the antibody)」との言及は、1つ以上の抗体および当業者に公知のこれらの等価物を含み、以下同様である。 他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、開示される本発明が属する当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。 本明細書中で記載される材料および方法と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、デバイスおよび材料は、記載される通りである。 本明細書中のいずれの記載も、本発明が従来の発明によるこのような開示に先行する権利を与えられていないという承認として解釈されるべきではない。 当業者は、慣用的な実験のみを使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得る。 このような等価物は、上記の特許請求の範囲に包含されることが意図される。 |