Hormone variant

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は１９８８年１０月２８日の米国特許出願番号第０７／２６4,６１１号の継続出願である。
本発明はポリペプチド中の活性ドメインおよびアミノ酸残基の同定法に関する。 また本発明はホルモン変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ポリペプチドすなわちペプチドおよびたん白質には各々特異的アミノ酸配列、構造および機能を有する広範囲の生物学的分子が含まれる。 ほとんどのポリペプチドは特異的基質と相互作用しそのポリペプチドの機能を遂行する。 したがってズブチリシン、アミラーゼ、組織ブラスミノーゲン活性化因子との酵素は特異的基質と相互作用を起こし、その特定の切断部位で加水分解を起こす一方、ヒト成長ホルモン、インシュリンなどのたん白質性ホルモンは特異的レセプターと相互作用を起こし成長や代謝を調節する。 別にポリペプチドと免疫原性レセプターなど該ポリペプチドの主要標的ではない物質との相互作用もある。 多くのポリペプチドは別個の生物学的効果を産む別々のリガンドまたはレセプターと相互作用する別個の領域を含む点で多機能的である。 たとえばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は成人において糖代謝および脂質代謝に関係し、子供においては長骨の成長を誘導する。
【０００３】
アミノ酸配列を修正による天然のポリペプチドの機能の改善について努力がはらわれてきている。 １つの方法はポリペプチドのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することである。 インビトロ突然変異誘発やクローン化遺伝子の発現によるたん白質工学が種々のたん白質の熱的または酸化的安定性の改善に応用された例が報告されている。 ビラフランカ（Villafranca), JE 等、（１９８３）Science ２２２ 、７８２−７８８；ペリー（Perry), LJ 等（１９８４）Science ２２６ 、５５５−５５７；エステル（Estell) 、DA 等（１９８５）J. Biel.Chem. ２６０ 、６５１８−６５２１；ロゼンバーグ（Rosenberg), S.等（１９８５）Nature（ロンドン） ３１２ 、７７−８０；コートニー（Ceurtney), M. 等 （１９８５）Nature（ロンドン）、 ３１３ 、１４９−１５７。 さらにこのような方法を応用して基質特異性を変化させた酵素を生成させたことも報告されている。 エステル（Estell), DA等（１９８６） Science ２２３ 、６５５−６６３；クレイク（Craik), CS 等（１９８５年）Science, ２２８ 、２９１−２９７；ファースト（Farsht), AR等（１９８５）Nature（ロンドン） ３１４ 、２３５−２３８；ウィンサー（Winther), JR(１９８５）Carisberg Res. Commun. ５０ 、２７３−２８４；ウェルス（Wells), JA 等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ８４ 、１２１９−１２２３。 修正すべきアミノ酸の決定は主にポリペプチドの結晶構造、ポリペプチドの機能に関する化学的修正の効果および、またはポリペプチドの作用モードを確認するための種々の基質とポリペプチドとの相互作用に基づいて行なわれる。 ある場合には、たとえば異なる基質特異性を有するズブチリシン類の基質結合領域におけるアミノ酸配列の差異など関連ポリペプチドの特異的アミノ酸残基に基づいてアミノ酸置換を誘導する場合もある。 ウェルス（Wells), JA 等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４ 、５７６７。 別の場合、分子の既知活性領域のアミノ酸配列を第２の分子の既知活性領域のアミノ酸配列となるよう修正することも報告されている。 ワートン(Wharton) RP 等（１９８５）Nature ３１６、６０１−６０５、およびワートン(Wharton) RP 等（１９８４）Cell ３８ 、３６１−３６９（ファージレセプターの認識ヘリックスの別のレセプター認識ヘリックスによる置換）；ジョーンズ（Jones), PT 等（１９８６） Nature ３２１ 、５２２−５２５（ヒトミエローマたん白質の可変領域のマウス抗体の相当領域による置換）。 この方法は置換により変化する性質に関しいくらかの予想を提供し得るが特定の性質を決定する全ての領域および残基の評価を保証する方法ではない。 せいぜい置換残基の分子接触力に関するエネルギーの実験的見積りが行なわれるぐらいである。 特異的な修正残基に対する水素結合（ファースト（Farsht), AR 等（１９８５）Nature ３１４ 、２３５；ブランアン（Bryan), P. 等（１９８６）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ ８３ 、３７４３；ウェルス（Wells), JA 等（１９８６）Philos. Trans. R. Soc. London A. ３１７ 、４１５）、静電相互用（ウェルス（Wells), JA 等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４ 、１２１９；クロニン（Cronin), CN, 等（１９８７）J. Am. Chem. Soc. １０９ 、２２２２）および疎水的および立体的効果（エステル（Estell), DA等（１９８６） Science ２３３ 、６５９；チェン（Chen), JT等（１９８７）Biochomistry ２６ 、４０９３）の強さが見積られた。 これらの報告および別の報告（ラスコウスキー(Laskowski), M. 等（１９８７）Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol. ５２ 、５４５：ウェルス（Wells), JA 等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４ 、５１６７；ジーンズ（Jones), PT 等（１９８６）Nature ３２１ 、５２２；ワートン(Wharton) RP 等（１９８５）Nature ３１６ 、６０１）は既知の接触残基の突然変異誘発は結合に大きな効果を引き起こすが一方非接触残基の突然変異誘発は比較的小さい効果しかないと結論づけた。
【０００４】
アミノ酸配列と機能との関係を理解するための第２の方法には、関連遺伝子間のインビボ相同的組換を利用したハイブリッドポリペプチドをコードするハイブリッドＤＮＡ配列の生成によるものである。 このようなハイブリッドポリペプチドは大腸菌およびサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium) 由来のｔｒｐＢおよびｔｒｐＡ（シュナイダー（Schneider), WP 等（１９８１）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ７８ 、２１６９−２１７３）；アルファ１およびアルファ２白血球インターフェロン（ウェバー（Weber), H.およびワンズマン（Weissmann), C. (１９８３）Nuc. Acids Res. １１ 、５６６１）；大腸菌Ｋ−１２の外膜ポアたん白質ｏｍｐＣおよびｐｈｏＥ（トマセン(thommassen), J.等（１９８５）ＥＭＢＯ ４ 、１５８３−１５８７）；およびパチルスステアロサーモフィラス（Bacillusstearothermophilus) およびバチルスリテニホルミス（Bacilluslichiniformis)由来の好熱性アルファーアミラーゼ（グレー（Gray), GL等（１９８６）J. Bacteriol. １６６ 、６３５−６４３）の相同的組換えにより得られると報告されている。 このような方法はハイブリッドアルファアミラーゼについて報告されているようにアミノ酸配列や機能の他に有用なハイブリッドポリペプチドに関する有用な情報を提供し得るが所定のポリペプチドを系統的に研究し標的物質の１つに活性を示すポリペプチド中の詳細な領域やアミノ酸残基を測定するのにこれらの方法を利用するのは難かしい。 このことはそのハイブリッドのＤＮＡおよびアミノ酸配列を規定する交叉組換えの部位が基本的に目的遺伝子のＤＮＡ配列および宿主細胞の組換えメカニズムに依存することからくる。 これらの方法は遺伝子の５′または３′末端付近で交叉が起こる偶然的環境以外１つのポリペプチドをコードするＤＮＡの比較的小さいセグメントの別の遺伝子由来の相当するセグメントによる所定のかつ方法論的に必然的な置換を提供することはない。
【０００５】
たん白質性ホルモンとそれらのレセプターとの相互作用をいくつかの方法で研究した報告がなされている。 １つの方法ではホルモンペプチドフラグメントを用いホルモン上のレセプター結合部位の位置を決定した。 別の方法では中和モノクローナル抗体とペプチドフラグメント間の競争を利用しエピトープマッピングによりレセプター結合部位の位置を決定した。 これらの方法の例にはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）について報告された研究がある。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は正常なヒトの成長および発達における多くの調節に関与している。 この２２０００ダルトンの脳下垂体ホルモンは線型成長（体発達）、泌乳、マクロファージの活性化、他のインシュリン様および糖尿病誘発効果を含む多くの生物学的効果を示す。 チョウラ（Chawla), RK（１９８３）Ann. Rev. Med. ３４ 、５１９；エドワーズ（Edwards), CK 等（１９８８）Science ２３９ 、７６９；ソーナー（Thorner), MO 等（１９８８）J. Clin.Invest. ８１ 、７４５参照。 子供の成長ホルモン欠乏症は小人症を引き起こすがこれは十年以上前からｈＧＨの投与によりうまく治療し得るようになっている。 またｈＧＨの遺伝的および翻訳後修正型を区別し臨床的に投与されたときのｈＧＨに対する免疫学的応答を調べたり、またこのホルモンの循環レベルを定量したりするためにｈＧＨの抗原性にも興味が持たれる（ルイス（Lewis), UJ （１９８４）Ann. Rcv. Physiol. ４６ 、３３）。
【０００６】
ｈＧＨは胎盤ラクトゲン、プロラクチンおよび他の成長ホルモンの遺伝子および種的変異体を含む相同的ホルモン群の一員である。 ニコル（Nichol), CS等（１９８６）Endocrine Reviews ７ 、１６９。 ｈＧＨは広い種特異性を示し、かつ単量体的に各クローン化ソマトジェニック（ラング（Leung), DW, 等（１９８７）Nature ３３０ 、５３７）またはプロラクチンレセプター（ボーチン（Boutin), JW等（１９８８）Cell ５３ 、６９）に結合する点でこれらの群の中で異常である。 ｈＧＨのクローン化遺伝子は大腸菌中分泌型として発現され（チャン（Chang. CN等（１９８７）Gene ５５ 、１８９）、かつそのＤＮＡおよびアミノ酸配列も報告されている（ゴーデル(Goeddel) 等（１９７９）Nature ２８１ 、５４４；グレー（Gray) 等（１９８５）Gene ３９ 、２４７）。ｈＧＨの三次元的構造はまた分っていない。しかし、ブタの成長ホルモンの三次元折りたたみパターンは中位の分解能と精度で報告されている（アブデル−メグッド（Abdel-Meguid), SS 等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ８４ 、６４３４）。
ｈＧＨ由来のペプチドフラグメントがｈＧＨのレセプター接合部位の位置決定に使用された。 り（Li), CH（１９８２）Mol. Cell. Biochem. ４６ 、３１；ミルス（Mills), JB,等（１９８０）Endocrinology 、 １０７ 、３９１。 他の報告ではウシ成長ホルモンのたん白質分解後、残基９６〜１３３のフラグメントが単離された。 ヤマサキン（Yamasakin)等（１９７０）Biochemistry ９ 、１１０７。 しかし残基１−１３３を含むより大きいフラグメントを組換え法で作ったときは検出可能な結合活性は観測されなかった。 クリビ（Krivi), GG 等 International Symposium on Growth Hormono : Basic and Clinical Aspects 、アブストラクトＩ−１８、最終プログラム、セロノシンポジア（Serono Symposia)提供、ＵＳＡ、１９８７年６月１４−１８日。 明らかにこれらの結果は矛盾しており、かつ、たん白質性ホルモン、特にその結合部位が２つ以上の不連続なエピトープおよび、または構造依存エピトープからなるものに関するレセプター結合部位の位置決めにペプチドフラグメントを使用するのは信頼性に欠けることを示している。
エピトープマッピングによるレセプター結合部位の位置決定に中和モノクローナル抗体を使用することは同様の制限がある。 たとえばモノクローナル抗体をレセプター結合検定中ｈＧＨの残基９８−１２８からなるペプチドに対しｈＧＨレセプターと競合するのに使用した報告がある。 たとえｈＧＨホルモンのペプチド９８−１２８のみが中和モノクローナル抗体と結合しても、この領域がこれらの競争実験に基づくレセプター結合部位を含むことが提唱された。 レテジン（Retegin), LA,等（１９８２）Endocrinology １１１ 、６６８。
【０００７】
ｈＧＨホルモンの抗原部位を同定する試みに同様な方法が使用されてきた。 報告による競合結合によるｈＧＨに対する異なる２４個のモノクローナル抗体のエピトープマッピングでは該ホルモン上の抗原部位はわずか４種に分類された。 スロウィー（Surowy), TK等（１９８４）Mol. Immunol. ２１、３４５；アストン（Aston), R.等（１９８５）Pharmac. Ther. ２７ 、４０３。 しかしこの戦術は該ホルモンのアミノ酸配列上のエピトープの位置は決められなかった。
抗体部位を限定する別の方法には目的たん白質上の短かい線状ペプチドに対する抗体の結合テストがある。 ゲイセン（Geysen), HM等（１９８４）Proc. Natl. Acad. Scl. ＵＳＡ ８１ 、３９９８；ゲイセン（Geyson), HM（１９８５）Immunol. Today ６ 、３６４。 しかしこの方法はレセプター結合部位の位置を決めるには線状ペプチドフラグメントを用いるのと同じ制限を受ける。 有用となるためにはこの線状配列はそれを認識するのにこの抗体の抗原中にみられる構造が保持されていなければならない。 さらにＸ線結晶学から明らかになった抗体エピトープの部位に基づき（シェリフ（Scheriff), S. 等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ ８４ 、８０７５；アミット（Amit), AG, 等（１９８６）Science ２３３ 、７４７）事実上全ての抗体結合部位は部分的に不連続であり（バーロー（Barlow), DJ等（１９８６）Nature ３２２ 、７４７）かつ結果として線状フラグメントはこれらの構造をうまく真似ることができないことが推定されてきた。 またｈＧＨのペプチドフラグメントはこれらのフラグメントの非共有結合的結合により研究されてきた。 数人の研究者はヒト成長ホルモンの天然のアミノ酸配列または化学修飾ペプチドを含む比較的長いフラグメントを結合させた分析を報告している。 バースタイン（Burstein), S. 等（１９７９）J.of Endo. Met. ４８ 、９６４（アミノ末端フラグメントｈＧＨ−１−１３４）とカルボキシル末端フラグメントｈＧＨ−（１４１−１９１）の組合せ））；リ（Li), CH等（１９８２）Mol, Cell. Biochem. ４６ 、３１，ミリス（Mills), JB,等（１９８０）Endocrinology １０７ 、３９１（ｈＧＨのズブチリシン切断二本鎖型）。 同様に、化学修飾フラグメントｈＧＨ−（１−１３４）およびヒト絨毛性ソマトマモトロピン（胎盤ラクトゲンとも呼ばれる）由来の化学修飾カルボキシ末端フラグメント（ｈＣＳ−（１４１−１９１））も化学修飾フラグメントｈＣＳ−（１−１３３）およびｈＧＨ−（１４１−１９１）同様非共有的に結合させた。 米国特許第4,189,426 。 これらの研究者は肝臓成長ホルモンレセプターへの結合決定基が成長ホルモンの最初の１３４個のアミノ末端残基であると誤って報告した（バースタイン（Burstein),等（１９７８）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ ７５ 、５３９１−５３９４）。 明らかにこれらの方法は間違った結果を導く。 さらに２個の大きいフラグメントを使用することによりこの方法では潜在的に特定の相互作用に実際に関与する特異的残基または領域を同定することなしにこれらの組合せで使用される２個のフラグメントのどちらかにその機能を割振ることが可能である。 ｈＧＨに関する上述の方法および実験のレビューが報告されている。 ニコル（Nichol), CS等（１９８６）Endocrine Rev. ７ 、１６９−２０３。
【０００８】
ｈＧＨの“欠失ペプチド”（ｈＧＨ−３２−４６）由来の７残基ペプチドフラグメントを他の哺乳類の成長ホルモンの類似セグメント由来のアミノ酸残基を含むよう修正した別の方法が報告されている。 しかしそのような置換の効果はあったとしても報告されてはいない。 米国特許第4,699,897 参考。 それにもかかわらず短かいペプチドフラグメントを使用する短所は、それらのフラグメントの線型配列が本来の成長ホルモンにみられる構造をインビトロでもインビボでも認識されるよう取り込れなければならないことから明白である。
多くの天然のｈＧＨ変異体が同定されている。 この中には、ｈＧＨ−Ｖ（シーバーグ（Seeberg), PH （１９８２）ＤＮＡ １ 、２３９；米国特許第4,446,235 号、4,670,393 号および4,665,180 号）およびｈＧＨの残基３２−４６の欠失を含む２０Ｋ ｈＧＨ（コスチオ（Kostyo), JL等（１９８７）Biochemica et Biophysica Acta ９２５ 、３１４；ルイス（Lewis), UJ,等（１９７８）J. Biol. Chem. ２５３ 、２６７９）が含まれる。
ある研究者は、ｈＧＨ中部位１６５のシステインをアラニンに置換した通常Ｃｙｓ−５３とＣｙｓ−１６５の間で生成するジスルフィド結合の破壊を報告した。 トクナガ（Tokunaga), T.,等（１９８５）Eur. J. Biochem. １５３ 、４４５。 この単一置換は明らかにｈＧＨの三次構造を維持し、かつｈＧＨのレセプターにより認識される変異体を生じた。
他の研究者は固体樹脂サポート上でのｈＧＨのインビトロ合成を報告した。 この研究者の第１の報告はｈＧＨの正しくない１８８個のアミノ酸配列を公表した。 リ（Li), CH等（１９６６）J. Am. Chem. Soc． ８８ 、２０５０；および米国特許第3,853,832 号。 第２の報告は１９０個のアミノ酸配列を公表した。 米国特許第3,853,833 号、、この後者の配列も正しくないものである。 特にｈＧＨの配列は部位６８の後にグルタミンが入っており、部位７３はグルタミンではなくグルタミン酸、部位１０６はアスパラギンではなくアスパラギン酸、部位１０８はアスパラギン酸ではなくアスパラギンである。
【０００９】
先に示したものに加え特定のモノクローナル抗体への結合が変化したハイブリッドインターフェロンも報告されている。 キャンブル（Camble), R. 等、“ペプチド；構造と機能”合成遺伝子から生成したインターフェロン−α２類似物の性質、Proceedings of the Ninth American Peptide Symposium 、（１９８５）デバー（Deber)等編、ピアスケミカル社、シカゴ、III., ３７５−３８４。 該文献に公表されているようにα−１インターフェロンのアミノ酸残基１０１−１１４またはγ−インターフェロンの残基９８−１１４がα−２インターフェロンへと置換されている。 α−２インターフェロンはＮＫ−２モノクローナル抗体を結合するがα−１インターフェロンは結合しない。 α−２インターフェロン中のこの特定の領域はα−１およびα−２インターフェロン間の２７個のアミノ酸の相異中の７個がこの領域中に存在することから選択された。 報告されているようにこのようにして得たハイブリッドはＮＫ−２モノクローナル抗体との活性が実質的に減少している。 抗ウイルス活性をテストしてみるとこれらのハイブリッドは野生型のα−２インターフェロンの活性と同程度の抗ウイルス活性を示した。 この領域内のより小さいセクションの置換も報告された。 また３〜７個のアラニン残基クラスターの連続的置換も報告された。 しかし、唯１つの類似体〔Ala −３０、３２、３３〕ＩＦＮ−α２が公表されている。
ニワトリ卵白リゾチームの小ペプチドフラグメント内のアラニン置換および２Ａｌｌまたは３Ａ９細胞の刺激に関するこれらの置換の効果も報告されている。 アレン（Allen), PM 等（１９８７）Nature ３２７ 、７１３−７１５。
抗原結合ループを含む二次構造ユニットの全ユニット（ジョーンズ（Jones), PT 等（１９８６）Nature ３２１ 、５２２−５２５）またはＤＮＡ認識ヘリックス（ワートン（Wharton), RP 等（１９８５）Nature ３１６ 、６０１−６０５）の置換による結合性の操作に関する別の報告もある。
上述の文献は単に本出願の登録期日前の公表のため提供したものであり先の発明または以前に登録された出願に基づく優先権によりこれらの公開期日が早いことから本発明の権利を失うという告白として解釈されるものはなにもない。
【００１０】
上述の参考文献により示される状況があるならば構造と機能との関係を明らかにするためポリペプチドの有効な系統的分析法が必要なことは明白である。 したがってここでの目的はポリペプチドの機能活性に寄与するポリペプチド内の活性ドメインの同定法を提供することである。
さらに本目的は機能活性を決定する活性アミノ酸の測定法を提供することである。
さらに本発明の目的はポリペプチド内の生物学的活性ドメインを系統的に同定する方法を提供することである。
さらに本目的は本来のホルモンとは異なる望ましい生物学的、生化学的および免疫原的性質を有するホルモン変異体を提供することである。
さらに本目的は１つの生物学的機能については減少した活性を有しかつ第２の標的物質については実質的または増加した活性を有するホルモン変異体を提供することである。
さらに本目的はｈＧＨに対するソマトジェニックレセプターに関する変化した結合活性および、または生物学的活性を有し、かつ有効性を増したｈＧＨ変異体を提供することである。
さらに本目的は１つ以上の望ましい生物学的性質は保持しているが糖尿病誘発活性は減少しているｈＧＨ変異体を提供することである。
さらに本目的はｈＧＨのソマトジェニックレセプターに関する結合活性を増加したｈＰＲＬおよびｈＰＬを提供することである。
さらに本目的はｈＧＨ変異体を含むポリペプチド変異体のクローニングおよび発現に使用するＤＮＡ配列、ベクターおよび該ベクターを含む発現宿主を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
１つの特徴として本発明は第１の標的物質に関するポリペプチドの活性に影響する未知の活性ドメインを同定することによるポリペプチドの構造と機能の系統的分析法を提供する。 これらの未知活性ドメインは該ポリペプチドの一次アミノ酸配列中に少なくとも２個の不連続アミノ酸セグメントを含む。 活性ドメインは該ポリペプチド（親ポリペプチドと呼ぶ）の選択されたアミノ酸セグメントを該ポリペプチドの類似体に由来する類似アミノ酸セグメントと置換することにより決定される。 この類似体は標的物質に関し親ペプチドと異なる活性を有している。 このようにして生成した各セグメント置換ポリペプチドの標的物質に関する活性を検定する。 これらの活性を親ポリペプチドの活性と比較する。 この構造的に類似するアミノ酸セグメントは標的物質に関し異なる相互作用を起こす類似体に由来することからこのような活性の比較は親ポリペプチド中の活性ドメインの位置の指標を提供する。
さらに本方法は親ポリペプチドの活性ドメイン中の活性アミノ酸の同定も含んでいる。 本方法は親ポリペプチドの活性ドメイン内のアミノ酸残基１個の各アミノ酸への置換、および該残基置換ポリペプチドの標的物質に関する検定を含んでいる。 各残基置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドの活性と比較する。 活性アミノ酸残基が同定されるまで活性ドメイン中の種々のアミノ酸についてこれらのステップを繰り返す。
本発明の別の特徴として、種々の標的物質に関し種々の活性ドメインおよび活性アミノ酸残基を同定する方法が提供される。 これらの方法には第２の標的に関し上述の方法の反復が含まれる。
【００１２】
上述の方法に従がい１つ以上の標的物質に関し親ポリペプチドと比較して異なる活性を有するポリペプチド変異体を同定する。 これらの変異体は標的物質に関し親ポリペプチドの活性を決定する活性ドメインまたは活性ドメイン中の活性アミノ酸残基の同定に基づき作られる。
さらに本発明は少なくとも３つの部分からなる成長ホルモン、プロラクチンおよび胎盤ラクトゲン変異体を含む。 第１部分は親ホルモンのアミノ酸の少なくとも１部に対応し、第３部分は同親ホルモンの少なくとも１部に対応し、かつ第２部分は親ホルモンの類似体のアミノ酸配列に対応する。 第２部分はポリペプチド変異体の第１および第３部分の間には含まれない親ホルモンのアミノ酸残基の類似体である。
また本発明にはｈＧＨのセグメント置換および残基置換変異体を含む特定のヒト成長ホルモン、ヒトプロラクチンおよびヒト胎盤ラクトゲン変異体を含む。
【００１３】
【発明の実施の形態】
１つの態様において本発明の方法は親ポリペプチドと標的物質との相互作用に関するポリペプチド中の１つ以上の活性ドメインを決定するための、ヒト成長ホルモンまたはヒトプロラクチンなどの親ポリペプチドの系統的分析を提供する。 本発明の方法を採用するにあたり目的とする標的物質に異なる活性を示す該ポリペプチドに対する１つ以上の類似体がなければならない。
したがって本明細書で用いられているように“親ポリペプチド：とは親ポリペプチドとは異なる標的物質への活性を示す“類似体”が存在するポリペプチドを意味する。このようなポリペプチド、類似体および標的物質の例を第１表に示す。
【表１】
第 １ 表

【００１４】

もちろん第１表の親ポリペプチド、類似体および標的物質は単に例である。 また親ポリペプチドにはたとえばスクシニルコエンザイムＡシンセターゼ、ミトコンドリアＡＴＰａｓｅ、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ、グルタミンシンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびアスパラテートトランスカルバモラーゼなどの１つ以上のサブユニットを含むたん白質性物質が含まれる（ハング（Huang)等（１９８２）Ann. Rcv. Biochem.

５１ 、９３５−９７１参照）。 このような多重サブユニット親ポリペプチドの場合、活性ドメインは親ポリペプチドの２つ以上のサブユニットにまがっている。 したがって後により詳細に述べる方法は特定のポリペプチドの各サブユニットを探り、部分的には１つのサブユニット上に含まれかつ部分的には１つ以上の他のサブユニット上に含まれる特定の標的物質に対する活性ドメインおよび活性アミノ酸を確定するのに用い得る。

一般的に親ポリペプチドおよび類似体は機能に関する１つのポリペプチド群に属する。 さらに通常このような親ポリペプチドおよび類似体はあるアミノ酸配列、すなわち保存残基を持つ。 これらの配列ホモロジーは９０％以上のこともあるが約１５％〜２０％と低いこともある。

一次配列ホモロジーに加え、親ポリペプチドの類似体はポリペプチドおよびその類似体の三次元的枠組みでも限定される。 したがって類似体はアミノ酸配列において親ポリペプチドからの多様性を示す場合もその分子の三次構造の全て、または一部の比較に基づき親ポリペプチドと構造的にホロモジーをもつこともある。 チョシア（Chothia), C.等（１９８６）Embo. J.

５ 、８２３。

【００１５】

一般に三次構造類似体は、その類似体の三次元構造が親ポリペプチドの構造と一緒であることが知られている場合同一と見なし得る。 α−炭素軸の二乗平均分析（ＲＭＳ）を行うことにより（たとえばサクリフ（Sutcliffe), MJ 等（１９８７）Protein Engineering

１ 、３７７−３８４）、もしあるとすれば三次元類似性をもつ領域の重なりが同定される。 テスト類似体配列の好ましくは６０％以上に関し、もしα−炭素軸が親ポリペプチドのα−炭素軸と重っているかまたは約２Å〜約3.５ÅＲＭＳの内にある場合、そのテスト類似体は親ポリペプチドと三次元的に類似している。 もちろんこのことは２つの配列の間に存在する挿入または欠失を除外する。

上述の親ポリペプチドおよび類似体は天然の分子の公開であるにもかかわらず、親ポリペプチドおよび類似体にはインビトロ組換え法で導入される配列中に天然の変異を含む変異体が含まれると理解すべきである。 このように親ポリペプチドまたは類似体として用いる変異体はその親ポリペプチドまたは類似体において１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入および、または欠失を含む変異体を含む。 このような変異体は本発明の方法を実行し活性ドメインおよび、または活性アミノ酸の同定または本発明のポリペプチド変異体の調製に使用し得る。 したがってｈＧＨの天然の変異体またはＣＹＳ−１６５のＡｌａ置換を含む組換え変異体はそれらが標的に対して活性をもつ限り親ポリペプチドまたは類似体として使用し得る。 このような天然および組換え変異体には他の親ポリペプチド中の特異的残基と等価の異なるアミノ酸残基が含まれ得る。 これらの異なるアミノ酸はそれらの残基が一次配列または三次構造により構造的に類似している、またはそれらが機能的に等価であるならば等価であると云える。

さらに、多くの親ポリペプチドおよび類似体はその役割を交換し得ることは明白である。 したがって非ヒト成長ホルモンおよびそれらの関連類似体群はそれぞれ親ポリペプチドとして使用できかつ同等にその活性ドメインを探ることができる。 さらに、ＨＩＶウイルスに対するＣＤ−４レセプターなどの標的物質もＣＤ−４レセプター類似体に関する親ポリペプチドとしてＨＩＶ結合に寄与する活性ドメインおよび活性アミノ酸の同定やＣＤ−４変異体の調製に使用される。

【００１６】

本明細書で使用しているように、“標的”とは親ポリペプチドと相互作用する物質である。 標的物質にはたん白質性ホルモン、酵素基質、たん白質性レセプターに対するホルモン、たん白質性結合たん白質に対する一般的リガンドおよびポリペプチドに接触し得る免疫系などが含まれる。 ホルモンレセプターの例にはｈＧＨに対するソマトジェニックおよびラクトジェニックレセプターおよびｈＰＲＬに対するレセプターが含まれる。 他の標的物質には抗体、プロテアーゼのインヒビター、たん白質性レセプターに結合するホルモンおよび組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）に結合するフィブリンが含まれる。

一般に標的物質は親ポリペプチド上の“活性ドメイン”と接触することにより親ポリペプチドと相互作用を起こす。 一般にこのような活性ドメインは該ポリペプチドの表面上に存在するか、もしくは三次元構造の変化によりそのポリペプチドの表面に導き出される。 ポリペプチドの表面とは、生理的条件下、すなわちインビボまたはインビトロで発現した時と同様の条件下に存在する本来の構造について規定される。 そのアミノ酸セグメントおよびアミノ酸残基はいくつかの方法で確認される。 もしその三次元結晶構造が十分な分解能で分っているなら、そのポリペプチドの表面にあるアミノ酸残基は“表面接近可能”なアミノ酸残基である。 これら表面接近可能残基にはその三次元構造の表面上に“転がる”理論上の水分子と接触する残基である。

ポリペプチドの表面上の活性ドメインはそのポリペプチドの一次アミノ酸配列の単一のセグメントに含まれる。 しかしながら多くの場合天然型のポリペプチドの活性ドメインは親ポリペプチドの一次アミノ酸配列中の２つ以上のアミノ酸セグメントから構成される。 たとえばヒト成長ホルモンのソマトジェニックレセプターへの活性ドメインを図５に示す。 示されているように活性ドメインのドメインＡ，ＣおよびＦは各々ｈＧＨ分子の不連続なアミノ酸セグメント上に存在する。 これらのアミノ酸セグメントは図４中Ａ，Ｃ，Ｆという文字で示されている。 活性ドメインを構成する不連続なアミノ酸セグメントは活性ドメインおよび標的物質の間の相互作用に有意に関係しない多くのアミノ酸残基により分離されている。 一般に不連続アミノ酸セグメント間の間隔は少なくともアミノ酸５残基分である。

【００１７】

本発明の方法は親ポリペプチドのアミノ酸配列中の未知活性ドメインの検出を目的としている。 標的物質に関するポリペプチドの三次元結晶構造が入手できる場合、たとえばインヒビターまたは転移状態類似体に関する酵素の結晶構造が入手できる場合は除いて多くのポリペプチドのほとんどの活性ドメインは未知のままである。

本明細書で使用している“類似ポリペプチドセグメント”または“類似セグメント”とは親ポリペプチド中の対応する配列と置換して“セグメント置換ポリペプチド”とするアミノ酸配列を意味する。 一般的に類似セグメントは親ポリペプチドにおいて１つ以上の異なるアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を起こすが親ポリペプチド中で置換する選択されたセグメント中の他の残基の相対的アミノ酸配列は維持される配列を有している。 一般に類似セグメントは親ポリペプチドと類似体の全アミノ酸配列を両配列間の配列同一性が最大となるよう整列させることにより同定される。 この配列整列に基づく類似セグメントは親ポリペプチドの対応する配列への置換用に選択される。 同様に三次構造ホモロジーを示す類似体由来の類似セグメントは構造ホモロジーを示すこれらの領域から誘導し得る。 このような類似セグメントは親ポリペプチド中の対応する配列と置換される。 さらにたとえば構造低類似領域の隣接領域などの三次構造相同体の他の領域も類似セグメントとして用いられる。

もし可能ならば類似セグメントを選択してセグメント置換ポリペプチド中への不安定化アミノ酸残基の導入は避けるべきである。 このような置換にはかさ高側鎖や疎水コア領域中へ親水性側鎖を導入するものが含まれる。

【００１８】

一般的に親ポリペプチドおよび類似体のアミノ酸配列は知られており、またある場合にはその３次元結晶構造も入手可能である。 １つ以上の類似体と親ポリペプチドのアミノ酸配列の整列化により少なくとも予備分析で変化を受けていない配列中の保存されているアミノ酸残基を容易に見つけることができる。 また配列整列化は１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含む配列変化領域も明らかにする。 このような変化を含む領域により親ポリペプチド中のどのセグメントが類似セグメントと置換したかが決定される。 それゆえ類似体の類似セグメントの置換はアミノ酸残基の置換だけでなく、アミノ酸残基の挿入および、または欠失も起こし得る。

もし３次元構造の情報が入手可能な場合は類似セグメントと置換すべきではない親ポリペプチド中の領域を同定することが可能となる。 たとえば親ポリペプチド中の両親媒性ヘリックスの疎水性表面において過密領域が同定された場合は類似セグメントと置換すべきではない。 そのように同定された残基はポリペプチド変異体中に保持されるべきでかつ表面残基のみが類似残基と置換されるべきである。

一般に類似セグメントは長さがアミノ酸３〜３０残基、好ましくは約３〜１５残基、もっとも好ましく約１０〜１５残基である。 ある場合、類似セグメントの好ましい長さは相同または親ポリペプチドと比べて類似セグメントの１つ以上のアミノ酸残基の挿入および、または欠失のため変化もある。 もし親ポリペプチドの３次元構造が入手できないときは一般に全部ではないにしろ親ポリペプチドのほとんどをカバーする類似セグメントに関するセグメント置換ポリペプチドを作る必要がある。 しかし全アミノ酸配列のセグメント置換は必ずしも必要ではない。 たとえば全アミノ酸配列の１部のみをカバーする偶然セグメント置換は特定標的物質に対する活性ドメインを同定するのに十分な情報を提供する。 しかしほとんどの場合アミノ酸配列の約１５％以上が活性ドメイン同定のためセグメント置換を受けることが必要である。 一般に約５０％、好ましくは約６０％、より好ましくは約７５％、もっとも好ましくは１００％のアミノ酸配列が構造情報がない場合にセグメント置換される。

【００１９】

ここで使用している“類似性アミノ酸残基”または“類似残基”とは親ポリペプチドの対応セグメント中の対応アミノ酸残基とは異なる類似セグメント中のアミノ酸残基を意味する。 したがってもし類似セグメントの置換が１つのアミノ酸置換を起こすならそのアミノ酸残基は類似残基である。 １度親ポリペプチドおよび１つ以上の類似体が同定されたならば１つ以上の類似体由来の類似セグメントを親ポリペプチド中の選択されたセグメントと置換し多くのセグメント置換ポリペプチドを作る。 このような置換は組換えＤＮＡ技術を用い簡単に行なわれる。 一般に親ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は簡便な宿主で発現されるようにクローン化およびその他の処理が行なわれる。 親ポリペプチドコードＤＮＡは親ポリペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡから誘導されるか、または化学合成的にＤＮＡ配列を構築することによるゲノムライブラリーから入手し得る（マニアチス（Meniatis), T. 等（１９８２）Molecular Cloning 、コールドスプリングハーバーラボラトリー NY )。

それからこの親ＤＮＡを適当なプラスミドまたはベクターに挿入し宿主細胞のトランスホームに使用される。 ＤＮＡ配列のクローニングおよび発現により親ポリペプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポリペプチドおよびポリペプチド変異体を作るのには原核生物が好ましい。 たとえば、大腸菌ｋ１２２９４株（ＡＴＣＣ No.３１４４６）、大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣNo. ３１５３７）および大腸菌ｃ６００株およびｃ６００ｈｆｌ株、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ

^- ，γ

^- , 独立栄養型、ＡＴＣＣ No.２７３２５）、枯草菌などのバチルス類およびサルモネラティムリウム（Salmonella typhimurlum) またはセラチアマルセサンス（Serratia marcesans) などその他の腸内細菌および種々のシュードモナス種が用いられる。 好ましい原核生物は大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。 原核生物中で発現したとき一般にポリペプチドはＮ−末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含みかつグリコシル化されていない。 もちろんこれらの例は制限することでなく説明を意図したものである。

【００２０】

原核生物に加え、イースト培養物や多細胞生物由来の細胞などの眞核生物も使用される。 原則としてこのような細胞の培養物も使用可能である。 しかし脊椎細胞が最も興味深く、培養中（組織培養）の脊椎細胞の増殖は、反復が可能である（“組織培養”アカデミックプレス版、クルーズ（Kruse)およびパターソン（Patterson)編（１９７３））。 これらの有用な宿主細胞系列の例にはＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系列がある。

一般に宿主細胞に適合する種由来の複製およびコントロール配列を含むプラスミドベクターがこれらの宿主と合せて使用される通常このベクターは複製部位およびトランスフホーム細胞に発現型選択を提供し得るたん白質をコードする配列を有している。 たとえば大腸菌は大腸菌由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２でトランスホームする（マンデル（Mandel), M. 等（１９７０）J. Mol. Biol.

５３ 、１５４）。 プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラチイクリン耐性遺伝子を含んでおり、そのため容易な選択手段を提供している。 好ましいベクターはｐＢＯ４７５である実施例１参照。 このベクターは宿主間での移動を可能にし、それにより突然変異誘発および発現を容易にするファージおよび大腸菌の複製オリジンを含んでいる。

“発現ベクター”とは適当な宿主中のＤＮＡの発現を可能にする適当なコントロール配列に機能的に結合する該ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を意味する。 これらのコントロール配列には転写を可能にするブロモーター、そのような転写をコントロールするオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の停止をコントロールする配列が含まれる。 ベクターはブラスミドでもファージ粒子でも、または単に潜在的ゲノム挿入物でもよい。 １度適当な宿主にトランスホームすればそのベクターは宿主ゲノムとは独立に複製しかつ機能するかまたはある場合にはゲノムそれ自身の中に組込まれる。 本明細書において“プラスミド”および“ベクター”はプラスミドが現在もっとも一般的に用いられているベクターであることからしばしば同義語的に使用される。 しかし、本発明は同様に機能しかつ本分野でよく知られている他の形の発現ベクターも包含する。

【００２１】

２つのＤＮＡまたはポリペプチドの関係を述べるときの“機能的に結合した”という言葉はそれらが互いに機能的に関係することを意味する。 たとえばおそらくシグナル配列の切断によりたん白質成熟型を分泌するプロセスにおいてシグナル配列として機能するなら該前配列はペプチドと機能的に結合している。 プロモーターはコード配列の転写をコントロールするならその配列と機能的に結合している。 リボゾーム結合部位は翻訳を可能とする位置にあるならそれはコード配列と機能的に結合している。

１度本ポリペプチドがクローン化されればそのクローン化親ＤＮＡについて部位特異的突然変異誘発（カーター（Carter), P. 等（１９８６）Nucl. Acids Res.

１３ 、４３３１；ゾラー（Zoller), MJ等（１９８２）Nucl. Acids Res.

１０ 、６４８７）、カセット突然変異誘発（ウェルス（Wells), JA 等（１９８５）Gene

３４ 、３１５）、制限選択突然変異誘発（ウェルス（Wells), JA 等（１９８６）Philos, Trans. R. Soc. London Ser A,

３１７ 、４１５）または他の技術をほどこし置換した類似セグメントにより規定されるアミノ酸配列の変化をコードする“セグメント置換ＤＮＡ配列が作られる。適当な発現ベクターに機能的に結合しているとき、セグメント置換ポリペプチドが得られる。ある場合、親ポリペプチドまたはセグメント修正ポリペプチドの回収は親ポリペプチドまたはセグメント修正ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能的に結合する適当なシグナル配列を用いることにより発現宿主からそれらの分子を発現かつ分泌させることで可能となる。これらの技術は当分野でよく知られている。もちろん望ましいポリペプチドのインビトロ化学合成などそれらのポリペプチドおよびセグメント置換ポリペプチドの生成に別の方法も使用し得る（バラニー（Barany), G. 等（１９７９）“ペプチド”(E. グロス(Gross) および J. メイエンホーファー（Meienhofer) 編）アカデミックプレス版、NY ２巻、３〜２５４頁）。

【００２２】

１度種々のセグメント置換ポリペプチドが生成されればそれらを標的物質に接触させ、もし、標的物質と各セグメント置換ポリペプチドとの相互作用があればそれを測定する。 同じ標的物質に関するこれらの活性を親ポリペプチドの活性と比較する。 もしその類似体が親ポリペプチドと比べその標的物質に関し異なる活性を有しているなら、それらのセグメント置換ポリペプチドは親ポリペプチド中の活性ドメインを規定する類似セグメントを含んでいると推定される。

もし１つの類似体が親ポリペプチドより大きい活性を有しているなら、複数のセグメント置換ポリペプチドがその標的物質に関し活性の増加を示す可能性がある。 このような場合、類似体の活性ドメインおよびその標的物質に関する活性を増加するように修正し得る親ポリペプチドの適当な領域を効果的に同定できる。 その標的との相互作用にかかわる類似体の領域が主に１つの連続するアミノ酸セグメント内に存在するとき、このような事象が起こりやすい。 もし類似体の“活性ドメイン”が類似体アミノ酸配列の不連続領域に含まれるなら、活性の増加はセグメント置換ポリペプチドへ、類似体からの全ての活性ドメインを同時に導入しなければならないからそのセグメント置換ポリペプチドの活性の増加は起こりそうもない。

したがって、類似体は標的物質に対し親ポリペプチドよりも小さい活性をもつことが好ましい。 このような場合、セグメント置換ポリペプチドには活性のロスがみられる。 しかし、１度親ポリペプチド中の活性ドメインが決定されたら、このポリペプチドは連続的にまたは同時にそのような活性ドメインを置換して標的物質に関して第１親ポリペプチドの活性を欠いた第２親ポリペプチドとする類似体として使用できる。

【００２３】

ポリペプチド中の活性ドメインは標的物質に関するセグメント置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドのそれと比較することにより同定される。 多くの分析測定が可能であるが標的物質の非触媒的結合についてはセグメント置換ポリペプチドと標的物質間に形成される複合体の解離定数Ｋｄを親ポリペプチドに関するＫｄと比べる方法が簡便なものの１つである。 セグメント置換により類似置換残基あたり、約1.５、好ましくは約2.０のＫｄ値の増減は、置換セグメントがその標的物質と親ポリペプチドの相互作用の活性ドメインであることを示している。 標的物質との触媒的相互作用の場合親酵素に対する活性を測定する適当なパラメーターはＫcat ／Ｋm 比を比較することである。 親酵素に対し置換類似残基当り約1.５、好ましくは2.０のＫcat ／Ｋm 値の増減は活性ドメインの置換を示す。

本明細書で使用している“スキャンニングアミノ酸”とは親ポリペプチド内の活性アミノ酸を同定するのに用いられるアミノ酸のことである。 “残基置換ポリペプチド”はスキャンニングアミノ酸に関する親ポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも単一置換を含むポリペプチド変異体である。 “残基置換ＤＮＡ配列”は残基置換ポリペプチドをコードする。 このようなＤＮＡおよびポリペプチドはセグメント置換ＤＮＡおよびポリペプチドの調製で述べた方法で調製される。

アミノ酸スキャンで同定した“活性アミノ酸残基”は一般的に標的物質と直接接触するものである。 しかし、活性アミノ酸は他の残基またはＨ

₂ Ｏのような小分子またはＮａ

⁺ ，Ｃａ

⁺² ，Ｍｇ

⁺²またはＺｎ

⁺²などのイオン種で形成される塩橋を介して間接的に標的物質に接触することもある。

ある場合には、スキャンニングアミノ酸は親ポリペプチドの活性ドメイン中に同定されるアミノ酸と置換される。 一般的に多くの残基置換ポリペプチドが調製され、その各々は活性ドメイン内の種々のアミノ酸残基の位置でスキャンニングアミノ酸の単一置換を含んでいる。 特定の標的物質に関するそのような残基置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドの活性と比較し、標的物質との相互作用に関係する活性ドメイン中のアミノ酸残基を決定する。 このような分析に用いられるスキャンニングアミノ酸は置換したものとは異なるアミノ酸、すなわちその他の１９種の天然のアミノ酸である。

【００２４】

【表２】

【００２５】

この表は各アミノ酸について以下の記号を使用している。

【００２６】

残基置換ポリペプチドの活性の効果がある場合、それを一様のスキャンニングアミノ酸残基への天然のアミノ酸残基の変化に系統的に帰着させることができるのでスキャンニングアミノ酸は各残基置換ポリペプチドと同じであることが最も望ましい。

ある場合、１つ以上の残基におけるスキャンニングアミノ酸置換は標的物質に関する活性の分析を行うのに十分な量の単離を可能にするレベルで発現しない残基置換ポリペプチドを生ずる。 このような場合種々のアミノ酸、好ましくはアイソステリックなアミノ酸が用いられる。

最も好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さい中性のアミノ酸である。 このようなアミノ酸残基にはアラニン、グリシン、セリンおよびシスティンが含まれる。 アラニンはベータ炭素からとび出た側鎖をもたず、かつ残基置換ポリペプチド主鎖構造が変化しにくいことからこのグループの中でも好ましいスキャンニングアミノ酸である。 またアラニンはもっとも一般的なアミノ酸であることからも好ましい。 さらにそれは、埋った形でも露出した形でも存在する（クレイトン（Creighton). TE,“たん白質”（WH フリーマン社版、NY ) ; チォシア（Chothla), C.（１９７６）J. Mol. Biol.

１５０ 、１）。 もしアラニン置換が適当な量の残基置換ポリペプチドを生じない場合、アイソステリックアミノ酸が使用される。 別に優先性が減る順番に以下のアミノ酸が使用される：Ｓer, ＡsnおよびＬeu 。

スキャンニングアミノ酸の使用はセグメント置換ポリペプチドの分析により確認される活性ドメイン中の活性アミノ酸の同定に限定されるわけではない。 たとえば親ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸が分っている場合か、または標的物質との相互作用に関っていると考えられる場合、その残基およびその囲りのアミノ酸残基を探るのにスキャンニングアミノ酸を使用することができる。 さらにもし親ポリペプチドが小さいペプチド、すなわち約３〜５０アミノ酸残基であるなら、全分子にわたってスキャンニングアミノ酸分析を行ないうる。

【００２７】

１度活性アミノ酸残基が同定されたならアイソステリックアミノ酸に置換される。 このアイソステリック置換は全ての場合に行う必要はないしまた活性アミノ酸が同定される前にも行なわれる。 このアイソステリックアミノ酸残基はいくつかの置換が起こし得る構造への潜在的破壊効果が最小となるように行なわれる。 アイソステリックアミノ酸を第II表に示す。

活性アミノ酸残基は標的物質に関する残基置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドと比較することにより同定し得る。 一般に、Ｋｄ値の２倍の増減は置換残基が標的物質との相互作用に活性があることを示している。 同様に標的物質との触媒的相互作用の場合、親酵素に対してＫcat ／Ｋm 値の２倍の増減は活性残基の置換を示している。

推定上の、または既知の活性アミノ酸残基をスキャンニングアミノ酸分析にかけるとき、その残基に隣接するアミノ酸残基をスキャンするべきである。 その結果３残基置換ポリペプチドができる。 １つは推定上または既知活性アミノ酸である部位Ｎにスキャンニングアミノ酸、好ましくはアラニンを含んでいる。 他の２つは部位Ｎ＋１およびＮ−１にスキャンニングアミノ酸を含んでいる。 各置換ポリペプチドが標的物質に対しＫｄまたはＫcat ／Ｋm 値に約２倍以上の効果を起こすならばそのスキャンニングアミノ酸は部位Ｎ＋２およびＮ−２で置換されている。 このことをＫｄまたはＫcat ／Ｋm 値への効果が２倍以下となる少なくとも１個、好ましくは４個の残基が両方向について同定されるまでか、または親ポリペプチドの末端に到達するまでくり返す。 このようにして、特定の標的物質との相互用に関係する連続するアミノ酸配列に沿って１つ以上のアミノ酸が同定され得る。

【００２８】

本発明の方法は特定の親ポリペプチドの１つ以上の標的物質に関する活性ドメインの検出に使用される。 さらに種々の活性ドメイン内の活性アミノ酸もこの方法により同定される。 １度２つ以上の活性ドメインおよび活性アミノ酸残基が特定のポリペプチドの種々の標的物質に関して同定されたならその親ポリペプチドに対して種々の修正を行って該ポリペプチドと１つ以上の標的物質間の相互作用を修正できる。 たとえばｈＧＨ表面上の２つの活性ドメインはソマトジェニックレセプターおよびプロラクチンレセプターについても同定された。 たの特殊な場合の活性ドメインは重複している。 したがってソマトジェニックおよびプロラクチンレセプターと相互作用する多くの共通する活性アミノ酸残基が存在する。 ｈＧＨに対する種々の修正は以後より詳しく説明する情報に基づいて行なわれる。 ある場合に種々の標的物質に関する活性ドメインは重複していない。 このような状況で１つのレセプターに関する親ポリペプチド中の活性アミノ酸の修正は種々のアミノ酸による置換で行なわれ、その結果その標的物質との活性ドメインの相互作用は減少または増加し、それらの変異体の生理作用が変化することになる。

本明細書で使用している“相互作用変化”とは１つ以上の活性ドメインが修正され標的物質とその変異体との相互作用が親ポリペプチドと比べて変化しているポリペプチド変異体について用いられる。 相互作用変化とは親ポリペプチドと特定の標的物質との相互作用に比べポリペプチド変異体の相互作用が少なくとも２倍増減することで定義される。

【００２９】

標的物質と親ポリペプチド、ポリペプチド変異体、セグメント置換ポリペプチドおよび、または残基置換ポリペプチドとの相互作用はインビトロまたはインビボの簡便なアッセイで測定し得る。 インビトロアッセイは標的物質とポリペプチド、たとえば酵素と基質、ホルモンとホルモンレセプター、抗体と抗原などの検出可能な相互作用を測定するのに用いられる。 このような検出には色変化、放射性変化、溶解度変化、ゲル電気泳動法および、またはゲル排除法による分子量変化の測定などが含まれる。 インビボアッセイには生理作用、たとえば体重変化、電解質バランスの変化、凝血時間の変化、血餅分解の変化および抗原応答の誘導などを検出するアッセイが含まれるが、以上に示したものに限定されるわけではない。 一般に標的物質と目的ポリペプチド間の相互作用変化を測定する可変パラメーターが存在するかぎインビトロアッセイが使用される。

本発明の例としてはヒト成長ホルモンのソマトジェニックレセプターに関する該ホルモンの活性を決定する該ホルモンの活性ドメインおよび活性アミノ酸を同定する態様がある。 本発明のこの態様を実施する場合、セグメント置換および残基

置換 ｈＧＨ変異体を含むヒト成長ホルモン変異体で成長ホルモンのソマトジェニックレセプターとの結合相互作用が天然のヒト成長ホルモンとは異なるものが調製または同定される。 これらのヒト成長ホルモン変異体の少なくとも１つはソマトジェニックレセプターに関しより高いアフィニティーを有し、かつラットのソマトジェネシスに対しより高い能力を有している。 他のものはソマトジェニックレセプターについて低い活性を有している。 このようなｈＧＨ変異体はｈＧＨアゴニストまたはアンタゴニストとして有用であり、かつそれらの変異体はソマトジェニックレセプターとの

実質的相互作用がないことからヒト成長ホルモンの他のレセプターを刺激するより高い能力を有している。 さらにこれらの変異体はｈＧＨ標準またはトレーサーとしてｈＧＨのイムノアッセイにおいても有用である。 たとえば抗ｈＧＨポリクローナル抗体を含むヒトおよびマウス血清との反応性が有意に低い変異体が同定されている別のものにはｈＧＨと同じソマトジェニックレセプターに対する結合アフィニティを有するが成長を刺激する能力がより高いものがある。

【００３０】

肝臓由来のソマトジェニックレセプターと相互作用するヒト成長ホルモンの活性ドメインを測定する方法を図１に示した。 この方法では、ｈＧＨのセグメントを、クローン化ｈＧＨ肝臓レセプターおよびｈＧＨに対するモノクローナル抗体に対して非常にアフィニティーの小さいことが知られているｈＧＨ類似体由来の類似配列と系統的に置換した。 このようなｈＧＨ類似体にはヒト胎盤ラクトゲン（ｐＰＬ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）およびヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）がある。 これらの類似体はソマトジェニックｈＧＨレセプター（ｈＧＨｒ）と比べクローン化ｈＧＨレセプターに対しては約１００〜１００００倍も小さい結合アフィニティーを有する（ハリントン（Harrington), AC等（１９８６）J.Clin. Invest.

７７ 、１８１７；バウマン（Baumann), G., 等（１９８６）J.Clin. Endocrinol、 Metab.

６２ 、１３７）。

相同たん白質はそれらが大きな配列多様性を有するときでさえ同様な三次元構造を有することが知られていることからこれらの類似体が使用される（チョシア（Chothia , C.等（１９８６）ＦＭＢＯ J.

５ 、８２３）。そのように行うと、類似配列置換をその分子の本来の構造を大きく破壊することなしに容易に適用できるという見込みが増す。ヒト成長ホルモンおよびその類似体ｈＰＬ、ｐＧＨおよびｈＰＲＬのアミノ酸配列を図２に示す。これらのうち最後の３個の類似体は各々８５％、６８％および２３％のレベルでｈＧＨとの配列同一性を共有する。

図１を参照すると、ヒトの成長ホルモンに対するソマトジェニックレセプター（ｈＧＨに対する“標準物質”）と相互作用するヒト成長ホルモン中の１つ以上の活性ドメインを同定する全戦術が示されている。 示されているように、ｈＧＨは標的レセプター、この場合のソマトジェニックレセプターに対し正の結合活性を有している。 しかしｈＰＲＬ、ｈＰＬおよびｐＧＨ類似体はマイナス記号で示されているにその標的物質に関し著しく活性が低い。 文字ＡからＦで示されている６個のセグメント置換成長ホルモンはｈＧＨの選択されたアミノ酸セグメントをｈＰＲＬ類似体の類似アミノ酸セグメントによる置換で生成する。 これらの選択されたセグメント各々は互いに異なり、これらを選択してｈＧＨの全アミノ酸配列または活性ドメインを含むことが期待される領域を探る。 セグメント置換ヒト成長ホルモンの調製後各ｈＧＨソマトジェニックレセプターに関する検定を行ないその活性を測定する。 ｈＧＨと比較したこれらの結果は図１のセグメント修正ヒト成長ホルモンの下の＋または−の記号で示した。 図１から分るように、この図中のセグメント置換ヒト成長ホルモンＣおよびＦはソマトジェニックレセプターと結合しない。 これらの結果に基づき、成長ホルモン変異体ＣおよびＦ中の類似体由来の類似セグメントに対応する成長ホルモン中の領域はｈＧＨのソマトジェニックレセプター結合に関する活性ドメインであると同定される。

【００３１】

示されているように、もし構造の情報または他のデータがある場合は必ずしもヒト成長ホルモンの全アミノ酸配列または他の親ポリペプチドを試験する必要はない。 したがって結晶学からの低分解能または高分解能情報は類似物から選択されるアミノ酸セグメントの不安定化置換を避けるための重要な情報を提供し得る。 たとえばヒト成長ホルモンのＸ線座標は得られていないがｐＧＨの低分解能Ｘ線結晶構造に基づくｐＧＨ構造モデルからのヘリックス投影図は４本のヘリックスのうちの３本（ヘリックス１，３および４）は強い疎水性モーメントをもつ両親媒性であることを明らかにした。 図３参照。 アイゼンバーグ（Elsenberg), D.等（１９８４） J. Mol. Biol.

１７９ 、１２５。 ポリペプチド中の疎水性コアは非常に密に存在するので（ポンダー（Ponder), JW 等（１９８７）J. Mol. Biol.

１９３ 、７７５）、それらの埋没したアミノ酸残基の変化は一般に不安定化を招く（アルバー（Alber), T.等（１９８７）Biol. Chem.

２６ 、３７５４；レイダール−オルソン（Reidhaar - Olson), JF（１９８８）Science

２４１ 、５３）。

さらにポリペプチド群たとえばヒト成長ホルモン群の中のアミノ酸が非常によく保存されている領域は少なくとも最初に調べる必要はない。 これはそのような保存配列の破壊はその分子の構造を破壊すると考えられるからである。 さらに他のデータは親ポリペプチドのある領域は特定の標的物質との相互作用に関係しないことを示している場合がある。 たとえば突然変異誘発によるｈＧＨのＮ末端１３残基アミノ酸の欠失（アシュケナン（Ashkenazi), A.等（１９８７）Bndocrlnology)

１２１ 、４１４）および残基３２〜４６を欠失したｈＧＨの中立変異体（２０Ｋｄ変異体；ルイス（Lewis), UJ 等（１９８０）Biochem. Blophys. Res. Commun.

９２ 、５１１１）はソマトジェニックレセプターに対する結合性に大きく影響しないことが報告されている。 さらに残基１３４と１４９の間の残基の一部または全てを欠失した制限たん白質分解によるｈＧＨの２本鎖誘導体の生成もソマトジェニックレセプターに対する結合に著しい影響を示さなかった。 リ（Li), CH（１９８２）Mol. Cell. Biochem.

４６ 、３１；ミルス（Mills), JB 等（１９８０）Endocrinology

１０７ 、３９１。

【００３２】

この情報に基づき、ｈＧＨのアミノ酸配列の６個のセグメントとが多くのｈＧＨ類似体由来の対応する類似アミノ酸セグメントとの置換に選ばれた。 これらの選択されたセグメントは図２のウからＦに対応する。 これらのセグメントをジスルフィド結合、二次構造の境界（図４参照）、成長ホルモン群中に高度に保存される配列の領域、またはそのソマトジェニックレセプターへの結合に関与しないことが以前に同定された領域によって分離した。 ｈＧＨの１９１残基中の８５残基を集合的に置換した１７個のセグメント置換ｈＧＨ変異体を調製した。 図２のＡからＦに割り当てた領域および各領域内のセグメントを置換したｈＧＨ変異体を第III 表にまとめた。

【００３３】

【表３】

【００３４】

1/ 制限選択−ウェルズ（Wells), JA 等（１９８６）

Philos. Trans. R. Soc. London Ser A

317, 415.

2/ カセット突然変異誘発−ウェルズ（Wells), JA 等（１９８５）

Gene

34 , 315.

3/ 組換え突然変異誘発−グレー（Gray), GL等（１９８６）

J. Bacteriol.

166, 635.

【００３５】

一般にセグメント置換ｈＧＨ変異体はヒト成長ホルモン配列へ置換される類似セグメントにより決まる。 しかしある場合には置換類似セグメント中の類似残基のすべてがその構築物中に維持されるわけではない。 このように第III 表のｈＰＬ（１２−２５）はヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）のアミノ酸１２〜２５が親ｈＧＨのアミノ酸残基１２〜２５と置換したセグメント置換ｈＧＨ変異体のことである。 この類似セグメントを置換した効果は、図２のこの領域中のｈＧＨとｈＰＬのアミノ酸配列を比較することにより決定することができる。 ｈＰＬ（１２−２５）変異体では４個のアミノ酸置換が生じているがなんの変化も起こらない。 ｈＰＬ（１２−２５）の場合のこれらの残基は１２、１６、２０および２５である。

ｈＰＬ（１２−２５）変異体中の実際のアミノ酸置換および他のセグメント置換変異体を第III 表に示した。 各置換は数字の前後に文字を付けて表わされる。 第１の文字および数字は未修正ｈＧＨの残基番号におけるアミノ酸を示している。 最後の文字はその位置で置換したアミノ酸を示している。 したがってＮ２１ＨはｈＧＨの１２番のアスパラギンがｈＰＬ（１２−２５）変異体ではヒスチジンに置換していることを示している。

したがって導入された実際の置換のいくつかは図２における対応するセグメントで示される置換とは対応していない。 このようにｈＰＬ（１２−２５）は全ｈＰＬ（１２−２５）セグメントが置換された場合４個の置換Ｎ１２Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｌ２０ＡおよびＦ２５

Ｉを含むことになる。 しかし、実際の変異体はＲ１６およびＬ２０は維持しており、導入される置換は第III 表に示されているように４個の置換のうちの２個、すなわちＮ１２ＨおよびＦ２５

Ｉだけである。 親ｈＧＨの１つ以上の残基を維持する他のセグメント置換変異体には領域ＡおよびＥを含むものおよびセグメント置換変異体ｈＰＬ（４６−５２）およびｐＧＨ（１６７−１８１）が含まれる。

【００３６】

各々のセグメント置換ヒト成長ホルモン変異体をクローン化可溶性ｈＧＨレセプターの細胞外領域からの

(

¹²⁵

Ｉ） ｈＧＨの置換を用いたインビドロシステムで検定しそのソマトジェニックレセプターに対するセグメント置換変異体の相対的アフィニティーを定量した。 レング（Leung), DW 等（１９８７）Nature

330, ５３７。 この短縮型のソマトジェニックレセプターは同膜型レセプターと比べ若干結合アフィニティーは小さいが（Ｋｄ−0.３ nＭ）同程度の活性を示す（スペンサー（Spencer), SA 等（１９８８）J. Biol. Chem.

２６３ 、７８６２）。

実施例に詳細に述べられているように各々残基１１−１９，５４−７４および１６４−１９１を含む選択セグメントＡ，ＣおよびＦはソマトジェニックレセプターと相互作用するｈＧＨ分子の活性ドメインである。 このことはこれらの領域内のｈＧＨ類似体の類似セグメントを含むほとんどのセグメント置換ｈＧＨ変異体に関し１０倍以上も低いＫｄ値が観測されたことに基づく。 図４参照。 もちろんこのことはこれらの活性ドメイン内の各アミノ酸残基がそのソマトジェニックレセプターの結合残基であることは意味しない。 むしろそれらのドメインはそのような活性残基を見い出し得るアミノ酸配列を規定している。 さらに活性ドメインＡ，ＣおよびＦの位置が決められた。 たとえば変異体ｈＰＲＬ（１２−３３）をアミノ酸およびカルボキシ末端変異体ｈＰＲＬ（１２−１９）およびｈＰＲＬ（２２−３３）に分断した。 この実験結果はｈＧＨの活性ドメインを残基１２〜１９にしぼり込んだ。 同様に領域Ｆ（ｐＧＨ（１６７−１８１））のアミノ末端領域は結合アフィニティーの著しい低下を示した。 最も著しい効果にはたった２個の突然変異Ｅ５６ＤおよびＲ５６Ｍが導入されたｈＰＬ（５６−６４）の結合よりも３０倍も小さいものがあった。 領域Ａ，ＣおよびＦはｈＧＨの一次配列上では非常に離れているが、そのホルモンの三次構造はそれらを非常に接近させている。 図５参照。 これらの活性ドメインはヘリックス１のアミノ末端（活性ドメインＡ），Ｃｙｓ−５３からヘリックス２の開始までのループ（活性ドメインＣ）およびヘリックス４の中央領域（活性ドメインＦ）を含むバッチを形成している。

【００３７】

さらにｈＧＨに対する８個のＭａｂをセグメント置換ｈＧＨ変異体に対して検定しｈＧＨのエピトープの地図を作った。 さらにそのＭａｂはｈＧＨおよびｈＧＨ変異体を用いた競争検定に用いｈＧＨに対するｈＧＨレセプター結合を阻害する各Ｍａｂの能力を評価した。

これらの実験結果を合せるとｈＧＨへの類似セグメントの置換は分子本来の構造を著しく破壊しないという証拠および観測される活性はソマトジェニックレセプターとレセプター置換ｈＧＨ変異体との相互作用に関する直接的効果によるものであるという証拠をいくつか提供している。 まずセグメント置換変異体はそのソマトジェニックレセプターまたはＭａｂに対する結合を破壊することに関し非常に選択的である。 第２にソマトジェニックレセプターおよびＭａｂは配列同様構造も認識する。 該レセプターおよび少なくとも４個のＭａｂは該たん白質三次構造感受性の不連続エピトープを認識する。 第３に精製変異体全ての円二色スペクトルは実際に野生型ｈＧＨと同じである。 第４にｐＧＨ（１６４−１９０）を除いて全ての変異体は基本的に野生型と同量発現したインビボのたん白質分解耐性が構造完全性のスクリーニングに用いられている。 ヘクト（Hecht), MH,等（１９８４）Proc. Natl. Acad. Scl.ＵＳＡ

８１ 、５６８５；ショートル（Shortle). D.等（１９８５）Genetics

１１０ ，５３９

セグメント置換ｈＧＨ変異体の結合活性変化は必ずしもそれら変異体中の置換残基が直接ソマトジェニックレセプターと接していることを示しているとは限ぎらない。 破壊的突然変異は好ましい相互作用がなくなるだけでなく、不都合なものも誘導する。 たとえばｈＰＬ（１２−１９）セグメント置換ｈＧＨ変異体中のＮ１２Ｒ変異体はＡｓｎ１２の水素結合するアミド基を変化させるばかりでなく、Ａｒｇ置換は正に荷電したより大きい側鎖を導入する。 さらに多くの結合性接触がその類似体間に保存されるのでその結果全ての接触ではないにしろある領域をセグメント置換ｈＧＨ変異体で探ることができる。

【００３８】

図２の活性ドメインＡ，ＣおよびＦ内の特定の活性アミノ酸を同定するためこれらの活性ドメインの精密構造分析を行った。 この分析ではこれら３個の活性ドメインの残基を順番にアラニンと置換した。 ６３個の単一アラニン変異体を作り、各々の可溶性ｈＧＨレセプター（ｓｈＧＨｒ）に対する結合定数を測定した。 レング（Leung), DW 等（１９８８）J. Biol. Chem.

２６３ 、７８６２。

この分析に基づいて第IV表にリストしたアミノ酸残基はソマトジェニックレセプターとの相互作用に関して活性なｈＧＨ分子内の残基を構成している。 これは、それらの残基のアラニン置換により誘導される相対的解離定数が野生型ｈＧＨに比べ４倍以上になることに基づいている。 図７参照。

ｈＧＨ変異体を作るのに好ましいこれらの残基のアミノ酸置換を示す。

【００３９】

【表４】

【００４０】

ソマトジェニックレセプターに対しあまり活性でないその他のアミノ酸残基を第Ｖ表に示す。 一般にこれらの残基はアラニンと置換したとき相対的Ｋｄ値が２倍以下の増加を示す。

【００４１】

【表５】

【００４２】

アラニンと置換したとき相対的にＫｄ値が減少する（つまりソマトジェニックレセプターに対してはより大きいアフィニティーを示す）ｈＧＨ中のアミノ酸残基を第VI表にリストする。

【００４３】

【表６】

第 VI 表Ｐ２ Ｅ６５ Ｓ１８４

Ｔ３ Ｑ６９ Ｅ１８６

Ｌ９ Ｌ７３ Ｓ１８８

Ｈ１８ Ｒ１６７ Ｆ１９１

Ｒ６４ Ｅ１７４

【００４４】

１残基置換ｈＧＨ変異体、Ｅ１７４Ａ、は驚くべきことにソマトジェニックレセプターに対する解離定数が有意に（ほぼ５倍）に減少する。 ソマトジェニックレセプターに対する結合アフィニティを示すことに加え、この変異体はラットの体重検定においてｈＧＨと比べソマトジェニック能の増加を示した。 この置換および1.４倍以上のソマトジェニック結合の増加を示す他の特定の残基置換を第VII 表に示す。

【００４５】

【表７】

【００４６】

図７には示されていないアラニン置換を含む他の変異体を第VIII表にリストする。

【００４７】

【表８】

【００４８】

注：ＮＥ−振とうフラスコ中容易に単離し得るほど発現されなかったもの（すなわち、野生型発現レベルの約５％以下）

同定後、ｈＧＨ中のソマトジェニックレセプターに対する活性アミノ酸残基を予備分析で行ったスキャンニングアミノ酸以外の種々のアミノ酸で置換することにより分析を行う。 第IX表にその残基置換変異体を示した。

【００４９】

【表９】

【００５０】

注：ＮＥ−振とうフラスコ中容易に単離し得るレベルまで発現しなかったもの（すなわち、野生型発現レベルの約５％以下）

調製したｈＧＨ変異体に加え、第Ｘ表にはｈＧＨ中の特定のアミノ酸残基と、生物学的機能が変化した変異体を生成することが予想される置換アミノ酸を示した。

【００５１】

【表１０】

【００５２】

別の態様においてはプロラクチンレセプターに対するｈＧＨの結合エピトープを決定した。 ｈＧＨは成長ホルモンレセプターにもプロラクチン（ＰＲＬ）レセプターにも結合し得る。 本明細書に示されているようにこれらのレセプターはｈＧＨへの結合に関し互いに競争し、このことはそれらの結合部位が重複していることを示している。 スキャンニング突然変異誘発データはｈＰＲＬレセプターに対するｈＧＨのエピトープはヘリックス１の中央部（残基Ｐｈｅ２５およびＡｓｐ２６を含む）、ループ領域（Ｉｌｅ５８およびＡｒｇ６４を含む）およびヘリックス４の中央領域（残基Ｋ１６８，Ｋ１７２，Ｅ１７４およびＦ１７６を含む）にある決定基から成る。 これらの残基はｈＧＨの構造モデル地図を作ったときのバッチを形成する。 この結合バッチは本明細書で述べられ、かつＢ． Ｃ． カニンガム（cunningham) およびＪ． Ａ． ウェルズ（Wells)（１９８９）Sccince ２４４、１０８１−１０８５）により公表されたｈＧＨレセプターについて決定されたものと重複するが同一のものではない。 ｈＧＨに関するこれらのレセプター結合部位の非重複領域に突然変異を起こすことにより、ｈＧＨの選択性が各レセプターへの結合アフィニティーを損失することなく、ｈＧＨレセプター側へ２０００倍以上またはＰＲＬレセプター側へ２０倍以上シフトした。 同様に重複領域に突然変異を起こすことにより、両レセプターに対し同時に５００倍以上結合を減少させ得る。 このようなｈＧＨのレセプター選択的変異体は、線型成長または泌乳などのｈＧＨの種々の生物学的活性と特異的レセプター結合現象を結びつける有用な分子プローブとなる。

【００５３】

別の態様ではヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のレセプター結合決定基を通常の非結合類似体、ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）中に入れた。 本明細書およびカニンガム（Cunningham), BCおよびウェルズ（Wells), JA ((１９８９）Sceince

２４４ 、１０８１−１０８５）で公表されたアラニンスキャンニング突然変異誘発は、ヒト肝臓からクローン化したｈＧＨレセプターに対する結合を調節するｈＧＨ中の重要な残基を同定した。 ｈＰＲＬ由来の別の突然変異がｈＧＨに導入され、ｈＧＨレセプター結合部位内のｈＰＲＬ置換は結合能をほとんど破壊することを明らかにした。 その後ｈＰＲＬのｃＤＮＡをクローン化し大腸菌で発現させた。 それからレセプター結合に非常に重要と思われるｈＧＨからの置換を順次導入し突然変異を起こした。 部位指定突然変異誘発を７回くり返した後、その会合定数がｈＧＨレセプターの１００００倍以上に強化された８個の突然変異を含むｈＰＲＬ変異体を同定した。 このｈＰＲＬ変異体は野生型よりもわずか６倍結合が弱く一方ｈＧＨとの配列一致性はわずか２６％であった。 これらの結果はｈＧＨおよびｈＰＲＬとの構造類似性を示し、ｈＧＨレセプターエピトープの同一性を確証している。 さらに一般にこれらの実験はアゴニストまたはアンタゴニストなどの新しい性質をもつハイブリッドホルモンを設計するのに有効であることが分っている近縁でかつ機能的に多様なホルモン類からレセプター結合性を容易に借し得ることを示している。

以下に示すものは例であって本発明の範囲を制限するものではない。

【００５４】

【実施例】

実施例１

ｈＧＨ突然変異誘発および発現ベクター効率的な突然変異誘発を行うためｈＧＨコード配列を変えることなく均等に分布する１８個の単独の制限部位をもつ合成ｈＧＨ遺伝子を作った。 この合成ｈＧＨ ＤＮＡ配列を各々およそ６０塩基対長で隣接するカセットと１０bp重複する７個の合成ＤＮＡカセットをライゲーションすることにより組立てＮｓｉＩからＢｇｌ II でしめされる４０５bpのＤＮＡフラグメントを作った。 この連続フラグメントをポリアクリルアミドゲルで精製し、これから溶出してアルカリホスファターゼプロモーターおよびＳｔｌｌシグナル配列（チャン（Chang), CN 等（１９８７）Gene

５５ 、１８９）、ファージｆｌの複製オリジンおよび複製オリジンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むbp１２０５から４３６１までのｐＢＲ３２２の領域を含む受容ベクターｐＢ０４７５を同様に切断したものにクローン化した。 この配列はダイデオキシ分析により確認した（サンガー(Sanger), F.等（１９７７） Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

７４ 、５４６３）。

図９に示したようにｐＢ０４７５を構築した。 長さ４７５bpのＤｒａＩ，ＲｓａＩフラグメント上に含まれる繊維上ファージ由来のｆｌ由来のＤＮＡをｐＢＲ３２２の単独のＰｖｕ II 部位にクローン化しプラスミドｐ６５２を作った。 テトラサイクリン耐性遺伝子のほとんどはｐ６５２をＮｈｅＩおよびＮａｒＩを制限切断し、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰを用いてその粘着末端を充填し、かつ大きい方の３８５０bpのフラグメントそれ自体をライゲーションすることにより欠失させてプラスミドｐ△６５２を構築した。 ｐ△６５２をＥcoＲＩ，ＥcoＲＶで切断し、その３６９０bpのフラグメントをアルカリホスファターゼプロモーター、ＳＴ II シグナル配列および中立ｈＧＨ遺伝子を含む phGH4R （チャン （Chang), CN 等（１９８７） Gcnc.

５５ 、１８９）由来の１３００bpＥcoＲＩ，ＥcoＲＶフラグメントはライゲーションした。 この構築物をｐＢ０４７３と命名した。 合成ＤＮＡを３種の様式でｐＢ０４７３にクローン化した。 ベクターｐＢ０４７３をＮｓｉＩ，Ｇｇｌ II で切断し、両方とも合成ＤＮＡ由来の２４０bP ＮsiＩ、Ｈind III フラグメントおよび１１７０bP Ｈind II, ＢglIIフラグメントにライゲーションした。 この構築物ｐＢ０４７５はｈＧＨの中立ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むがｈＧＨ遺伝子の突然変異誘発やその後の操作を可能にする多くの新しい単独制限部位を有している。 ｈＧＨアミノ酸配列とともにｐＢ０４７５の全ＤＮＡ配列を図１０に示す。 ｐＢ０４７５中のｈＧＨ配列内の単独制限部位は類似体ｐＧＨ，ｈＰＬおよびｈＰＲＬ由来の類似セグメントをコードするＤＮＡ配列を含む変異原カセットの挿入を可能にする（ウェルス（Wells), JA 等（１９８５）Gene

３４ 、３１５）。 別にｈＧＨ配列を一本鎖ベクターｐＢ０４７５の部位指定突然変異誘発により修正し、つづいて単独制限部位の１つについての制限選択を行った（ウェルス（Wells), JA 等（１９８６）Philos. Trans. R. Soc. London Ser A

３１７ 、４１５）

【００５５】

第III 表にあげた１７種類のセグメント置換ｈＧＨ変異体を調製した。 各々は野生型ｈＧＨと同様のレベルおよび後に述べるｈＧＨ−ｈＧＨハイブリッドをはるかに越えるレベルで大腸菌の細胞周辺腔に分泌された。 ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体は低いリン酸最小倍地で生育した大腸菌Ｗ３１１０，ｔｏｎＡ株（ＡＴＣＣ２７３２５）で発現させた（チャン（Chang), CN 等（１９８７）Gene

５５ 、１８９）。

ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体は以下のように精製した。 細胞ペレット２００ｇに４倍容（８００ml) の１０ mＭトリス（pH 8.0) を加えた。 この混合物をペレットが溶解するまで室温でシェーカーにより振とうした。 この混合物をホモジナイズして低温室で１時間攪拌した後、７０００ｇで１５分間遠心した。 その上清をデカンテーションしてから４５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え（２７７ｇ／リットル）、室温で１時間攪拌した。 １１０００ｇ３０分間の遠心後、そのペレットを４０mlの１０ mＭトリス（pH 8.0) に懸濁した。 この溶液を２リットルの１０ mＭトリス（pH 8.0) に対し一晩透析し、この試料を遠心または0.４５ミクロンメンブレンで濾過した。 その後試料を１００mlのＤＥＡＥセルロース（ファーストフロー、ファルマシア製）カラムにかけた。 カラム容量の８〜１０倍の１０ mＭトリス（pH 8.0) 中ゼロから３００ mＭ ＮａＣl の勾配を用いてカラムの溶出を行った。 ＰＡＧＥで同定したｈＧＨフラクションを集めて１０ mＭトリス−ＨＣl(pH 8.0) に対し一晩透析した。 この試料を Centri - Prep１０限外濾過によりおよそ１mg／mlになるまで濃縮した。

【００５６】

実施例２

ｈＧＨおよびｈＧＨの相同組換え体ブタの成長ホルモンのＣ末端領域に結合したｈＧＨの種々の長さのＮ末端領域を含むランダムハイブリッドライブラリを直列に結合した遺伝子のランダム組換え法により構築した。 グレー（Gray), GL等（１９８６） J. Bacteriol.

１６６ 、６３５。

ｐＢ０４７５のＥcoＲＩ部位を該プラスミドのＥcoＲＩ制限処理により除去し、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰを添加することにより粘着末端を充填した後、このプラスミドをライゲーションした。 つぎにｈＧＨ遺伝子の３′末端の直前に新しいＥcoＲＩ部位を導入した。 これはＥcoＲＩ部位を含むｈＧＨ−４Ｒの３４５bp Ｂgl II , ＥcoＲＶフラグメントをＥcoＲＩ

^- ｐＢ０４７５構築由来の同様の制限レクターにサブクローニングすることにより行った。 それからｐＧＨ遺伝子（シーバーグ（Seeburg) PH等（１９８３）ＤＮＡ

２ 、３７）をこの構築物のｈＧＨ遺伝子の３′末端直後に導入した。 これは先に述べた構築物のＥcoＲＩ，ＥcoＲＶ消化物の大きい方のフラグメントにｐＧＨｃＤＮＡを含むＥcoＲＩ、Ｈind III （充填）フラグメントを導入することにより行った。 このプラスミドｐＢ０５０９は３′末端に単独のＥcoＲＩ部位をもつ本来のｈＧＨ遺伝子と、それに同じ方向でつづく本来のｐＧＨ遺伝子を含む。 ｈＧＨ遺伝子とｐＧＨ遺伝子のホモロジーのためｐＢ０５０９の一部は大腸菌 rec

⁺ ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）にトランスホームしたときインビボ組換えを起こしハイブリッドｈＧＨ／ｐＧＨを生ずる。 これらの組換え体は集めたＤＮＡをＥcoＲＩで制限処理し、ＥcoＲＩ部位を失うような組換えを行わなかったプラスミドを線状にすることにより濃縮した。 ２回の制限選択および大腸菌 rec

⁺ ＭＭ２９４へのトランスホーメーションの後、ほとんど全てのクローンがハイブリッドｈＧＨ／ｐＧＨ組換え体となった。 ２２個のクローンの配列分析は、ｈＧＨ／ｐＧＨハイブリッドがアミノ末端ｈＧＨ配列とそれにつづくアミノ酸残基＋１９，＋２９，＋４８，＋９４，＋１０５，＋１２３および＋１６４で始まるｐＧＨ配列を含んでいることを示した。

【００５７】

ｈＧＨ遺伝子に均等に分布する交叉点を有する７個のｈＧＨ−ｐＧＨハイブリッドが得られた。 しかし極端なカルボキシ末端ハイブリッド（ｈＧＨ（１−１０３）−ｐＧＨ（１６４−１９１））のみが精製および分析に十分なレベルで大腸菌から分泌された。 このｈＧＨ−ｐＧＨハイブリッドはヘリックス４の疎水面上に存在する３個の置換（Ｍ１７０Ｌ，Ｖ１７３ＡおよびＶ１８０Ｍ）を導入する。 したがって図２のヘリックス領域Ａ，Ｄ，ＥおよびＦにおける配列変化のほとんどはヘリックスの疎水面上の残基の突然変異を避けるよう設計した。 たとえば上述のハイブリッドｈＧＨ−ｐＧＨ変異体は、Ｍ１７０，Ｖ１７３，Ｆ１７６およびＶ１８０を維持するよう修正した。 なぜならこれらの残基はヘリックス４の疎水面上内に存在するからである。

【００５８】

実施例３

可溶性ヒト成長ホルモンレセプターの大腸菌からの発現および精製可溶性ヒト成長ホルモンレセプターｓｈＧＨｒをコードするクローン化ＤＮＡ配列（レング（Leung), DW 等（１９８７） Nature

３３０ 、５３７）をｐＢ０４７５にサブクローンしｐＪＩ４６６を作った（図１１および図１２参照）。

ベクターｐＣ１Ｓ，２ＳＨＣＨＲ（レング（Leung), DW 等（１９８７）Nature

３３０ 、５３７）をＸbaＩおよびＫpnＩで消化し、ｈＧＨの分泌シグナルおよび２４６コドンの細胞外領域をコードする1.０bpフラグメントを精製した（マニアチス（Maniatis), T. 等（１９８２）モレキュラークローニング、コールドスプリングハーバーラボライリー，Ｎ．Ｙ．）。 このフラグメントを同様に切断したＭ１３mp１８にライゲーションし組換え体用に一本鎖ＤＮＡを精製した（メシング（Messing), J.（１９８３）Methods in Enzymology.１０１巻、２０頁）。 部位指定突然変異誘発（カーター（Carter), P. 巻（１９８６）Nucleic Acids Res.

１３ 、４３３１）を１８mer.ジゴヌクレオチド５′−Ａ−ＡＧＴ−ＡＧＴ−ＧＣＡ−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＧＧ−３′により行ないコドン＋１にＮsiＩを導入した。 変異配列はダイデオキシ配列分析（サンガー（Sanger), F. 等 Proc.Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

７４ 、５４６３）により確認した。 変異体の二本鎖ＤＮＡを精製しＮsiＩおよびＳmaＩで切断した。 ｈＧＨレセプターの２４６コドン細胞外領域を含む９００bpフラグメントを単離した。 ｐＢ０４７５をＮsiＩおよびＥcoＲＶで切断し4.１kbフラグメント（合成ｈＧＨ遺伝子を欠く）を精製した。

レセプターの９００bpフラグメントおよび4.1 kbベクターフラグメントをライゲーションし、その組換えクローン（ｐＪ１４４６）を制限地図により確認した。 これを大腸菌ＫＳ３０３（トランスホームし（ストローチ（Strauch), K.等（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８５ 、１５７６）、ついで、低リン酸培地（チャン（Chang), CN 等（１９８７）Gene ５５、１８９）中３０°Ｃで成育した。レセプターフラグメントたん白質をｈＧＨアフィニティークロマトグラフィーで精製した（スペンサー（Spencer), SA 等（１９８８）J.Biol. Chem.

２６３ 、７８６２；レング（Leun g) DW 等（１９８７）Nature

３３０ 、５３７）。ｐＪ１４４６の配列をクローン化レセプターのアミノ酸配列とともに図１２に示す。

【００５９】

大腸菌Ｗ３１１０，deg Ｐ株（ストローチ（strauch), KL 等（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ

８５ 、１５７６）をｐＪ１４４６でトランスホームし、ファーメンター中低リン酸培地（チャン（Chang), CN 等（１９８７）Gene

５５ 、１８９）を用い３０°Ｃで生育させた。 ２４６アミノ酸のｈＧＨｒを用い予備データをとった。 アミノ酸１〜２３８番を含むわずかに短かいｈＧＨｒを本明細書の実施例１で用いた。 このレセプターについて得られた結果は２４６アミノ酸ｈＧＨｒで得た値と区別できなかった。

カルボキシル末端異質性の問題を避けるためにＧｌｎ２３８の後に停止コドンを入れたプラスミドｐｈＧＨｒ（１−２３８）を構築した。 ｐｈＧＨｒ（１−２３８）を含むＫＳ３３０培養物からは結合たん白質がｐｈＧＨｒ（１−２４６）を含む培養物からよりもわずかに高い収率でかつより均一なものが生成した（データ示さず）。 湿重量0.２kgの細胞ペレットから始め７０〜８０パーセントの収率で２０〜４０mgの高純度結合たん白質がルーチンに単離された（２リットルの高密度細胞培養物から）。 Ｎ末端シーケンシングおよび質量スペクトル分析と組合せたペプチドマッピングでその生成物は残基１から２３８に及んでいることが確認された。

ｐｈＧＨｒ（１−２４６）テンプレートの部位指定突然変異誘発をオリゴヌクレオチド

を用いて行ない（カーター（Carter),等（１９８６）Nucleic Acids Res.

１３ 、４４３１−４４４３）ｐｈＧＨｒ（１−２４０，Ｃ２４１Ｒ）を作った（式中アステリスクはｐｈＧＨｒ（１−２４６）とのミスマッチを示し、下線は新しい単独のＭluＩ部位であり、ＣＧＴ−ＴＡＧはＣ２４１Ｒ突然変異とそれにつづく停止コドンを示す（第Ｘ表Ａ）。

【００６０】

【表１１】

＊は野生型テンプレートとのミスマッチを示す。

【００６１】

プラスミドｐｈＧＨｒ（１−２３８）をＭluＩ部位（第Ｘ表（Ａ））に対する制限選択（ウェルス（Wells), 等（１９８６）Phil Trans. R. Soc. Lond. A.

３１７ ，４１５−４２３）を用いたｐｈＧＨｒ（１−２４０，Ｃ２４１Ｒ）テンプレートの部位指定突然変異誘発により生成した。 簡単に云うとオリゴヌクレオチド

はＧln２３８（ＣＡＡトリプレット）の後に翻訳停止コドンを誘導しかつＭluＩ制限部位（下線）を修正した。 ヘテロ二本鎖による最初のトランスフェクションから二本鎖ＤＮＡを回収した後、再トランスホームしてＤＮＡシーケンシングの前に目的とするｐｈＧＨｒ（１−２３８）プラスミドを増やした。

最終的にｐｈＧＨｒ（１−２３８）中にクローン化したｈＧＨ結合たん白質がｃＤＮＡ変異体またはクローニングアーテファクトを生じさせるＴ５１Ａ突然変異を含むことはＤＮＡシーケンシングで確認された。 それゆえＡ５１Ｔリバータントは報告されている配列と同じである。 （レング（Leung)等（１９８７）Nature(London)

３３０ 、５３７−５４３。部位５１にＴhrまたはＡlaを含むたん白質の精製および結合性は区別できない（データ示さず）。Ａla５１結合たん白質変異体は特性が明らかになっているのでひきつづく全ての分析用に選択された。ヒト血清から単離した天然の産物と大腸菌由来の組換えｈＧＨ結合たん白質の特異性を比較するため野生型と種々のｈＧＨ変異体のアフィニティーを測定した。

【００６２】

【表１２】

ａ． Ｋｄ値およびその標準偏差（ＳＤ）は、野生型ｈＧＨ（wt) および多くのｈＧＨ変異体を用いた競争結合分析（図２４）により測定した。

ｂ． 各ｈＧＨ結合たん白質に対するｈＧＨ変異体および野生型ｈＧＨ（wt) の解離定数の比から計算される結合アフィニティーの減少。

ｃ． 所定のｈＧＨ型の２つのｈＧＨ結合たん白質の解離定数の比。

【００６３】

両たん白質はｈＧＨと特定の化学両論比の複合体を形成した（図２４）。 これから分るように野生型ｈＧＨおよびその変異体のアフィニティーは２つの結合たん白質間でほぼ同じであった（上述、右側欄）。 組換えｈＧＨ結合たん白質はヒト血清由来の中立たん白質と比べ非常に高いアフィニティーを有している。 このことは、その組換えたん白質の純度および均一性を反映している。 ｈＧＨ結合たん白質に対する結合能を破壊するｈＧＨの４つのアラニン変異体に対する結合アフィニティーの変化によって示されるように両たん白質は同じ特異性を有している（上述Ｋｄ（変異体）／Ｋd （ｗｔ）。Ｔyr２４６にまで及び結合たん白質に対するｈＧＨのアフィニティー（Ｋd ＝0.３６±0.０８ nＭ）は実質的にＧln２３８の後で終っているものと同じであり（0.４０＋0.０３ｎＭ）、このことは、その分子の７個目のシステインを含む最後の８残基はｈＧＨの結合に関し重要ではないことを示している。

【００６４】

実施例４

レセプターおよびモノクローナル抗体結合検定精製したｈＧＨまたはｈＧＨ変異体（９５％以上の純度）について、実施例３の可溶性ｈＧＨレセプターへの結合に関する検定を行った。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のコーマージ染色ゲルのレーザーデンシトメータスキャンニングにより精製ホルモンの濃度を定量した。 これらの値は２８０nmの吸光度による濃度（ε

₂₃₀

^1% ＝0.９３）とよく一致した。 解離定数（Ｋｄ）は２５°Ｃにおける可溶性ｈＧＨレセプターに結合する〔

¹²⁵ Ｉ〕ｈＧＨの競合置換に関するスキャッチャード分析から計算した。 この〔

¹²⁵ Ｉ〕ｈＧＨはスペンサー（Spencer), SA 等（１９８８），J. Biochem.

２６３ 、７８６２）の方法に従って調製した。

酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用い種々のセグメント置換および残基置換ｈＧＨ変異体に対する８個のモノクローナル抗体の結合を検定した。 以下のＭａｂを使用した。

【００６５】

【００６６】

ｈＧＨに対するウサギポリクローナル抗体をアフィニティー精製し、0.００５Ｍ炭酸ナトリウム（pH１０）中最終２μg ／mlの濃度、２４°Ｃ、１６〜２０ｈマイクロプレート（Ｎunc プレート、インターメド社、デンマーク）をコーティングした。 このプレートをバッファＢ中（５０mMトリス〔pH 7.5〕、0.１５ＭＮa Ｃl 、２mM ＥＤＴＡ，５mg／ml ＢＳＡ，0.０５％トウィーン２０，0.０２％アジ化ナトリウム）0.１μg ／mlの各ｈＧＨと２５°Ｃ、２時間反応させた。 プレートを洗浄後バッファＢで１５０〜0.００２ nＭに段階的に希釈した指示Ｍabとインキュベートした。 ２時間後プレートを洗浄し、ホースラディッシュバーオキシダーゼ結合抗マウス抗体で染色して検定した。 得られた値は各ｈＧＨ変異体への最高結合量の半値を与えるのに必要な各Ｍabの濃度を表わしている。

抗ｈＧＨ ＭabによるｈＧＨからのｈＧＨレセプターの競合置換は以下のように測定した。 この検定は先に述べたように抗ＧＨウサギポリクローナル抗体をコートしたマイクロプレートにおける野生型ｈＧＨの固定化により行った。 レセプター（１０ nＭで固定）および所定の抗ｈＧＨ Ｍab（１５０〜0.００２ nＭの範囲で希釈）をｈＧＨコートマイクロプレートに入れ２５°Ｃで１６〜２０時間インキュベートし、その後未結合成分を洗浄した。 結合レセプター量はｈＧＨと該レセプターとの結合を阻害しないホースディッシュパーオキシダーゼに結合させた抗レセプターＭabを加えることにより定量した。 標準化置換値はプレート上のｈＧＨを飽和するのに必要なＭab濃度の半値に対する該レセプターの５０％を置換するのに必要なＭab濃度の比から計算した。 この値は各Ｍabの該レセプター置換能の比較に用いた。

【００６７】

実施例５

ソマトジェニックレセプター結合の活性ドメイン実施例３の可溶性ソマトジェニックレセプターおよび実施例４で述べたモノクローナル抗体への結合に関し、実施例１および２で述べた１７個のセグメント置換ｈＧＨ変異体を検定した。 ソマトジェニックレセプターに対する結合検定の結果を第III 表に示す。 これから分るように結合能をほとんど破壊するセグメント置換は図４および図５の領域Ａ，ＣおよびＦ内のものである。 さらにこれらの領域をさらに小さいセグメントにしばり込みソマトジェニックレセプターへの結合に関係するｈＧＨ分子の活性ドメインの位置を決定した。 第III 表からの最も重要な結果を図４に示す。 この図は、類似体ｈＰＲＬ、ｈＰＬおよびｂＧＨ由来の類似配列の置換による可溶性ｈＧＨレセプターへの結合における相対的減少を示した棒グラフである。 各々アミノ酸残基１２−１９、５４−７４および１６４−１９０を含む３つの活性ドメイン領域Ａ，ＣおよびＦが同定された。 これらの領域は図５のｈＧＨ分子の３次元に示されている。

これから分るように、３つの活性ドメインＡ，ＣおよびＦはｈＧＨのアミノ酸配列中では不連続であるけれどもｈＧＨに関するソマトジェニック結合部位を規定する分子構造においては連続領域を形成している。

【００６８】

実施例６

ｈＧＨエピトープマッピング特定のセグメント置換ｈＧＨ変異体に対する８種のモノクローナル抗体の結合を第XI表に示す。

【００６９】

【表１３】

【００７０】

ｐＧＨ（１６７−１９０）変異体は除いて各モノクローナル抗体に対する結合能の破壊は著しくかつ非常に選択的である。 図１３〜２０はｈＧＨの３次元構造内の各Ｍabに対するエピトープの位置を示してる。 図６はソマトジェニックレセプターに対する結合部位に対するエピトープを示している。

たとえばｈＰＲＬ（８８−９５），ｈＰＲＬ（９７−１０４），ｈＰＬ（１０９−１１２）およびｈＰＲＬ（１１１−１２９）変異体はＭabＩに結合しないが、それらの領域以外の他のセグメント置換ｈＧＨは野生型ｈＧＨと同様の効率で結合した。 Ｍab２，３，４，５および６への結合は一次配列の不連続であるが、ホルモン３次元構造においては近接している領域の突然変異により阻害された（図６および図１４〜１９参照）。 これと対照的にＭab１，７および８は図１３、図１９および図２０に示したように連続的配列で規定される突然変異により阻害された。 さらに所定のモノクローナル抗体への結合を阻害する領域を、特定のセグメント置換ｈＧＨ領域のサブドメインへの細分化または特定のＭabにすでに結合した共通の置換を有する変異体の分析により解析した。 たとえばｐＧＨ（１１−３３）はＭab４への強固な結合を維持しているがｈＰＲＬ（１２−３３）は結合能を失っていた。 したがって、ｈＰＲＬ（１２−３３）変異体における破壊的突然変異はｐＧＨ（１１−３３）では変異していない残渣：Ｎ１２，Ｌ１５，Ｒ１６、Ｄ２６およびＥ３０に限定し得る。 さらにｈＰＲＬ（１２−１９）変異体は結合能を失ったがｈＰＲＬ（２２−２３）は失なわなかったことから（図１６参照）、これはＮ１２、Ｌ１５およびＲ１６に限定される。 Ｎ１２Ｈ突然変異がｐＧＨ（１１−３３）とは共通しない変異であることからこれでＭab４への結合の阻害を説明し得る。 このことをＡsn−１２のアラニン置換でテストした。 Ｎ１２Ａ残基置換ｈＧＨ変異体へのＭab３またはＭab４の結合は１００倍以上も減少したが他のＭabへの結合は影響を受けなかった。

【００７１】

このセットのｈＧＨ変異体を用いることにより、８個のＭabのほとんどの結合が共通セットの突然変異により阻害されたとしてもこれらのＭab全てのエピトープを解明し得る。 たとえばｈＰＲＬ（１２−１９）はＭab２，３および４への結合を示さないが、他の変異体はこれらのＭabが種々の構造を認識することを示した。 特にＭab２および３はｐＧＨ（１１−３３）により阻害されるがＭab４は影響を受けなかった。 Ｍab３および４の結合はｈＰＬ（１２−２５）により阻害されたがＭab２への結合は影響を受けなかった。 このように８個の抗体は重複するが完全に重ならないエピトープを有する。 結合を乱す突然変異はヘリックスおよびループの両方に存在し、かつ常にホルモン構造において近接している。

合せて考えてみると、８個のＭabセットのエピトープはこのホルモンのほとんどをカバーする。 しかしなおＭabが結合しない領域がある。 たとえば２０個の変異体のうちの３個はテストしたＭab（ｈＰＲＬ（２２−３３）、ｐＧＨ（４８−５２）およびｈＰＲＬ（１２６−１３６）のいずれに対する結合も有意に乱さなかった。

抗体エピトープとレセプター結合部位には有意な差がある。 第１に阻害的突然変異により規定されるバッチはどのＭabに関してよりもレセプターに関するものの方が大きい。 第２の差はレセプターがＭabよりもホルモンの阻害的置換に対しより耐性が強い。 これはどの変異体のレセプターへの結合に関してもその最大の減少は約７０倍であるがほとんど全ての抗体にはＮ１２Ａなどの単一置換の結果の場合のように１０００倍の結合の減少をひき起こす少なくとも１つの変異体がある。

【００７２】

実施例７

ＭabおよびｓｈＧＨｒの競合的結合レセプター結合を乱す多くの変異体は１つ以上のＭabの結合も乱す。 すれゆえ、ｈＧＨに対するｈＧＨレセプターの結合を阻害する８個のＭabの各々の能力を評価した。 この検定の結果を第XII 表に示す。

【００７３】

【表１４】

【００７４】

表から分るようにＭab５および６はｈＧＨレセプターの結合を阻害する上で最も効率がよい。 このことはそれらのＭabがレセプターに対する決定基と密接に重複する残基５４−７４までのレープおよびヘリックス４内に存在する抗原決定基を有することによる（図５、図６、図１７および図１８参照）。 Ｍab２は次に競合的な抗体であり、かつレセプターと共通する阻害的突然変異を共有する（ｈＰＲＬ（１２−１９））。 これに対しＭab３および４はＭab２に比べおおよそ１０００倍競争力が小さいがそれらはまたヘリックス１中にレセプターと重複する阻害的突然変異を共有している。 図１５および図１６参照。 Ｍab３および４を乱すヘリックス１中の突然変異がＭab２またはレセプターへの結合を乱す残基と異なるならこの見かけ上の差は容易に解決されよう。 事実、１つの変異体（Ｎ１２Ａ）はＭab２またはそのレセプターへの結合に影響することなくＭab３または４の結合を乱す。

Ｍab７はｈＧＨに対してそのレセプターと比較的強く競合し、またたとえばｈＰＬ（４６−５２）などレセプター結合をわずかに乱すセグメント置換ｈＧＨ変異体により阻害される。 したがってＭab２および７はレセプター結合部位の境界上に存在するように思える。 Ｍab１および８はレセプターの検出可能な置換を与えられなかったまた予想されるようにこれらはレセプターと重複する抗原決定基を含んでいない。 これらの競合結合データは直接的エピトープマッピングデータおよびレセプター結合データとともに図５に示されるようなレセプター結合部位の一般的位置を強く支持している。

【００７５】

実施例８

レセプター活性アミノ酸残基実施例５、６および７におけるｈＧＨの分析はレセプター結合に重要なヘリックス１のアミノ末端領域（残基１１−１９）を含んでいる。 さらに残基５４−７４および１６７−１９１もレセプター結合に重要であることが分った。 レセプター結合に活性なこれらのドメイン中のアミノ酸の同定は全部で６３個の単一アラニン変異体を分析することにより行った。 第XIII表、第XIV 表、および第XV表参照。

【００７６】

【表１５】

【００７７】

【表１６】

【００７８】

【表１７】

【００７９】

アミノ末端残基位置の不明確さのためアラニン置換は残基２−１９を含むように行った（アブデル−メギド（Abdel-Meguid), SS等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８４ ，６４３４）。 実際に結合のもっとも著しい減少はＦ１０Ａ（６倍）でつづいてヘリックス１のＮ末端の残基４−６のアラニン置換で起こった（図２１参照）。 結合に関して実質的により大きい効果（２０倍以上）は残基５４〜７４のループおよびカルボキシ末端配列１６７−１９１内の特異的アラニン置換で起った。 いくつかのアラニン変異体の結合は4.５倍に増加した。 最も劇的な例は多くの破壊的アラニン突然変異の中間に位置するＥ１７４Ａであった。 図４、図７および図２１参照。

ほとんどの破壊的アラニン置換はＦ１０からＲ６４およびＤ１７１からＶ１８５に広がる約２５Å角のバッチをホルモン上に形成する（図２１参照）。 さらにこれらの側鎖はその分子の同じ方向を向いているようである。 たはえばヘリックス４に関する結合に最も影響する全てのアラニン変異体（Ｄ１７１Ａ，Ｋ１７２Ａ，Ｅ１７４Ａ，Ｆ１７６Ａ，１１７９Ａ，Ｃ１８２ＡおよびＲ１８３Ａ）はこのヘリックスの３回半に限られまたそれらの側鎖はこのヘリックスの同じ面から突き出ている（図２１参照）。 このモデルに基づいて、Ｔ１７５およびＲ１７８は、図２１で示されているように中央位置を占めていることから結合に関与していることが予想される。

Ｔ１７５Ａ変異体は振とうフラスコ中検定するのに十分な収率で発現されないけれども、より保存的変異体（Ｔ１７５Ｓ）であった。 したがってＴ１７５Ｓ変異体はレセプター結合が１６倍減少した。 同様に、Ｒ１７８Ａはあまり発現されないにもかかわらずＲ１７８Ｎは分析可能な収量で発現した。 Ｒ１７８Ｎは結合アフィニティーが４倍以上減少した。

【００８０】

カルボキシ末端における次に破壊的変異体はＶ１８５Ａであった。 Ｖ１８５Ａはヘリックス４の外にあるけれども、このモデルによりヘリックス４内の破壊的突然変異を同じ方向を向いていることが予想される。 これに対し結合バッチ外のアラニン突然変異またはその中にあり上述のものと反対を向いているアラニン突然変異（Ｒ１６７Ａ，Ｋ１６８Ａ，Ｖ１８０Ａ、Ｑ１８１Ａ，Ｓ１８４Ａ，Ｅ１８６Ａ，Ｓ１８８Ａ）は一般にレセプター結合に関して影響しないか、またはほとんど影響しない。

ヘリックス１におけるアラニン変異体は並みの効果しかもたないがこれにも同様の分析を行った。 このヘリックス内でもっとも結合を破壊するアラニン置換はこのヘリックスの同じ面に存在する残基６，１０および１４のものであった。 もっとも小さい破壊的アラニン突然変異（Ｌ９Ａ，Ｎ１２ＡおよびＬ１５Ａ）ヘリックス１の反対の面に存在する。 さらにこのことはｈＧＨに対する結合をレセプターと競合しない抗ｈＧＨ Ｍab３および４の両方がＡsn−１２に結合するという事実により確認される。 第XVI 表参照。

【００８１】

【表１８】

【００８２】

５４−７４ループ内の側鎖の相対的位置はそれらがヘリックス１および４内の側鎖のように固定しえない。 しかし偶数残基の突然変異は奇数残基に比べ結合を大きく阻害するという結合において著しい周期性がある。 特にこのことはこの領域の最初の部分によくてはまり（５４−５９）かつ偶数残基はレセプターの方に突き出ておりかつ奇数残基は反対を向いているという構造を反映している。

【００８３】

実施例９

アラニン置換ｈＧＨ変異体の構造完全性および結合エネルギーいくつかの証拠はレセプター結合を乱すアラニン置換は分子の構造をゆがめることによりそれを起こすのではないことを示している。 第１に８種のＭabはｈＧＨに関して同様レセプターへの結合の破壊を起こすほとんどすべてのアラニン変異体と反応する。 先の第XII 表参照。

例外は各々個ｈＧＨ Ｍab６および５への結合を瀬洗濯的に破壊するＲ６４ＡおよびＣ１８２Ａである。 これら２つのＭabは以前にｈＧＨへの結合に関しソマトジェニックレセプターと競合することが示された。 さらにレセプター結合に影響しない２つのアラニン変異体を作った。 １つは２つのＭabの結合に影響し（Ｎ１２Ａ）、もう１つはＭabのいずれにも影響しない（Ｋ１６８Ａ）。 このデータはＭabもしくはレセプターへの結合が変異体構造の非常に局所的ゆらぎにより破壊されることを示している。 さらに全てのｈＧＨ変異体の遠紫外円二色スペクトルは野生型ｈＧＨと実質的に同じであった。

振とうフラスコ中、アラニン変異体の約２０％（Ｄ１１Ａ、Ｔ６０Ａ，Ｐ６１Ａ，Ｔ６７Ａ，Ｎ７２Ａ，Ｅ７４Ａ，Ｄ１６９Ａ，Ｍ１７０Ａ，Ｖ１７３Ａ，Ｔ１７５Ａ，Ｌ１７７Ａ，Ｋ１７８Ａ，Ｃ１８９Ａ，Ｇ１９０Ａ）は単離および分離するのに十分なレベルで分泌されなかった。 このような変異体をコードする遺伝子は同じベクターで発現され、かつその発現は特定のアラニンコドンとは独立しているので定常的発現レベルの変化は、おそらく分泌レベルの差および、またはｈＧＨ変異体のたん白質分解を反映したものである。 ヘリックス４における非発現性アラニン変異体のいくつかはヘリックスの疎水性側面を白で示した図２１に示されている疎水性面上に存在する（Ｍ１７０Ａ，Ｖ１７３ＡおよびＬ１７７Ａ）。 しかしいくつかのアラニン置換がヘリックス１（Ｌ６Ａ，Ｌ９Ａおよびけ１０Ａ）およびヘリックス４（Ｆ１７６ＡおよびＶ１８０Ａ）の疎水性面内で容認されていることからこのことは一般的な効果ではない。

【００８４】

さらにｈＧＨ変異体の発現の減少は荷電または中性アミノ酸がアラニンと置換したときにしばしば観察される（Ｄ１１Ａ，Ｔ６０Ａ，Ｔ６７Ａ，Ｎ７２Ａ，Ｆ７４Ａ，Ｄ１６９Ａ，Ｔ１７５Ａ，Ｒ１７８Ａ）。 水素結合基をその部位に保存するＴ１７５ＳおよびＲ１７８Ｎのような突然変異はたとえあったとしても野生型よりも低いレベルで発現される。 非発現性のＣ１８９Ａ変異体はカルボキシ末端スルフィドを破壊し、かつその相対物（Ｃ１８２Ａ）も野生型よりもはるかに低いレベルで発現する。 他のいくつかの非発現性アラニン変異体（Ｔ６０Ａ，Ｔ６１ＡおよびＴ６７Ａ）はループ構造内に存在する。 したがって低レベル発現または非発現は多くの構造効果に由来するが単一構造的または単一機能的置換によって回避し得る。

結合に１０倍以上の効果を示す置換（１５８Ａ，Ｒ６４Ａ，Ｋ１７２Ａ，Ｔ１７５Ｓ，Ｆ１７６Ｓ，Ｆ１７６Ａ）は直接結合に関与しているようである。 天然に存在する（ファーシュト（Fersht), AR（１９７２）J. Mol. Biol.

６４ ，４９７；ブラウン（Brown), LR 等（１９７８）Eur. J. Biochem.

８８ 、８７；マリバー（Malivor), R.等（１９７３） J. Mol. Biol.

７６ 、１２３）または部位指定突然変異誘発で作り上げられた（ファーシュト（Fersht), AR等（１９８５）Nature

３１４ 、２２５；ブライアン（Bryan), P.等（１９８６）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８３ 、３７４３；ウェルズ（Wells), JA 等（１９８７）Proc. Nstl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８４ 、１２１９；クロニン（Cronin), ON等（１９８７）J. Am. Chem. Soc.

１０９ 、２２２２；グラフ（Graf), L. 等（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８５ 、４９６１）水素結合または塩橋の強さは微環境に依存して１〜５Ｋcal/mol の範囲に広く分布している。 ｈＧＨに関する結合自由エネルギーの減少はＥ５６，Ｑ６８，Ｄ１７１，Ｋ１７２およびＲ６４の各アラニン置換に対し0.８、1.０、1.２、1.６および1.８Ｋcal ／mol （△△Ｇ結合＝＋Ｒ

_T lnＫd （変異体）／Ｋd (wt)であった。疎水性側鎖のたん白質中への埋没のエネルギーはエダノール中への転移の自由エネルギーに対応する傾向がある（エステル（Estoll), DA等（１９８６）Science

２３３ 、６５９；キザキ（Nozaki), Y. 等（１９８０）“疎水性効果”（ウィリー版、Ｎ．Ｙ．４〜２１頁）。

したがってＦ１７５Ａ，Ｆ１０Ａ，Ｐ５４Ａ，１５８ＡおよびＶ１８５Ａの結合自由エネルギーの減少は各々1.６、1.０、0.９、1.７および0.９Ｋcal ／mol であった。 これらの値はＰhe , I le またはＶalからＡlaへの置換における疎水性自由エネルギーの予想値、各々2.０、2.４および1.０Ｋcal ／mol よりもわずかに小さい。 この分析により、Ｔ１７５Ｓ変異体の効果（△△Ｇ結合＝1.６Ｋcal ／mol ）はガンマメチル基の損失に期待される効果（△△Ｇ疎水性＝0.７Ｋcal ／mol ）よりも大きい。 ｈＧＨとそのソマトジェニックレセプターとの分子接触の性質を十分把握するために直接的構造の情報が必要である。 しかし、これらアラニン変異体の結合エネルギーはそれらが全く別のシステムにおける接触残基について行った以前の測定の範囲内にあることを示している。 事実、レセプター結合に最も破壊的であるＣ１８２Ａを除いたアラニン置換変異体の結合自由エネルギーの総和は（−１3.２Ｋcal ／mol ）、ｈＧＨとそのレセプター間の総結合自由エネルギーと一致している（−１３Ｋcal ／mol ）。

【００８５】

実施例１０

ｈＧＨ変異体の抗ｈＧＨポリクローナルとの反応性ｈＧＨ変異ｈＰＲＬ（２２−２３）、Ｅ１７４ＡおよびｈＰＲＬ（８８−９５）をラットの体重検定でテストした。 この検定の結果を図２２に示す。 これから分るようにｈＰＲＬ（２２−３３）以外の変異体は生育的１４日後減少能を有している。 成長のレベルダウンは生物学的効果を中和する種々の成長ホルモンに対する抗体の発現に寄因する。 ｈＰＲＬ（２２−３３）変異体が成長しつづけたという事実はそれが野生型ｈＧＨまたは使用した他の変異体と同じ免疫原性をもたないことを示している。

ｈＧＨに対する種々のｈＧＨ変異体の反応性をポリクローナル抗体を含むヒトおよびマウスの血清と比較した結果を第XVII表に示す。

【００８６】

【表１９】

【００８７】

表から分るように残基２２〜３３の領域内に置換を含む変異体は野生型ｈＧＨに対し各ヒトおよびマウス抗血清との結合活性が実質的に減少しているか、またはある場合には活性をもたない。

変異体ｐＧＨ５７−７３を除いて、他の領域の置換を含む変異体は有意な反応性の減少を示さない。 残基１１および３３の間のセグメント置換変異体はソマトジェニックレセプターへの結合能を維持しているので、このような変異体はソマトジェネシスの推進能は維持しているが他の性質、この場合抗ｈＧＨポリクローナル抗体への反応性を変化させた変異体の生成を示している。

【００８８】

実施例１１

Ｋd と能力の関係特定のｈＧＨ変異体のＫd （変異体）／Ｋd （野生型）の比とラット体重検定におけるこれら変異体の能力のセミログプロットを図２３に示す。 これから分るように線型関係の存在はソマトジェニックレセプターへの結合アフィニティーの減少は能力の減少を示している。

図から分るように、ｈＧＨ変異体Ｅ１７４Ａはソマトジェニックレセプターに関し野生型ｈＧＨよりも高い結合アフィニティーを有している。 また、この能力は野生型ｈＧＨよりも約１２％大きい。

さらに変異体ＰＲＬ（９４−１０４）は基本的に野生型と同じ結合定数を有しているが能力は約2.７倍大きい。

【００８９】

実施例１２

プロラクチンレセプター結合に関するｈＧＨの活性ドメインヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は模型成長、泌乳、窒素遅延、糖尿病誘発性およびインシュリン様効果およびマクロファージ活性化など多くの生理効果を示す。 RK チョウラ（Chawla), JSパークス（Parks)および D. ラドマン（Rudman), Annu. Rev. Med.

３４ 、５１９−５４７（１９８３）； OGP イサクソン（Isaksson),等（１９８５），Annu. Rev. Physiol.

４７ 、４８３−４９９； CKエドワーズ（Edwards)等（１９８８） Science

２３９ 、７６９−７７１。 これらの効果は各々ｈＧＨと特異的細胞レセプターとの相互作用で始まる。 JP ハイス（Hughe) 等（１９８５）Annu. Rev. Physiol.

４７ 、４６９−４８２。 これまでのｈＧＨと結合する生成物を作るクローン化遺伝子の肝臓のｈＧＨレセプター（AW レング（Leung), 等（１９８７）Nature（ロンドン）

３３０ 、５３７−５４３）および乳線のヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）レセプター（JM ブーチン（Boutin) 等、（１９８８）Cell

５３ 、６９−７７）のみであった。 ｈＰＲＬレセプターへのｈＧＨのレセプター“スピルオーバー”は高レベルのｈＧＨを生産する先端巨大症が、通常レベルのｈＰＲＬを有するにもかかわらず過プロラクチン症となる場合の臨床的徴候である（ JE フラドキン（Fradkin)等（１９８９）New Engl. J. Mcd.

３２０ 、６４０−６４４）。 しかしｈＧＨと結合する他のレセプターが存在し、これらには胎盤ラクトゲン（ＰＬ）レセプター（ M. フリーマーク（Freemark) 等（１９８７）Endocrinology)

１２０ 、１８６５−１８７２）。 これらのレセプターに関するｈＧＨ上の結合部位が同一のものであるかどうか、またはどのレセプター（レセプター群）が薬学効果を担っているかは分っていなかった。 これらの問題を解くためにｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプター結合部位の位置決めがなされた。 得られた結果はこれらのレセプター結合部位は重複しているが、同一のものではないことを示している。 このことはｈＧＨのレセプター特異的変異体の合理的設計を可能にする。

【００９０】

ｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターには３２％の配列ホモロジーをもつ細胞外ホモロジー結合ドメイン、単一のトランスメンブレンドメインおよび配列の長さも様々である細胞質内ドメインがある。 ｈＧＨレセプターの細胞外結合ドメインは大腸菌中で発現され、かつ可溶性血清結合たん白質など天然に見られるものと同一の結合性を有する（ SA スペンサー（Spencer)等（１９８８) J. Biol. Chem.

２６３ 、７８６２−７８６７）。 同様にｈＰＲＬレセプターの細胞外ドメインは大腸菌内で発現されかつ精製された。 ｈＰＲＬレセプターフラグメントは残基 Ｇln１からＴhr 2 1 1にわたり、単一のトランスメンブレンドメインの直前で終っている。 それは完全な長さのレセプターと実質的に同じ高い結合アフィニティーおよび特異性を有している。 この実験で用いているｈＰＲＬレセプターをコードする遺伝子はカナダ モントリオール マクギル大学、ケリー(Kelly), PA博士により提供された。 このＤＮＡ配列はヒト乳線ｃＤＮＡライブラリーから入手し、プロラクチンレセプター群の交叉種メンバーのうち既知の保存領をカバーするプローブで同定された。 たとえばダビエス（Davies) JA 等（１９８９）Mol. Endrocrinology

３ 、６７４−６８０；エデリー（Edery)等（１９８９） Proc. Natl. Acad. Scl. ＵＳＡ

８６ 、２１１２−２１１６；ジオリコアー（Jolicoeur)等（１９８９）Mol. Endrocrinology

３ 、８９５−９００参照。 これらの短縮型で高純度のレセプターはｈＧＨ変異体の結合アフィニティーの迅速かつ正確な検定に非常に有用な試薬である。

【００９１】

ｈＰＲＬおよびｈＧＨレセプター結合部位の関係

ｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターのエピトープが重複しているかどうかを測定するため我々はｈＰＲＬレセプターフラグメントがｈＧＨ由来のｈＧＨレセプターフラグメントと置換し得るかどうか分析した（データ示さず）、事実、ｈＰＲＬレセプターフラグメントはｈＧＨレセプター結合部位に関し見かけ上のＫd 値１ nＭで競合する。 これはｈＧＨに対するｈＰＲＬレセプターの直接的結合で測定されたアフィニティーと実質的に同じである（結果示さず）。

第III 表のセグメント置換ｈＧＨ変異体のうちの７つを用いｈＰＲＬレセプターに関するｈＧＨ上のエピトープの位置を決定した。 この実験にはｈＧＨ△３２−４６変異体を用いた。 方法はｈＧＨｓの代りにｈＰＲＬｒをレセプターとして用いたこと以外に述べたｈＧＨレセプターに対するｈＧＨ上のエピトープの決定に用いた方法、すなわちｈＧＨ変異体の結合への影響により行った。 上述の１２個のセグメント置換ｈＧＨ変異体の結果を第XVIII 表に示す。

【００９２】

【表２０】

第 XVIII 表ｈＰＲＬレセプター（ｈＰＲＬｒ）の細胞外ドメインに対するホモログースキャンニング突然変異誘発により調製したｈＧＨ変異体の結合、変異体は種々のｈＧＨ類似体：ｐＧＨ、ｈＲＬ、またはｈＲＬから置換したセグメントに従って命名した。 導入された突然変異の正確な記述はコンマで区切られた一連の単一変異体で与えられる。 各単一変異体は野生型残基の１文字コードとそれにつづく成熟ｈＧＨ中のそのコドンの位置および変異体残基で示される。 ｈＧＨの変異体を先に述べた方法で生産し、精製下。 ｈＰＲＬｒへの結合は基本的にｈＧＨｒについて述べた方法で測定した（スペンサー（Spencer), SA 等（１９８８）J. Biol. Chem. ２６３、７８６２−７８６７）。 もっともこの方法ではｈＰＲＬｒに対するアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体を用いキャリヤーたん白質としてギブコ製ＢＳＡ（粗）を使ってｈＰＲＬｒ複合体を沈殿させた。 一般にＫ

_D値の標準偏差は報告されている値の２０以下であった。 ｈＧＨｒに対する結合アフィニティーの相対的減少（Ｋ

_D （変異体）／Ｋ

_D （ｈＧＨ））は第III 表から得られたものである。 レセプター選択性の変化はｈＧＨｒに対する結合アフィニティーをｈＰＲＬｒと比較した相対的減少比で計算した。 ＷＴ−野生型。

【００９３】

表から分るようにｐＧＨ（１１−３３）およびｐＧＨ（５７−７３）はｈＰＲＬレセプター結合アフィニティーに大きな影響を及ぼす一方ｐＧＨ（４８−５２）は影響をもたない。 ｈＧＨレセプターとは異なりｈＰＲＬレセプターはｈＰＲＬおよびｈＰＬとは結合するがｐＧＨとは結合しない。 予想されるように、結合競合ホルモンｈＰＬまたはｈＰＬ由来の実質的に全ての置換は結合に影響しなえった。 唯一の例外はｈＰＬレセプターへの結合アフィニティーが７０倍以上減少するｈＰＲＬ（２２−３３）である。 このようにｈＰＲＬレセプターはｈＧＨ中ヘリックス１の中央領域および残基５７および７３の間のループ付近の突然変異に非常に敏感である。

またホモログースキャンデータによりｈＰＲＬおよびｈＧＨレセプターエピトープはいくつかのセグメント置換変異体がレセプター結合選択性に大きな変化を与えることから同一ではないことが示された（第XVIII 表）。 たとえばｐＧＨ（１１−３３）またはｈＰＲＬ（２２−３３）により引き起こされる結合への影響はｈＧＨレセプターに対してよりもｈＰＲＬレセプターに対しての方が約１００倍大きい。 一方、ｈＰＬ（５６−６４）およびｈＰＲＬ（５４−７４）はｈＰＲＬレセプターに関してほとんど影響しない一方それらは各々１７倍および６９倍ｈＧＨレセプターへの結合が弱くなった。 さらにこれらの選択的結合効果（先に議論したモノクローナル抗体の結合とともに）はレセプター結合アフィニティーの減少はｈＧＨの変異体における局所的であり、全体的構造変化によらないことを実証している。

【００９４】

ｈＰＲＬレセプターへの結合を強く調節するｈＧＨ中の特定の側鎖をアラニンスキャンニング突然変異誘発および相同的置換により同定した。 第XIX 表に示したｈＧＨ変異体を調製した。 ｈＰＲＬ置換、Ｆ２５ＳおよびＤ２６Ｅはヘリックス１における結合アフィニティーの最も大きい減少を引き起こした（各々２１および４５倍）。 これらの残基はヘリックス１の親水性面から突き出ており、かつ結合に緩やかな効果を与えるヘリックス１中の他の突然変異（主にＨ１８ＡおよびＦ１０Ａ）と同じ側に存在する。

ｈＧＨレセプターの結合に影響することが知られているループ領域（５４〜６８）中の４個の残基ならびに近接しているがｈＧＨレセプター結合に影響しないこの領域に先行する２つの残基（Ｑ４９ＡおよびＴ５０Ａ）をテストした。 最も破壊的な変異体は１５８ＡおよびＲ６４Ａであり、これらは各々結合アフィニティーが３２倍および６倍減少している。 他の４個の突然変異の影響は無視できる。

ヘリックス１およびループ領域（５８−６４）がｈＰＲＬレセプターに対する強力な結合決定基を含むという事実はヘリックス４と関係する。 というのはこのヘリックスはこれら２つの構造の間に押し込まれているためである（図２５Ｂ）。 事実、Ｃ１６５〜Ｖ１８５に結合するジスルフィド間のヘリックス４領域のアラニンスキャンニングは強力な結合決定基を明らかにした（第XIX 表）。 最も破壊的突然変異はほとんど４個のヘリックスターン、Ｒ１６７〜Ｒ１７８に分布しており、かつ同じ親水性面に存在する。

【００９５】

【表２１】

第 XIX 表ｈＰＲＬまたはｈＧＨレセプターフラグメント（ｈＰＲＬｒまたはｈＧＨｒ）に対するｈＧＨの単一変異体の結合。 部位指定突然変異誘発で作ったＱ２２Ｎ，Ｆ２５Ｓ，Ｄ２６Ｅ，Ｑ２９ＳおよびＥ３３Ｋ以外のｈＧＨの変異体は先に述べたように調製及び精製した（カニンガム（Cunningham), BC およびウェルズ（Wells), JA （１９８９）Science

２４４ 、１３３０−１３３５； ゾラー（Zoller), MJ およびスミス（Smith), M. (１９８２）Nucleic Acids Res.

１０ 、６４８７−６４９９）。 レセプター結合アッセイおよび変異体の名称を第XVIII に示す。 ｈＧＨｒに対する結合アフィニティーの減少のデータは第III 表からとった。 ＮＤは測定しなかったことを示す。

【００９６】

機能地勢図はｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターの位置に基づいて導びいた（図２８）。 ｈＰＲＬレセプターに対する最高のエピトープ部分は、（図２５Ｂ）。 結合アフィニティーの２倍以上の減少を示す突然変異が割り振られる。 この基準によりｈＰＲＬレセプターのエピトープは基本的にＦ１０〜Ｑ２９のヘリックス１の前面、Ｆ５４〜Ｑ６８のループおよびＲ１６７からＲ１７８のヘリックス４の親水性面に限定される。 一方、ｈＧＨレセプターエピトープ（図２５Ａ）はアミノ末端領域から１４〜Ｍ１４のヘリックスの前面、Ｆ５４からＳ７１のヘリックス１の前面およびＤ１７１からＶ１８５のヘリックス４の親水性面の残基を含む。 さらに変異分析がｈＰＲＬエピトープに残存するギャップを満たすのに必要であるがこのエピトープがｈＧＨレセプターのエピトープと重複するが同一のものではないことは明らかである。 これらのデータはｈＧＨを認識する結合決定基の全てがｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターに関しその細胞外結合ドメインと３２％のホモロジーを持つにもかかわらず同一のものではていことを示している。

レセプター結合アフィニティーに大きな変化を起こす残基は間接的な構造効果によってそれを行っている。 しかしこれら破壊的効果のほとんどがテストした全ての単一変異体が８個のｈＧＨモノクローナル抗体群に対し完全な結合アフィニティーを維持しており、かつしばしばレセプター選択性の変化に導くがレセプターアフィニティーに均一な影響を与えないことから局所的な効果によるものと考えられている（第XIX 表および以下参照）。

【００９７】

ｈＧＨのレセプター特異的変異体の設計多くの単一ｈＧＨ変異体はレセプター結合選択性に多くの変化を起こす（第XIX 表）。 最も顕著なのはｈＧＨレセプターに対するアフィニティーの４倍増加を導くがｈＰＲＬレセプターの結合は２０倍以上減少するＥ１７４Ａである。 このことはレセプター選択性の１２０倍の変化を示している。 別の突然変異は（主にＲ１７８ＮおよびＩ１７９Ｍ）はｈＧＨを選択的にｈＰＲＬレセプターに結合させる。 一般的にレセプター特異性を最も変化させる変異体は２つのレセプターエピトープの非重複領域に存在する。

レセプター結合の自由エネルギー変化が加算的であるならわずかな突然変異をもつｈＧＨの非常に特異的な変異体を設計することができると考えられる。 事実２つの最もｈＧＨレセプター選択的な単一変異体（Ｋ１６８ＡおよびＥ１７４Ａ）を合せると、その二重変異体はｈＧＨレセプターへの結合に関し２３００倍の選択性を示す（第XX表）。 先に指摘したようにｈＰＬ（５６−６４）の結合選択性はわずか２０の突然変異Ｅ５６ＤおよびＲ６４Ｍを含むｈＰＬ（５６−６４）によりほぼ２０倍増加し得る（第ＸIII 表）。 これらのｈＧＨ変異体（Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４ＡまたはＥ５６Ｄ、Ｒ６４Ｍ）は実質的に好ましいレセプター、各々ｈＧＨまたはｈＰＲＬに対する選択性を減少していない。 また同時に両レセプターの結合を減らすこともできる。

【００９８】

【表２２】

第 XX 表ｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプター（ｈＧＨｒおよびｈＰＲＬｒ）を識別するよう設計されたｈＧＨき二重変異体の結合、ｈＧＨ変異体の部位指定突然変異誘発により調製し、精製し、かつ第XIII表に述べた方法でｈＧＨｒまたはｈＰＲＬｒへの結合を検定した。 Ｋ

_D測定値の標準偏差は報告されている値の±１００％であった１０Ｍ以上の値以外報告されている値の２０％以下であった。

【００９９】

たとえば個々にｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターへの結合アフィニティーを大きく減少させるＫ１７２ＡおよびＦ１７６Ａを合せると各々５５０および１５０００倍のアフィニティーの破壊を生む。

全ての場合において結合自由エネルギー変化（△△Ｇ結合）は驚くべきほどに加算的である（第XXI 表）。 突然変異の加算的効果は酵素−基質相互作用にもみられ（PJ カーター（Carter) 等（１９８４）Cell

３８ 、８３５−８４０；JAウェルズ（Wells)等、（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８４ 、５１６７−５１７１）、プロテアーゼ−プロテアーゼインヒビター相互作用（M.ラスコウスキー（Laskowaki)等、“プロテアーゼインヒビター：医学および生化学的特徴”（１９８３）、 N．カツヌマ（Katunuma) 編、ジャパンサイエイスサイアティー版、東京、５５〜６８）およびたん白質の安定性（D.ショートル（Shortlo)等、（１９８６）Protein,

１ 、８１−８９（１９８６）： MMメクト(Mecht)、 JMスターテバント（Sturtevant) および RTソーアー（Sawer) Protein

１ 、４３−４６）にもみられ、またこれらの参考文献で公表されているように変異残基が独立に機能しかつ互いに接しているときは一般に身うけられる。 このことは多くのｈＧＨ変異体中で対を作っている残基は独立に機能していることを示している。 このような加算性は望ましいレセプター結合アフィニティーおよび特異性をもつｈＧＨ変異体を作る上で非常に予想可能な状況を作り出している。

【０１００】

【表２３】

第 XXI 表ｈＧＨまたはｈＰＲＬレセプター（ｈＧＨｒまたはｈＰＲＬｒ）への結合に関するｈＧＨ中の変異の加算効果。 野生型ｈＧＨに対する変異体の結合自由エネルギー変化（△△Ｇ結合）は△△Ｇ結合＝ＲＴ ｌｎ〔ＣＫ

_D ( 変異体）／Ｋ

_D （ｈＧＨ）〕

に従い結合アフィニティーの減少から計算した。 単一または多重変異ホルモンのＫ

_D （変異体）／Ｋ

_D （ｈＧＨ）値は第XIII表−第XX表から得た。

【０１０１】

ｈＧＨと同様にアドレナリンレセプター（RJ レフコウィッツ（Lefkowitz)および MGキャロン（Caron)（１９８８）J. Biol. Chem.

２６３ 、４９９３−４９９６）、ＩＣＦ−１レセプター（ MAカサイエリ（Cascieri) 等、（１９８９）J. Biol. Chem. ２６４、２１９９−２２０２）、ＩＬ−２レセプター（RJ ロブ（Robb) 等（１９８４）J. Exp. Med.

１６０ 、１１２６−１１４６； RJ ロブ（Robb) 等（１９８８）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８５ 、５６５４−５６５８）およびＡＮＰレセプター（ D. ロー（Lowe) およびD.ゴーデル（Goeddel)、非公開）など２つ以上のレセプターまたはレセプターサブタイプが存在する多くの例がある。 これらの場合、特定のレセプター機能を特定の薬学的効果と結びつけるのは難しい。 しかしレセプター特異的ホルモン類似体の使用でこの仕事を非常に簡便化できる。 たとえばカテコールアミン類似体はβ−アドレナリンレセプターサブタイプの特性を明らかにし、かつレセプター機能を生理的応答に結びつけるのに使われる（ RJ レフコウィッツ（Lefkowitz)等、（１９８３）Annu. Rev. Biochem.

５２ 、１５９−１８６）同様に、ｈＧＨのレセプター特異的変異体はｈＧＨの他のレセプターの同定やｈＧＨの複合体薬理学におけるｈＧＨおよびｈＰＲＬレセプターの働きを探る上での重要な道具を提供する。 この研究はレセプター特異的変異体の合理的設計を可能にするホルモンにおけるレセプター結合部位を同定するための系統的方法を示している。

【０１０２】

実施例１３

ヒト成長ホルモンに結合するヒトプロラクチンの作製プロラクチン（ＰＲＬ）は成長ホルモン（ＧＨ）、胎盤ラクトゲン（ＰＬ）およびプロリフェリンを含む相同ホルモン群の１員である。 ニコル（Nicoll), CS等（１９８６）Endocrlnol. Rev.

７ 、１６９−２０３。 集合的にこのグループのホルモンは成長、分化、電解質バランスなどに関する巾広い生理効果を調節する。 チョウラ（Chawla), RK等（１９８３）Ann. Rev. Med.

３４ 、５１９−５４７；イサクソン（Isaksson) OGP等（１９８５）Ann. Rev. Physiol.４７、４８３−４９９。 これらの薬理学的効果は特定の細胞レセプターへの結合で始まる。 たとえばｈＰＲＬはラクトジェニックレセプターには結合するがソマトジェニックレセプターには結合せず、また泌乳に活性化するが骨成長は活性化しない。 ｈＧＨはラクトジェニックレセプターおよびソマトジェニックレセプターの両方と結合し、かつ泌乳および骨成長の両方を活性化する。 レセプター結合特異性の差の分子的基礎はまだ理解てされていない。

ｈＰＲＬのクローニングと発現ｈＰＲＬのｃＤＮＡをλgt１０中のヒトの脳下垂体ｃＤＮＡライブラリーから（ハイン（Huynh), TV 等（１９８５）“ＤＮＡクローニング技術−方法”１巻、DM グローバー（Glover) 編（オックスフォードＩＲＬプレス）、４９−７８）公表されたＤＮＡ配列の５′および３′末端に対応するオリゴヌクレオチドを用いた（コーク（cooke)、NE 等（１９８１）J. Biol. Chem.

２５６ 、４００７−４０１６）ハイブリダイゼーションにより（マニアチス（Maniatis),T. 等編（１９８２）“モレキュラークローニング、ラボラトリーマニュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ））クローニングした。ほぼ全長のｃＤＮＡクローンが同定され、またコドン２２から停止コドンの下流５５bpまでの７２０bpＢst II −Ｈind III フラグメントをｐＪＣ１１８にサブクローン化した。この配列をダイデオキシ法（サンガー（Sanger), F. 等（１９７７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

７４ 、５４６３−５４６７）により決定したところ以前に報告されていたものと全く一致した（コーク（Cookた), KE 等（１９８１）J. Biol. Chem.

２５６ 、４００７−４０１６）。

【０１０３】

標準法により細胞内発現ベクターｐＢＯ７６０（図２６）を作った（マニアチス（Maniatis), T. 等編（１９８２）モレキュラークローニングラボラトリーマニュアル（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）。ｈＰＲＬ遺伝子の転写にｐＨＧＨ２０７−１由来の大腸菌 trpプロモーターを用いた（デボア（deboer), HA等（１９８２）“プロモーターの構造と機能”ロドリゲス（Rodriguez), RL およびチャンベリ（Chamberlin), MJ編（プラガー版、ニューヨーク）、４６２−４８１）。ｈＰＲＬコード配列は４７bp ＸbaＩ−ＢstＥ II 合成ＤＮＡカセットおよびｈＰＲＬ ｃＤＮＡ由来の７２０bp ＢstＥ II −Ｈind III フラグメントを含んでいる。合成ＤＮＡカセットは

という配列であり、開始コドンはアステリスクで示してある。 ファージｆｌオリジン、ｐＢＲ複製オリジンおよびｐＢＲ３２２β−ラクタマーゼ遺伝子はｐＢＯ４７５に由来する（カニンガム（Cunningham), BC等（１９８９）Science

２４３ 、１３３０−１３３５）。

ｐＢＯ７６０を含む大腸菌（ＭＭ２９４）を１５μｇ／mlカルベニシリン添加Ｍ９ハイケース培地１００mlを含む0.５Ｌ振とうフラスコ中３７°Ｃで４時間増殖させた（初期対数期；Ａ

₅₅₀ ＝0.1 〜0.3 ）（ミラー（Miller), JH( １９７２）“分子遺伝学実験”（コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ）。インドルアクリル酸を添加し（最終５０μｇ／ml）tep プロモーターを誘導した。細胞をさらに６〜８ｈ増殖した後遠心で収穫した。細胞分画実験はｈＰＲＬはほとんど排他的に包含粒子中に存在し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してみると全細胞たん白質中の２〜５％にあたることを示した（データ示さず）。

【０１０４】

ｈＰＲＬの精製および再生。 ｈＰＲＬを含む包含粒子を基本的に報告されている方法で単離した（ウィンクラー（Winkler), ME 等（１９８６）Biochemistry

２５ 、４０４１−４０４５）。 簡単に云うと、湿細胞ペレット５０ｇを0.２５リットルの１０mMトリス（pH 8.0）、１mM ＥＤＴＡ（ＴＥパッファ）に懸濁し、激しい超音波処理で細胞を分解した。 不溶性の物質で遠心（10,000×ｇ 15分間）で集め２５mlのＴＥバッファに懸濁した。 このサスペンションを５０％グリセリン0.２リットルのクッション上に重層し、９０００×ｇ２５分間の遠心によりｈＰＲＬ包含粒子をペレット化した。 この包含粒子由来のｈＰＲＬ（純度約２０％）を５mlのＴＥバッファに懸濁した。

ＴＥバッファ中0.３ｇの還元グルタチオン（シグマ）を含む８ＮＧn ＨＣl 溶液１５６mlに包含粒子を溶かすことによりｐＰＲＬを再生した。 室温で３０分間緩やかに攪拌した後この混合物を０°Ｃに冷やし、0.６ｇの酸化グルタチオンを含む冷ＴＥバッファ８４４mlで希釈した。 この溶液を４°Ｃで一晩ゆっくりと攪拌した後、２４時間に３回外液を変える４リットルのＴＥバッファを用いた透析を行った。 不溶性物質を遠心で除去した（10,000×ｇ ２０分間）。

さらに再生し可溶化したｈＰＲＬを４５％飽和の（NH

₄ )

₂ SO

₄の添加および室温2.５時間の攪拌による沈殿化で精製した。 この沈殿を遠心（１2,０００×ｇ 3０分間）で集め５mlのＴＥバッファに溶解した。 室温３０分後この溶液を清澄化した後（１0,０００×ｇ １０分間）、ミリポアフィルターで濾過した（0.45μm)。 この溶液を４°Ｃで一晩0.５リットルのＴＥバッファに対して透析した。 最後にこのｈＰＲＬ（純度８５％）を基本的にｈＧＨの精製について述べた方法と同じＤＥＡＥ高速マトリックスを用いたＦＰＬＣにより均一となるまで（＞９５％）精製した（カニンガム（Cunningham) 、BC 等（１９８９）Science 、

２４３ 、１３３０−１３３５）。

【０１０５】

ｈＧＨおよびｈＰＲＬ変異体の突然変異誘発および結合性部位指定突然変異誘発（ゾラー（Zoller)、 MJ等（１９８２）Nucleic Acids Res.,

１０ 、６４８７−６５００）は大腸菌のメチル化修復欠損株ＭutＬを用いて行った（クレーマー（Kramer)、 B. 等（１９８４）Cell

３８ 、８７９−８８７）。 変異体クローンの濃縮化は、インビボ生成ヘテロ二本鎖のトランスホーメーション後に得られた最初のプラスミドＤＮＡプールに制限精製または制限選択を応用し得るように各々単独制限部位を導入または除外する変異原オリゴヌクレオチドを設計することにより行った（ウェルス（Wells), JA 等（１９８６）Phil. Trans. R.Soc. Lond. A

３１７ 、４１５−４２３）。 全てのオリゴヌクレオチドはもっとも上流のミスマッチの５′側に正確にマッチする１２bpおよびもっとも下流のミスマッチの３′側に正確にマッチする１０bpを有するよう設計する。 ｈＧＨの突然変異誘発の場合、先に述べたｈＧＨ合成遺伝子は多くの制限部位を含んでおり、これをプラスミドｐＢＯ４７５にクローン化した。 ｈＧＨの変異体は大腸菌の細胞周辺腔に分泌され（チャン（Chang), CN 等（１９８７）Gene

５５ 、１８９−１９６）先に述べたように精製した。

各類似体のＫd 値は本明細書およびスペンサー（Spencer), SA 等（１９８８）、J. Biol. Chem.

２６３ 、７８６２−７８６７に述べられている精製組換えｈＧＨ結合たん白質に結合した(

¹²⁵ Ｉ）ｈＧＨの競合的置換により測定した。 先に述べたｈＧＨ結合たん白質（クローン化ヒト肝臓レセプターの残基１〜２３８を含む）をフー（Fuh)、G.等（１９８９）、提出）により述べられている方法により大腸菌から分泌させ精製した。 置換曲線を３回作成し、またＫd 値の標準偏差は一般に報告値の２０％以下であり、Ｋd 値が１０μＭ以上となる場合を除いて報告値の５０％を越えることはなかった。

ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ変異体の濃度は吸光係数＋Ｓ（0.１％、２８０）＝0.９（ウェトローファー（Wetlaufer)、 DB （１９６２）Adv. in Prot. Chem.

１７ 、３０３−３９０）を用いたＡ

₂₃₀で測定した。 これは変異体が芳香族残基における突然変異を含む場合はそれに応じて調整した。 吸光度により測定した濃度値はＳＤＳ−ＰＡＧＥとｈＧＨのコマージブルーによる染色を用いたレーザーデンシトメトリーによって測定した値と１０％以内の誤差で一致していた。 円二色スペクトルはアビブキャリー６０スペクトロポーラリメーターを用いて測定した。

ｈＰＲＬ中の残基がｈＧＨレセプターへの結合にもっとも破壊的であるかを探るため（図２７）、まず多くのｈＰＲＬ残基をｈＧＨ中に導入した（第XXII表）。

【０１０６】

【表２４】

【０１０７】

ｈＧＨ中部位５８、６４、１７６および１７８の単一アラニン置換はレセプター結合を著しく破壊するが、これらの部位におけるｈＰＲＬ残基の置換はほとんど影響しなかった。 ｈＰＲＬ置換の最も大きい効果は部位１７６および１７８を含むヘリックス４残基中に存在した。 これらのデータはｈＰＲＬのヘリックス４領域における残基がｈＧＨレセプターへの結合の欠除を最もよく説明し得ることを示している。

組換えｈＰＲＬは天然様の構造および機能性を維持していた。 まず近および遠紫外線ＣＤスペクトル（図２８）は天然のｈＰＲＬのスペクトルと同じであった（ビューリー（Bewiey) 、TA （１９７９）“ホルモン研究の最近の進歩”35巻、１５５〜２１３頁、アカデミープレス、NY ) 、遠紫外線スペクトルはｈＧＨと同じであり、このことは２０８nmおよび２２４nmにおける平均残基だ円率の重要な差がしられているが同様の４−ヘリックス束構造の存在を示している。 これらのホルモンの芳香族残基の数や微環境の差を反映する近紫外ＣＤは著しく異なる。 別の研究で組換えｈＰＲＬはｈＰＲＬ ＥＬＩＳＡにおいて十分な免疫学的交叉反応性を維持しており（データ示さず）、またラットのリンパ種Ｎｂ２細胞を繁殖させることにおいてｈＧＨと等価であった（タナカ（Tanaka), T. 等（１９８０）J. Clin. Endo. Metab.

５１ 、１０５８−１０６３）。 還元すると精製ｈＰＲＬはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度の著しい減少を起こし（ｈＧＨでもみられる）、このことはジスルフィド結合の形成を示している（ポリット（Poliitt), S.等（１９８３）J. Bacteriol。

１５３ 、２７−３２）。 アミノ末端配列分析は細胞内発現ｈＰＲＬはアミノ酸末端メチオニンを維持していることを示した。 しかし、メチオニルｈＧＨと同様このことは見かけ上その構造や機能に影響しない。

ｈＧＨ結合たん白質へのｈＰＲＬの結合はｈＧＨと比較して１０

⁵倍以上も減少し（第XXIII 表）、これは結合アッセイの検出限界以下である。

【０１０８】

【表２５】

【０１０９】

1. 先に述べたようにｈＰＲＬ変異体を生成、精製および分析した。 多くの変異体はコロンで区切られた一連の単一変異体で示される（第XXII表）。 コドン番号はｈＧＨ配列に基づいている（図２）。

2. 平均標準誤差は、それが５０％ほどになるＫd 値が１μM を越える場合を除いて報告値の２０％以下であった。 この誤差はＫd 値が１０μM を越えるとさらに大きくなる。

ｈＧＨ由来のヘリックス４中の３つの残基を組合せて（Ｈ１７１Ｄ、Ｎ１７５ＴおよびＹ１７６Ｆ）、ｈＰＲＬに導入した。 アラニンスキャンニング突然変異誘発およびｈＰＲＬ置換（第XXII表）はこれらの残基がｈＧＨのｈＧＨレセプターへの結合に非常に重要であっことを示している。 ｈＰＲＬのこの三重変異体はｈＧＨよりは１４０００倍も弱いがｈＧＨ結合たん白質に検出可能な結合を起こした。 さらにテトラ変異体を作るため他の重要なヘリックス４残基（Ｋ１７８Ｒ）を導入すると、これは野生型よりわずか６６０倍低いだけのレベルの結合に強められた（第ＸIII 表の変異体Ｂ）。 ｈＰＲＬ変異体ＢへのｈＧＨ残基１８４〜１８８の導入はｈＧＨ結合たん白質への結合を強化しなかった。 しかしｈＰＲＬ変異体Ｃを与えるＥ１７４Ａの導入（第XXIII 表）はＥ１７４ＡがｈＧＨに組込まれたときと同じようにｈＧＨ結合たん白質への結合アフィニティーをさらに3.５倍増加した。

【０１１０】

ヘリックス４領域への結合力をもつことから残基５４〜７４を含むループ領域を分析した。 ｈＰＲＬ中のループ領域をｈＧＨ由来の配列（第ＸIII 表のｈＧＨ（５４−７４））で完全に置換することはｈＧＨ結合たん白質へのかろうじて検出可能な結合を与える。 この変異体を変異体Ｂと合せたとき結合アフィニティーが実質的に増加する。 しかし、この新しい変異体（Ｂ＋ｈＧＨ（５４−７４））の結合アフィニティーは変異体Ｂ単独のときよりもほとんど１０倍減少する。 したがって５４−７４ループ中のいくつかのｈＧＨ残基はヘリックス４中のｈＧＨ置換と適合しなかった。 我々はｈＧＨの５４−７４ループからアラニンスキャンニング突然変異誘発によりもっとも結合に影響することが示された７個の残基を選択した。 ｈＧＨのＲ６４Ａ突然変異は結合アフィニティー４２０倍以上減少させるが、ｈＧＨのＲ６４Ｋ変異体（ｈＰＲＬ置換）はｈＧＨ結合たん白質への結合がわずかに多い（第XXII表）。 それゆえｈＰＲＬ中のＬys６４は変化しないままであった。 結果としてｈＧＨにおいてアラニンへの変化が最も破壊的であった７個の置換のうちの６個をｈＰＲＬへ組込んだ。 この新しい変異体（Ｂ＋Ｈ６５Ｆ：Ｓ５６Ｅ：Ｌ５８Ｉ：Ｅ５６Ｓ：Ｄ６８Ｎ：Ｑ６６Ｅ）はＢ＋ｈＧＨ（５４−７４）よりも５０倍も強く結合するが野生型ｈＧＨの結合アフィニティーよりもわずかに１１０倍小さいだけである。 しかし、これは変異体Ｂ単独よりもわずかな改善を示したのみで（６倍）、先にｈＧＨのループ領域において観察された強い相互作用に期待されるほどではなかった。 それゆえ、ループ内の６個の突然変異をさらに分断し、Ｈ５４Ｆ：Ｓ５６Ｅ：Ｌ５８Ｉ＋変異体Ｂの組合せが変異体よりも３倍も結合が弱いことが明らかになった。 最後に変異体Ｃへの突然変異Ｅ６２Ｓ：Ｄ６３Ｎ：Ｑ６６Ｅの組込みは（変異体Ｄ）はｈＧＨに比べ結合アフィニティーがわずかに６倍低いだけの最も高いアフィニティーをもつ類似体を生ずる。 別の単一突然変異（Ｈ５４Ｆ、Ｓ５６Ｅ、Ｌ５８Ｉ、Ａ５９Ｐ、Ｎ７１ＳおよびＬ１７９Ｉ）はｈＧＨ結合たん白質へのｈＰＲＬ変異体Ｄの結合アフィニティーを高めることはなかった。 変異体Ｄの構造は事実上ＣＤスペクトル分析（図２８）またはＥＬＩＳＡ活性（データ示さず）によって天然のｈＰＲＬと区別できなかった。

【０１１１】

これらの研究は部位指定突然変異誘発実験由来の機能情報のみを用いた遠い関係の類似体の結合性を回復させ得る可能性を示した。 ｈＧＨのアラニンスキャンニング突然変異誘発はｈＧＨのレセプターへの結合を調節するのに重要な側鎖の系統的分析を提供した（図２７）。 この情報はｈＧＨレセプター結合し得ないことを説明するｈＰＲＬ中の多くの残基を浮き立たせた（図２９）。 しかしさらに分析することでｈＧＨ中のアラニン置換がｈＧＨ中のｈＰＲＬ置換よりもより破壊的であることが示された（第XXII表）。 さらにいくつかのｈＰＲＬ置換は、特にｈＰＲＬ中により大きい側鎖が存在するとき結合アフィニティーに関し他のものよりかなり破壊的であった。 たとえばｈＧＨ中の保存的（しかしより大きい）Ｆ１７６Ｙ置換はｈＧＨレセプターに関する結合アフィニティーに８倍の減少を引き起こすが、一方より小さいＲ６４Ｋ置換は結合アフィニティーのわずかな増加を示した。 このようにｈＧＨ中の破壊的ｈＰＲＬ置換の分析は最初にｈＰＲＬへの結合アフィニティーを遂行するヘリックス４中の残基クラスターの導入を示している。 このことは野生型ｈＰＲＬによるｈＧＨレセプターへの結合が観察されないことから非常に重要であり、使用した検定の範囲内の結合アフィニティーをもたらすため（Ｋd ≦５０μM ）ｈＰＲＬ中に同時にいくつかのｈＧＨ置換を導入することが必要である。

ヘリックス４に機能的に重要な残基を導入することによりｈＰＲＬに容易に検出可能な結合アフィニティーを導入された。 しかし、５４−７４間のループ領域を作り出すことはより困難であることが分った。 ｈＧＨの全ループをｈＰＲＬに組込むことによる結合の増加は期待されたよりも小さく、至適化されたヘリックス４変異体Ｂと組合せたときは結合に対して破壊的であった。 我々のデータはｈＰＲＬの５４−７４ループ構造はこのたん白質中の他の相互作用により支持されることを示している。 この問題は段階的に解決された。 まず、ｈＧＨ中のｈＰＲＬ置換を伴アラニン置換で重要であると同定されたｈＧＨ由来の６個のループ残基をｈＰＲＬに導入した。 これはその状況を改善したにもかかわらずいくつかのｈＧＨ突然変異（Ｈ４３Ｆ、Ｓ５６ＥおよびＬ５８Ｉにしぼった）の組合せはｈＰＲＬに対して破壊的であった。 これらのデータはループ中のいくつかの残基がその構造に重要でありそのまま残した方がより安定でしることを示している。

【０１１２】

突然変異誘発の多くの反復サイクルがｈＰＲＬのｈＧＨレセプターへの堅い結合を可能にする残基の組合せを一本化するのに必要であった。 この戦術は変異効果が実際に観察されるように加算的であるという仮定に依存している。 たとえばＥ１７４Ａ突然変異がｈＰＲＬ変異体ＣまたはｈＧＨに加えられたとき結合を３〜５倍増加した。 さらに変異体Ｄに対するＨ５４Ｆ、Ｓ５６Ｅ、およびＬ５８Ｉ単一変異体の破壊的効果は（4.４倍）変異体Ｂに付加された３つの全ての突然変異の組合せによって引き起こされる破壊とほぼ同じであった（３倍）。

変異体Ｄの結合アフィニティーはわずか６倍減少するだけであるにもかかわらず変異体Ｄに組込んでさらに結合を改善する試みを行いうるＶ１４ＮおよびＨ１８５Ｖなどいくつかの他の残基がある。 すなわちｈＧＨ中のアラニン置換がｈＧＨの結合を２〜３倍の減少を起こす部位がある（図２９）。 高分解能の構造が設計過程の助けとなるが、それは明らかに基本的なものではない。 突然変異効果の累積性は天然の変化および淘汰サイクルによるたん白質進化と同じ様式で結合性を収れんさせうる。

従来のたん白質工学実験は高分解能構造分析を用いて基質接触残基による天然の変異体酵素の基質特異性の実際的変換が可能であることを示した（ウェルズ（Wells) JA等（１９８７）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ

８４ 、５１６７−５１７１；ウィルクス（Wilks), HM 等（１９８８）Science

２４２ 、１５４１−１５４４）。 同様に他のものは結合性は抗原結合ループ（ジョーンズ（Jones), PT 等（１９８６） Nature

３２１ 、５２２−５２５）またはＤＮＡレセプターヘリックス（ワートン（Wharton), RP 等（１９８５）Nature

３１６ 、６０１−６０５）を含む二次構造ユニットの全ユニットの置換により産み出し得ることを示した。 しかし、ｈＰＲＬにｈＧＨレセプター結合性を与えるにはｈＰＲＬの構造枠組内の選択的残基置換を必要とする。 さらにＣＤスペクトルデータはｈＰＲＬ変異体Ｄの全構造はそれぞれがｈＧＨと同様の結合性は維持しているにもかかわらず、ｈＰＲＬの構造には非常によく似ているがｈＧＨには似ていない。

【０１１３】

ｈＧＨレセプターへの結合特異性がｈＰＲＬに組込まれ得るという事実はソマトジェニックレセプター結合に対する特性の残基の機能的重要性を確認している。 またこれらの研究はｈＧＨとｈＰＲＬがわずか２３％の一致しかもたないにもかかわらず両者の構造的関係に対する動かぬ証拠を提供する。 これは成長ホルモン、プロラクチン、プロリフェリンまたは胎盤ラクトゲン構造を始めとするこのホルモン群内に含まれる新しいレセプター結合機能に近づく合理的方法を提供する。 このようなハイブリッドはレセプターサブタイプの薬理学的重要性とともにレセプター結合および活性化を区別する上で有用である。 これらの類似体はアゴニストまたはアンタゴニストとしてより有用な性質をもつ新しいレセプター特異的ホルモンの設計に導く。

【０１１４】

実施例１４

ヒト胎盤ラクトゲンへのヒト成長ホルモンの結合性の付与ヒト胎盤ラクトゲン（ｈＰＬ）のｈＧＨレセプターに対する結合アフィニティーはｈＧＨに比べ３０倍小さい（G.バウマン（Baumann)等（１９８６）J. Clin. Endocrinol. Metab.

６２ 、１３４； AGヘリントン（Herington)、等（１９８６）J. Clin. Invest.

７７ 、１８１７）。 以前の変異実験はｈＧＨレセプターに対するｈＧＨの結部位は基本的にアミノ末端（残基４−１４）付近のいくつかのマイナーな決定基とともに２つの領域（残基５４−７４および１７１−１８５を含む）内に存在する。 ｈＰＬの全配列はｈＧＨと８５％が同じである。 ｈＧＨ上のレセプター結合エピトープを広く構成している３つの領域内でｈＰＬはわずか７箇所で異なり以下の置換を含む：Ｐ２Ｑ、１４Ｖ、Ｎ１２Ｈ、Ｒ１６Ｑ、Ｅ５６Ｄ、Ｒ６４Ｍ、および１１７９Ｍ。 （この命名法では野生型ｈＧＨの残基を１文字コードで示し、つづいて成熟ｈＧＨの部位番号およびｈＰＬ中の残基を示した）。 これら７個の各部位においてｈＧＨの単一アラニン置換を作った。 これらのうち、４つのアラニン置換、１４Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｒ６４Ａ、およびＩ１７９Ａは結合アフィニティーの２倍以上の減少を引き起こすことが分った。 一般にアラニン置換は結合に関しヒトプロラクチン由来の相同的置換よりも大きい効果を有している。 それゆえ、ｈＧＨに導入されたｈＰＬ由来の置換のいくつかの効果を研究した。 Ｉ１７９Ａ置換はアフィニティーの2.７倍の減少を起こした一方、Ｉ１７９Ｍはわずか1.7 倍の効果しか示さなかった。 しかし、Ｒ６４ＡおよびＲ６４Ｍ置換は結合アフィニティーの同一およびより大きい減少（約２０倍を引き起こした。さらに、ｈＧＨの二重変異体（Ｅ５６Ｄ：Ｒ６４Ｍ）のアフィニティーはさらに計３０倍の減少を示した（第１表）。このようにＥ５６ＤおよびＲ６４Ｍは基本的にｈＧＨとｈＰＬのレセプター結合アフィニティーの差を決定する。それゆえｈＰＬの二重変異体Ｄ５６Ｅ、Ｍ６４Ｒは実質的にｈＧＨレセプターへの結合アフィニティーが増加している。Ｍ１７９ＩおよびＶ４１のような付加的修正もｈＰＬのｈＧＨレセプターへの結合を高める。

【０１１５】

実施例１５

ヒト成長ホルモンへの結合に関する部位１７４でのアミノ酸置換の効果先に示されているように、Ｇlu１７４のＡlaによる置換（Ｅ１７４Ａ）はヒト成長ホルモンのそのレセプターへのアフィニティーを４倍以上増加させる。 部位１７４における至適置換残基を決めるため他の１２個の残基で置換したｈＧＨ変異体を作りｈＧＨ結合たん白質とのアフィニティーを測定した（第XXIV表）。 荷電ではなく側鎖の大きさが結合アフィニティーを決定する主要要素である。 アラニンが至適置換を起こし、Ser 、 Gly 、 Gln 、 Asn 、 Glu 、 His 、 Lys 、 Leu 、 そしてTyr の順でつづいている。

【０１１６】

【表２６】

【０１１７】

a. 突然変異はｐＢＯ４７５にクローン化した部位１７８にＫpnＩ部位を含むｈＧＨ遺伝子の変異体に部位指定突然変異誘発を行うことにより生成させた（カーター（Carter), P. 等（１９８６）Nucleic Acids Res.

１３ 、４４３１−４４４３）。 突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは、

で表わされる配列を有している。 ここでＮＮＮは部位１７４の新しいコドンを表わし、またアステリスクはコドン１７８で始まるＫpnＩ部位を除外するミスマッチを示している。 変異コドンは次に示すものである：Ｇln, ＣＡＣ；Ａsn, ＡＡＣ；Ｓer, ＡＧＣ；Ｌys, ＡＡＡ；Ａrg, ＡＧＧ；Ｈls, ＣＡＣ；Ｇly, ＧＧＧ；Ｖal, ＧＴＧ；Ｌeu, ＣＴＧ。 ヘテロ日本鎖合成につづいて野生型配列のバックグランドを減少させるためおＫpnＩによる制限処理でプラスミドプールの突然変異を濃縮した。 全ての変異体配列はダイオキシ配列分析で確認した（サンガー（Sanger), F. 等（１９７７）Proc. Natl. Acad. Sci.ＵＳＡ

７４ 、５４６３−５４６７）。

ｂ． 側鎖バッキング値は C. コチア(Chotia)((１９８４）Annu. Rev. Biochem.

５３ 、５３７）のデータによる。

ｃ． 解離定数は先に述べたようなｈＧＨ結合たん白質による(

¹²⁵ Ｉ）ｈＧＨの競合適置換により測定した。 ＮＦは変異ホルモンが単離および検定するには低すぎるレベルで発現することを示している。

実施例１６

第XXV 表に示したｈＧＨ変異体を構築した。 野生型ｈＧＨに対するこれらの相対的能力を示す。

【０１１８】

【表２７】

本発明の好ましい態様を述べてきたがこれら公開した態様を種々に変化させうること、およびこのような修正は本発明の範囲内にあることは当業者にとって明白である。

【図面の簡単な説明】

【図１】活性ドメインの同定に使用する戦術を示している。

【図２】ｈＧＨ、ｈＰＬ、ｐＧＨおよびｈＰＲＬのアミノ酸配列中の保存性および可変性アミノ酸残基を示している。

【図３】ｈＧＨの推定される低分解能構造および各ヘリックスに対しＮ末端開始残基から見たラセン投影図を示している。 疎水性、中性および荷電残基は各々〇、■および●で示されている。

【図４】可溶性ｈＧＨレセプターに対する種々のセグメント置換ｈＧＨ変異体の結合に関する相対的減少を示す棒グラフである。

【図５】ソマトジェニックｈＧＨレセプターと相互作用する活性ドメインＡ、ＣおよびＦにおける類似アミノ酸を示す。

【図６】ソマトジェニックレセプターの相対的結合位置およびｈＧＨに対する８個のモノクローナル抗体を示す。

【図７】種々のアラニン置換ｈＧＨ変異体の可溶性ｈＧＨソマトジェニックレセプターに対する結合の相対的増減を示す棒グラフである。 Ｔ１７５の斜線棒はアラニンではなくセリンが置換していることを示している。 Ｒ１７８の縞棒はアラニンではなくアスパラギンが置換されていることを示している。

【図８】実施例で用いているｈＧＨ遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。

【図９】合成ｈＧＨ遺伝子を含むベクターｐＢＯ４７５の構築を示している。

【図１０】ｈＧＨのアミノ酸配列を示すｐＢＯ４７５のＤＮＡ配列である。

【図１１】ベクターｐＪ１４４６の構築を示している。

【図１２】肝臓由来のソマトジェニックレセプターの可溶性部分のアミノ酸配列を示すｐＪ１４４６のＤＮＡ配列である。

【図１３】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図１４】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図１５】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図１６】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図１７】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図１８】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図１９】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図２０】８個の異なるモノクローナル抗体各々に対するｈＧＨ上のエピトープ結合部位を示している。

【図２１】ｈＧＨ中のソマトジェニックレセプターに対する結合に関与する活性アミノ酸およびヘリックス１および４に関するラセン投影図を示している。

【図２２】ｈＧＨおよびｈＧＨ変異体を５０マイクログラム／kg／日で投与したラットの経時的体重増加を示している。

【図２３】野生型ｈＧＨと比較したｈＧＨ変異体の活性に対するＫd 比のセミログプロットである。

【図２４】ヒト血清（〇）またはプラスミドｐｈＧＨｒ（１−２３８）を発現する大腸菌ＫＳ３３０培養物から単離したｈＧＨ結合たん白質に対する(

¹²⁵ Ｉ）ｈＧＨおよび未標識ｈＧＨの競合結合曲線である。 棒は平均値からの標準偏差を示す。 挿入図は競合結合曲線から導びいたスキャッチャードプロットを示している。 ヒト血清および大腸菌由来の結合たん白質の濃度は各々0.１ nＭおよび0.０８ nＭであった。

【図２５】 2.８Å分解能のＸ線構造から決定したｐＧＨの構造に基づくｈＧＨの構造モデルである。 パネルＡはｈＧＨレセプターエピトープの機能性等高線地図を示しパネルＢはｈＰＬレセプターエピトープについて測定された同地図を示している。 黒丸の大きさは各残基のアラニン置換に関する破壊効果の大きさを示している。 小さな丸は２倍以上の破壊を示し、大きい丸は１０倍以上の破壊を示す。 ｈＧＨレセプターエピトープにおける▲は（バネルＡ）結合親和性が４倍以上増加させるＥ１７４Ａ Ｋ位置を示している。

【図２６】大腸菌におけるｈＰＲＬの細胞内発現に使用したプラスミドｐＢＯ７６０を示している。

【図２７】ｈＧＨ結合たん白質に対する結合に強く影響するｈＧＨ中の残基の位置を示している。 結合親和性の１０倍以上の減少（〇）、４〜１０倍の減少（■）または４倍以上の増加（▲）を引き起こすアラニン置換（Ｔ１７５またはＲ１７８の場合は各々セリンまたはアスパラギン）が示されている。 α−ヘリックス領域のラセン投影図はそれらの両親媒性およびヘリックス４において最も重要な決定因子は親水性面（影部分）に存在するという事実を明らかにしている。

【図２８】ｈＧＨ（−）、野生型ｈＰＲＬ（−−）およびｈＰＲＬ変異体Ｄ（−−−−）の遠紫外（パネルＡ）または近紫外（パネルＢ）における円二色スペクトルを示している。

【図２９】同類およびアラニンスキャンニング突然変異誘発により限定された結合に重要な領域に関するｈＧＨとｈＰＲＬの配列比較を示している。 同一残基は影を付け、またその番号はｈＧＨ配列に基づいている。 変異したとき結合親和性が４倍以上変化する残基には丸を付けた。 残基の上のアステリスクは変異が結合親和性を２〜４倍減少させる部位を示している。