Generation of artificial binding protein based on ubiquitinprotein |
|||||||
申请号 | JP2011104112 | 申请日 | 2011-05-09 | 公开(公告)号 | JP2011201893A | 公开(公告)日 | 2011-10-13 |
申请人 | Scil Proteins Gmbh; サイル プロテインズ ゲーエムベーハーScil Proteins Gmbh; | 发明人 | FIEDLER MARKUS; FIEDLER ULRIKE; RUDOLPH RAINER; | ||||
摘要 | PROBLEM TO BE SOLVED: To provide modified proteins of proteins having a ubiquitin-like fold motif and expressing a binding affinity with respect to a binding partner.SOLUTION: The modified proteins of the superfamily of ubiquitin-like proteins, proteins having a ubiquitin-like fold, and fragments or fusion proteins thereof, are provided. As a result of the modification, the modified proteins have binding affinity with respect to the predetermined binding partner that has not been previously existed. A method for producing the modified proteins and utilization of the same are also provided. | ||||||
权利要求 | “ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における1以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが維持されているタンパク質。 前記修飾のために選択されるタンパク質が、ヒトユビキチンと少なくとも30%のアミノ酸配列の同一性及びユビキチン様折り畳みモチーフを有し、かつ/又は、“ユビキチン関連タンパク質”のタンパク質ファミリーに属する請求項1記載のタンパク質。 前記修飾のために選択されるタンパク質が、ユビキチン様折り畳みモチーフを有し、好ましくは、SUMO‐1、FAU、NEDD‐8、UBL‐1、Rub1、APG8、I SG15、URM1、HUB1、GDX、elonginB、PLIC2(N末ドメイン)、ヒトparkin(N末ドメイン)からなる群から選択される請求項1又は2に記載のタンパク質。 前記タンパク質が、ヒトユビキチン又はその他の哺乳類のユビキチンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前記修飾が、前記タンパク質の表面の5から10アミノ酸、好ましくは6から8アミノ酸の隣接する領域を含み、好ましくはその2から4アミノ酸が表面露出βシートにある前請求項の1以上に記載のタンパク質。 第1及び第4βシート鎖の表面露出アミノ酸が修飾され、必要に応じて、さらに、哺乳類ユビキチンの非βシート領域の第62から65番目の領域が修飾された前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前記修飾が、置換、挿入、欠失、化学修飾又はこれらの組み合わせであり、一次配列で直接隣接した又は直接隣接していないアミノ酸を少なくとも部分的に1以上、好ましくは、置換を含み、好ましくは、一次配列において隣接していない修飾されたアミノ酸が、二次構造において隣接した結合パートナーに対する結合領域を形成する前請求項の1以上に記載のタンパク質。 修飾、好ましくは、置換される一次配列において直接隣接したアミノ酸の数が、2から8の直接隣接したアミノ酸であり、より好ましくは、3から7、又は、4から6、又は、 2から4の直接隣接したアミノ酸である前請求項の1以上に記載のタンパク質。 一次配列において互いに直接隣接した修飾されたアミノ酸の部分が、βシート鎖の開始又は終結部分であって、前記部分が、2以上のアミノ酸長、好ましくは、2又は3のアミノ酸長である前請求項の1以上に記載のタンパク質。 一次配列において互いに直接隣接する5以上のアミノ酸が修飾、好ましくは、置換され、そのうちの1、2以上、好ましくは、2又は3の直接隣接したアミノ酸が、βシート鎖領域の開始又は終結部分を形成する前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前記修飾が、前記タンパク質表面上で隣接する領域を形成するアミノ酸において行われる前請求項の1以上に記載のタンパク質。 請求項1の野生型タンパク質において、ユビキチンの天然結合パートナーへの結合に関与する領域に属さない位置のアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前記タンパク質、好ましくは、ユビキチンのβ鎖に存在する少なくとも25%のアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。 さらに、前記タンパク質のループ領域のアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。 ヒトユビキチン又はそれに相同なタンパク質であって、少なくとも8個のユビキチンの表面露出アミノ酸が修飾、好ましくは、置換されており、前記修飾アミノ酸が結合パートナーに対する結合親和性を有する領域を含む前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前記8個の表面露出アミノ酸のうち少なくとも6個が、前記タンパク質のβシート領域に指定される領域内に存在する請求項15記載のタンパク質。 修飾、好ましくは、置換された少なくとも5個のアミノ酸が、一次配列において互いに直接隣接している請求項15又は16に記載のタンパク質。 前記タンパク質のアミノ末端βシート鎖及び/又はカルボキシ末端βシート鎖に位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。 さらに、カルボキシ末端βシート鎖に続くループに位置するアミノ酸が修飾されている前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前記修飾タンパク質が、第2、4、6、62、63、64、65及び66番目の位置で、置換、欠失、挿入、及び/又は、化学修飾、好ましくは、置換されたヒトユビキチンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。 修飾のために選択されるタンパク質が、既に挿入、欠失、置換及び/又は化学修飾され、前記タンパク質の生物学的及び/又はタンパク質化学的機能が、廃棄され又は新規に生成された前請求項の1以上に記載のタンパク質。 修飾の後に、合計して少なくとも10、好ましくは、少なくとも15のユビキチンのアミノ酸が置換された請求項21記載のタンパク質。 置換、挿入及び/又は欠失による改変のために選択されるタンパク質が、第44、48 、54、70、72及び75番目の位置の1以上においてアミノ酸が置換され、第76番目のアミノ酸が欠失されたヒトユビキチンであって、本質的に天然の結合パートナーとの相互作用を示さないユビキチンである請求項21又は22記載のタンパク質。 前記タンパク質が、第45番目の位置においてフェニルアラニンからトリプトファンへの置換を含むヒトユビキチンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。 ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われた前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前記結合パートナーが、抗原又はハプテンである前請求項の1以上に記載のタンパク質。 予め定められた結合パートナーに対するK Dで表される結合親和性が、10 -6 Mから1 0 -12 M、さらにより好ましくは、10 -8 Mから10 -12 M、又は、10 -9 Mから10 -12 Mである前請求項の1以上に記載のタンパク質。 “ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、1以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが維持されているタンパク質であり、下記方法により得ることができるタンパク質。 a)修飾するタンパク質を選択し; b)結合パートナーを決定し; c)βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域におけるアミノ酸を選択し; d)前記選択アミノ酸を、好ましくは、置換、挿入、欠失、及び/又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持し; e)前記修飾タンパク質を、工程b)で決定した結合パートナーと接触させ、 f)工程b)で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する。 前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により、同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合されており、二価又は二重特異的な結合特性を示す前請求項の1以上に記載のタンパク質。 前請求項の1以上に記載のタンパク質の製造方法であって、前記タンパク質が、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも1 つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における1以上のアミノ酸の修飾に起因して、以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが保持されているタンパク質であって、下記工程を含む製造方法。 a)修飾するタンパク質を選択する工程。 b)結合パートナーを決定する工程。 c)βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む前記タンパク質の表面露出領域におけるアミノ酸を選択する工程。 d)前記選択アミノ酸を、置換、挿入、欠失、及び/又は、化学修飾により修飾し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフを維持する工程。 e)前記修飾タンパク質を、工程b)で決定した結合パートナーと接触させる工程。 f)工程b)で予め定めた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質を検出する工程。 工程c)からd)が、前記修飾タンパク質の化学合成により行われる請求項30記載の製造方法。 工程d)における修飾が、対応する修飾タンパク質に属するDNAを改変する遺伝子工学により行われ、前記タンパク質の発現が、原核若しくは真核生物宿主又はインビトロで行われる請求項31記載の製造方法。 工程d)において、遺伝子ライブラリが確立される請求項30記載の製造方法。 工程d)において、ランダム突然変異生成により選択されたアミノ酸のランダム置換が行われる前請求項の1以上に記載の製造方法。 工程e)において、予め定められた結合パートナーとの接触が、適切な選択方法、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、CI Sディスプレイ、又は、細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ、バクテリア表面ディスプレイ、特に好ましくは、ファージディスプレイ法により行われる前請求項の1 以上に記載の製造方法。 工程f)において、予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の検出が、ELISA、プラズモン表面共鳴分光法、蛍光分光法、FACS、等温滴定熱量計、又は、分析的超遠心分離法の1以上の方法により行われる前請求項の1以上に記載の製造方法。 工程f)の後に、検出された予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の単離及び/又は質向上の工程が続く前請求項の1以上に記載の製造方法。 前記タンパク質が、それ自体公知の方法により、その結合親和性、その結合特異性、及び/又は、安定性、溶解度、若しくは、収率などのその他のタンパク質特性が成熟される前請求項の1以上に記載の製造方法。 前記タンパク質が、部位特異的な共有結合により同じ又は異なる特異性のタンパク質に結合され、それにより、二価又は二重特異的タンパク質が得られる前請求項の1以上に記載の製造方法。 前請求項の1以上に記載のタンパク質の使用であって、それ自体公知の方法、例えば、 クロマトグラフィー又は吸収技術における、対応する結合パートナーの検出、定量、分離、及び/又は対応する結合パートナーの単離のための使用。 前請求項の1以上に記載のタンパク質の使用であって、対応する結合パートナーが直接又は間接的に関与する疾病の診断、予防及び治療のための使用。 |
||||||
说明书全文 | 本発明は、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフ(フォールディングモチーフ)を有するタンパク質、及び、その断片又は融合タンパク質の修飾タンパク質であって、前記修飾の結果として以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を示すタンパク質に関し、並びに、これらのタンパク質の調製方法及びその使用に関する。 ユビキチンは、小型、単量体、細胞質性のタンパク質であって、配列が高度に保存され、原生動物から脊椎動物まで既知の全ての真核生物に存在するタンパク質である。 前記生命体において、ユビキチンは、細胞のタンパク質の制御分解の調節において重要な役割を果たす。 この目的のために、分解に向かうことになっているタンパク質は、酵素のカスケードの通過の間にユビキチン又はポリユビキチン鎖に共有結合され、この標識のために選択的に分解される。 最近の結果によれば、ユビキチン又はユビキチンによるタンパク質の標識は、別の細胞プロセス、例えば、いくつかのタンパク質のインポートやその遺伝子制御などにおいても同様に重要な役割を果たす(Marx, 2002;非特許文献1)。 その生理的機能の解明に加えて、そもそも、その構造的及びタンパク質化学的特性のために、ユビキチンは、研究対象となっている。 ユビキチンのポリペプチド鎖は、76アミノ酸からなり、並外れてコンパクトなα/β構造に折り畳まれて(フォールドされて)いる(Vijay-Kumar, 1987;非特許文献2)。 そのペプチド鎖の87%のほとんどは、水素結合により、二次構造要素の形成に関与している。 顕著な二次構造としては、3回転半のαへリックス、及び、4つの鎖からなる逆平行のβシートが挙げられる。 これらの要素の特徴的な配置―タンパク質表面に露出した逆平行βシート、その裏側にαへリックスが包まれ、前記αヘリックスが前記βシート上に垂直に横たわる―は、一般的に、いわゆるユビキチン様折り畳みモチーフとみなされる。 それ故、ユビキチンは、タンパク質スーパーファミリー(“ユビキチン様タンパク質”)又は、タンパク質ファミリー(“ユビキチン関連タンパク質”)の名称の起源となっている(Murzin et al., 1995;非特許文献3) その小さなサイズのため、ユビキチンの人工的な調製は、化学合成によっても、バイオテクノロジー手法によっても、同様に実施できる。 その有利な折り畳み特性に起因して、 天然の機能が人工的な用途―例えば、バイオテクノロジー、生物学的分析、又は、医学など―に利用されるこれらのタンパク質の中で、抗体(即ち、免疫グロブリン)は、主要な機能を果たす。 任意に考えうる物質のほとんどに対して特異的に非共有結合する抗体の能力は、抗体を、リガンド、受容体若しくはその他の標的分子の認識、結合又は分離が必要な生物科学的用途のほとんど全てにとって、最も重要なツールとする。 近年発達した大腸菌における抗体断片の機能的生合成方法は、免疫グロブリンの利用可能性をさらに拡大させたが、同時に、その困難性及び限界を示した。 従来のタンパク質化学的方法によって主に得ることができたFab‐及びFv‐断片( 大腸菌における抗体断片の調製法は、診断及び治療に対して十分な質及び量の提供ができるのみならず、それらのタンパク質及びその免疫化学的特性の簡単かつ迅速な修飾ができる。 バクテリア宿主の容易な取り扱い性は、標準的な分子生物学的手法を用いたベクターにコードされる異種タンパク質遺伝子の直接的な改変を可能にする。 標的抗体工学 (Ko 上述したような抗体工学により提供される成果及び実現性にもかかわらず、いくつかの不利点が、抗体の実用を制限しうる。 すなわち、それらを十分量供給することが問題となる。 機能的抗体の産生は、真核細胞培養系、すなわち、並外れてコストが集中される方法で実施されるからである。 さらに、そのサイズに起因する抗体分子の低組織透過性、及び、血清中の長期滞留時間(遅い血中クリアランス )は、それぞれ、多くの治療の適用を妨害する。 より小型の抗体断片、例えば、scFv又はFab断片(上記参照)などは、バクテリアで、それ故基本的には低コストで、調製することができる。 しかしながら、この組換え産物の収率は、望ましくない折り畳み特性及びいくつかのジスルフィド結合の形成の必要性が原因で、望ましいレベルよりも低い。 さらに、組換え抗体断片は、しばしば、 そのような制限を回避するため、抗体結合の原理、つまり、保存されたタンパク質骨格上に位置する超可変表面露出領域を用いた結合を他のタンパク質に付与する試みがなされている(Skerra, 2000;非特許文献23)。 これは、本質的な可変ループが、人工的な結合特性を生むために変化されることを意味する。 この目的のため、通常、天然型の結合タンパク質、例えば、リポカリン(Beste et al., 1999;非特許文献24)又は、フィブロネクチンIII型ドメイン(Koide et al., 1998;非特許文献25)などのようなものが、抗体と同じような方法で、可動性“ループ”構造から結合部位が形成される開始点として使用される。 そして、その可動性“ループ”構造の修飾は、天然型のものとは異なるリガンドの認識を可能とする。 あるいは、WO01/04144(特許文献1)によれば、それ自体は結合部位を欠いたβシート構造タンパク質において、結合部位をそのタンパク質表面に人工的に作り出すことができる。 これを用いて、新規に作り出された人工結合部位(下記参照)、例えば、 Marx, J. (2002) Ubiquitin lives up to its name. Science 297, 1792-1794. Vijay-Kumar, S., Bugg, CE, and Cook, WJ (1987) Structure of ubiquitin refined at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 194, 531-544. Murzin AG, Brenner SE, Hubbard T., and Chothia C. (1995). SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. J. Mol. Biol. 247, 536-540. Muller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., and Jentsch, S. (2001) SUMO, ubiquitin's mysterious cousin. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 202-210. Michiels, L., Van der Rauwelaert, E., Van Hasselt, F., Kas, K., and Merregaert, J. (1993) Fau cDNA encodes a ubiquitin-like-S30 fusion protein and is expressed as an antisense sequence in the Finkel-Biskis-Reilly murine sarcoma virus. Oncogene 8, 2537-2546. Kumar, S., Yoshida, Y., and Noda, M. (1993) Cloning of a cDNA which encodes a novel ubiquitin-like protein. Biochem. Biophys. Res. Comniun. 195, 393-399. Jones, D. and Candido, EP (1993) Novel ubiquitin-like ribosome protein fusion genes from the nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. J. Biol. Chem. 268, 19545-195451. Filippi, M., Tribioli, C., and Toniolo, D. (1990) Linkage and sequence conservation of the X-linked genes DX253 (P3) and DXS254E (GdX) in mouse and man. Genomics 7, 453-457. Skerra, A. (2000) Engineered protein scaffolds for molecular recognition. J. Mol. Recognit. 13, 167-187. Dubel, S. and Kontermann, RE (2001) Recombinant Antibodies. In: Kontermann, R. and Dubel, S. (Hrsg.) " Antibody Engineering. "Springer Verlag, Heidelberg. Bird, RE, Hardman, KD, Jacobson, JW, Johnson, S., Kaufman, R., Lee, SM, Pope, HS, Riordan, GS, and Whitlow, M.( 1988) Single-chain antigen-binding proteins. Science 242, 423-426. Brinkmann, U., Reiter, Y., Jung, SH, Lee, B., and Pastan, I. (1993) A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv-fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7538-7542. Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan MD, Wong WL, Rowland AM, Kotts CE, Carver ME, and et al (1992) High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment. Biotechnology 10, 163-167. Holliger, P., Prospero, T., and Winter, G. (1993) " Diabodies ": small bivalent and bispecific antibodies. Proc. Natl. Sci. USA 90, 6444-6448. Muller, BH, Chevrier, D., Boulain, J.-C., and Guesdon, J.-L. (1999) Recombinant single-chain Fv antibody fragment-alkaline phosphatase conjugate for one-step immunodetection in molecular hybridization. J. Immunol. Methods 227, 177-185. Griep, RA, van Twisk, C., van der Wolf, JM, and Schots, A. (1999) Fluobodies: green fluorescent single-chain Fv fusion proteins. J. Immunol. Methods 230, 121-130. Reiter, Y. and Pastan, I. (1998) Recombinant Fv immunotoxins and Fv fragments as novel agents for cancer therapy and diagnosis. Trends Biotechnol. 16, 513-520. Dubel, S. and Kontermann, RE (2001) Recombinant Antibodies. In: Kontermann, R. and Dubel, S. (Hrsg.) " Antibody Engineering. "Springer Verlag, Heidelberg. Knappik, A., Ge, S., Honegger, A., Pack, P., Fischer, M., Wellnhofer, G., Hoess, A., Wolle, J., Pluckthun, A., and Virnekas, B. (2000) Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides. J. Mol. Biol., 296, 57-86. Winter, G. (1998) Synthetic human antibodies and a strategy for protein engineering. FEBS Lett. 430, 92-94. Hoogenboom, HR, de Bruine, AP, Hufton, SE, Hoet, RM, Arends, JW, and Roovers, RC (1998) Antibody phage display technology and its applications. Immunotechnology 4, 1-20. Hanes, J., Schaffitzel, C., Knappik, A., and Pluckthun, A. (2000) Picomolar affinity antibodies from a fully synthetic naive library selected and evolved by ribosome display. Nature Biotechnology 18, 1287-1292. Skerra, A. (2000) Engineered protein scaffolds for molecular recognition. J. Mol. Recognit. 13, 167-187. Beste, G., Schmidt, FS, Stibora, T., and Skerra, A. (1999) Small antibody-like proteins with predescribed Ligand specificities derived from the lipocalin fold. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1898-1903. Koide, A., Bailey, CW, Huang, X., and Koide, S. (1998) The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins. J. Mol. Biol. 284, 1141-1151. それ故、本発明は、選択された結合パートナーに対して以前は存在しなかった新規な結合親和性を示し、上述した不利点を示さないタンパク質の提供を目的とする。 本発明は、 本発明によれば、この目的は、請求項1に記載の修飾タンパク質であって、大部分は開始タンパク質、例えば、ユビキチンなどのタンパク質構造に基づき、その表面に人工的に生成された結合部位を有するタンパク質を提供することで達成される。 特に、本発明は、“ユビキチン様タンパク質”のスーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフをそれぞれ有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、前記タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域であってβシート領域の少なくとも1つのβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域を含む領域における1つ以上のアミノ酸の修飾に起因して以前は存在しなかった予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を示し、さらに、ユビキチン様折り畳みモチーフが保持されているタンパク質を提供する。 4個のバリエーションのタンパク質安定性について、ユビキチン(WT)及び対照エピトープと比較したコンピューター解析の結果を示す。 ファージディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するタンパク質への結合を検出するELISA実験の結果を示す。 リボソームディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するタンパク質への結合を検出するELISA実験の結果を示す。 リボソームディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するタンパク質への結合を検出するBIACORE実験の結果を示す。 ファージディスプレイにより選択されたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の対応するハプテンへの結合を検出するELISA実験の結果を示す。 ファージディスプレイにより選択され、二次的な突然変異生成により得られたユビキチンを基礎としたIgM Fcへの結合タンパク質であるバリエーションSPU‐3‐A7のその抗原への改善された結合を検出するELISA実験の結果を示す。 上述のとおり、本発明は、置換、挿入、欠失、化学修飾又はこれらの組み合わせにより修飾され、“ユビキチン様タンパク質”のタンパク質スーパーファミリーのタンパク質、 さらに、本発明は、それぞれ、上述したユビキチンに基づく修飾タンパク質の調製方法、及び、これらの修飾タンパク質の使用方法を提供することを目的とする。 したがって、本発明は、さらに、“ユビキチン様タンパク質”のスーパーファミリーのタンパク質、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質、及び、ユビキチン様折り畳みモチーフをそれぞれ有するその断片又は融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質であって、1つ以上のアミノ酸の修飾に起因して予め定められた結合パートナーに対する以前は存在しなかった結合親和性を示し、下記方法により得ることができるタンパク質の調製方法を開示する。 このように、本発明は、それぞれ、タンパク質又はポリペプチドの修飾により調製され、それぞれ、本願において定義するユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質又はポリペプチドを提供する。 これらは、“ユビキチン様タンパク質”タンパク質スーパーファミリー、ユビキチン様折り畳みモチーフを有する全てのタンパク質、及び、これらのタンパク質の断片又は融合タンパク質を含むタンパク質であって、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するという条件付きのタンパク質である。 これらのタンパク質又はポリペプチドから開始して、この開始タンパク質又はポリペプチドの1つ以上のアミノ酸が修飾される。 前記修飾は、特に、アミノ酸の置換を含み、また、同様に、1つ以上のアミノ酸の挿入及び欠失、並びに、アミノ酸の化学修飾を含む。 これらの修飾は、修飾されるタンパク質の少なくとも1つの表面露出領域において実行される。 少なくとも1つのアミノ酸の前記修飾は、βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖を含み、前記βシート鎖は、前記タンパク質の表面に局在する必要がある。 結合パートナー又はリガンドが、前記修飾タンパク質に測定しうる親和性で結合できるように接近可能とするためである。 本発明のその他の実施態様として、βシート領域のβシート鎖の改変に加えて、非βシート領域も同様に修飾される。 前記領域は、表面露出であることが好ましい。 前記予め定めた結合パートナーに対する結合親和性に影響を与え、好ましくは、結合親和性を増大させ、ひいては、特異性を向上させるためである。 当該技術分野の当業者は、1つ以上のアミノ酸の修飾のためのそれ自体公知のさまざまな技術を利用できる。 これらは以下により詳細に記載する。 加えて、Ausuebel et al., 1 ユビキチンの非表面露出コア領域におけるアミノ酸修飾は、既に公知である(Finucane 以下において、“以前に存在しなかった結合特性”、及び、 新規に生成された人工結合部位の用語の意味を、それぞれ、本発明に照らして説明する。 これらの用語は、その修飾タンパク質が、以前は前記修飾領域において予め定められた結合パートナー又はユビキチンの天然の結合パートナーに対して結合特性を示さないことを意味する。 本発明のその他の実施態様において、修飾されるタンパク質は、予め定められる結合パートナーに対して結合親和性を示さないものが選択される。 前記結合パートナーは、また、リガンドとして定義できるが、本発明により修飾されたタンパク質に対して測定可能な親和性を有する。 本発明において、修飾は、アミノ酸の置換、挿入、欠失、又は、化学修飾を意味することを意図される。 本発明において、修飾されるタンパク質として、“ユビキチン様タンパク質”スーパーファミリーのタンパク質を使用できる。 本発明において、このスーパーファミリーは、Mu 本発明において使用できるユビキチン様タンパク質スーパーファミリーに由来するタンパク質は、広範囲に特徴付けされている。 単なる例示として、次のインターネットサイトを参照できる: http://bip.weizmann.ac.il/scop/index.html 。 このサイトによれば、ユビキチン様タンパク質のファミリーは、ユビキチン関連タンパク質のファミリーが属するスーパーファミリーとして定義される。 このスーパーファミリーの全てのメンバーは、主に、逆平行様式に配置されたβシートにより特徴付けされ、α及びβのセグメントに細分される。 その折り畳みは、β‐グラスプ(Grasp)として定義され、ひいては、ユビキチン様として定義される。 そのコア領域は、次のように定義される:β(2)‐α‐β 当該技術分野の当業者は、配列比較、いわゆるアライメントを用いて、又は、構造的考察により、そのタンパク質がユビキチン様タンパク質のタンパク質スーパーファミリーのメンバーか否かについて、予め判断することができる。 当然ながら、最後の証拠は、いつも構造解析から得られる。 例えば、X線結晶学又は多次元核磁気共鳴分光学による構造解析が挙げられる。 最近では、遺伝学的アルゴリズムを使用した構造解析もまた、よい予測を与えうる。 ユビキチンスーパーファミリーについてのさらなる情報は、例えば、Larsen et al., 2 上述したファミリー及びスーパーファミリーのタンパク質は、通常、高度に保存されている。 現在の知識によれば、例えば、ユビキチンは、全ての哺乳類で同一のアミノ酸配列を有する。 酵母のユビキチンは、この配列と3つのアミノ酸のみ異なる。 ヒトユビキチン又は哺乳類のユビキチンは、それぞれ、76アミノ酸からなり、初めの方に記述した前記構造を有する。 本発明において、修飾されるタンパク質は、修飾される開始タンパク質、例えば、ヒトユビキチンに対して、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%若しくは50%、 本発明において、上述のタンパク質の断片も、それらが上述したユビキチン様折り畳みモチーフを有する限り含まれ、上述のタンパク質の他のタンパク質への融合物も同様である。 そのような断片及び融合タンパク質の場合、本発明の枠組みにおいて言及されるアミノ酸の位置は、常に、ヒトユビキチンにおけるそれぞれの位置を参照する。 融合パートナーの例としては、(レポーター)酵素、毒素、又は、その他の結合タンパク質などが挙げられる。 さらに、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光及び/又は発光物質などのような低分子量物質への化学的結合も実施できる。 融合タンパク質の場合、既に融合されたタンパク質を本発明に従って修飾できる。 しかしながら、修飾又は選択の後にセグメントを融合することも、同様に本発明に含まれる。 本発明において、修飾タンパク質の調製のために選択されるタンパク質は、ヒトユビキチン又はその他に由来するユビキチン、例えば、その他の哺乳類のユビキチンが好ましい。 それ故、以下においては、特に、ヒトユビキチンを例示的に使用して本発明について記載する。 ヒトユビキチンの修飾は、以下で、突然変異タンパク質(mutein)として参照され、予め定められた結合パートナーに対して以前は存在しなかった結合親和性を示すタンパク質を得るためのいくつかの実施例を用いて説明する。 哺乳類のユビキチンとしては、哺乳類の分野の中でも、特に、げっ歯類、家畜及び農業動物のユビキチンを使用できる。 本発明により調製されたタンパク質の使用分野が既知の場合、即ち、本発明の修飾タンパク質が、例えば、ヒトの疾病治療のための医薬組成物として使用される場合、ヒトタンパク質を修飾される開始タンパク質として使用することが好ましい。 このことは、対応する使用分野でも適用される。 以下に示される説明は、単に例としてヒトユビキチンに基づいていることに留意すべきである。 この明細書の詳細な説明及び示される実施例に基づいて、当該技術分野の当業者は、本発明に従い、ユビキチン特異的折り畳みモチーフを有するタンパク質をさらに修飾できる。 それ故、本発明は、ヒトユビキチン又は一般的なユビキチンに限定されない。 しかしながら、この点についての指示及び説明は、本発明の特に好ましい例示的な実施態様とみなされる。 上述のとおり、ヒト及び哺乳類のユビキチンは、それぞれ、76アミノ酸を有している。 逆平行βシートの形成に寄与する4つのβ鎖のアミノ酸は、本発明において、また、P 第1鎖(アミノ末端):2〜7; 第2のβシート鎖:12〜16; 第3鎖:41〜 修飾されるアミノ酸の選択と修飾: ProSAIIソフトウエア(“Protein Structure Analysi 好ましい実施態様によれば、―入手可能なヒトユビキチンの構造データから開始して― 本発明において、抗原は、抗体に結合される物質を参照する。 抗原の用語は、ハプテン、ペプチド、タンパク質、糖、DNAなどを含む。 Roche Lexikon Medizin(4th edition 抗原(AG) :免疫系により異種(“非自己”)であると認識されるあらゆるものの称号。 ほとんどの場合、免疫反応を引き起こし、免疫に至る(=“免疫原”);アレルギー(=“アレルゲン”)及びアトピー(=“アトピゲン”)の場合、それぞれ、この免疫反応が拡大する。 AGは、体液性(抗原抗体反応)及び/又は細胞性防御反応(免疫、下記参照)を誘導する。 AGが免疫系により許容される場合(免疫寛容)、“免疫寛容原”ともいう。 主に、免疫反応に関与する化学的に同定可能な機能性(決定基)を有する複合体やより大きな分子量の物質(タンパク粒、多糖、ヌクレオチド、及び多くの合成化合物) ハプテン :抗原(AG)の特異性に関与し、又は、その構造(決定基)に起因して抗体と特異的に結合できる簡単な、低分子量化合物であるが、完全AGと対照的にアレルギーを生じることはできない。 キャリアと呼ばれるタンパク粒と結合した後に完全な抗原(抗原)となる。 本発明を使用すれば、例えば、腫瘍マーカーなどのような非免疫原性物質に対し結合パートナーとして結合特性を有するユビキチンのバリエーションを同様に生成できることに留意すべきである。 本発明の好ましい実施態様において、修飾、好ましくは、置換は、一次配列において直接隣接する少なくとも2又はそれ以上のアミノ酸について部分的に行う。 ここで、互いに前記直接隣接するアミノ酸は、三次構造において、そのタンパク質のβシート鎖の少なくとも一部分に位置することがより好ましい。 一般的に、タンパク質におけるどのアミノ酸の置換も、そのタンパク質の安定性の低下を伴う。 単一置換は、たいてい、隣接するアミノ酸の影響に起因して広範囲に不安定化することなく許容されうる。 しかしながら、全体の領域、即ち、例えば、いくつかの隣接アミノ酸からなる構造全体が変化した場合、直接的に隣接するアミノ酸に起因する安定化の効果はもはや期待できない。 それ故に、これまでの従来技術においては、互いに直接隣接しないアミノ酸のみがユビキチンにおいて修飾された。 直接隣接するアミノ酸の修飾によるこのような広範囲にわたるタンパク質の改変の後に、前記タンパク質の安定性が実質的に低下しないことは驚愕すべきことであった。 特に、比較的小さなユビキチンの場合、直接隣接したアミノ酸の修飾は、なおさら、互いに直接隣接していないアミノ酸の場合よりも遺伝子工学によりこのタイプの修飾を施すことが一層容易になるという利点を有する。 それ故、この実施態様において、大多数の修飾タンパク質の簡易化された生成が、タンパク質レベル及びDNAレベルにおいて提供されうる。 直接隣接したアミノ酸の置換数は、好ましくは、2〜10であり、より好ましくは、2 一次配列において互いに直接隣接したアミノ酸が置換された場合、これらのアミノ酸の部分がβシート鎖領域に及ぶことができる。 βシート鎖領域にわたるこの部分は、2以上のアミノ酸長、好ましくは、2又は3つのアミノ酸長を有することができる。 それ故、直接隣接したアミノ酸の領域は、βシート鎖領域の始まりの部分又は終わりの部分であって、好ましくは、約2〜3のアミノ酸の長さを有する。 さらに好ましい実施態様において、5以上の直接隣接したアミノ酸が修飾、好ましくは、置換される。 ここで、2以上、好ましくは、2又は3の直接隣接したアミノ酸が、βシート鎖領域の始まりの部分又は終わりの部分を形成する。 この場合、好ましくは、8、9 ユビキチンのβシート鎖における直接隣接したアミノ酸の修飾の場合であって、これらのアミノ酸がβシート鎖の始まり又は終わりである場合、一般的に、これらのアミノ酸は、全て表面に露出している。 この場合、全てのアミノ酸が、新規な結合特性の生成に関与していると推測することができる。 本発明の好ましい実施態様において、これらのアミノ酸は、新規な結合特性を有する領域であって、タンパク質の表面上の隣接する領域を形成する領域を生成するために修飾される。 このようにして、以前は存在しなかった結合特性を有する隣接する領域を生成することができる。 本発明において、“隣接する領域”は、次の事項を参照する:それらの側鎖のチャージ、空間構造及び疎水性/親水性に起因して、アミノ酸が類似する様式でそれらの環境と相互作用する。 前記環境は、溶媒、一般には水、又は、例えば、空間的にアミノ酸に近い他の分子がなりうる。 タンパク質についての構造情報及びそれぞれのソフトウエアを用いて、前記タンパク質の表面を特徴付けできる。 例えば、タンパク質の原子と溶媒との間の界面領域は、このようにして、どのようにこの界面領域が構成され、その表面領域が溶媒に接近できるのかについて、又は、どのようにチャージが表面上に配置されているかについての情報を含み、視覚化できる。 隣接する領域は、例えば、適切なソフトウエアを使用したこのタイプの視覚化により、明らかにすることができる。 このような方法は、当該技術分野の当業者に公知である。 本発明によれば、基本的に、表面露出領域全体を、新規結合特性の生成のため修飾される表面上の隣接する領域として使用することができる。 好ましくは、この目的のために、修飾は、さらに、αヘリックス領域を含むことができる。 タンパク質の少なくとも1つの表面露出領域であって、βシート領域の少なくとも1つのβシート鎖が含む領域のアミノ酸を修飾することが重要である。 βシート構造は、本質的にシート状であり、ほぼ完全に伸長していることにより定義される。 連続したポリペプチド鎖のセグメントから形成されるαヘリックスと対照的に、βシートは、ポリペプチド鎖の異なる領域から形成されうる。 このようにして、一次構造では空間的に一層遠くに離れた領域が、互いに近接することができる。 β鎖は、一般的に、5〜10アミノ酸長であって、ほぼ完全に伸長した立体構造である。 β鎖は、互いに近接しており、一方の鎖のC βシート構造の突然変異生成のため、タンパク質において表面に近いβシート領域が選択される。 表面露出アミノ酸は、入手可能なX線結晶学構造により同定することができる。 結晶構造が入手できない場合には、コンピューター解析を用いて、入手可能な一次構造(www.embl heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)により表面露出βシート領域及び各アミノ酸位置の接近性を予測し、又は、3dタンパク質構造をモデル化し(www.expasy.ch/swissmo/SWISS-MODEL.html)、こうして潜在的な表面露出アミノ酸についての情報を得る試みをすることができる。 しかしながら、βシートにおける突然変異生成を実施して、突然変異させるアミノ酸位置の時間のかかる事前選択を省くことも可能である。 βシート構造をコードするDNA領域を、DNA環境から単離し、ランダム突然変異を導入し、その後、以前にそれらが除去されたタンパク質をコードするDNAに再び組み込む。 この後に、望ましい結合特性を有する変異体の選択工程が続く。 本発明のその他の実施態様において、表面に近いβシート領域は、既に上記で詳しく述べたとおり選択でき、これらの選択された領域内の突然変異導入するアミノ酸位置を同定できる。 このように選択されたアミノ酸位置は、その後、部位特異的突然変異生成によりDNAレベルで突然変異を導入する。 即ち、特定のアミノ酸をコードするコドンを、予め選択されたその他の特異的なアミノ酸をコードするコドンに置換する。 この置換は、ランダム突然変異生成により実施してもよい。 この場合、置換されるアミノ酸位置は確定されるが、新規でまだ決定されないアミノ酸をコードするコドンは確定されない。 表面露出アミノ酸は、周囲の溶媒に接近可能である。 タンパク質のアミノ酸の接近性が、モデルトリペプチドGly‐X‐Glyのアミノ酸の接近性と比較して、8%を超える場合、そのアミノ酸は、表面露出と呼ばれる。 これらのタンパク質領域又は各アミノ酸位置もまた、それぞれ、本発明により選択される予定される結合パートナーに対する好ましい結合部位である。 加えて、Connolly et al., 1983及びShrake et al., 1973を参照でき、その完全な開示は、参照することにより本願に含まれる。 新規に生成された人工結合部位の領域のアミノ酸置換によりその親タンパク質及び互いに異なるユビキチンタンパク質骨格のバリエーションは、それぞれの配列セグメントの標的突然変異導入により生成できる。 この場合、例えば、極性、チャージ、溶解度、疎水性若しくは親水性などのような特定の特性を有するアミノ酸は、それぞれ、その他の特性を有するアミノ酸と入れ替え又は置換できる。 置換に加えて、“突然変異生成”の用語は、 それぞれの配列セグメントの突然変異生成の開始点として、例えば、ユビキチン様タンパク質のcDNAが機能を果たす。 前記cDNAは、当該技術分野の当業者に公知の方法により調製され、改変され、増幅されうる。 比較的狭い範囲の一次配列(約1〜3アミノ酸)におけるユビキチンの部位特異的改変には、市販の試薬及び方法が自由に使用できる(“Quick Change”、Stratagene;“Mutagene Phag βシート領域の1つ以上のβシート鎖及び必要に応じて非βシート領域の突然変異生成の開始点として、例えば、ユビキチン様タンパク質のcDNA又は同様のゲノムDNAがなりうる。 さらに、前記タンパク質をコードする遺伝子は、また、合成的に調製しうる。 それ自体公知のさまざまな突然変異生成方法が利用可能であり、それらは、部位特異的突然変異導入法、ランダム突然変異導入法、PCR突然変異導入法、又は、これらに類似の方法である。 本発明の好ましい実施態様において、突然変異を起こすアミノ酸位置は、予め定められる。 修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるタンパク質に依存して、及び/又は、選択された結合パートナーに依存して行われる。 この場合、一般的に、さまざまな変異体のライブラリが確立され、それ自体公知の方法を使用してスクリーニングされる。 当然、修飾されるアミノ酸の事前選択は、修飾されるタンパク質について十分な構造情報が入手できる場合には、特に容易に実施できる。 しかしながら、そのような構造情報がなくても、ランダム突然変異生成及びそれに続く選択を採用する方法を使用し、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質を変化させ、予め定められたリガンド又は結合パートナーそれぞれに対する結合親和性を取り入れることが可能である。 例えば、PCR、化学的突然変異生成、又は、バクテリアの突然変異誘発株の使用により標的突然変異生成及びより長い配列セグメントの突然変異生成を行う方法は、同様に、 本発明の一実施態様において、突然変異生成は、アミノ酸コドンNNKを有するDNA 突然変異は、βシート構造が維持されるように実施される。 一般的に、突然変異生成は、タンパク質の表面に露出する安定したβシート領域の外側で行われる。 それは、部位特異的及びランダム突然の両方の突然変異生成を含む。 比較的狭い範囲の一次配列(約3〜 より広い領域に部位特異的突然変異を生成する場合には、DNAカセットを調製する必要がある。 ここで、突然変異を起こす領域は、突然変異させる位置及び変化していない位置を含むオリゴヌクレオチドのアセンブリにより得ることができる(Nord et al., 1997; 本発明の1つの実施例において、ユビキチンの第2、4、6、62、63、64、65 さらに、得られた増幅産物を、例えば、制限酵素認識配列を導入する側面オリゴデオキシヌクレオチドを使用したその他のポリメラーゼ連鎖反応に加えることができる。 適切な制限酵素で加水分解した後、得られた合成DNA分子は、例えば、しかるべく調製されたクローニング若しくは発現ベクターの核酸配列にライゲーション、即ち、連結することができる。 そのような方法や系は、当該技術分野の当業者に公知である。 これらの系は、例えば、Novagen (Madison, WI)、IBA (Gottingen)又は、New England Biolabs (Beverly, 本発明の好ましい実施態様において、修飾されていないユビキチンにおいて、ユビキチンの天然型の結合パートナーへの結合に関与する領域に属さないアミノ酸のみが、新規な結合特性の生成のために修飾される。 このことによって確実に、既に存在するユビキチンの結合特性は改変されない。 修飾のための領域は、基本的に、それらが予定される結合パートナーに接近可能かどうか、及び、タンパク質の全体的な構造が修飾を許容できると推測されるかどうかに関して選択される。 本発明において、タンパク質、好ましくは哺乳類のユビキチン中のβ鎖に存在するアミノ酸の少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも2 本発明の実施例において、例えば、β鎖に存在する24アミノ酸のうち6個が修飾され、予め定められた結合パートナーに対する結合特性を生成した。 より多数のアミノ酸を修飾のために選択することにより、結合親和性を有するタンパク質のより大きなライブラリを生成でき、これらの修飾タンパク質のいずれかが、予め定められた結合パートナーに対する定量化可能な及び/又は高い結合親和性を示す可能性を向上できる。 さらに、β鎖の修飾に加え、タンパク質のその他の表面露出領域の修飾もまた、実施できる。 好ましくは、例えば、ループ領域における修飾である。 β鎖における修飾領域に加え、これらの修飾領域も、新規に生成される結合に関与しうる。 本発明のその他の好ましい実施態様において、ユビキチン、好ましくは哺乳類又はヒトのユビキチンの表面露出アミノ酸のうち、少なくとも6個、好ましくは少なくとも8個を修飾することができ、前記修飾としては、置換が好ましい。 これらの少なくとも6個の表面露出修飾アミノ酸は、その後、予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有する領域を形成する。 この点において、前記表面露出アミノ酸のうち、少なくとも4個、 本発明のその他の好ましい実施態様において、タンパク質の4つのβ鎖のうち、少なくとも2つ、好ましくは正確に2つのβ鎖におけるアミノ酸が修飾され、新規な結合特性を生成する。 前記4つのβ鎖のうち3又は4つにおける修飾も同様に、選択された結合パートナーに対する以前は存在しなかった結合特性の生成のために好ましい。 アミノ末端及びカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸を修飾、好ましくは置換して、新規な結合特性を生成することが、特に好ましい。 この点において、さらに、カルボキシ末端βシート鎖に隣接するループにおけるアミノ酸を修飾、好ましくは置換することが、さらに好ましい。 哺乳類ユビキチン、好ましくはヒトユビキチンの下記位置:第2、4、6、62、63 本発明において、新規な結合特性の生成のためのアミノ酸置換は、任意の所望のアミノ酸で行うことができる。 即ち、新規な結合特性の生成のために修飾が行われる場合には、 本発明において、例えば、置換、挿入、欠失及び/又は化学的修飾などのようなその他の修飾により、この修飾の前に既にタンパク質の生物学的及び/又はタンパク質化学的機能がスイッチオフされた若しくは新たに加えられたものも、選択された結合パートナーに対する以前は存在しなかった結合親和性の生成のための修飾されるタンパク質とみなされうる。 従って、ユビキチンの天然型結合パートナーに対する結合特性は、例えば、スイッチオフすることができる。 従って、本発明の一実施態様において、第45番目の位置のアミノ酸フェニルアラニンがトリプトファンに置換されたヒトユビキチンのバリエーションが使用された。 このようにして、ユビキチンの構造及び安定性が維持されたまま、前記置換に起因してユビキチンと比較して分光学的特性が向上したタンパク質を提供できた。 本発明のその他の実施態様において、例えば、ヒトユビキチンの第44、48、54、 このタイプの既に前修飾がされたユビキチンが以前には存在しなかった結合特性の生成に使用される場合、ユビキチンは、野生型ユビキチン又は一般的な哺乳類ユビキチンのアミノ酸を総計で少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個置換して、最終的に好ましく得られる。 実施例において、このようにして、14個の置換及び欠失を有し、その原構造を維持した修飾ユビキチンが得られた。 ユビキチンのアミノ酸総数に基づけば、これは、約20%のパーセンテージに相当する。 このことは、並外れて驚愕すべきことであり、予測できないことであった。 なぜなら、一般的に、もっと低いパーセンテージで、すでに、タンパク質の折り畳みに支障を来たすには十分だからである。 本発明において、選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくは、ランダム突然変異生成、即ち、選択されたアミノ酸のランダムな置換による遺伝子レベルでの突然変異生成により実施される。 好ましくは、工程d)における修飾は、それぞれのタンパク質に属するDNAの改変のための遺伝子工学的手法により行われる。 好ましくは、その後、そのタンパク質の発現が、原核生物又は真核生物において行われる。 本発明において、修飾タンパク質は、さらに好ましくは、化学的修飾により調製されうる。 この実施態様において、請求項1の工程c)からd)は、1つの工程で実施される。 予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を用いたアミノ酸の選択と測定 : 本発明において、接触は、好ましくは、適した提示と選択方法、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ若しくは細胞表面ディスプレイ、酵母表面ディスプレイ若しくはバクテリア表面ディスプレイの方法、好ましくは、ファージディスプレイ法により行われる。 完全な開示としては、下記の参考文献を参照できる:Hoess, Curr. Opin. Struct. Biol. 3 (1993), 572-579; Wells and Lowmann, Curr 本発明において、修飾タンパク質が予め定められた結合パートナーに対して定量化可能な結合親和性を有するかどうかの測定は、好ましくは、1つ以上の下記方法により行うことができる:ELISA、プラズモン表面共鳴分光法、蛍光分光法、FACS、等温滴定熱量計、及び、分析的超遠心分離法。 本願に適合するファージディスプレイのタイプは、本発明における結合特性を示すユビキチンのバリエーションに対する選択方法の実施例として以下に記載される。 同様の様式で、例えば、バクテリア( バクテリア表面ディスプレイ ;Daugherty et al., 1998)若しくは酵母細胞( 酵母表面ディスプレイ ;Kieke et al., 1997)において提示する方法、又は、例えば、 リボソームディスプレイ (Hanes and Pluckthun, 1997;He and Taussig, 1 ここで記載されるファージディスプレイ法において、ユビキチンの組換えバリエーションは、線状ファージ上に提示され、一方、提示されるバリエーションをコードするDNA 予め定められたハプテン又は抗原に対する結合特性を有するユビキチンバリエーションの単離に関する選択方法に適したバクテリアのベクターであって、前述の融合タンパク質の遺伝子カセットが挿入されるベクターは、ファスミドという。 数ある中でも、それは、 得られたファスミドを、そこに提示されたユビキチンバリエーションの予め定められたハプテン又は抗原への結合について当該技術分野の当業者に公知の方法により選択することができる。 この目的のために、提示されたユビキチンバリエーションを、一時的に、例えば、マイクロタイタープレートに結合した標的物質に固定することができ、非結合バリエーションを分離した後に特異的に溶出することができる。 前記溶出は、例えば、100 このようにして得られたユビキチンバリエーションのさらなる特徴付けは、ファージミド、即ち、ファージに融合した形で、又は、同一遺伝子カセットを適した発現ベクターにクローニングした後に可溶性タンパク質の形で行うことができる。 適切な方法は、当該技術分野の当業者に公知であるか、又は、文献に記載されている。 前記特徴付けは、例えば、DNA配列、それ故、単離されたバリエーションの一次配列の決定を含みうる。 さらに、単離されたバリエーションの親和性及び特異性を、例えば、ELISA若しくはプラズモン表面共鳴分光法などのような免疫学的標準方法、蛍光分光法、FACS、等温滴定熱量計、又は、分析的超遠心分離法などにより検出できる。 安定解析法については、例えば、化学的又は物理的アンフォールディングに関連した分光法が、当該技術分野の当業者に公知である。 同様に使用されるリボソームディスプレイ法において、ユビキチンのバリエーションは、無細胞転写/翻訳系により調製され、対応するmRNA及びリボソームの複合体として提示される。 この目的のために、上述したとおり、バリエーションの遺伝子が発現及びタンパク質生合成のための対応する調節配列と融合した形で存在するDNAライブラリが、 これらの複合体は、そこに提示されたユビキチンバリエーションの予め定められたハプテン又は抗原への結合について当該技術分野の当業者に公知の方法により選択することができる。 この目的のために、リボソーム複合体上に提示されたユビキチンバリエーションを、一時的に、例えば、マイクロタイタープレートに結合した標的物質に固定することができ、又は、溶液中で結合後に磁性粒子に結合することができる。 非結合バリエーションを分離した後に、リボソーム複合体を破壊することにより、結合活性を有するバリエーションの遺伝子情報を、mRNAの形で特異的に溶出することができる。 前記溶出は、例えば、50mM EDTAにより好ましく行うことができる。 このようにして得られたmR インビトロ転写/翻訳、選択及び増幅の連続サイクルにより、予め定められたハプテン又は抗原に対する結合特性を有するユビキチンバリエーションの質を高めることができる。 このようにして得られたユビキチンバリエーションのさらなる特徴付けは、上述したとおり、同一遺伝子カセットを適した発現ベクターにクローニングした後に可溶性タンパク質の形で行うことができる。 適切な方法は、当該技術分野の当業者に公知であるか、又は、文献に記載されている。 好ましくは、(d)工程、即ち、予め定められた結合パートナーに対して結合親和性を有するタンパク質の検出工程の後に、検出したタンパク質の単離及び/又は質向上の工程が続く。 ユビキチン様折り畳みモチーフを有する本発明の修飾されたタンパク質の発現に続き、 本発明において、また、直前に記載の方法において、例えば、ハプテン又は抗原などの予め定められた結合パートナーに対する結合親和性を有するユビキチンのバリエーションは、概ね単離することができる。 本発明において提供される修飾タンパク質の結合パートナーとして、生物学的及び医学的に活性であり、関連する全ての分子を用いることができる。 予定される結合パートナーを以下に例示的に記す。 しかしながら、複数個のその他の考えられるリガンドをこのリストに加えることができることに留意すべきである。 抗体と抗原との関係と同様に、予定される結合パートナーのリストは、さらなる予定されるリガンドにより完成されうる。 好ましくは、結合パートナーは、生物学的受容体であって、好ましくはGタンパク質共役受容体(GPCR;例えば、ヒトGLP−1受容体、ヒトPTH受容体)、又は、EG 本発明の特別な利点は、修飾タンパク質又はユビキチンが、細胞内環境及び細胞外環境で活性を有すること、即ち、細胞の内部及び外部の両方でそれぞれの結合パートナーに結合することである。 本発明の修飾タンパク質又はユビキチンが、ハプテン、即ち、小さい分子、及び、抗原、即ち、例えばタンパク質などのような大きな分子の両方に定量化可能な様式で結合できることは、特に有利な点である。 本発明の修飾されたタンパク質のこの可変性により、有望な新規に生成される結合パートナーが、このようにして、結合パートナーの幅広い範囲であまねく提供される。 本発明のタンパク質は、さらに、検出及び定量、並びに、それぞれの結合パートナーの分離と単離のために使用できる。 その他の応用は、それぞれの結合パートナーが関与する疾病の診断及び治療においてである。 既に述べたとおり、本発明は、また、新規に生成された人工結合部位の外側に位置する各アミノ酸位置の標的改変に関する。 このようにして、例えば、天然ユビキチンにおいて生物学的機能を果たすアミノ酸に占められている位置を、その他のアミノ酸により占有することができる。 このようにして、例えば、ユビキチン化カスケードの酵素との相互作用などの生物学的機能が不活性であるが、その骨格及びタンパク質化学的特性がほぼ開始タンパク質と同一であるユビキチンタンパク質骨格が得られる。 これは、例えば、大腸菌における発現率の測定、例えば、化学的若しくは物理的アンフォールディングについての蛍光若しくは円偏向二色性測定などの分光法による安定性の解析、又は、例えば、ELIS Arg54及びArg72をそれぞれLeuとする置換により、例えば、ユビキチン活性酵素E1との相互作用を阻害できる(Burch and Haas, 1994)。 さらに、その他にも、 異なる文献において別々に述べられた修飾が、1つのユビキチンに、本質的にその構造又は安定性を変えることなく集約できたことは、驚くべきことである。 本発明の基礎をなす記載したアプローチにより、驚くべきことに、ユビキチン様折り畳みモチーフを有するタンパク質を基礎として、一方で、新規に生成された結合特性を示し、他方で、大部分ユビキチンのタンパク質化学的特性を示す修飾タンパク質を得ることができる。 この点において、ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質は、好ましくは、10 この場合に使用されるユビキチン骨格が、ポリペプチド鎖の折り畳みにマイナスの影響を与えることなく一次配列において行われる広範囲の改変を明確に許容することは、さらに驚くべきことである。 これは、アミノ酸置換の数―野生型ユビキチンの約20%―について予測できなかったのみならず、タンパク質骨格において変化されるアミノ酸位置の位置取りにもまた起因する。 従って、一般に強固で柔軟性がないとみなされるβシート内における、とりわけ、直接隣接したアミノ酸の置換に対する許容度は、事前に予測できなった。 得られたユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の突然変異DNAから開始して、前記タンパク質は、公知の遺伝子工学手法を用いて調製できる。 この点において、その産生は、原核生物宿主内で行うことが好ましい。 低コスト及び高収率のためである。 しかしながら、真核生物又は無細胞系の使用は排除されない。 一般的に、DNA配列の適した発現ベクターへの挿入、及び、適した生物へのトランスフォーメーション、トランスフェクション又はインフェクションの後、外来性の修飾タンパク質は、バクテリアの転写/翻訳系によって合成される。 この目的のために、調製方法は、新規結合特性を有する個々の修飾タンパク質に適合させることができる。 このようにして、例えば、大腸菌が宿主として使用される場合、ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質を、適したシグナル配列を用いてペリプラズム空間に分泌させることができ、又は、細胞質内に調製できる。 本発明の修飾タンパク質が、細胞内で折り畳みされずに凝集する場合には、このような封入体からの機能的な再折り畳みも、また、可能である。 無細胞系は、例えば、低発現率な又は宿主生物に対する毒性効果を有するバリエーションの場合に有利となりうる。 組換えタンパク質の調製及び精製のための遺伝子工学の適した手法は、それぞれ、当該技術分野の当業者に公知であり、文献に記載されている(例えば、Sambrook et al., 2001)。 したがって、人工結合部位の生成により新規な結合親和性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質であって、その極めて可変な表面が、例えば、ハプテン、ペプチド、 さらに、ランダム化された領域の可変表面特性に起因して、結合特性と異なる特性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質を、適切な選択方法を用いて、得ることができる。 これらは、例えば、予め定められた化学反応に対する以前は存在しなかった新規な触媒活性を含む。 この特性は、例えば、結合パートナーが、それぞれの反応が触媒されるような様式で前記修飾タンパク質により結合された分子又は遷移状態である場合に、得ることができる。 このように、本発明は、以前は存在しなかった新規結合特性の導入のための骨格分子としてのユビキチンなどのような分子の提供を含む。 さらに、本発明において、遺伝子ライブラリを、工程d)の方法、例えば、ランダム突然変異生成により、確立できる。 その実施態様の1つとして、本発明は、また、このように調製された遺伝子ライブラリを含み、特に、第2、4、6、62、63、64、65、 さらに、タンパク質骨格を、さらなる機能を修飾タンパク質に与えるために、人工結合部位の外側を標的として修飾することができる。 これは、例えば、適した試薬との化学的結合によるタンパク質複合物を得るための―好ましくは、アミノ及びカルボキシ末端における―さらなるアミノ酸の導入又は個々のアミノ酸若しくはペプチドの置換を含む。 そのような融合は、また、修飾タンパク質遺伝子の融合パートナー遺伝子への遺伝子工学手法を用いた結合により、直接調製することができる。 これは、抗体と対照的に、バクテリア宿主により、たった1つの外来遺伝子、ひいては、たった1つのペプチド鎖が発現され、 本発明により提供されるユビキチンに典型的な折り畳みモチーフを有する修飾タンパク質は、同じ又は異なる特異性のタンパク質に、部位特異的に共有結合することができる。 このように、例えば、上述の方法で得られた2つの同一のユビキチンバリエーションであって、同一抗原に結合するものは、当該技術分野の当業者に公知の方法を用いた単一システイン残基の付加導入を介して、部位特異的に互いに共有結合させることができる。 そのような二価結合特性は、一価のもの(結合活性効果)と比べてより強い明白な結合をすることにより特徴付けされる。 同様に、異なる抗原に結合する2つのユビキチンバリエーションを適当な方法により互いに結合させることができ、それにより、単独で二重特異性の結合分子を得られる。 そのようなヘテロ2量体の選択的形成のため、正又は負の荷電アミノ酸からなり、融合パートナーのカルボキシ末端に融合されるポリペプチド鎖を使用することができる。 正反対に荷電したアミノ酸が使用される場合、これらの、いわゆるポリイオンタグは、互いに静電相互作用を受け、異なる特異性の結合タンパク質を1:1という望ましい割合で互いに結合させる。 がん治療において、そのような二重特異性薬剤を、免疫系のエフェクター細胞と接触させて、例えば、腫瘍細胞などの適当な表面構造に的を絞ることにより、その腫瘍細胞を標的として破壊することができる。 さらに、上述の選択方法の1つにより単離され、既に特異的抗原に対して結合特性を示すユビキチンバリアントは、修飾して、その親和性及び/又は特異性の質をさらに向上させることができる。 この目的のために、アミノ酸の新たな標的及び/又はランダム置換を、結合部位の中及び/又は外に生成できる。 そのような成熟方法に適切な方法は、当該技術分野の当業者に公知である。 既に得られたユビキチンバリエーションの成熟は、親和性及び特異性を含むが、これらに限定されない。 向上しうるその他のタンパク質特性としては、例えば、安定性、溶解度、及び原核生物内における産生レベルなどが挙げられる。 本発明との関連では、例えば、ユビキチンバリエーションの免疫グロブリンMのFc部分への結合親和性が、このようにして、結合部位内の2つのアミノ酸の標的置換により、10 本発明により提供されるユビキチンを基礎とした修飾タンパク質は、抗体及びその断片と同様の様式で、幅広い用途で使用できる。 これは、診断及び治療の用途、並びに、クロマトグラフィー法を含む。 このように、標的物質を、任意の生物分析試験、例えば、EL 本発明において修飾され選択されたタンパク質は、このように、広範囲の考えられる用途が得られる。 それらは、医学、薬学の分野のみならず、分析論、栄養食品工業、栄養補助品、化粧品、医学的及び非医学的診断及び分析の分野などで利用できる。 当然に、利用分野は、選択した結合パートナーのタイプに依存する。 ヒト及び獣医学の薬物療法及び予防法の分野において、薬学的に効果のある薬剤は、それ自体公知の方法により調製できる。 生薬に依存して、これらの組成物を、経静脈的に、 前記組成物は、治療上有効な用量を含むように構成される。 投与される用量は、治療される生物、疾病の種類、患者の年齢及び体重、並びに、それ自体公知のさらなる因子に依存する。 前記組成物は、それ自体公知の助剤を含むことができる。 これらは、例えば、分解防止化剤、界面活性剤、塩、緩衝剤、着色剤などを含む。 前記医薬組成物は、液体製剤、クリーム、局所投与用のローション、エアロゾル、パウダー剤、顆粒剤、タブレット剤、座薬、カプセル剤、乳剤、又は、リポソーム製剤の剤形であってよい。 前記組成物は、好ましくは、無菌、非発火性かつ等張性であって、薬学上それ自体従来公知で許容できる添加剤を含む。 加えて、米国薬局方規則を参照できる。 以下の実施例は、本発明のさらなる説明のために提供される。 本発明が、一例として、 以下に本発明を実施例及び添付図面を用いてより詳細に説明する。 図1:表面に人工的に生成された結合部位を有する野生型ユビキチン(PDBコード: 図2:野生型ユビキチン(PDBコード:lubi)の表面上における結合部位の生成。 調製されるライブラリにおいてランダムに置換される残基(薄灰色で示される第2、4 図3:ファージディスプレイによるMUBIバリエーションの選択において使用するファスミドベクターpMUBI‐1。 pMUBI‐1は、ファージライブラリの調製に使用され、PelBシグナル配列、ユビキチンバリエーションの遺伝子、MyCUTタグ及びファージキャプシドタンパク質(aa253‐406、ΔgpIII)の融合タンパク質をテトラサイクリンプロモータ/オペレータ(tet p/o )の転写制御下にコードする。 図4:ユビキチンバリエーションのファージディスプレイライブラリの作成方法。 図5:ELISAにおける、recGLP1−Rに対するファージディスプレイにより選択されて得られたユビキチンバリエーションSPU‐1‐D10の、組換えにより調製されたヒトGLP‐1受容体のアミノ末端ドメインへの結合。 適切な数のウェルのマイクロタイタープレートをrecGLP1−R及びBSA、又は、組換えで調製したヒトPT 図6: リボソームディスプレイにより選択され得られたユビキチンバリエーションSP 図7: リボソームディスプレイにより選択され得られたユビキチンバリエーションSP 図8:ヒドロコルチゾンに対する選択で得られたユビキチンバリエーションSPU‐3 図9:部位特異的ランダム突然変異生成を用いた親和性成熟後のユビキチンバリエーションSPU‐2‐A7及びSPU‐2A7(62/63)のFcIgMへのELISAにおける結合の比較。 図5に記載された同じ実験方法を行った。 平衡条件下でのK D値の測定は、非線形回帰により行った。 図10:単一カルボキシ末端システイン残基を介して2つのユビキチンを基礎としたタンパク質の部位特異的共有結合についてのSDS‐PAGE解析。 20μLの非結合タンパク質(レーン1)及び結合反応後サンプル(レーン2)をアプライした。 電気泳動後、 新規に生成された結合親和性を有する修飾タンパク質の選択ための合成ユビキチン遺伝 人工結合タンパク質の調製のための開始点としてのIle44Ala、Lys48Ar 望ましいPCR産物は、分析アガロースゲル電気泳動を用いて同定し、MinElut 的確なDNA配列を有する遺伝子カセットは、調製的Nde I/ Xho I制限酵素処理によりクローニングベクターpCR(商標)4Blunt−TOPO(商標)から切り出し、調製アガロースゲル電気泳動により単離した。 修飾ユビキチンタンパク質骨格の遺伝子の発現ベクターpET20B(−)(Novagen)への挿入は、対応するタンパク質の産生のために行い、ファスミドベクターpMUBI‐1への挿入は、ユビキチンバリエーションのライブラリの作成のために行った。 ユビキチンバリエーションライブラリの調製 第2増幅工程は、1,000μLのサンプル容量で行い、第1のPCR反応で得られた約1.0ngの産物を使用し、 Taqポリメラーゼを採用した。 反応サンプルをピペットで取り、前記容量の20倍となるように適合させ、上述したとおり、10x Taqバッファー、25mM MgCl 2 、dNTPミックス、及び、5'末端がビオチン標識され、互換性がないSfi Iエンドヌクレアーゼの制限酵素認識部位を有する側面プライマー(配列番号12、13;10μM)を含ませた。 H 2 Oで満たした後、2.5UのTaqポリメラーゼを加熱中に添加し(上述参照)、PCRプログラムを開始した。 94℃/1分、 得られた増幅産物の次の切断は、PCR反応サンプル中で直接行った。 この目的のため、総容積4,000μLにおいて、完結したPCR反応溶液を、対応する容量の供給された10xバッファーII(100mM Tris/HCl、pH7.9、100mM M 受容ベクターの調製のため、ファスミドpMUBI‐1を、 Sfi Iを用いて製造業者の取扱説明書に従って切断し、より大きな(ベクター)断片を調製アガロースゲル電気泳動及びQIAクイックゲル抽出キット(Qiagen)を用いて単離した。 分子内ライゲーションを回避するため、その5'末端を脱リン酸化した。 この目的のため、0.5Uのエビ(Pandalus borealis)由来アルカリホスファターゼ及び供給されたバッファーを、 エレクトロポレーションのため、遺伝子パルサー(商標)IIシステム(Biorad ファージ表面におけるユビキチンバリエーションの調製とタンパク質及びハプテンに対 予め定められた標的物質に結合する表面提示ユビキチンバリエーションを有するファージミドを単離するための親和性マトリクスとして、マイクロタイタープレートの各24ウェルをそれぞれの物質でコートした。 組換え技術により調製されたヒトGLP‐1受容体(recGLP‐1R;Bazarsuren et al., 2002)のアミノ末端ドメイン、ヒト免疫グロブリンMのFc部分(FcIgM)及びBSAに結合したヒドロコルチゾン(HC)を標的物質として使用し、4℃一晩でマイクロタイタープレート上に固定化した。 前記マイクロタイタープレート表面上の空いている結合部位は、各ウェルを400μL 繰り返しのファージ産生及び新たな親和性向上サイクルのため、バクテリア細胞培養液の10倍低い培養液容量及びよりストリンジェントな洗浄条件を選択し、上述の方法を繰り返した(第2ラウンド:PBSTを用いた3x洗浄、PBS中4%BSAを用いた5分インキュベーション3回、及び、PBSを用いた3x洗浄;第3ラウンド:PBST0. 標的物質に特異的に結合するモノクローナルファージミドの単離と特徴付け(単一ファ ELISAを行うため、分析するモノクローナルファージミドにつきマイクロタイタープレートの1つのウェルを4℃の抗原で満たし、1つをBSA溶液で満たした。 ウェルのプラスチック表面の空いている結合部位の飽和は、3%BSA(w/v)PBST0.5 ELISAにおいて、各抗原に対して比較的強い結合シグナルを示し、BSAには示さなかったファージミド(約20個)に由来するユビキチンバリエーションのDNAを配列番号14のプライマー及び上述の方法を用いて配列決定した。 分析したDNA配列の一部分は、読み枠のシフト又はアンバーストップコドンを示し、それ以上使用しなかった。 このようにして得られ、さらに分析されたユビキチンバリエーションのアミノ酸置換を、例示的に表1にリスト化する。 (表1)異なる標的物質に対するファージディスプレイ選択後のユビキチンを基礎とした修飾タンパク質における新規に生成された結合部位領域のアミノ酸置換 1 SPU:結合ポケットに置換がないユビキチンタンパク質骨格 インビトロ転写/翻訳システムにおけるユビキチンバリエーションの調製及びリボソー 第1工程において、実施例2と同様に、8コドンに突然変異生成されたライブラリを表すユビキチンバリエーションの合成遺伝子を、配列番号1又は15に基づき、PCRを用いて調製した。 これは、 Pfuポリメラーゼ(Promega)を使用して50μLの容量で行った。 この目的のため、5μLの提供される10x Pfuバッファー及び4μLのdNTPミックスを使用し、H 2 Oで満たした。 さらに、サンプルには、望ましい塩基対置換を導入するため、2.5μLの側面プライマー(配列番号1に基づくライブラリに対しては配列番号16及び17、配列番号15に基づくライブラリに対しては配列番号18 バクテリオファージM13のエンベロープタンパク質IIIの一部を含み、インビトロ翻訳の過程で新生タンパク質をリボソームのチャネルから押し出しユビキチンバリエーションの最適な提示を可能とするスペーサは、2つの連続するPCR反応において合成された。 これは、第1に、5μLの提供された10x Pfuバッファー、4μLのdNTPミックス及び適量のH 2 Oを使用した総容積50μLで行った。 さらに、前記サンプルには、2.5mlの各側面プライマー(配列番号20、21;10μM)並びに1.0ngのバクテリオファージM13DNAを含ませた。 2.5UのPfuポリメラーゼを添加した後、94℃/1分、65℃/1分及び72℃/1.5分のサイクルを25サイクル、インキュベーションした。 最終インキュベーションは、72℃で5分行った。 望ましいPCR 以下の工程において、8コドンに突然変異導入されたライブラリを表すユビキチンバリエーションの合成遺伝子を、リンキングPCR反応を用いて調製したスペーサDNAに融合させた。 これは、 Pfuポリメラーゼ(Promega)を使用して50μLの容量で行った。 この目的のため、5μLの供給される10x Pfuバッファー及び4μLのdN 最終工程において、インビトロ転写/翻訳反応のための適切な制御配列(T7プロモーター、リボソーム結合部位)が、さらなるPCR反応により導入され、線状発現コンストラクトが完成した。 反応は、500μLのサンプル容量で行われ、先のPCR反応で得られた産物の約500ngを採用し、 Taqポリメラーゼを使用した。 反応サンプルは、1 インビトロ転写/翻訳反応のため、RTS100大腸菌キット(Roche Cat. 予め定められた標的物質に結合した表面に提示されたユビキチンバリエーションを有する三重リボソーム複合体の単離用の親和性マトリクスとして、マイクロタイタープレートの2つのウェルを対応する物質でコートした。 標的物質として、組換え技術により調製した成長因子VEGFを標的物質として使用し、4℃一晩でマイクロタイタープレート上に固定化した。 前記マイクロタイタープレート表面上の空いている結合部位は、各ウェルを400μLのWBT中3%BSAを用いて室温で90分インキュベーションしてブロックした。 ブロッキング溶液を除去した後、250μLのインビトロ転写/翻訳反応から得た三重リボソーム複合体を含む溶液をウェルごとに添加し、4℃、60分、50rpmでインキュベーションした。 次に、非結合の複合体を、例えば、WBTを用いた5回の洗浄( 得られた懸濁液からのRNAの単離は、室温で可能な限り迅速に、QiagenのRN 逆転写反応から得た反応サンプルを、質が向上したユビキチンバリエーションの遺伝情報の新しい再増幅用、及び、新しい選択サイクルの制御配列の再導入用のPCRに直接使用した。 この目的のため、 Expand High Fidelity PCRシステム( また、各遺伝子は、発現ベクターpET20B(−)にクローニングした(上述参照) (表2)異なる標的物質に対するリボソームディスプレイ選択後のユビキチンを基礎とした修飾タンパク質における新規に生成された結合部位領域のアミノ酸置換 1 SPU:結合ポケットに置換がないユビキチンタンパク質骨格 ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の調製と精製 新規な結合特徴を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の組換え技術による調製のため、50mLの2xYT/amp/kan培地へ単一コロニーを植菌し、37℃、 クロマトグラフィーは、AKTA(商標)エクスプローラFPLCユニット(Amer 新規結合特性を有するユビキチンを基礎とした修飾タンパク質の結合特性の特徴付け 固定化抗原と修飾タンパク質との間の結合/解離平衡を前提として、 実施例3及び4においてrecGLP1‐Rに対するファージディスプレイを用いた親和性向上で得られたユビキチンバリエーションSPU‐1‐D10に対するこの種類のE ユビキチンバリエーションの予め定められた抗原への結合の定量解析のため、BIAC まず、標的分子の測定のため、例えば、VEGFを、製造業者の取扱説明書に従い、第1級アミン基を介したNHS/EDC結合によりセンサーチップCM5(Biacore (表3)ユビキチンを基礎とした修飾タンパク質と異なる標的物質との複合体の解離定数 さらに、修飾タンパク質の結合特異性について評価した。 この目的のため、単一の適当な濃度の修飾タンパク質を使用して上述のようにELISA実験を行った。 この目的のため、マイクロタイタープレートのウェルを標的物質及び構造的に似た物質で満たした。 実施例3及び4においてHCに対する親和性向上で得られたユビキチンバリエーションSP 部位特異的二次的突然変異生成によるユビキチンを基礎とした結合タンパク質の結合特 この目的のため、2つの位置のコドン(第62、63番目、及び、第64、65番目) エレクトロコンピテント大腸菌、例えば、Nova−Blue又はBL−21細胞の形質転換の後、発現ベクターの形で得られた前記ライブラリのクローンの遺伝子情報を含む単一コロニーを得た。 96個のこれらの単一コロニーを使用して、300μLの2xYT 遺伝子の機能性の検証又は得られた置換の解析のため、前記ELISAにおいて比較的強い結合シグナルを示すSPU‐2‐A7のバリエーションについて、DNA塩基配列決定をした。 期待できる候補を、1.5Lスケールで組換え技術により調製し、カルボキシ末端に融合させた6ヒスチジンペプチドを使用した固定化金属キレートアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)を用いて精製した。 親和性の定量化のため、実施例7に記載のように、濃度非依存ELISAを、成熟の基礎としたユビキチンバリエーションであるSPU‐2‐A7と比較して行った。 ユビキチンバリエーションSPU‐2‐A7及びE 2つの同一のユビキチンを基礎としたタンパク質のビス‐マレイミド試薬によるカルボ 精製されたタンパク質を、1mM EDTA及び5mM β‐メルカプトエタノールを含むPBSに対して透析を行い、後に続くPBS、1mM EDTAを反応バッファーとして使用した結合反応に約1mg/mLの濃度で使用した。 この目的のため、最初に、タンパク質溶液を100mM ジチオトレイトール(DTT)に調整し、室温で1時間インキュベーションすることで、フリーのシステイン残基を還元した。 その後、PD10セファデックスG−25Mカラム(Amersham Biosciences)を用いて還元剤をタンパク質から分離し、過剰な2倍のモル濃度の結合試薬(ストック溶液:DMS この方法で得られた結合サンプルをSDS−PAGE(図10)で解析し、結合度を計算した。 上述の方法では、約40%であった。 参照文献: 配列番号1:修飾ユビキチンタンパク質骨格のDNA配列配列番号2〜7:鋳型配列番号8〜14:プライマー: |