Heterodimeric receptor library using phagemid |
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| 申请号 | JP2007130665 | 申请日 | 2007-05-16 | 公开(公告)号 | JP2007222179A | 公开(公告)日 | 2007-09-06 |
| 申请人 | Scripps Res Inst:The; ザ スクリップス リサーチ インスティテュート; | 发明人 | KANG ANGRAY; BARBAS CARLOS; LERNER RICHARD A; | ||||
| 摘要 | PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new surface integration technology expressing heterodimeric recombinant gene products on the surface of filamentous phage containing recombinant gene. SOLUTION: The filamentous phage containing a genome encoding ligand-binding heterodimeric receptor is provided, wherein the ligand-binding heterodimeric receptor comprises the first and second polypeptides, the first polypeptide is fused with a carboxy-terminated filamentous phage coat cpIII anchor domain or cpVIII anchor domain, the first and second polypeptides are independently expressed as different polypeptides and then reconstructed on the filamentous phage surface as the ligand-binding heterodimeric receptor. COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT | ||||||
| 权利要求 | リガンド結合へテロ二量体受容体をコードするゲノムをカプセル化する繊維状ファージ。 前記受容体がエピトープ結合複合体である請求項１記載の繊維状ファージ。 前記ファージが検出可能に標識された請求項１記載の繊維状ファージ。 第１および第２のポリペプチドからなるリガンド結合へテロ二量体受容体であって、前記第１のポリペプチドにはアミノ末端原核分泌シグナルドメインおよびカルポキシ末端繊維状ファージ膜アンカードメインが隣接し、前記第２のポリペプチドがアミノ末端原核分泌シグナルドメインに融合したリガンド結合へテロ二量体受容体。 前記受容体がエピトープ結合複合体である請求項４記載の受容体。 前記第１のポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドである請求項５記載の受容体。 前記第１のポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチドである請求項５記載の受容体。 前記原核分泌シグナルがｐｅｌＢ分泌シグナルである請求項４記載の受容体。 前記ｐｅｌＢ分泌シグナルが、 （ａ）配列番号：５， （ｂ）配列番号：６および （ｃ）配列番号：７ よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項８記載の受容体。 前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項４記載の受容体。 前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１７の残基２６〜残基４０の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１０記載の受容体。 前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項４記載の受容体。 前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１６の残基ｌ〜２１１の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１１記載の受容体。 融合ポリペプチドを発現するベクターであって、前記ベクターは挿入物ＤＮＡの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列からなり、前記上流の配列は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列は前記融合ポリペプチドの部分としての前記翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一組のＤＮＡ発現シグナルに機能的に結合したベクター。 前記原核分泌シグナルがｐｅｌＢ分泌シグナルである請求項１４記載のベクター。 前記ｐｅｌＢ分泌シグナルが、 （ａ）配列番号：５， （ｂ）配列番号：６および （ｃ）配列番号：７ よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１５記載のベクター。 前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項１４記載のベクター。 前記繊維状ファージ膜アンカーが、配列番号：１７の残基２６〜残基４０の式により表されるアミノ酸残基配列を有する請求項１７記載のベクター。 前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項１４記載のベクター。 前記繊維状ファージ膜アンカーが配列番号：１１２のヌクレオチド塩基配列を有する請求項１９記載のベクター。 繊維状ファージ複製開始点をさらに含む請求項１４記載のベクター。 前記一組の発現シグナルが、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列とフレームの合ったプロモーター、リボソーム結合部位、および少なくとも１つの停止コドンを含む請求項１４記載のベクター。 前記ベクターが配列番号：１１６の塩基１〜塩基２０８に示すヌクレオチドに示す配列を有する請求項１４記載のベクター。 第２の挿入物ＤＮＡの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した原核分泌シグナルをコードする第２の上流の翻訳可能なＤＮＡ配列をさらに含み、前記第２の翻訳可能なＤＮＡ配列が第２の融合ポリペプチドの部分としての前記第２の翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一組のＤＮＡ発現シグナルに機能的に結合した請求項１４記載のベクター。 前記原核分泌シグナルが、 （ａ）配列番号：５， （ｂ）配列番号：６および （ｃ）配列番号：７ よりなる群から選択される式によって表されるアミノ酸残基配列を有する請求項２４記載のベクター。 前記ベクターが配列番号：３の塩基３６〜塩基１１８に示すヌクレオチド配列を有する請求項２４記載のベクター。 前記ＤＮＡ発現ベクターがベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８またはｐＣＫＡＢ８である請求項２４記載のベクター。 前記ＤＮＡ発現ベクターがベクターｐＣＯＭＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３、ｐＣＯＭＢ２−３′または ｐＣＫＡＢ３である請求項２４記載のベクター。 アミノ末端で原核分泌シグナルドメインに機能的に結合し、カルポキシ末端で繊維状ファージ膜アンカードメインに機能的に結合したリガンド結合受容体ポリペプチドからなるポリペプチド。 ポリペプチドが抗体可変鎖ポリペプチドである請求項２９記載のポリペプチド。 可変鎖が抗体重鎖ポリペプチドである請求項３０記載のポリペプチド。 それぞれのファージ粒子が請求項１４または請求項２４記載のＤＮＡ発現ベクターを含む繊維状ファージ粒子のライブラリー。 前記ライブラリーが少なくとも１０ 7の異なる種の前記ＤＮＡ発現ベクターを含有する請求項３２記載のライブラリー。 それぞれのファージ粒子が少なくとも １つの請求項４記載のリガンド結合へテロ二量体受容体を含有する繊維状ファージ粒子のライブラリー。 免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発を誘導するプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは３′および５′末端を有し、 ａ）免疫グロブリン遺伝子の第１のフレーム構造領域に前記３′末端でハイブリダイズ し得るヌクレオチド配列、 ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第２のフレーム構造領域に前記５′末端でハイブリダイズ し得るヌクレオチド配列、および ｃ）次の式： ［ＮＮＲ］ｎ による前記３′および５′末端の間のヌクレオチド配列（式中、Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドであり、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログであり、ｎは３〜約２４であり、またＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、前記３′および５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する）およびこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド。 前記３′末端がヌクレオチド配列５'−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）およびこれに相補的な配列を有する請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。 前記５′末端がヌクレオチド配列５'−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ−３'（配列番号：１２３）およびこれに相補的な配列を有する請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。 前記免疫グロブリンがヒトのものである請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。 前記ＣＤＲがＣＤＲ３である請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。 式：５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ［ＮＮＲ］ｎＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２４）による請求項３５記載のオリゴヌクレオチド。 ｎが１６であり、ＲがＳ（配列番号：１２０）である請求項４０記載のオリゴヌクレオチド。 免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発を誘導するに際し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により免疫グロブリン遺伝子のＣＤＲ部分を増幅することからなり、ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドおよびこれに相補的な配列を使用し、前記オリゴヌクレオチドは３′および５′末端を有し、 ａ）免疫グロブリン遺伝子の第１のフレーム構造領域に前記３′末端でハイブリダイズ し得るヌクレオチド配列、 ｂ）免疫グロブリン遺伝子の第２のフレーム構造領域に前記５′末端でハイブリダイズ し得るヌクレオチド配列、および ｃ）次の式： ［ＮＮＲ］ｎ による前記３′および５′末端の間のヌクレオチド配列（式中、Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドであり、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログであり、ｎは３〜約２４であり、またＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、前記３′および５′末端ヌクレオチド配列は約６〜５０ヌクレオチドの長さを有する）からなる方法。 前記３′末端がヌクレオチド配列５′−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）およびこれに相補的な配列を有する請求項４２記載の方法。 前記５′末端がヌクレオチド配列５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ−３′（配列番号：１２３）およびこれに相補的な配列を有する請求項４２記載の方法。 前記免疫グロブリンがヒトのものである請求項４２記載の方法。 前記ＣＤＲがＣＤＲ３である請求項４２記載の方法。 式：５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ［ＮＮＲ］ｎＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２４）による請求項４２記載の方法。 ｎが１６であり、ＲがＳ（配列番号：１２０）である請求項４７記載の方法。 ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法であって、それぞれＤＮＡ分子は繊維状ファージ粒子の表面上でポリペプチドを発現させるシストロンからなり、 （ａ）連結緩衝液中で （ｉ）ｄｓＤＮＡの形態のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれのベクターは方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）、および （ｉｉ）線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクター（それぞれのベクターは（ａ）共通のリーディングフレームで前記ポリペプチドを方向性をもって受容するよう適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合した上流および下流の付着末端を有し、前記上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列はそれぞれ上流および下流のＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する） を組合せることにより連結混合物を形成し、 （ｂ）前記ポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合するのに十分な時間期間の間前記混合物を連結条件に供し、これにより前記ライブラリーを形成することからなる方法。 ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法であって、それぞれのジシストロン性ＤＮＡ分子は、繊維状ファージの表面上でヘテロ二量体受容体の第１および第２のポリペプチドを発現させる第１および第２のシストロンからなり、 （ａ）連結緩衝液中で （ｉ）線状ｄｓＤＮＡの形態の第１のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれは 方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）、および （ｉｉ）線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクター（それぞれのベクターは（ａ）共通のリ ーディングフレームで前記第１のポリペプチド遺伝子を方向性をもって受容するよ う適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結 合した上流および下流の第１の付着末端を有し、前記上流の翻訳可能なＤＮＡ配列 は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファー ジ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列はそれぞれ上流および下流の ＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する） を組合せることにより第１の連結混合物を形成し、 （ｂ）前記第１のポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合し、複数の環状Ｄ ＮＡ分子（それぞれは前記第１のポリペプチドを発現する前記第１のシストロンを 有する）を製造するのに十分な時間期間の問前記混合物を連結条件に供し、 （ｃ）前記環状ＤＮＡ分子を開裂させて前記第２の付着末端を形成するのに十分な制限 エンドヌクレアーゼ処理条件に前記複数の環状ＤＮＡ分子を処理することにより、 線状形態で複数のＤＮＡ発現ベクターを製造し（それぞれの線状ベクターは、（ｉ ）共通のリーディングフレームで第２のポリペプチド遺伝子のレパートリーの１つ を方向性をもって受容するよう適合し、（ｉｉ）それぞれの上流および下流のＤＮ Ａ配列に機能的に結合した第２の上流および下流の付着末端を有し、前記上流のＤ ＮＡ配列は原核分泌シグナルをコードする翻訳可能な配列であり、前記下流のＤＮ Ａ配列は前記リーディングフレームに少なくとも１つの停止コドンを有し、前記翻 訳可能なＤＮＡ配列はＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する）、 （ｄ）連結緩衝液中で （ｉ）工程（ｃ）で形成した前記複数のＤＮＡ発現ベクター、および （ｉｉ）ｄｓＤＮＡの形態の第２のポリペプチド遺伝子の前記レパートリー（それぞれ は前記複数の線状ＤＮＡベクターへの方向性をもった連結に適合した付着末端を有 する）を組合せることにより第２の連結混合物を形成し、 （ｅ）前記第２のポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に結合し、複数の環状Ｄ ＮＡ分子（それぞれは前記第２のポリペプチドを発現するための前記第２のシスト ロンを有する）を製造するのに十分な時間期間の間前記第２の混合物を連結条件に 供し、これにより前記ライブラリーを形成することからなる方法。 前記へテロ二量体受容体がエピトープ結合複合体である請求項５０記載の方法。 ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーであって、それぞれが繊維状ファージの表面でヘテロ二量体受容体の第１および第２のポリペプチドを発現する第１および第２のシストロンからなり、請求項５０記載の方法によって製造される前記ライブラリー。 繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を変化させるに際し、 （ａ）請求項３２記載の繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、 （ｂ）ライブラリーの構成員がリガンドに結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形 成するのに十分な条件下で調製したライブラリーと予備選択したリガンドとを接触 させ、 （ｃ）前記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成員から単離し、前記予備 選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積 ライブラリーを形成する工程からなる方法。 前記予備選択したリガンドを固体支持体に固定し、前記複合体を固相にあるものとし、前記単離が （ｉ）固体支持体を洗浄して固体支持体から非結合ライブラリー構成員を濯ぎ、 （ｉｉ）固相結合ファージ粒子を溶出させて前記単離したファージ粒子を形成する 工程からなる請求項５３記載の方法。 前記溶出が、前記固相結合ファージ粒子とｐＨ２〜ｐＨ６のｐＨを有する溶出緩衝液とを接触させることからなる請求項５４記載の方法。 前記溶出が、前記固相結合ファージ粒子と前記予備選択したリガンドを含有する溶出緩衝液とを接触させることからなる請求項５４記載の方法。 前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＶＩＩＩ膜アンカーである請求項５４記載の方法。 前記繊維状ファージ膜アンカーがｃｐＩＩＩ膜アンカーである請求項５４記載の方法。 繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を増加させるに際し、 （ａ）請求項３２記載の繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、 （ｂ）それぞれのＤＮＡ発現ベクターに存在する免疫グロブリン可変ドメインコード ヌクレオチド配列を変異させ、それぞれ変異した免疫グロブリン可変ドメインヌク レオチド配列を含有するファージ粒子のライブラリーを形成する 工程からなる方法。 請求項２記載の繊維状ファーゾによりコードされるエピトープ結合複合体の親和力を成熟させるに際し、 （ａ）前記繊維状ファージのゲノムを調製し、 （ｂ）調製したゲノムに存在する免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列 を変異させ、変異した免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を含有するフ ァージ粒子のライブラリーを形成し、 （ｃ）ライブラリーの構成員がリガンドと結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形 成するのに十分な条件下で工程（ｂ）で形成したライブラリーと予備選択したリガ ンドとを接触させ、 （ｄ）前記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成員から単離し、前記予備 選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積 ライブラリーを形成する工程からなる方法。 前記変異が、エラープローン（誤りがちな）ポリメラーゼ連鎖反応に前記免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を供することからなる請求項６０記載の方法。 前記変異が、免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列のＣＤＲを変異させる請求項３５記載の方法に前記免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を供することからなる請求項６０記載の方法。 前記免疫グロブリン可変ドメインがＶ Hである請求項６０記載の方法。 サンプル中の予備選択したリガンドの存在を検出するに際し、 （ａ）予備選択した抗原を含有すると考えられるサンプルと前記予備選択したリガンド に結合する請求項４記載のリガンド結合へテロ二量体受容体とを、前記リガンド結 合へテロ二量体受容体が前記リガンドに結合してリガンド−受容体複合体を形成す るのに十分な結合条件下で混合し、 （ｂ）前記リガンド受容体複合体または前記リガンド結合へテロ二量体受容体の存在を 検出する工程からなる方法。 前記リガンド結合へテロ二量体受容体が繊維状ファージ粒子の表面上にある請求項６４記載の方法。 前記リガンド結合へテロ二量体受容体が、ｃｐＩＩＩおよびｃｐＶＩＩＩよりなる群から選択される繊維状ファージ膜アンカーに融合した請求項６５記載の方法。 前記検出が、前記繊維状ファージ粒子の存在、およびこれにより前記生成物の存在を検出することからなる請求項６５記載の方法。 |
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| 说明书全文 | 本発明はクローン化ベクター、および繊維状ファージ粒子の表面上で融合ポリペプチドを発現し得るＤＮＡ分子のライブラリーの製造方法に関する。 繊維状バクテリオファージは細菌に感染する一群の関連するウイルスである。 Ｆｆファージ粒子の集成は高度に複雑な機構を含む。 宿主細胞内でファージ粒子が集成されることはなく、これらは寧ろ宿主細胞の膜を介するウイルスゲノムの押出しの際に集成される。 押出しの前に、主コート蛋白質ｃｐＶＩＩＩおよび副コート蛋白質ｃｐＩＩＩが合成され、宿主の細胞膜に移される。 ｃｐＶＩＩＩおよびｃｐＩＩＩの両者は、成熟粒子へのこれらの組込みの前に宿主細胞膜に定置される。 更に、ウイルスゲノムが生産され、ｃｐＶ蛋白質によってコートされる。 押出し過程の際に、ｃｐＶコートゲノムＤＮＡはｃｐＶコートを剥され、同時に成熟コート蛋白質により再コートされる。 これらの蛋白質の膜から粒子への移動を調節する集成機構は現在では知られていない。 ｃｐＩＩＩおよびｃｐＶＩＩＩ蛋白質の両者は、成熟ファージ粒子の集成のシグナルを与える２つのドメインを含む。 第１のドメインは、新たに合成された蛋白質を宿主細胞膜に向ける分泌シグナルである。 分泌シグナルはポリペプチドのアミノ末端に局在し、ポリペプチドを標的として少なくとも細胞膜に向かわせる。 第２のドメインは、宿主細胞膜との会合および集成の際のファージ粒子との会合のシグナルを与える膜アンカードメインである。 ｃｐＶＩＩＩおよびｃｐＩＩＩの両者についてのこの第２のシグナルは、少なくとも膜を渡る疎水性領域からなる。 ｃｐＩＩＩの配列の操作により、正常には膜アンカー機能の礎となる疎水性アミノ酸のＣ末端２３アミノ酸残基の伸張は種々の方法で変えることができ、膜と会合する能力は保持されることが示された。 しかしながら、このようなアンカー修飾ｃｐＩＩＩ蛋白質は遺伝子ＩＩＩ変異体と遺伝的に相補するその能力を喪失し、機能的集成に対する膜アンカーの必要性が解明されていないことを示している。 組換え遺伝子を含む繊維状ファージの表面上でヘテロ二量体組換え遺伝子産物を発現させる新しい表面組込み技術を突き止めた。 この発明は、繊維状ファージ複製の集成段階に際して遺伝子産物および遺伝子を結合させる手段として繊維状ファージコート蛋白質膜アンカードメインを使用するものである。 よって、本発明は、ヘテロ二量体受容体および受容体をコードする遺伝子を単離する方法においてヘテロ二量体受容体認識および繊維状ファージ複製の機能の結合を提供するものである。 この方法により、組換えゲノムをカプセル化する遺伝子ＶＩＩＩコード蛋白質のマトリックスから構成した繊維状ファージを製造する。 組換えゲノムは、ヘテロ二量体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。 ヘテロ二量体受容体は、ヘテロ二量体受容体ポリペプチドの１つへの翻訳の際にペプチド結合により融合した繊維状ファージコート蛋白質の膜アンカードメインを介してカプセル化マトリックスに表面組込みされている。 ヘテロ二量体受容体ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ複製周期の集成段階に際して物理的に結合される。 固体支持体に対する受容体コートファージの特異的結合により、組換えゲノムの多様なライブラリーから所望のヘテロ二量体受容体をコードする組換えゲノムを単離する手段が有利に提供される。 １つの態様では、本発明は重鎖および軽鎖ポリペプチドからなる抗体分子を企図し、前記重鎖ポリペプチドはアミノ末端原核分泌シグナルドメインおよびカルボキシ末端繊維状ファージ膜アンカードメインが隣接するＶ Hドメインからなり、前記軽鎖ポリペプチドはアミノ末端原核分泌シグナルドメインに融合したＶ Lドメインからなる。 Ａ． 定義 式にここに示した全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の慣用された方向で左から右の方向性を有することを銘記すべきである。 更に、「アミノ酸残基」という記載は、対応表に列記したアミノ酸並びに修飾および通常でないアミノ酸、たとえば３７ＣＦＲ１．８２２（ｂ）（４）に列記されたもの（参考によりここに取入れる）を包含するものとして広く定義する。 更に、アミノ酸残基配列の始めまたは終りのダッシュは、１以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合またはＮＨ 2のようなアミノ末端基またはアセチルまたはＣＯＯＨのようなカルボキシ末端基に対する共有結合を示すことを銘記すべきである。 塩基対（ｂｐ） ：二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の対合関係。 ＲＮＡではチミンをウラシル（Ｕ）で置換する。 遺伝子 ：そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸。 遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡとすることができる。 相補的塩基 ：ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖構造をとる場合に正常に対合するヌクレオチト。 ＤＮＡ相同体 ：予備選択した保存されたヌクレオチド配列および予備選択したリガンドに結合し得る受容体をコードする配列を有する核酸。 抗体 ：抗体という用語はその種々の文法的形態においてここでは免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子に言及するものである。 例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の部分（当業界でＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′） 2およびＦ（ｖ）として知られる部分を含む）である。 モノクローナル抗体 ：モノクローナル抗体という記載は、その種々の文法的形態において、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団に言及するものである。 よってモノクローナル抗体は典型的には免疫反応する全ゆる抗原に対して単一の結合親和力を示す。 したがってモノクローナル抗体は複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含み、それぞれ異なる抗原に対して免疫特異的であり、たとえば二特異的モノクローナル抗体がある。 シストロン ：アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ分子のヌクレオチド配列であり、上流および下流のＤＮＡ発現調節要素を含む。 Ｂ． 繊維状ファージ 第１および第２のポリペプチドは機能性エピトープ結合複合体（ヘテロ二量体受容体）への自己集成が可能であり、これはその後リガンドに接近し得る様式で外側表面上で発現される、すなわちこれらはファージに表面で組込まれている。 表面接近可能な様式で受容体がファージに結合するため、ファージを固相アフィニティ吸収体として有利に使用することができる。 好適な態様では、アガロース、セルロース、合成樹脂、多糖類等のような固体（水不溶性）マトリックスにファージを結合、好ましくは着脱可能に結合させる。 例えば、ファージを収納する形質転換体をカラムに充填保持し、ファージの収納を支持する条件下に維持することができる。 ファージにより発現された受容体に結合するリガンドを含有する水性組成物に、その後所定の速度で受容体結合条件下にカラムを通過させて固相受容体−リガンド複合体を形成する。 その後カラムを洗浄して非結合物質を除去すると、固相ファージに結合したリガンドが残る。 その後受容体−リガンド複合体の解離を促進する緩衝液でカラムを洗浄することによりリガンドを除去して回収することができる。 この発明のファージは、この発明の診断方法で使用する場合に標識することができる。 好適な標識には、ファージゲノムに組込まれた放射性標識核酸、またはファージ粒子の蛋白質成分に組込まれた放射性標識アミノ酸が包含される。 標識したファージの調製は、ここに記載するようにファージを生育させることにより慣例に従って調製することができるが、それぞれファージの核酸またはポリペプチドへの組込みのために放射性標識した核酸または放射性標識したアミノ酸を培養培地に含むものとする。 例示的な標識は3 Ｈチミジン、または35 Ｓメチオニンである。 他の同位元素標識および他のヌクレオチドまたはアミノ酸前駆体は当業者に容易に利用可能である。 標識したファージは、好ましくはこの発明のリガンド結合検定で検出し得るのに十分な標識を含む、すなわちファージは検出可能に標識される。 Ｃ． ＤＮＡ発現ベクター 発現ベクターは、本発明の融合ポリペプチドのような構造遺伝子産物を和合性の宿主中で発現し得ることを特徴とする。 好適な態様では、利用するベクターは、原核レプリコン、すなわちこれにより形質転換された細菌宿主細胞のような原核宿主細胞中で染色体外の組換えＤＮＡ分子の自己複製およひ維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列を含む。 この種のレプリコンは当業界で周知である。 更に、原核レプリコンを含むこのような態様は、その発現によって、これにより形質転換された細菌宿主に薬剤耐性のような選択性の利点を与える遺伝子も含む。 典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。 ベクターは、典型的には翻訳可能なＤＮＡ配列の挿入を図る便利な制限部位も含む。 例示的なベクターには、バイオラド・ラボラトリイズ（リッチモンド、ＣＡ）から入手可能なプラスミドｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、並びにファルマシア（ピスカタウェイ、ＮＪ）から入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３がある。 方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列、すなわちポリリンカーは、（１）複製および移動のために上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合し、（２）ＤＮＡ配列のベクターへの方向性をもった連結のための部位または手段を与えるＤＮＡ発現ベクターの領域である。 典型的には、方向性ポリリンカーは、２以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列または制限部位を特定するヌクレオチドの配列である。 制限開裂に際して、２つの部位は付着末端を生成し、これを介して翻訳可能なＤＮＡ配列をＤＮＡ発現ベクターに連結することができる。 好ましくは、２つの制限部位は、制限開裂に際して非相補的な付着末端を与え、これにより翻訳可能なＤＮＡ配列のカセットへの方向性をもった挿入を可能とする。 １つの態様では、方向性をもった連結手段は、上流の翻訳可能なＤＮＡ配列、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列または両者に存在するヌクレオチドによって与えられる。 他の態様では、方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列は、多重方向性クローン化手段を特定するヌクレオチドの配列からなる。 方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列が多数の制限部位を特定する場合、これを多重クローン化部位として言及する。 翻訳可能なＤＮＡ配列は、１つのリーディングフレームにポリペプチドをコードする少なくとも８コドンの非中断系列を与える線状系列のヌクレオチドである。 ｐｅｌＢ蛋白質のリーダー配列は、融合蛋白質の分泌シグナルとして先に使用されている。 ベターら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４０−１０４３（１９８８）、サストリーら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８６：５７２８−５７３２（１９８９）、およびムリナックスら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８７：８０９５−８０９９（１９９０）。 下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードする。 好適な膜アンカーは、繊維状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄ等の等価な繊維状ファージから取得することができる。 好適な膜アンカードメインは、遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＶＩＩＩによりコードされるコート蛋白質に認められる。 よって、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩコートポリペプチドの膜アンカードメインに対応する、また好ましくは同一のアミノ酸残基配列をコードする。 ファージｆ１において、遺伝子ＶＩＩＩコート蛋白質の膜縦断領域は残基Ｔｒｐ−２６乃至Ｌｙｓ−４０からなり、細胞質領域はカルボキシ末端１１残基４１〜５２からなる。 オーカワら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５６：９９５１−９９５８（１９８１）。 例示的な膜アンカーはｃｐＶＩＩＩの残基２６〜４０よりなるものとし得る。 繊維状ファージ粒子の構造、そのコート蛋白質および粒子集成の詳細な記載については、ラチェトら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５０：４０１−４２７（１９８６）による総説およびモデルら「バクテリオファージ：第２巻」中、アール・カレンダー編、プレナム・パブリシング社、ｐｐ． ３７５−４５６（１９８８）を参照することができる。 ＤＮＡ発現調節配列は、構造遺伝子産物を発現するための一組のＤＮＡ発現シグナルからなり、周知のようにシストロンが構造遺伝子産物を発現することができるようにシストロンに機能的に結合した５′および３′要素の両者を含む。 ５′調節配列は、転写を開始するプロモーターおよび上流の翻訳可能なＤＮＡ配列の５′末端に機能的に結合したリボソーム結合部位を特定する。 （ｉ）ＳＤ配列と１６ＳｔＲＮＡの３′末端との間の相補性の程度。 ３′調節配列は、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合しフレームの合った少なくとも１つの終止（停止）コドンを特定する。 よって、この発明の好適なＤＮＡ発現ベクターは、先に詳細に説明したカセットに加えて、第２の融合ポリペプチドを発現させる第２のカセットを含む。 第２のカセットは、先に特定したように典型的にはカセットのリーディングフレームの少なくとも一つの停止コドンを特定するベクターの下流のＤＮＡ配列に対する方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介してその３′末端で機能的に結合した分泌シグナルをコードする第２の翻訳可能なＤＮＡ配列を含む。 第２の翻訳可能なＤＮＡ配列は、前記特定した５′要素を形成するＤＮＡ発現調節配列にその５′末端で機能的に結合させる。 第２のカセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（挿入物ＤＮＡ）の挿入に際して、挿入物ＤＮＡによりコードされるポリペプチドとの分泌シグナルの融合体からなる第２の融合ポリペプチドを発現することができる。 好適な態様では、ＤＮＡ発現ベクターは、本発明の教示によりゲノムをカプセル化する繊維状ファージ粒子の形態で便利に操作するよう設計する。 この態様では、ＤＮＡ発現ベクターは、適切な遺伝的相補の提示に際してベクターが一本鎖複製形態の繊維状ファージとして複製して繊維状ファージ粒子にパッケージされ得るように繊維状ファージ複製開始点を特定するヌクレオチド配列更に含む。 この特徴は、ファージ粒子の集団を構成する他の粒子から粒子およびこれに含まれるベクターが続いて分離されるためにファージ粒子へとパッケージされるＤＮＡ発現ベクターの能力を与えるものである。 本発明で使用するのに好適な繊維状ファージ複製開始点は、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄファージ複製開始点である。 特に好適なのは、配列番号：１１７に示され、ショートら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７５８３−７６００（１９８８）に記載された配列を有する繊維状ファージ複製開始点である。 好適なＤＮＡ発現ベクターは、実施例１に記載するジシストロン性発現ベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＫＡＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８、ｐＣＯＭＢ３、ｐＣＫＡＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３およびｐＣＯＭＢ２−３′である。 Ｄ． ポリペプチド 好適な態様では、受容体蛋白質は、リガンド結合ヘテロ二量体受容体のポリペプチド鎖である。 さらに好ましくは、ヘテロ二量体受容体はエピトープ結合複合体である。 式（Ｆ１）において、分泌シグナルおよび繊維状ファージコート蛋白質膜アンカーはここに前記した通りである。 よって、好適なポリペプチドは、そのアミノ末端で分泌シグナルに機能的に結合しそのカルボキシ末端で膜アンカーに機能的に結合した抗体可変鎖ドメイン誘導ポリペプチドからなる。 １つの態様では、Ｖはヘテロ二量体受容体分子の鎖のリガンド結合ドメインを特定するアミノ酸配列残基であり、好ましくは免疫グロブリン可変領域ポリペプチドである。 特に好適なポリペプチドＶはＶ HまたはＶ Lポリペプチドである。 本発明の受容体は、競合的に阻害されるその能力により証明されるように、抗原、ハプテン、酵素基質等のような予備選択したまたは所定のリガンドに特異的な結合部位を有する構造を想定するものである。 １つの態様では、この発明の受容体は、予備選択した抗原と特異的に結合して抗原と単離されるべき複合体の結合部位との間の十分に強力な結合を有する複合体を形成する抗原結合部位を形成するリガンド結合ポリペプチドである。 受容体が抗原結合ポリペプチドである場合、その親和力または結合力は一般に１０ 5 Ｍ -1より大きく、更に通常は１０ 6より大きく、好ましくは１０ 8 Ｍ -1より大きい。 好ましくは対象発明により製造される受容体はヘテロ二量体であり、したがって通常は２つの異なるポリペプチド鎖から構成され、これらは共にいずれかのポリペプチド単独、すなわち単量体としての親和力または結合定数と異なり恐らくより高い予備選択したリガンドに対する結合親和力または結合定数を有する構造を想定するものである。 ヘテロ二量体受容体は、リガンド結合ヘテロ二量体受容体としても言及し、リガンドに結合するその能力を内包するものとする。 リガンド結合ヘテロ二量体受容体は、エピトープ結合複合体として言及し、複合体がリガンド中に存在するエピトープと結合する能力を有することを内包するものとし、ここに記載するように２つのポリペプチドの結合（複合化）によりヘテロ二量体受容体が形成されることを内包するものとする。 対象発明により製造される受容体は、単量体並びに多量体形態で活性とすることができ、ホモ体またはヘテロ体とするが、好ましくはヘテロ体とする。 例えば、本発明により製造されるＶ HおよびＶ Lリガンド結合ポリペプチドは、ヘテロ二量体において有利に組合せていずれかの活性を変調させるかヘテロ二量体に独特の活性を生成することができる。 個々のＶ HおよびＶ Lポリペプチドは、その天然に存在する長さと等しいか実質的に等しい長さで製造することができる。 しかしながら、好適な態様では、Ｖ HおよびＶ Lポリペプチドが有し得るのは１２５アミノ酸残基未満、更に通常には約１２０アミノ酸残基未満であり、一方正常に有するのは６０アミノ酸残基を越え、通常は約９５アミノ酸残基を越え、更に通常には約１００アミノ酸残基を越える。 好ましくは、Ｖ Hは約１１０〜２３０アミノ酸残基の長さとすることができ、またＶ Lは約９５〜約２１４アミノ酸残基の長さとすることができる。 Ｆａｂを形成するのに十分に長いＶ HおよびＶ L鎖が好適である。 幾つかの状況においては、Ｖ HおよびＶ Lポリペプチドの共有架橋結合を与えるのが望ましく、これはカルボキシ末端にシステイン残基を設けることにより達成することができる。 ポリペプチドは通常は免疫グロブリン不変領域を含まないものとして調製し得るが、ＤＮＡ合成プライマーの有利な選択の結果として小部分のＪ領域を含むものとし得る。 Ｄ領域は、通常はＶ Hの転写体に含むものとし得る。 Ｅ． ライブラリーを製造する方法 発現と検索との結合は、細菌細胞のペリプラズムを融合ポリペプチドの標的として機能性受容体の集成を可能とすることと、ファージ集成の際に繊維状ファージ粒子のコートを融合ポリペプチドの標的として意図するライブラリー構成員の便利な検索を可能とすることとの組合せにより達成される。 ペリプラズムを標的とすることは、この発明の融合ポリペプチド中の分泌シグナルドメインの存在により与えられる。 ファージ粒子を標的とすることは、この発明の融合ポリペプチド中の繊維状ファージコート蛋白質膜アンカードメイン（すなわちｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩ誘導膜アンカードメイン）の存在により与えられる。 この態様では、ポリペプチドコード遺伝子のレパートリーは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの形態であり、レパートリーのそれぞれの構成員は方向性をもった連結に適合した付着末端を有する。 更に、複数のＤＮＡ発現ベクターは、それぞれ（ａ）共通のリーディングフレームでポリペプチド遺伝子を方向性をもって受容するよう適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合した上流および下流の付着末端を有する線状ＤＮＡ分子である。 上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は分泌シグナル、好ましくはｐｅｌＢ分泌シグナルをコードし、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、この発明のポリペプチドのためここに記載するように繊維状ファージコート蛋白質膜アンカーをコードする。 また翻訳可能なＤＮＡ配列も、ここに記載するＤＮＡ発現ベクターについて特定するようにそれぞれ上流および下流のＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する。 ２． 遺伝子レパートリーの製造 よって、１つの態様では、本発明は、予備選択した活性を有する二量体受容体をコードする一対の遺伝子を保存された遺伝子のレパートリーから単離する方法を企図する。 更に、クローン化した遺伝子の対の発現および得られる発現した二量体受容体蛋白質の単離も記載する。 好ましくは、受容体とし得るのはリガンドに結合し得るヘテロ二量体ポリペプチド、例えば抗体分子またはその免疫学的に活性な部分、細胞受容体、保存された遺伝子の系統群の構成員の１つによりコードされた細胞付着蛋白質、すなわち少なくとも約１０ヌクレオチド長さの保存されたヌクレオチド配列を含む遺伝子である。 二量体受容体の異なるポリペプチド鎖をコードする例示的な保存された遺伝子系統群は、免疫グロブリン、クラスＩまたはＩＩの主要組織適合性複合体抗原、リンパ球受容体、インテグリン等をコードするものである。 免疫グロブリン Ｈ鎖のＣ領域は特定の免疫グロブリンの種類を特定する。 したがって、Ｈ鎖のＣ領域からのここに特定するような保存された配列を選択すると、結果的に選択されたＣ領域の免疫グロブリンの種類の構成員を有する免疫グロブリン遺伝子のレパートリーの調製が与えられる。 主要組織適合性複合体 リンパ球受容体および細胞表面抗原 インテグリンおよび付着 種々の周知の方法を用いて有用な遺伝子レパートリーを製造することができる。 例えば、Ｖ HおよびＶ L遺伝子レパートリーは、抗体生産細胞、すなわちＢリンパ球（Ｂ細胞）、好ましくは脊椎動物の循環系または脾臓に認められるもののような再構成されたＢ細胞の異種起源集団からＶ HおよびＶ LコードｍＲＮＡを単離することにより製造することができる。 再構成されたＢ細胞は、その上に隣接して位置する免疫グロブリン遺伝子Ｖ、ＤおよびＪ領域転写体と共に細胞中のｍＲＮＡの存在により証明されるように、免疫グロブリン遺伝子位置転移、すなわち再配置が生起したものである。 典型的には、Ｂ細胞は１〜１００ｍｌの血液のサンプルとして集められ、これは通常は１０ 6 Ｂ細胞／ｍｌを含む。 幾つかの場合、予備選択した活性についてレパートリーを偏向させるのが望ましく、例えば種々の段階の年齢、健康状態および免疫応答のいずれか１つにおける脊椎動物からの核酸細胞（起源細胞）を供給源として使用することによる。 例えば、再構成したＢ細胞を集める前の健康な動物の繰返し免疫化により、結果的に高い親和力の受容体を製造する遺伝的材料について集積されたレパートリーを取得することができる。 ムリナックスら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８７：８０９５−８０９９（１９９０）。 逆に、再構成したＢ細胞をその免疫系が先に攻撃されていない健康な動物（すなわち素朴な免疫系）から集めると、結果的に高い親和力のＶ Hおよび／またはＶ Lポリペプチドの生産に対して偏向していないレパートリーを製造することとなる。 よって、１つの好適な態様では、活性が探索される抗原性リガンド（抗原）、すなわち予備選択した抗原により免疫化または部分的に免疫化した脊椎動物、好ましくは哺乳動物から起源細胞を取得する。 免疫化は従来同様に実施することができる。 動物における抗体力価をモニターして所望する免疫化の段階を決定することができ、この段階は所望するレパートリーの集積または偏向の量に対応する。 部分的に免疫化した動物は典型的には唯一の免疫化を受容し、応答が検出された直後にこれらの動物から細胞を集める。 十分に免疫化した動物はピーク力価を示し、これは通常は２〜３週の間隔で宿主動物に抗原を１回以上繰返し注射することにより達成される。 通常は最後の攻撃の３〜５日後に脾臓を除去し、脾臓細胞の遺伝的レパートリー（その約９０％が再構成されたＢ細胞である）を標準的な手順を使用して単離する。 「分子生物学の現代の手順」、アウスベルら編、ジョン・ウイレイ・アンド・ソンズ、ＮＹを参照することができる。 Ｖ HおよびＶ Lポリペプチドをコードする核酸は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭを生産する細胞から、最も好ましくはＩｇＭおよびＩｇＧ生産細胞から誘導することができる。 免疫グロブリン可変領域遺伝子を多様な集団としてクローン化することのできるゲノムＤＮＡの断片を調製する方法は当業界で周知である。 例えば、ヘルマンら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：１８０−１８３（１９８７）、フリシャウフ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：１８３−１９０（１９８７）、フリシャウフ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：１９０−１９９（１９８７）、およびジレラらＭｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：１９９−２１２（１９８７）を参照することができる。 （ここに引用した文献の教示を参考によりここに取入れる。） ｍＲＮＡを利用する場合、ＲＮａｓｅ阻害条件下に細胞を溶解することとなる。 １つの態様では、第１の工程は全細胞ＲＮＡを単離することである。 その後オリゴｄＴセルロースカラムへのハイブリダイゼーションによりポリＡ＋ｍＲＮＡを選択することができる。 重鎖および／または軽鎖ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在は、その後適切な遺伝子のＤＮＡ一本鎖とのハイブリダイゼーションにより検定することができる。 便利には、Ｖ HおよびＶ Lの不変部分をコードする配列をポリヌクレオチトプローブとして使用することができ、この配列は利用可能な起源から取得することができる。 例えば、アーリーとフッド、「遺伝子操作」、セトロウとホラエンダー編、第３巻、プレナム・パブリシング社、ＮＹ（１９８１）、第１５７〜１８８頁、およびカバトら、「免疫学的に興味あるものの配列」、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ（１９８７）を参照することができる。 好適な態様では、全細胞ｍＲＮＡを含有する調製物を、Ｖ Hおよび／またはＶ LコードｍＲＮＡの存在について最初に集積する。 集積は、典型的には全ｍＲＮＡ調製物またはその部分的に精製したｍＲＮＡ生成物を、ここに記載するようにポリヌクレオチド合成プライマーを用いるプライマー延長反応に供することにより行う。 ポリヌクレオチド合成プライマーを使用するＶ HおよびＶ L遺伝子レパートリーを製造する例示的な方法は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２８３６（国際公開番号ＷＯ９０／１４４３０）に記載されている。 遺伝子レパートリーを製造する特に好適な方法は、ここに記載するようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして予備選択したオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ反応生成物を形成することによるものである。 好適な態様では、予備選択した抗原に対して単離したＢ細胞を試験管内で免疫化する。 試験管内免疫化は、抗原刺激に応答するエピートープ特異的培養Ｂ細胞のクローン展開として特定される。 最終結果は免疫グロブリンレパートリーにおける抗原特異的Ｂ細胞の頻度を増加させるものであり、これにより所望の特異性の抗体を発現するクローンを同定するために検索する必要のある発現ライブラリーにおけるクローンの数が減少する。 試験管内免疫化の利点は、毒性または弱い免疫原を含む治療的に価値ある無制限の数の抗原に対してヒトモノクローナル抗体を生成することができる点である。 例えば、腫瘍関連抗原、リウマチ性因子および組織適合性抗原の多形性抗原決定基に特異的な抗体を製造することができ、これは免疫化した動物中ては顕在化させることはてきないものてある。 更に、生体内では通常は抑制されている免疫応答を生成することが可能たり得る。 試験管内免疫化を使用して一次または二次免疫応答のいずれも生起することができる。 抗原に対するＢ細胞の最初の露呈に起因する一次免疫応答の結果、エピトープ特異的細胞のクローン展開および低乃至中の見かけの親和力定数（１０ 6 〜１０ 8 Ｍ -1 ）を有するＩｇＭ抗体の分泌に至る。 ヒト培養脾臓および扁桃リンパ球の一次免疫を使用し、細胞、ペプチド、マクロ分子、ハプテンおよび腫瘍関連抗原を含む多様な抗原に対するモノクローナル抗体を製造することができる。 免疫化した供与体に由来する記憶Ｂ細胞を培養において刺激し、血清陽性個体から誘導した過敏リンパ球をクローン展開することによって特にウイルス抗原に対して高い親和力のＩｇＧイディオタイプの抗体（＞１０ 9 Ｍ -1 ）のクローン展開および生産を特徴とする二次免疫応答を生起することもできる。 試験管内免疫化に加えて、細胞選別処理（ｐａｎｎｉｎｇ）（免疫親和力吸着）を使用して抗原特異的Ｂ細胞の頻度を更に増加させることができる。 固相抗原結合によりＢ細胞下位集団を選択する技術は十分に確立されている。 選別処理条件を至適化し、細胞表面部分を含む多様な抗原に対して高い親和力で結合するＢ細胞を選択的に集積することができる。 選別処理は単独で、またはいずれかの技術単独で得られるレベル以上に抗原特異的細胞の頻度を増加させるために試験管内免疫化と組合せて使用することができる。 Ｂ細胞の集積した集団から構成した免疫グロブリン発現ライブラリーは、抗原特異的抗体クローンを好感して偏向しており、よってより小さく複雑でないライブラリーからの所望の特異性を有するクローンの同定を可能とする。 １つの態様では、供与体末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を重篤な複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）マウスに移し、その後ＳＣＩＤマウスのＢ細胞から重鎖および軽鎖コード核酸を回収する前にＳＣＩＤマウス内で生体内で追加免疫して免疫応答を増加させることができる。 例えば、ドチョサルら、Ｎａｔｕｒｅ，３５５：２５８−２６２（１９９２）を参照することができる。 この報告では、抗破傷風毒素（ＴＴ）力価を有する供与体からのヒトＰＢＬをＳＣＩＤマウス宿主内で追加免疫した。 この結果得られた３７０，０００クローンのライブラリーは、ＴＴに結合できる表面Ｆａｂを発現する２つのファージ粒子を与えた。 ここで使用するように「プライマー」という用語は、核酸制限消化物から精製されたか合成的に製造されたかに拘らず、核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物の合成を誘導する条件下、すなわちヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等のような重合のための試薬の存在下に適切な温度およびｐＨに置かれた場合に核酸合成の開始の地点として作用し得るポリヌクレオチドに言及するものである。 プライマーは最大の効率のために好ましくは一本鎖とするが、その他二本鎖形態とすることができる。 二本鎖の場合、延長生成物を調製するのに使用する前にプライマーを最初に処理してこれをその相補的鎖から分離する。 好ましくはプライマーはポリデオキシリボヌクレオチドとする。 プライマーは、重合のための試薬の存在下に延長生成物の合成を起動するのに十分に長くなければならない。 プライマーの正確な長さは多くの因子に依存し得るが、温度およびプライマーの起源が含まれる。 例えば、標的配列の複雑性により、ポリヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むことができる。 短いプライマー分子は、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために一般により冷たい温度を要求する。 ここで使用するプライマーは、合成または増幅するそれぞれの特異的な配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。 これは、プライマーがそのそれぞれの鋳型鎖と非無作為にハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。 したがって、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映してもしなくてもよい。 例えば、プライマー配列の残余を鎖に実質的に相補的として、非相補的なヌクレオチド断片をプライマーの５′末端に付着させることができる。 この種の非相補的な断片は、典型的にはエンドヌクレアーゼ制限部位をコードする。 また、プライマー配列が合成または増幅される鎖の配列と十分な相補性を有してこれと非無作為にハイブリダイズし、これによりポリヌクレオチド合成条件下で延長生成物を形成する限り、非相補的塩基またはより長い配列をプライマー中に散在させることができる。 本発明のプライマーは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはその相補体も含むことができる。 例えば、クリーグら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：７０５７−７０（１９８４）、スツジエルら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０（１９８６）、および「分子クローン化：実験室マニュアル、第２版）、マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）を参照することができる。 プライマーは、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼについての鋳型配列または複製開始部位も含有し得る。 典型的なＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼは、リザルジら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７−１２０２（１９８８）により記載されたＱＢレプリカーゼを含む。 ＲＮＡ指向性ポリメラーゼは、鋳型配列または複製開始部位を含む少数の鋳型ＲＮＡ鎖から多数のＲＮＡ鎖を製造する。 プライマーのヌクレオチド配列の選択は、核酸上における所望の受容体をコードする領域からの距離、使用するいずれかの第２のプライマーに関する核酸上におけるそのハイブリダイゼーション部位、それがハイブリダイズすべきレパートリーにおける遺伝子の数等のような因子に依存する。 Ｖ HコードおよびＶ LコードＤＮＡ相同体のレパートリーを（ＰＣＲ）増幅によって製造すべき場合、増幅すべき核酸のそれぞれのコード鎖について２つのプライマー、すなわちＰＣＲプライマー対を使用しなければならない。 第１のプライマーはノンセンス（マイナスまたは相補的）鎖の一部となり、レパートリー内でＶ H （プラスまたはコード）鎖間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。 したがってＶ HコードＤＮＡ相同体を製造するためには、免疫グロブリン遺伝子等のＪ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域内の保存された領域にハイブリダイズする（すなわちこれらに相補的である）ように第１のプライマーを選択する。 Ｖ LコードＤＮＡ相同体を製造するためには、免疫グロブリン軽鎖遺伝子等のＪ領域または不変領域内の保存された領域にハイブリダイズする（すなわちこれらに相補的である）ように第１のプライマーを選択する。 第２のプライマーはコード（プラス）鎖の一部となり、マイナス鎖の間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。 したがってＶ HコードＤＮＡ相同体を製造するためには、リーダーまたは第１のフレーム構造領域をコードするその領域におけるようなＶ Hコード免疫グロブリン遺伝子の５′末端で保存されたヌクレオチド配列とハイブリダイズするように第２のプライマーを選択する。 Ｖ HおよびＶ LコードＤＮＡ相同体の両者の増幅において、第２のプライマーの保存された５′ヌクレオチド配列は、ローら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：２１７−２２０（１９８９）により記載されたように、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して外生的に付加した配列に相補的とすることができることを銘記すべきである。 第１および第２のプライマーの一方または両方は、エンドヌクレアーゼ認識部位を特定するヌクレオチド配列を含むことができる。 この部位は免疫グロブリン遺伝子に対して異種起源とすることができ、増幅されて典型的にはプライマーの５′末端または近傍に認められる。 存在する場合、制限部位を特定する部分は、典型的にはプライマーの５′末端非起動部分に局在する。 第１のプライマーにより特定される制限部位は、典型的には第２のプライマーにより特定される制限部位を認識しない制限酵素によって認識されるものであるよう選択するが、その目的は互いに非相補的であるためにベクターへの方向性をもった挿入を可能とする付着末端を有するＤＮＡ分子の製造を可能とすることである。 ＰＣＲにおいては、それぞれのプライマーは第２のプライマーと組合せて働き、標的核酸配列を増幅する。 ＰＣＲで使用するためのＰＣＲプライマー対の選択は、ここに論ずるように遺伝子レパートリーを製造するための考慮に支配される。 すなわち、プライマーは、レパートリーにおいて保存された配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。 有用なＶ HおよびＶ L起動配列を後記する表５〜６および７〜９に示す。 Ｖ HおよびＶ Lコード遺伝子レパートリーは、ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのセンス鎖のようなポリヌクレオチドコード鎖から構成される。 レパートリーが二本鎖ゲノムＤＮＡの形態である場合、典型的には一本鎖への融解により通常は最初にこれを変性させる。 ＰＣＲプライマー対を用いてレパートリーを処理する（接触させる）（対のそれぞれの構成員は予備選択したヌクレオチド配列を有する）ことによりレパートリーをＰＣＲ反応に供する。 ＰＣＲプライマー対は、レパートリー内で保存された好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、更に好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることによりプライマー延長反応を開始することができる。 ＰＣＲプライマー対の第１のプライマーは、核酸のコードまたはセンス鎖にハイブリダイズするため、ここでは場合により「センスプライマー」として言及する。 更に、ＰＣＲプライマー対の第２のプライマーは、核酸の非コードまたはアンチセンス鎖、すなわちコード鎖に相補的な鎖にハイブリダイズするため、ここでは場合により「アンチセンスプライマー」として言及する。 ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマー対、好ましくはその所定量とレパートリーの核酸、好ましくはその所定量とをＰＣＲ反応混合物を形成するＰＣＲ緩衝液中で混合することにより行う。 ＰＣＲ反応生成物の形成に十分な時間期間の間ポリヌクレオチド合成条件下に混合物を維持し（これは典型的には所定のものである）、これにより複数の異なるＶ Hコードおよび／またはＶ LコードＤＮＡ相同体を製造する。 他の戦略では、ゲノムｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖またはｍＲＮＡを逆転写酵素反応に供することにより製造したポリヌクレオチドのようなレパートリーのポリヌクレオチド相補体を与えることによりレパートリーからＶ Hおよび／またはＶ Lコード遺伝子をクローン化することを目的とする。 この種の相補体を製造する方法は当業界で周知である。 ＰＣＲ緩衝液は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰおよびポリメラーゼ（典型的には熱安定性）も含み、プライマー延長（ポリヌクレオチド合成）反応のために全て適切な量とする。 得られる溶液は（ＰＣＲ混合物）は、約１〜１０分、好ましくは１〜４分間約９０℃〜１００℃に加熱する。 この加熱期間の後に溶液を５４℃に冷却する（これはプライマーハイブリダイゼーションに好適である）。 合成反応は、室温からこれを越えるとポリメラーゼ（誘導試薬）が最早効率的に機能しなくなる温度までで生起し得る。 よって、例えばＤＮＡポリメラーゼを誘導試薬として使用する場合、温度は一般に約４０℃を越えないものとする。 例示的なＰＣＲ緩衝液は次のものからなる：１００マイクロリットルの緩衝液当り５０ｍＭＫＣ１、１０ｍＭトリス−ＨＣ１、ｐＨ８．３、１．５ｍＭＭｇＣ１ 2 、０．００１％（ｗｔ／容量）ゼラチン、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００μＭｄＧＴＰ、および２．５単位サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（米国特許第４，８８９，８１８号）。 誘導試薬は、プライマー延長生成物の合成を達成するように機能し得る全ゆる化合物または系とすることができ、酵素を含む。 この目的に適切な酵素には、例えばイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および他の酵素（熱安定性酵素を含み、適切な様式でヌクレオチドの結合を促進してそれぞれの核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物を形成する）が包含される。 一般に、合成はそれぞれのプライマーの３′末端で開始し、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５′方向に進行し、異なる長さの分子を生成する。 ただし誘導試薬があれば、これにより５′末端で合成が開始し、前記したのと同じプロセスを使用して前記方向に進行する。 誘導試薬は、ＲＮＡプライマー延長生成物の合成を達成するように機能し得る化合物または系とすることもでき、酵素を含む。 好適な態様では、誘導試薬は、Ｔ７ＲＡＮポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとすることができる。 これらのポリメラーゼは相補的なＲＮＡポリヌクレオチドを生成する。 チャンベリンら、「酵素」、ピー・ボイヤー編、ｐｐ． ８７−１０８、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９８２）により記載されたように、ＲＮＡポリメラーゼの高いターンオーバー速度により出発ポリヌクレオチドが増幅される。 Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの他の利点は、ジョイスら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １７：７１１−７２２（１９８９）により先に記載されたように、１以上の変異誘発性オリゴデオキシヌクレオチド（ポリヌクレオチド）を用いてｃＤＮＡの一部を置換し、部分的に不整合の鋳型を直接転写することにより、ポリヌクレオチド合成に変異を導入できる点である。 転写に基く増幅系は、ギンゲラスら、「ＰＣＲ手順、方法および応用の指針」中、ｐｐ２４５−２５２、アカデミック・プレス社、サンジエゴ、ＣＡ（１９９０）により記載されている。 誘導試薬をＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとし、したがってリボヌクレオチド三リン酸を組込む場合、十分な量のＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰをプライマー延長反応混合物と混合し、得られる溶液を前記したように処理する。 複数の異なるＶ HおよびＶ Lコード遺伝子についてのＶ HおよびＶ LコードＤＮＡ相同体をレパートリー内で製造した後、ＤＮＡ分子を典型的には更に増幅する。 自己複製ベクターへの組込みのような古典的な技術によりＤＮＡ分子を増幅することができるが、これらをベクターに挿入する前に、これらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）な供することにより分子を最初に増幅するのが好適である。 ＰＣＲ増幅法が詳細に記載されているのは、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、４，８００，１５９号および４，９６５，１８８号、および「ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅の原理と応用」、エッチ・エルリヒ編、ストックトン・プレス、ニューヨーク（１９８９）、および「ＰＣＲ手順：方法および応用の指針」、イニスら編、アカデミック・プレス、サンジェゴ、カリホルニア（１９９０）を含む少なくとも幾つかのテキストである。 好適な態様では、ＰＣＲプロセスは、ＤＮＡ分子のライブラリーを製造するためだけではなく、ライブラリー内の変異を誘導するか、単一の親クローンから多様性を生成し、これにより更に大きい異種性を有するライブラリーを提供するために使用する。 第１に、ＰＣＲプロセスは、当業界で周知の多様な因子によりそれ自体固有に変異誘発性であることを銘記すべきである。 第２に、前記参照した米国特許第４，６８３，１９５号に記載された多様性を誘導する変異に加えて、ＰＣＲの多様性を誘導する他の変異を用いることができる。 例えば、延長生成物に組込まれる異なる量の１以上のヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応混合物を形成することができる。 この種の条件下では、ＰＣＲ反応が進行して特定の塩基の欠乏の結果として延長生成物内でヌクレオチド置換体が生成する。 同様に、ほぼ等モル量のヌクレオチドを、Ｘ回の繰返しを効率的に行う量で初発ＰＣＲ反応混合物に組込むことができ、その後Ｘを越える繰返し回数、例えば２Ｘにより繰返し混合物を処理する。 また、増幅されるレパートリーの核酸中には通常は認められないイノシンのようなヌクレオチド誘導体を反応混合物に組込むことによりＰＣＲ反応に際して変異を誘導することができる。 その後の生体内ＤＮＡ合成および宿主細胞中での核酸の複製の際に、ヌクレオチド誘導体は置換ヌクレオチドにより置換され得て、これにより点変異が誘導される。 ５． 線状ＤＮＡ発現ベクター ６． 遺伝子ライブラリーを生成する連結反応 ７． ジシストロン性遺伝子ライブラリーの調製 ジシトロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法は、次の工程からなる： （ｂ）第１のポリペプチド遺伝子をベクターに機能的に結合してそれぞれ第１のポリペプチドを発現する第１のシストロンを有する複数の環状ＤＮＡ分子を生成するのに十分な時間期間の間混合物を連結条件に供する。 （ｄ）連結緩衝液中で （ｉ）工程（ｃ）で形成した複数のＤＮＡ発現ベクター、および （ｉｉ）ｄｓＤＡＮの形態の第２のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれ複数のＤＮＡ発現ベクターへの方向性をもった連結に適合した付着末端を有する） ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法を実施するに際し、上流および下流の第１の付着末端が、上流および下流の第２の付着末端と同一のヌクレオチド配列を有さないものとするのが好適である。 この態様では、環状ＤＮＡ分子を線状化する処理工程（ｃ）は、典型的には前記第２の末端を生成するのに特異的であるが、第１の末端を形成した部位で環状ＤＮＡ分子を開裂させない制限エンドヌクレアーゼの使用を含む。 例示的な好適な第１および第２の末端は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩにより上流および下流の第１の末端を形成するｐＣＢＡＫ８の開裂により特定され、またＳａｃＩおよびＸｂａＩにより上流および下流の第２の末端を形成するｐＣＢＡＫ８の開裂により特定される末端である。 複数の環状ＤＮＡ分子をＤＮＡ開裂条件下に処理して線状ＤＮＡ分子を形成する方法は一般に周知であり、開裂されるヌクレオチド配列および開裂の機構に依存する。 好適な処理は、制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡ分子を開裂させるのに十分な量で所望の開裂位置にてエンドヌクレアーゼ認識部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼとＤＮＡ分子とを混合することを含む。 制限エンドヌクレアーゼ開裂のための緩衝液、開裂条件および基質濃度は周知であり、利用する特定の酵素に依存する。 例示的な制限酵素開裂条件は実施例２に記載する。 ８． ライブラリーの多様性を変化させる方法 核酸の変異は種々の手段により行うことができるが、最も便利には本発明のＰＣＲプロセスの際のＰＣＲ反応において行うものとする。 ＰＣＲ変異誘発は、一般に周知のように、特定のヌクレオチド配列に対して無作為または指向性とすることができる。 無作為の変異誘発を好感する条件下でＰＣＲを行うことは先に記載しており、「エラープローン（誤りがちな）ＰＣＲ」として言及する。 同様に、指向性変異誘発は、ヌクレオチド配列の特定の領域への特定の種類の変異を標的とするよう設計されたＰＣＲプライマーの使用を含む。 よって、この発明は、この発明のＤＮＡベクターに存在するクローン化した免疫グロブリン遺伝子の免疫学的特異性を変化させる変異誘発方法を企図する。 この方法は、免疫グロブリン遺伝子の予備選択したＣＤＲ中で指向性変異誘発を与えるものであるが、これは標的ＣＤＲを有するクローン化した免疫グロブリン遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を、ＣＤＲの予備選択した領域を増幅するのに適切なＰＣＲ条件に供することからなる。 この方法では、予備選択したＣＤＲ領域から誘導されるがＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を含む増幅したＰＣＲ生成物を生成する周知のようなＰＣＲプライマー対における第１のプライマーを構成する後記するようなＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ条件にｒＤＡＮ分子を供する。 ＰＣＲ増幅条件における第２のオリゴヌクレオチドは、ここに記載するように変異誘発する免疫グロブリン遺伝子から誘導される全ゆるＰＣＲプライマーとすることができる。 好適なのは、後記するようにこの発明のオリゴヌクレオチドを使用する方法である。 免疫グロブリン遺伝子が、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両者上に３つのＣＤＲ領域を有する限り（それぞれ特有のフレーム構造領域により分離される）、標的ＣＤＲに隣接するフレーム構造領域にハイブリダイズするものとして前記５′および３′ヌクレオチド配列を選択することにより特定のＣＤＲに変異を導入するのに前記例を容易に適用し得ることを理解すべきである。 よって、前記第１および第２のフレーム構造配列は、重鎖または軽鎖いずれかの上でＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３に隣接する保存された配列とすることができる。 例示的で好適なものは、ヒト免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ３である。 ＣＤＲに隣接するフレーム構造領域は免疫学的技術において十分に特徴付けられており、ここに随所に記載するように公知のヌクレオチド配列またはコンセンサス配列を含むものである。 単一の予備選択した免疫グロブリン遺伝子を変異誘発すべき場合、特定のＣＤＲに隣接するフレーム構造特定配列は公知であるか、ヌクレオチド配列決定手順により容易に決定することができる。 免疫グロブリン遺伝子のレパートリーを変異誘発すべき場合、フレーム構造誘導配列は、ここに随所に記載するように好ましくは保存されたものである。 ３′末端ヌクレオチド配列として使用するのに特に好適なフレーム構造特定ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５′−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）を有する。 好適なオリゴヌクレオチドは前記した３′および５′末端の間のヌクレオチド配列からなり、これは式：［ＮＮＲ］ nにより表され、式中Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドとすることができ、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログとすることができ、ここでＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、またここでｎは３〜約２４である。 好適な態様では、オリゴヌクレオチドは式： よって、この発明は、ａ）本発明による繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、ｂ）ライブラリー中のそれぞれのＤＮＡ発現ベクターに存在する免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を変異させてそれぞれ変異した免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を含むファージ粒子のライブラリーを形成する工程からなる繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を増加させる方法を企図する。 ｂ． ライブラリーの集積 好適な態様では、予備選択したリガンドを固体支持体に固定し、リガンド−ファージ粒子複合体を固相で形成する。 この態様は、ｉ）接触工程の後に固体支持体を洗浄して固体支持体から非結合ライブラリー構成員を濯ぎ、ｉｉ）全ゆる固相結合ファージ粒子を固体支持体から溶出させる工程を更に含む。 溶出したファージ粒子を集め、これにより集積したライブラリーからなる単離したファージ粒子を形成する。 当業者に明らかたり得るように、これらの方法の組合せにより種々の方策を構成することができる。 たとえば、ライブラリーを単離し、変異誘発（多様化）し、その後特定の結合活性について検索（集積）することができる。 また、ライブラリーから特定の活性について集積し、特定のエピトープ結合複合体を変異誘発し、製造したライブラリーを変異誘発により更に集積することができる。 抗体親和力および結合価の周知の原則を適用し、ｃｐＶＩＩＩに基くライブラリーに認められる多価試薬を使用して単離し得る広い範囲の親和力（１０ 4 〜１０ 9 Ｍ -1の結合定数）と比較して一般により高い親和力結合相互作用（１０ 6 〜１０ 9 Ｍ -1の結合定数）についての検索に際してｃｐＩＩＩに基くライブラリーを集積できることが理解される。 したがって、ｃｐＶＩＩＩに基くライブラリーは低〜高のエピトープ結合複合体の広い範囲の親和力を単離するのに有用であるのに対し、ｃｐＩＩＩに基くライブラリーはより狭い範囲の高い親和力のエピートープ結合複合体を単離するのに有用である。 他の態様では、新規な親和力を成熟させる能力をここに例として示すが、この場合リガンド末端毒素（ＴＴ）を結合するヘテロ二量体を発現し得るクローン化したＶ H ／Ｖ Lヘテロ二量体コード遺伝子をＣＤＲ指向性ＰＣＲ変異誘発を使用して変異誘発し、これに起因する変異誘発した核酸集団をｃｐＩＩＩに基くライブラリーに挿入し、異なるリガンド、フルオレセインへの結合について検索する。 フルオレセインに結合する高い親和力のエピトープ結合複合体を同定した。 よって、本発明は、ａ）繊維状ファージのゲノムを調製し、ｂ）調製したゲノムに存在する免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を変異させて変異した免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を含むファージ粒子のライブラリーを形成し、ｃ）ライブラリーの構成員がリガンドに結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で工程（ｂ）で形成したライブラリーと予備選択したリガンドとを接触させ、ｄ）非結合ライブラリー構成員から前記複合体中のファージ粒子を単離して予備選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積ライブラリーを形成する工程からなるこの発明の繊維状ファージによりコードされるエピトープ結合複合体の親和力を成熟させる方法も企図する。 Ｆ． ファージライブラリー パッケージした発現ベクターが、例えばＦａｂを形成するＶ HおよびＶ Lポリペプチドのような自己集成受容体の第１および第２のポリペプチドをコードする場合、受容体特異性の多重性を含むか発現するものとしてライブラリーを特徴付けることもできる。 よって、ライブラリーは少なくとも１０ 5 、好ましくは少なくとも１０ 6 、更に好ましくは少なくとも１０ 7の異なる受容体、例えば異なる抗体、Ｔ細胞受容体、インテグリン等を発現する。 より大きい多様性を生成するため、前記したような２つのレパートリーを「混ぜ合せる」能力を評価する実験系を設計した。 この系は、ハプテン、パラ−ニトロフェニルホスホンアミデート（ＮＰＮ）により免疫化したマウスから誘導した結合したＦａｂライブラリーを利用するものとした。 ２２の異なるクローンを単離し、重鎖および軽鎖コード核酸を単離し、配列決定して２２対の内２１が核酸配列のレベルで異なることを決定した。 ２２のＮＰＮリガンド結合クローンを無作為に再度組合せ（混ぜ合せ）、ＮＰＮに対する結合について再検索した。 ライブラリーの複雑性は、配列の予め存在するライブラリーのヌクレオチド配列を変異させるここにおける方法を使用して増加させることもできる。 発現した融合ポリペプチドについてのアミノ酸残基の差異に関して言えば、無作為の変異を標的とするそれぞれのアミノ酸残基位置につきライブラリーの大きさで潜在的に２０倍の増加があり得る。 ヘテロ二量体受容体の一方または両方の構成員をコードするＤＮＡ分子の単離（分離）は、ライブラリーを含む他のファージ粒子の集団から意図する単数または複数の遺伝子を含む繊維状ファージ粒子を分離することにより行う。 ファージ粒子の分離は、個々のファージ粒子をライブラリー中の他の粒子から物理的に分離して増殖させることを含む。 繊維状ファージ粒子を物理的に分離して個々の粒子を生成し、個々の粒子を増殖させて個々の分離した粒子から誘導された子孫ファージの集団を形成する方法は繊維状ファージの技術において周知である。 好適な分離方法は、ファージ粒子と予備選択したリガンドとの間のリガンド結合特異性によりファージ粒子の表面上で発現したヘテロ二量体を同定することを含む。 例示的な好適なものは「選別処理」方法の使用であり、これによりファージ粒子の懸濁物を固相リガンド（抗原）に接触させ、特異的に結合（またはヘテロ二量体が免疫グロブリン可変ドメインを含む場合は免疫反応）させる。 結合の後、非結合粒子を固相から洗浄するが、結合したファージ粒子はその表面上にリガンド特異的ヘテロ二量体受容体（ヘテロ二量体）を含むものである。 その後結合した粒子は、典型的にはリガンド−受容体相互作用を妨害する水性溶剤を使用することにより、固相からの結合した粒子の溶出によって回収することができる。 典型的な溶剤は、高いイオン強度、低いｐＨ、または受容体−リガンド結合相互作用を破壊するのに十分な量の可溶性競合リガンドを有する緩衝液を含む。 表面発現ヘテロ二量体のリガンド特異性に基いて粒子の集団からファージ粒子を分離する他の方法は、リガンドと架橋結合させることにより溶液相からファージ粒子を沈殿させるものである。 例示的な好適な架橋結合および沈殿方法は実施例４ｃに詳細に記載する。 よって、１つの態様では、ファージライブラリーは予備選択したリガンド結合特異性について集積した粒子の集団である。 他の態様では、本発明は、単一の粒子の子孫であり、したがって全てが粒子表面上で同じヘテロ二量体を発現するファージ粒子の集団を企図する。 この種のファージの集団は同種であり、クローン的に誘導され、したがって大量の特定の融合ポリペプチドを発現する供給源を与える。 例示的なクローン的に同種のファージ集団を実施例４に記載する。 宿主細胞からのファージ粒子押出しの過程において繊維状ファージ粒子の表面上に補足されるヘテロ二量体受容体のレベルは、多様な手段により調節することができる。 １つの態様では、融合ポリペプチドのレベルは、ポリペプチドを発現する第１および第２のシストロン中で強力なプロモーターを使用することにより調節し、この場合融合ポリペプチドシストロンの転写が、ヘルパーファージ上のｃｐＶＩＩＩ遺伝子の転写の速度より大きい相対速度で生起するようにする。 他の態様では、ヘルパーファージはｃｐＶＩＩＩを発現する遺伝子にアンバー変異を有することができ、この場合融合ポリペプチドより野生型でないｃｐＶＩＩＩが宿主細胞中で転写され、これにより押出し過程に際しｃｐＶＩＩＩと比較して融合ポリペプチドの増加した速度を導くものとする。 Ｇ． 診断方法 ここで使用するように、「パッケージ」という用語は、本発明のヘテロ二量体受容体、繊維状ファージまたはファージのライブラリーを固定限界内で保持し得るガラス、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカーボネート）、紙、ホイル等のような固体マトリックスまたは材料に言及するものである。 よって、例えば、パッケージは企図する標識ファージ調製物のミリグラム量を含むのに使用するガラス瓶とすることができ、またはこれはマイクログラム量の企図する受容体又はファージを機能的に固定、すなわちリガンドを結合し得るよう結合したミクロ滴定プレート穴とすることができる。 本発明の診断系は、好ましくは予備選択したリガンドと複合したリガンド結合ヘテロ二量体受容体またはファージを含む結合反応複合体の形成をシグナル化し得る標識または表示手段も含む。 標識手段は、抗体または抗原にこれらを変性させることなく化学的に結合して免疫蛍光トレーサーとして有用な蛍光色素（色素）を形成する蛍光標識剤とすることができる。 適切な蛍光標識剤には蛍光色素、例えばフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）等がある。 免疫蛍光分析技術の記載はデルカ、「免疫蛍光分析」、「道具としての抗体」中、マルカロニスら編、ジョン・ウイレイ・アンド・ソンズ社、ｐｐ． １８０−２３１（１９８２）に認められ、これを参考によりここに取入れる。 放射性元素も有用な標識剤であり、ここでは例示的に使用する。 例示的な放射性標識剤はガンマ線放射を生成する放射性元素である。 それ自体ガンマ線を放射する元素、たとえば124 Ｉ、 125 Ｉ、 128 Ｉ、 132 Ｉおよび51 Ｃｒは、１つのクラスのガンマ線放射生成放射性元素表示群を代表する。 特に好適なのは125 Ｉである。 他の群の有用な標識手段は、それ自体陽電子を放射する11 Ｃ、 18 Ｆ、 15 Ｏおよび13 Ｎのような元素である。 このように放射された陽電子は、動物の体に存在する電子との遭遇に際してガンマ線を生成する。 同様に有用なのは3 Ｈの111インジウムのようなベータエミッターである。 診断系は、好ましくは別のパッケージとして、特異的結合剤も含むことができる。 「特異的結合剤」は、本発明の試薬分子種またはこの種の分子種を含む複合体に選択的に結合することができるが、それ自体は本発明のポリペプチドまたはファージではない分子実体である。 例示的な特異的結合剤は抗体分子、相補的蛋白質またはその断片、エス・オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）蛋白質Ａ等である。 好ましくは特異的結合剤は、その分子種が複合体の一部として存在する場合に試薬分子種に結合する。 本発明の診断キットを「ＥＬＩＳＡ」形式で使用して流体サンプル中の予備選択したリガンドの量を検出することができる。 「ＥＬＩＳＡ」は、固相に結合した抗体または抗原および酵素−抗原または酵素−抗体接合体を用いてサンプル中に存在する抗原の量を検出して定量する酵素結合免疫吸着検定に言及するものであり、本方法に容易に適用可能である。 ＥＬＩＳＡ技術の記載は、１９８２年にロス・アルトス、ＣＡのランゲ・メディカル・パプリケーションにより出版されたディ・ピー・サイテスらによる「基礎および臨床免疫学」の第４版の第２２章、および米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号および第４，０１６，０４３号に認められ、これらを全て参考によりここに取入れる。 水性媒体からの吸着により典型的には試薬を固体マトリックスに固定するが、蛋白質およびポリペプチドに適用し得る他の固定の様式を使用することができ、これは当業者に周知である。 例示的な吸着方法はここに記載する。 Ｈ． 検定方法 競合または非競合いずれかの種々の異種的およ同種的な手順を、この発明の検定方法を実施するのに用いることができる。 免疫学的技術で周知のように、検出工程は複合または結合試薬（複合体の受容体成分）のいずれかに向けることができる。 よって、受容体に特異的な抗体のような二次結合試薬を利用することができる。 更なる診断方法は架橋結合リガンドに対する繊維状ファージ粒子の多価性を利用するものであり、これにより多価リガンドおよびファージ粒子の凝集物を形成し、沈殿し得る凝集物を生成する。 この態様は、免疫沈殿の周知の方法と比較し得るものである。 この態様は、サンプルとこの発明の複数のファージ粒子とを混合して結合条件下で結合混合物を形成する工程からなり、その後形成した結合複合体を単離する分離工程を行う。 典型的には、凝集物を混合物から除去する遠心分離またはろ過により単離を行う。 結合複合体の存在は、検出すべき予備選択したリガンドの存在を示す。 以下の実施例はこの発明の範囲を示すことを意図するものであるが、限定するものではない。 実施例１ａ． ジシストロン性発現ベクターｐＣＯＭＢの構成 （ｉｉ） ラムダＨｃ２の調製 ラムダＨｃ２を調製するため、互いにハイブリダイズし得て図３に示す二本鎖合成ＤＮＡ配列を形成する２０〜４０塩基の一本鎖ポリヌクレオチド断片を設計することにより、前記特徴の全てを含む合成ＤＮＡ配列を構成した。 個々の一本ポリヌクレオチド断片を表３に示す。 制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより予め消化した実施例１ａ（ｉ）に記載したラムダＺａｐ TM ＩＩベクターに完成した合成ＤＮＡ挿入物を直接連結した。 ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリホルニアから入手可能なギガパックＩＩゴールドパッキング抽出物を使用し、製造業者の指針に従って連結混合物をパッケージした。 パッケージした連結混合物をＸＬ１ブルー細胞（ストラタジーン）上にプレート処理した。 個々のラムダプラークを抜取り、製造業者（ストラタジーン）により提供されたラムダＺａｐ TM ＩＩについての生体内切出し手順に従って挿入物を切出した。 この生体内切出し手順により、クローン化した挿入物はラムダＨｃ２ベクターからファージミドベクターに移動し、操作および配列決定が容易となった。 サンガーら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７（１９７７）に記載されたサンガーのジデオキシ法を使用し、ＡＭＶ逆転写酵素35 Ｓ−ＡＴＰ配列決定キット（ストラタジーン）における製造業者の指針を使用して挿入物を配列決定することにより、前記クローン化工程の正確性を確認した。 Ｖ H発現ベクター（ラムダＨｃ２）における得られた二本鎖合成ＤＮＡ挿入物の配列を図３に示す。 ラムダＨｃ２のそれぞれの鎖の配列（頂部および底部）を、それぞれ配列番号：１および配列番号：２として配列中に列記する。 得られたラムダＨｃ２発現ベクターを図４に示す。 （ｉｉｉ） ラムダＬｃ２の調製 ７０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ、５ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、５００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む溶液に１μｌ（０．１μｇ／μｌ）のそれぞれのポリヌクレオチドおよび２０単位のＴ 4ポリヌクレオチドキナーゼを添加することにより、ポリヌクレオチド０２、０３、０４、０５、０６および０７（表４）をキナーゼ処理した。 ３７℃で３０分間溶液を維持し、６５℃で１０分間溶液を維持することにより反応を停止させた。 ２０．０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．０ｍＭＭｇＣｌおよび１５．０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む１／１０容量の溶液と共に、２０ｎｇのそれぞれの２つの末端ポリヌクレオチド０１および０８を前記キナーゼ反応溶液に添加した。 この溶液を７０℃に５分間加熱し、水の５００ｍｌビーカー中で１．５時間かけて室温、約２５℃に冷却した。 この時間期間の間に、８つのポリヌクレオチドがアニールして図５に示す二本鎖合成ＤＮＡ挿入物を形成した。 ５０ｍｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７ｍｌＭｇＣｌ、１ｍｍＤＴＴ、１ｍｍＡＴＰおよび１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に４０μｌの前記反応物を添加することにより、個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合させて合成ＤＮＡ挿入物を安定化した。 この溶液を３７℃で３０分間維持し、その後６５℃で１０分間溶液を維持することによりＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。 ５２μｌの前記溶液、１０ｍＭＡＴＰおよび５単位のポリヌクレオチドキナーゼを含む４μｌの溶液を混合することにより末端ポリヌクレオチドをキナーゼ処理した。 この溶液を３７℃で３０分間維持し、その後溶液を６５℃で１０分間維持することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。 制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩにより予め消化した実施例１（ａ）（ｉ）に記載したラムダＺａｐ TM ＩＩベクターに完成した合成ＤＮＡ挿入物を直接連結した。 ギガパックＩＩゴールドパッキング抽出物（ストラタジーン）を使用し、製造業者の指針にしたがって連結混合物をパッケージした。 パッケージした連結混合物をＸＬ１ブルー細胞（ストラタジーン）上にプレート処理した。 個々のラムダプラークを抜取り、製造業者（ストラタジーン）により提供されたラムダＺａｐ TM ＩＩについての生体内切出し手順にしたがって挿入物を切出した。 この生体内切出し手順により、クローン化した挿入物はラムダＬｃ２ベクターからプラスミドファージミドベクターに移動し、操作および配列決定が容易となった。 ラムダＬｃ３と命名したこの発明で使用するのに好適なベクターは前記調製したラムダＬｃ２の誘導体である。 図５および配列番号：３に示すように、ラムダＬｃ２は、ＥｃｏＲＩ制限部位に対して３′およびシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位に対して５′に位置するＳｐｅＩ制限部位（ＡＣＴＡＧＴ）を含む。 図３および４並びに配列番号：１に示すように、ＳｐｅＩ制限部位はラムダＨｃ２にも存在する。 以下の実施例１ａ（ｉｖ）に記載するようにラムダＨｃ２およびＬｃ２の部分を共に組合せることにより、ｐＣｏｍｂと命名した結合ベクターを構成した。 得られる結合ｐＣｏｍｂベクターは、１つがラムダＨｃ２により与えられ１つがラムダＬｃ２により与えられＥｃｏＲＩ部位が間にある２つのＳｐｅＩ制限部位を含んでいた。 ２つのＳｐｅＩ制限部位の存在にも拘らず、以下の実施例１ｂに記載するように、ＳｐｅＩおよびＥｃｏｒＩ付着末端を有するＤＮＡ相同体は、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにより予め消化したｐＣｏｍｂ発現ベクターに成功裡に方向性をもって連結された。 Ｌｃ２ベクターにより与えられる３′ＳｐｅＩ部位に対するＥｃｏＲＩ制限部位の近接性により、３′ＳｐｅＩ部位の完全消化が阻害された。 よって、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＣｏｍｂを消化しても、２つのＳｐｅＩ部位の間のＥｃｏＲＩ部位の除去には帰着しない。 第２のＳｐｅＩ制限部位の存在は、２つの部位の間の領域が除去され得るため、ＳｐｅＩのみで消化したｐＣｏｍｂベクターへの連結には望ましくない可能性がある。 したがって、最初にＳｐｅＩによりラムダＬｃ２を消化して線状化したベクターを形成することにより、ラムダＬｃ３と命名した第２のまたは３′ＳｐｅＩ部位を欠失するラムダＬｃ２の誘導体を製造する。 末端を埋めて平滑末端を形成し、これらを互いに連結し、結果としてＳｐｅＩ部位を欠失したラムダＬｃ３を得る。 ラムダＬｃ３は、以下に記載するように結合ベクターを構成する使用に好適である。 ファージミドＨｃ２およびファージミドＬｃ２の部分を組合せることにより製造される結合ファージミドベクターｐＣｏｍｂの構成のため、ファージミドＨｃ２を最初にＳａｃＩにより消化し、ＬａｃＺプロモーターに対して５′に位置する制限部位を除去した。 線状化したファージミドをその後Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端として連結した結果、ＳａｃＩ部位を欠失するＨｃ２ファージミドを得た。 修飾したＨｃ２ファージミドおよびＬｃ２ファージミドをその後別々にＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩにより制限消化し、結果として５′から３′にＳｃａＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有するＨｃ２断片および５′から３′にＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限部位を有するＬｃ２断片を得た。 線状化したファージミドをその後そのそれぞれの付着末端で互いに連結し、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩおよびＳｃａＩの制限部位の線状配列を有する環状化したファージミドであるｐＣｏｍｂを形成した。 連結したファージミドベクターをその後適切な細菌宿主に挿入し、抗生物質アンピシリン上で形質転換体を選択した。 ２つのＮｏｔＩ部位の存在について、選択したアンピシリン耐性形質転換体を検索した。 得られたアンピシリン耐性結合ファージミドベクターをｐＣｏｍｂと命名し、その図示的構成を図７に示す。 得られた結合ベクターｐＣｏｍｂは、２つの融合蛋白質を発現する２つのカセットを有し、５′から３′方向に列記する機能的に結合した次の要素：ＬａｃＺ遺伝子の上流の誘導性ＬａｃＺプロモーターよりなる第１のカセット、ＮｏｔＩ制限部位、リボソーム結合部位、ｐｅｌＢリーダー、スペーサー、５′Ｘｈｏおよび３′ＳｐｅＩ制限部位を境界とするクローン化領域、発現調節停止配列が後続するデカペプチドｔａｇ、発現調製リボソーム結合部位よりなる第２のカセットに対して５′に位置するＥｃｏＲＩ制限部位、ｐｅｌＢリーダー、スペーサー領域、発現調節停止配列および第２のＮｏｔＩ制限部位が後続する５′ＳａｃＩおよび３′ＸｂａＩ制限部位を境界とするクローン化領域についてのヌクレオチド残基配列を有するＤＮＡ分子よりなるものであった。 ｐＣｏｍｂ２と命名したこの発明での使用に好適な結合ベクターは、ｐＣｏｍｂの調製について前記したようにファージミドＨｃ２およびファージミドＬｃ３の部分を組合せることにより構成する。 得られる結合ベクターｐＣｏｍｂ２は、第２のカセット中の第２のＳｐｅＩ制限部位を除去した以外は、ｐＣｏｍｂと同様に２つの融合蛋白質を発現するｐＣｏｍｂと同一の２つのカセットを有するＤＮＡ分子よりなる。 （ｉ） ｐＣｏｍｂＶＩＩＩの調製 ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端を介してｃｐＶＩＩＩ膜アンカーコードＰＣＲ断片をｐＣｏｍｂ２ファージミド発現ベクターに方向性をもって連結することにより、ｐＣｏｍｂ２−ＶＩＩＩまたはｐＣｏｍｂ２−８と命名したこの発明で使用するのに好適なファージミド発現ベクターを前記したように調製した。 ｐＣｏｍｂ２−８は、唯一のＳｐｅＩ制限部位を有していた。 ショートら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７５８３−７６００（１９８８）により記載されストラタジーンから市販されているｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）からの５１塩基対断片の添加により、ｐＣｏｍｂ−ＩＩＩ′またはｐＣｏｍｂ２−３′と命名した付加的な制限酵素クローン化部位を有するこの発明での使用に更に好適なファージミド発現ベクターを、ｐＣｏｍｂ２−３について前記したように調製した。 ｐＣｏｍｂ２−３′を調製するため、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素によりｐＣｏｍｂ２−３を最初に消化して線状化したｐＣｏｍｂ２−３を形成した。 同じ酵素によりベクターｐブルースクリプトを消化し、制限酵素部位ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩを含む５１塩基対断片を放出させた。 付着ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ末端を介して５１塩基対断片を線状化したｐＣｏｍｂ２−３ベクターに連結してｐＣｏｍｂ２−３′を形成した。 実施例１ｃ． クロラムフェニコール耐性マーカーを有するｐＣＢＡＫベクターの構築 その後ＳａｃＩによりｐＣＢ前駆体ベクターを消化し、Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端とした。 その後Ｔ４ポリメラーゼ処理ｐＣＢベクターを連結してｐＣＢベクターを形成したが、ＳａｃＩ部位を欠失するものである。 （ｉｉｉ） ｐＣＢＡＫ８の調製 実施例２ 第１のシストロンは、融合蛋白質、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩまたはＦｄ−ｃｐＩＩＩに機能的に結合したペリプラズム分泌シグナル（ｐｅｌＢリーダー）をコードする。 第２のシストロンは、カッパ軽鎖に機能的に結合した第２のｐｅｌＢリーダーをコードする。 ｐｅｌＢリーダーの存在により、細菌細胞質からペリプラズムへの融合蛋白質および軽鎖の共働してはいるが別の分泌が促進される。 ヘルパーファージと共にその後イー・コリに感染させると、繊維状バクテリオファージの集成が進行するため、図８および９に示すように繊維状ファージ粒子の全長さに沿ってコート蛋白質ＶＩＩＩが組込まれる。 ｃｐＩＩＩを使用する場合はバクテリオファージの尾部で蓄積が起こる。 ｃｐＩＩＩに対してｃｐＶＩＩＩ由来の膜アンカーの利用の利点は２倍である。 第１に、管状列に集成した約２７００ｃｐＶＩＩＩ単量体よりなる結合部位の多重性が粒子表面に沿って存在する。 第２に、構成体はファージの感染性を妨害しない。 （ｉ） Ｖ H プライマー 第１の代替は、混合したプライマープールの個々の構成員に対応する多数の独特のプライマー（その８つを表５に示す）を構成するものとした。 ５つの縮退位置の３つで２つの可能なヌクレオチドのいずれかを組込むことにより、表５の個々のプライマー２〜９を構築した。 ガンマ１重鎖ｍＲＮＡの第１の不変領域ドメインの部分に相補的となるように独特の３′プライマーを含む更なるＶ H増幅プライマーを設計した（プライマー１６および１７、表５）。 これらのプライマーは、Ｖ H由来のアミノ酸および重鎖の第１の不変領域ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ相同体を生成し得る。 したがって、これらのＤＮＡ相同体を使用してＦ vより寧ろＦａｂ断片を製造することができる。 脾臓またはハイブリドーマｍＲＮＡからの増幅の対照として、不変領域ＩｇＧ、重鎖内の高度に保存された領域にハイブリダイズする一組のプライマーを構成した。 ５′プライマー（プライマー１１、表５）はＣ H ２領域のｃＤＮＡに相補的であるのに対し、３′プライマー（プライマー１３、表５）はＣ H ３領域のｍＲＮＡに対して相補的である。 これらのプライマーとその鋳型との間には不整合はないと考えられる。 （ｉｉ） Ｖ L プライマー カッパまたはラムダｍＲＮＡの不変領域にハイブリダイズするように更なる３′Ｖ L増幅プライマーを設計した（表６のプライマー１０および１１）。 これらのプライマーにより、カッパまたはラムダ鎖の不変領域アミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むものとしてＤＮＡ相同体を製造するのが可能となる。 表５に列記した１９のプライマーは配列表に列記したが、次の配列番号により命名した： ジメチルホルムアミド中に２．５ｍｇのＮＰＮを含む２５０μｌの溶液と０．０１モル（Ｍ）リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に２ｍｇのＫＬＨを含む７５０μｌの溶液とを混合することにより、ＮＰＮ−ＫＬＨ接合物を調製した。 回転攪拌棒によりＫＬＨ溶液を攪拌しつつＮＰＮ溶液をＫＬＨ溶液にゆっくり添加することにより、２つの溶液を混合した。 その後４℃で１時間同じ攪拌で混合物を維持して接合を進行させた。 セファデックスＧ−２５によるゲルろ過により非接合ＮＰＮおよびＫＬＨから、接合したＮＰＮ−ＫＬＨを単離した。 単離したＮＰＮ−ＫＬＨは以下に記載するようにマウスに注射した。 チョムクジンスキーら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９（１９８７）により記載されたＲＮＡ調製方法を使用し、製造業者の指針に従いＲＮＡ単離キット（ストラタジーン）を使用して、前記したようにＫＬＨ−ＮＰＮにより免疫化した単一のマウスの脾臓から全細胞ＲＮＡを調製した。 簡略には、免疫化したマウスから脾臓を除去した直後に、４．０Ｍグアニンイソチオシアネート、ｐＨ７．０の０．２５Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．１Ｍのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍｌの変性溶液中でガラスホモジナイザーを使用して組織をホモジナイズした。 ｐＨ４．０で２Ｍの濃度の１ｍｌの酢酸ナトリウムをホモジナイズした脾臓と混合した。 ホモジナイズした脾臓を含む変性溶液には予めＨ 2 Ｏで飽和させた１ｍｌのフェノールも混合した。 ２ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）混合物をこのホモジネートに添加した。 ホモジネートを１０秒間激しく混合し、氷上で１５分間維持した。 その後ホモジネートを厚い壁の５０ｍｌポリプロピレン遠心分離チューブ（フィッシャー・サイエンティフィック社、ピッツバーグ、ＰＡ）に移した。 この溶液を１０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。 上部ＲＮＡ含有水層を新しい５０ｍｌのポリプロピレン遠心分離チューブに移し、等容量のイソプロピルアルコールと混合した。 この溶液を−２０℃で少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿させた。 沈殿したＲＮＡを含む溶液を１０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。 ペレット化した全細胞ＲＮＡを集め、前記した３ｍｌの変性溶液に溶解させた。 ３ｍｌのイソプロピルアルコールを再懸濁した全細胞ＲＮＡに添加して激しく攪拌した。 この溶液を−２０℃で少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿させた。 沈殿したＲＮＡを含む溶液を１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離した。 ７５％エタノールを含む溶液でペレット化したＲＮＡを１回洗浄した。 ペレット化したＲＮＡを真空下に１５分間乾燥させ、その後ジメチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理（ＤＥＰＣ−Ｈ 2 Ｏ）Ｈ 2 Ｏに再懸濁した。 「分子クローン化：実験室マニュアル」、マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２）に記載された方法を使用し、長いポリＡ域を含む配列について集積したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を全細胞ＲＮＡから調製した。 簡略には、前記したように調製した単一の免疫化したマウス脾臓から単離した全ＲＮＡの半分を１ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ 2 Ｏに再懸濁し、６５℃で５分間維持した。 １００ｍＭトリス−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンヒドロクロリド）、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．５の２．０ｍＭエチレンジアミン二ナトリウム四酢酸（ＥＤＴＡ）、および０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）よりなる１ｍｌの２×高塩装填緩衝液を再懸濁したＲＮＡに添加し、混合物を室温に冷却した。 ０．１Ｍ水酸化ナトリウムおよび５ｍＭＥＤＴＡを含む溶液でオリゴｄＴを洗浄した後にＤＥＰＣ−Ｈ 2 Ｏでカラムを平衡化するとにより予め調製したオリゴｄＴ（コラボラティブ・リサーチタイプ２またはタイプ３）カラムにその後混合物を装填した。 殺菌したポリプロピレンチューブに溶出物を集め、溶出物を６５℃で５分間加熱した後に同じカラムに再装填した。 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５の１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含む２ｍｌの高塩装填緩衝液を用いてその後オリゴｄＴカラムを洗浄した。 ５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳよりなる２ｍｌの１×中塩緩衝液を用いてその後オリゴｄＴカラムを洗浄した。 １０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、ｐＨ７．５、のｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳよりなる１ｍｌの緩衝液を用いてメッセンジャーＲＮＡをオリゴｄＴカラムから溶出させた。 フェノール／クロロホルムでこの溶液を抽出した後に１００％クロロホルムで一回抽出することによりメッセンジャーＲＮＡを精製した。 エタノール沈殿によりメッセンジャーＲＮＡを濃縮し、ＤＥＰＣＨ 2 Ｏに再懸濁した。 実施例２ｃ． ＤＮＡ相同体の調製 独特の５′プライマー（２〜９、表５）を使用し、脾臓ｍＲＮＡからの効率的なＶ HコードＤＮＡ相同体合成および増幅をアガロースゲル電気泳動により示されるように行う。 増幅したｃＤＮＡ（Ｖ HコードＤＮＡ相同体）は、予期される大きさ（３６０ｂｐ）の主要バンドとして認められた。 それぞれの反応における増幅したＶ Hコードポリヌクレオチド断片の量は類似しており、これらのプライマーの全ては増幅を開始するに際してほぼ同等に効率的であったことを示す。 これらのプライマーによる増幅の収率および質は再現性がある。 Ｖ LのＤＮＡ相同体も前記したように調製した精製したｍＲＮＡから調製する。 ＰＣＲ増幅のための調製に際し、前記例により調製したｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。 典型的な５０μｌ転写反応では、水中の５〜１０μｇの脾臓ｍＲＮＡを３００ｎｇ（５０．０ｐｍｏｌ）の３′Ｖ Lプライマー（プライマー１４、表５）と６５℃で５分間最初にアニールさせる。 その後、１．５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、８ｍＭＭｇＣｌ 2 、５０ｍＭＮａＣｌおよび２ｍＭスペルミジンに混合物を調整する。 モロニーネズミロイケミアウィルス逆転写酵素（ストラタジーン）２６単位を添加し、溶液を１時間３７℃に維持する。 前記したように製造した約５μｇのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、３００ｎｇの３′Ｖ Lプライマー（表５のプライマー１４）、３００ｎｇの５′Ｖ Lプライマー（表５のプライマー１６）、２００ｍＭのｄＮＴＰの混合物、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１５ｍＭＭｇＣｌ 2 、０．１％ゼラチンおよび２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌ反応物中でＰＣＲ増幅を行う。 実施例２ｄ． ＤＮＡ発現ベクターへのＤＮＡ相同体の挿入 ２５０単位のそれぞれの制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（両者ともベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ製）および製造業者により推奨された緩衝液を含む溶液に１００μｇのこのＤＮＡを混合することにより、ＤＮＡ相同体を挿入するためにラムダＨｃ２発現ＤＮＡベクターを調製する。 この溶液を３７で１．５時間維持する。 溶液を６５℃で１５分間加熱して制限エンドヌクレアーゼを不活性化させる。 溶液を３０℃に冷却し、製造業者の仕様に従って２５単位の熱失活性（ＨＫ）ホスファターゼ（エピセンター、マジソン、ＷＩ）およびＣａＣｌ 2をこれに混合する。 この溶液を３０℃で１時間維持する。 フェノールおよびクロロホルムの混合物で溶液を抽出することによりＤＮＡを精製し、その後エタノール沈殿を行う。 ここでラムダＨｃ２発現ベクターは、前記例で調製したＶ H ＤＮＡ相同体への連結のための準備が整う。 ３モルのＶ H ＤＮＡ相同体挿入物と各モルのＨｃ２発現ベクターとを５℃で一夜連結することにより、前記調製したＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限消化ラムダＨｃ２発現ベクターにこれらの調製したＶ H ＤＮＡ相同体をその後直接挿入する。 ギガパックＩＩボールド（ストラタジーン）を用いてＤＮＡをパッケージした後に約３．０×１０ 5のプラーク形成単位が得られ、その５０％が組換え体である。 製造業者の仕様にしたがってギガパック・ゴールドＩＩパッケージ抽出物（ストラタジーン）を使用し、Ｖ H ＤＮＡ相同体を含む連結混合物をパッケージする。 得られるラムダＨｃ２発現ライブラリーをその後ＸＬ１ブルー細胞に形質転換する。 Ｖ L配列において集積したライブラリーを調製するため、実施例２ｃにしたがってＶ L配列において集積したＰＣＲ増幅生成物を調製する。 これらのＶ L ＤＮＡ相同体を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより消化し、Ｖ H ＤＮＡ相同体について前記したように消化したＶ L ＤＮＡ相同体を１％アガロースゲル上で精製し、方向性をもった連結に適合したＶ Lポリペプチド遺伝子のレパートリーを形成する。 ラムダＨｃ２について記載したように制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより予め消化したラムダＬｃ２発現ベクターに調製したＶ L ＤＮＡ相同体をその後方向性をもって連結する。 Ｖ L ＤＮＡ相同体を含む連結混合物をパッケージし、前記したようにラムダＬｃ２発現ライブラリーを形成し、ＸＬ１ブルー細胞上にプレート処理するのに準備が整ったものとする。 実施例２ｅ． 同一の発現ベクター上におけるＶ H およびＶ L ＤＮＡ相同体のランダムな結合 重鎖と同様の様式で構成した軽鎖ライブラリーは２．５×１０ 6の構成員を含む。 抗カッパ鎖抗体を使用するプラーク検索は、ライブラリーに含まれる６０％が軽鎖挿入物を発現することを示す。 挿入物の百分率が小さいのは、ＳａｃＩおよびＸｂａＩによる開裂の後のベクターの不完全な脱リン酸化に起因する。 実施例２ｄで調製したラムダＬｃ２ライブラリーを増幅し、「分子クローン化：実験室マニュアル」、マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２）に記載された手順を使用して増幅したファージストックから５００μｇのラムダＬｃ２発現ライブラリーファージＤＮＡを調製する。 エンドヌクレアーゼ製造業者により供給された２００μｌの緩衝液中に１００単位のＭＬｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）を含む溶液中に３７℃で１．５時間、５０μｇのこの増幅した発現ライブラリーファージＤＮＡを維持する。 その後フェノールおよびクロロホルムの混合物により溶液を抽出する。 その後ＤＮＡをエタノール沈殿し、１００μｌの水に再懸濁する。 製造業者により特定された成分を含む最終容量２００μｌの緩衝液中で、この溶液を１００単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）と混合する。 この溶液を３７℃で１．５時間維持し、その後フェノールおよびクロロホルムの混合物によりこの溶液を抽出する。 ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＮＡをＴＥに再懸濁する。 実施例２ｄで調製したラムダＨｃ２発現ライブラリーを増幅し、前記詳述した方法を使用して５００μｇのラムダＨｃ２発現ライブラリーファージＤＮＡを調製する。 エンドヌクレアーゼ製造業者により供給された２００μｌの緩衝液中に１００単位のＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（ベーリンガー）を含む溶液中で３７℃で１．５時間、５０μｇのこの増幅したライブラリーファージＤＮＡを維持する。 ０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５により飽和したフェノールおよびクロロホルムの混合物を用いてその後溶液を抽出する。 その後ＤＮＡをエタノール沈殿させ、１００μｌの水に再懸濁する。 製造業者により特定された成分を含む最終容量２００μｌの緩衝液中で、この溶液を１００単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）と混合する。 この溶液を３７℃で１．５時間維持し、その後フェノールおよびクロロホルムの混合物によりこの溶液を抽出する。 ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＮＡをＴＥに再懸濁する。 制限消化したＨｃ２およびＬｃ２発現ライブラリーを互いに連結する。 その目的のため、連結キット（ストラタジーン）で供給された試薬を使用し、１μｇのＨｃ２および１μｇのＬｃ２ファージライブラリーＤＮＡよりなるＤＮＡ混合物を１０μｌ反応物中で調製する。 ＤＮＡ混合物を４５℃に５分間加温し、再アニールし得た全ゆる付着末端を融解する。 その後混合物を０℃に冷却して再連結を防止する。 バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（エキソヌクレアーゼ耐性検定で決定したものとして０．０２単位と等価な０．１ウエイス単位）を、１μｌの５ｍＭＡＴＰおよび１μｌの１０×バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍＭＭｇＣｌ 2 、５０ｍＭＤＴＴおよび５００μｇ／ｍｌＢＳＡを混合することにより１０×緩衝液を調製する）と共に冷却したＤＮＡ溶液に混合して連結混合物を形成する。 ４℃で１６時間の連結の後、ギカパック・ゴールドＩＩパッケージ抽出物を用いて１μｌの連結したファージＤＮＡをパッケージし、製造業者の指針に従って調製したＸＬ１ブルー細胞上にプレート処理し、ＮＰＮ免疫化マウスから誘導した重鎖および軽鎖を発現し得るジシストロン性発現ベクターのラムダファージライブラリーを形成する。 取得したクローンの一部を使用して組合せの有効性を決定する。 実施例２ｆ． 抗ＮＰＮ反応性ヘテロ二量体生成ジスシトロン性ベクターの選択 多数のクローンを検索する能力を評価し、結合ライブラリーにおける抗原結合クローンの頻度のより定量的な予測を得るため、百万のファージプラークを検索し、抗原に結合する約１００のクローンを同定した。 ＮＰＮに結合すると考えられた６つのクローンについて、６つの陽性および約２０の周囲のバクテリオファージプラークを含むプレートの領域を選択し、それぞれのプラークを抜取り、再プレート処理し、複製隆起により検索した。 予期されたように、２０のファージの内ほぼ１つが抗原に特異的に結合した。 陰性と考えられたプレート処理したファージの領域の核は再プレート処理の際に陽性ではなかった。 ＮＰＮと反応したファージの１つであるクローン２ｂを生体内切出し手順に従って切出したが、この場合２００μｌのファージストックおよび２００μｇのＣＬ１ブルーのＦ＋誘導体（Ａ 600 ＝１．００）（ストラタジーン）を１μｌのＭ１３ｍｐ８ヘルパーファージ（１×１０ 10 ｐｆｕ／ミリリットル（ｍｌ））と混合し、３７℃で１５分間維持した。 ルリア・ベータニ（ＬＢ）培地中で４時間維持し、７０℃で２０分間加熱してＸＬ１ブルー細胞を熱失活させた後、ファージミドをＸＬ１ブルー細胞に再感染させ、アンピシリンを含むＬＢプレートにプレート処理した。 この手順によりクローン化挿入物がラムダＺａｐＩＩベクターからプラスミドベクターに変換され、容易な操作および配列決定（ストラタジーン）が可能となった。 製造業者の指針に従って配列決定キットを使用し（ＵＳバイオケミカル社、クリーブランド、オハイオ）、サンガーら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７４：５４６３−５４６７（１９７７）に記載されたサンガーのジデオキシ法を使用し、Ｖ HおよびＶ Lの一部をコードするファージミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定によりその後決定した。 クローン２ｂＦｄ鎖のヌクレオチド残基配列を配列番号：９９として配列列記に列記する。 カッパ軽鎖可変および不変領域のヌクレオチド残基配列は、それぞれ配列番号：１００および配列番号：１０１として配列列記に列記する。 実施例２ｇ． 繊維状ファージコート蛋白質膜アンカーをコードするＤＮＡ配列の調製 細菌懸濁物に対して２００μｌの新たに調製した溶液ＩＩを混合し、チューブを迅速に５回反転させた。 溶液ＩＩは０．２ＮＮａＯＨおよび１％ＳＤＳを混合することにより調製した。 細菌懸濁物、１５０μｌの氷冷溶液ＩＩＩを混合し、倒立位置で１０秒間穏やかにチューブをボルテックス処理し、粘稠な細菌溶解物に溶液ＩＩＩを分散させた。 溶液ＩＩＩは、６０ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム、１１．５ｍｌの氷酢酸および２８．５ｍｌの水を混合することにより調製した。 その後得られた細菌溶解物を氷上に５分間保存し、その後ミクロ遠心中で１２，０００×ｇで５分間４℃で遠心分離した。 得られた上澄を回収し、新しいチューブに移した。 上澄に対して等容量のフェノールクロロホルムを添加し、混合物をボルテックス処理した。 その後混合物をミクロ遠心中で１２，０００×ｇで２分間遠心分離した。 得られた上澄を新しいチューブに移し、２容量のエタノールを用いて室温で二本鎖バクテリオファージＤＮＡを沈殿させた。 混合物を室温に２分間放置した後、混合物を遠心分離してＤＮＡをペレット化させた。 上澄を除去し、ペレット化した複製形態ＤＮＡを２５μｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭＥＤＴＡ（ＴＥ）に再懸濁した。 二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８複製形態ＤＮＡをその後ＰＣＲの鋳型として使用した。 Ｆ：前方プライマー Ｂ：後方プライマー １：５′から３′：Ｃ H １３′末端について重複する配列に二本下線を付す。 修飾したｃｐＶＩＩＩ膜アンカードメインの増幅を確認するため、ＰＣＲ精製ＤＮＡ生成物を１％アガロースゲル中で電気泳動した。 ｃｐＶＩＩＩの予期される大きさは約１５０塩基対であった。 修飾ｃｐＶＩＩＩＤＮＡ断片を含むアガロース中の領域を前記したようにアガロースから単離した。 単離した修飾ｃｐＶＩＩＩＤＮＡ断片の配列を配列番号：１１１として列記する。 その後単離したｃｐＶＩＩＩＤＮＡ断片と実施例２ｉに後記するように同様に調製した修飾Ｆｄの断片とを混合し、融合蛋白質Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩをコードするＤＮＡ断片の形成を図った。 表７に列記するプライマー対Ｇ−３（Ｆ）（配列番号：１０７）およびＧ−３（Ｂ）（配列番号：１０８）を前記行ったように第１のＰＣＲ反応で使用し、ｃｐＩＩＩ膜アンカー遺伝子を増幅させ、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ制限部位を断片に組込んだ。 増幅したＰＣＲ断片は、重鎖およびｃｐＩＩＩコードドメインの間に並置した４つのグリセリン残基および１つのセリンから構成される５つのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列も含むものとした。 一旦発現されると、通常の二次構造を欠失する５つのアミノ酸の配列は、ＦａｂおよびｃｐＩＩＩドメインの間の相互作用を最小にするように働いた。 それぞれ断片の５′および３′末端のＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ部位を有する得られたＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩＤＮＡ断片は、前記したように確認し精製した。 ＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩ膜アンカードメインＤＮＡ断片の配列を配列番号：１１３として配列表に列記する。 表７に列記したプライマー対Ｌａｃ−Ｆ（配列番号：１０９）およびＬａｃ−Ｂ（配列番号：１１０）を使用する第２のＰＣＲ増幅は、５′ＮｈｅＩ部位および３′ＥｃｏＲＩ部位を有するＬａｃＺプロモーター、オペレーターおよびＣａｐ結合部位を増幅するＭ１３ｍｐ１８複製形態鋳型ＤＮＡの別の画分上で行った。 この増幅のために使用するプライマーは、ｃｐＩＩＩ遺伝子断片の３′末端および増幅したｃｐＩＩＩ断片に対して３′のＮｈｅＩ部位の一部と重複する増幅した断片の５′末端上のＮｈｅＩ部位を組込むように設計した。 ＰＣＲ生成物の反応および精製は前記したように行った。 ５′ＮｈｅＩおよび３′ＥｃｏＲＩ制限部位を有する得られたＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩＤＮＡ断片の配列を配列番号：１１４として配列表に列記する。 ｃｐＩＩＩ膜アンカーおよびＬａｃＺプロモーター領域を構成するのに使用する他のＬａｃ−Ｂプライマーは表１０に示すようにＬａｃ−Ｂ′とした。 第２のＰＣＲ増幅においてＬａｃ−Ｂに代えてＬａｃ−Ｆと共にＬａｃ−Ｂ′を使用した以外は、前記したようにして増幅反応を行った。 配列番号：１１４のヌクレオチド位置１〜ヌクレオチド位置１７２として増幅反応からの生成物を配列表に列記する。 Ｌａｃ−Ｂ′を使用すると結果的に３′末端の２９ヌクレオチドを欠失するＬａｃＺ領域が得られたが、Ｌａｃ−ＦおよびＬａｃ−Ｂプライマーを用いて製造したより長い断片と機能的に等価であった。 プライマー対６−３（Ｆ）および６−３（Ｂ）およびＬａｃ−ＦおよびＬａｃ−Ｂを使用する第１および第２のＰＣＲ増幅の生成物をその後ｃｐＩＩＩ膜アンカー重複およびＮｈｅＩ制限部位に対応するヌクレオチドにて組換え、Ｇ３−Ｆ（配列番号：１０７）およびＬａｃ−Ｂ（配列番号：１１０）プライマー対を使用する第２回のＰＣＲに供し、次のもの：５′ＳｐｅＩ制限部位、全成熟ｃｐＩＩＩ蛋白質のアミノ酸残基１９８に対応するヌクレオチド残基配列で開始するｃｐＩＩＩＤＮＡ膜アンカードメイン、アミノ酸残基番号１１２で膜アンカーにより与えられる内生停止部位、ＮｈｅＩ制限部位、ＬａｃＺプロモーター、オペレーターおよびＣａｐ結合部位配列、および３′ＥｃｏＲＩ制限部位よりなる組換えＰＣＲＤＮＡ断片生成物を形成した。 その後組換えＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩ膜アンカードメインＤＮＡ断片をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにより制限消化し、実施例１ａ（ｉｖ）で調製した唯一のＳｐｅＩ部位を有するｐＣｏｍｂ２ファージミド発現ベクターに方向性をもって連結するためのＤＮＡ断片を製造し、ｐＣｏｍｂ２−ＩＩＩ（ｐＣｏｍｂ２−ＩＩＩとしても言及する）ファージミド発現ベクターを実施例１ｂ（ｉｉ）に記載したように形成した。 実施例２ｈ． 抗ＮＰＮコードＶ H ＤＮＡ断片の単離 実施例２ｉ． 融合蛋白質Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩの部分をコードするＤＮＡ断片の調製 実施例２ｊ． ｐＣＡＢＫ８−２ｂジシストロン性発現ベクターの構成 その後ジシストロン性ＤＮＡ分子を含むファージミドによりイー・コリ株ＴＧ１を形質転換し、元のクローン２ｂがアンピシリン選択可能耐性マーカー遺伝子を含むため、形質転換体をアンピシリン上で選択した。 イー・コリの高効率電気形質転換のため、ＴＧ１細胞の１：１００容量の一夜培養物を１リットルのＬブロス（１％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種した。 細胞懸濁物を激しく振盪しながら３７℃に維持して６００ｎｍの吸光度を０．５〜１．０とした。 その後最初に氷中でフラスコを１５〜３０分間冷却し、その後冷却したローター中で４０００×ｇで１５分間遠心分離して細菌をペレット化することにより、対数増殖期の細胞懸濁物を回収した。 得られる上澄を除去し、合計１リットルの冷却した水に細菌細胞ペレットを再懸濁して細胞懸濁物を形成した。 遠心分離および再懸濁手順を更に２回繰返し、最後の遠心分離の後に細胞ペレットを２０ｍｌの冷却した１０％グリセリンに再懸濁した。 その後再懸濁した細胞懸濁物を遠心分離して細胞ペレットを形成した。 得られた細胞ペレットを再懸濁して冷却し、１０％グリセリン中で２〜３ｍｌの最終容量とし、結果として１〜３×１０ 10細胞／ｍｌの細胞濃度とした。 電気形質転換手順のため、４０μｌの調製した細胞懸濁物を１〜２μｌのファージミドＤＮＡと混合して細胞−ファージミドＤＮＡ混合物を形成した。 得られた混合物を混合し、１分間氷上に載置した。 エレクトロポレーション装置、例えばジーンパルサーを２５ｕＦおよび２．５ｋＶに設定した。 パルス調節器を２００オームに設定した。 冷却した０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに細胞−ＤＮＡ混合物を移した。 その後キュベットを冷却した安全隔室に置き、前記設定で１回パルス処理した。 パルス処理した混合物にその後１ｍｌのＳＯＣ培地を混合し、パスツールピペットを用いて細胞を再懸濁した（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母エキス、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ 2 、１０ｍＭＭｇＳＯ 4および２０ｍＭグルコースを混合することによりＳＯＣ培地を調製した）。 その後細胞懸濁物を１７×１００ｍｍポリプロピレンチューブに移し、３７℃で１時間維持した。 維持期間の後、選択可能マーカー遺伝子を与えるファージミドを含むアンピシリン耐性コロニーの選択のため、形質転換ＴＧ１細胞をその後アンピシリンＬＢプレート上にプレート処理した。 アンピシリン耐性コロニーを選択し、正確な挿入物の大きさおよびＦａｂの発現について分析した。 簡略には、ファージミドＤＮＡの単離のために選択したコロニーのＤＮＡ小調製物を調製した。 それぞれの小調製物から単離したファージミドＤＮＡをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩにより制限消化し、１％アガローゲル上で消化物を電気泳動した。 ８３０ｂｐ断片がゲル上で見られたものとしてクローンＡＫ１６を選択し、消化したクローン２ｂへのＦｄ−ｃｐＶＩＩＩＰＣＲ融合生成物の挿入を確認した。 得られたｐＣＢＡＫ８−２ｂ発現ベクターは、次の要素：ｆ１繊維状ファージ複製開始点、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ選択可能耐性マーカー遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子の上流の誘導性ＬａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼプロモーターが隣接する多重クローン化部位、およびジシストロン性ＤＮＡ分子（第１のカセットは、リボソーム結合部位、ｐｅｌＢリーダーおよびＦｄ−ｃｐＶＩＩＩＤＮＡ融合生成物よりなり、第２のリボソーム結合部位、第２のｐｅｌＢリーダーおよびカッパ軽鎖よりなる第２のカセットに機能的に結合する）をコードするヌクレオチド残基配列よりなるものであった。 この発明で使用するクロラムフェニコール耐性ベクターを製造するため、得られたｐＣｏｍｂ２−３ファージミドベクターをその後ＳａｃＩＩおよびＡｐａＩにより制限消化し、単離した断片を形成した。 発現調節配列およびｃｐＩＩＩ配列を含む得られた単離断片を、実施例１ｃ（ｉｉ）で調製した同様に消化したｐＣＢＡＫ０ファージミドベクターに方向性をもって連結し、ｐＣＢＡＫ３ファージミド発現ベクターを形成した。 このベクターはＦｄおよびカッパ軽鎖配列を欠失していた。 実施例２ａに記載した元の結合ライブラリーから単離したファージミドクローン２ｂをＳａｃＩおよびＸａｂＩにより制限消化し、カッパ軽鎖をコードするヌクレオチド残基配列を単離した。 Ｆｄ−ｃｐＩＩＩを含む前記調製したＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限消化ファージミド発現ベクターに単離したカッパ軽鎖配列をその後方向性をもって連結し、ファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ３−２ｂを形成した。 得られたベクターは、Ｆｄ−ｃｐＩＩＩ融合蛋白質とカッパ軽鎖との共働発現のためのジシストロン性ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を含んでいた。 その後ファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ３−２ｂによりＸＬ１ブルー細胞を形質転換した。 クロラムフェニコール耐性ファージミドを含む形質転換したコロニーを前記したように選択し、実施例２ｊに記載したようにＦａｂの正確な大きさの挿入物および発現について分析した。 ｐＣＢＡＫ３−２ｂファージミドベクターにおける挿入物およびＦａｂの発現の確認の後、ＸＬ１ブルー細胞をその後形質転換し、実施例３および４に記載したようにＦａｂ抗体の発現のために誘導した。 この糸の使用は、実施例６により、またパーソンら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８８：２４３２−２４３６（１９９１）により記載され先に特徴付けられた（５０００クローン当り１つの結合体）ヒト結合抗破傷風毒素Ｆａｂライブラリーを分類することにより更に示された。 元はラムダファージベクター系中のライブラリーを、重鎖および軽鎖の元の対合を保持するｐＣｏｍｂ２−３において再構成した。 ライブラリーの大きさ、１０ 7クローンは、元のラムダファージライブラリーより１０倍大きかった。 １回繰返しの選別処理の後、拾った１３または５７のクローンが破傷風毒素結合体であると決定され、これは１０ 3倍の集積を示した。 ３回目の選別の後、ファージ収率は２００倍に増加し、特定のファージの集積が示された。 よって全てのクローンが抗原特異的結合体である。 よって１０ 8の構成員の大きな結合ライブラリーがこの系を使用して接近可能となる。 実施例６〜８に記載する変異誘発によって更に大きなライブラリーが達成される。 実施例３ 実施例４ 実施例４ｂ． ファージＥＬＩＳＡ 実施例４ｃ． ファージの抗原特異的沈殿 更に、ＤＮＡ制限分析を実施し、重鎖および軽鎖挿入物の存在を決定した。 クローンのＤＮＡ制限分析により、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合構成体およびカッパ鎖挿入物について予期されたように、１．４ｋｂのＸｈｏＩおよびＸｂａＩ断片の存在が明らかとなった。 特定された結合特異性のクローンの集積について固定化した抗原の有用性を示すため、選別処理実験を行った。 ｃｐＶＩＩＩ融合体として抗破傷風Ｆａｂを発現するアンピシリン耐性ファージミドを構成した。 ヘルパーファージによるこのクローンのレスキューにより、そのコート上で抗破傷風Ｆａｂを示すアンピシリン耐性ファージミドをコードするファージが製造された。 破傷風特異性をコードするこれらのファージをＮＰＮハプテンコードファージと混合し（１：１００）、破傷風毒素により被覆したミクロ滴定プレートに結合させた。 １時間の維持期間の後、プレートを十分に洗浄し、その後低いｐＨの緩衝液を用いてファージを溶出した。 対数増殖期のＸＬ１ブルー細胞への感染およびアンピシリンおよびクロラムフェニコール上への画分のその後のプレート処理により、集積の直接定量を行った。 １，０００を越えるコロニーの検討により、溶出したファージから誘導したアンピシリン耐性コロニーが、クロラムフェニコール耐性コロニーを２７対１で越えることが示された。 したがって、選別処理によって抗破傷風Ｆａｂを示すファージが２７００倍に集積された。 この結果は、百万分の１で存在する特定の特異性のクローンが、２回繰返しの選別処理の後には非特異的クローンに対して優勢となり得ることを示唆する。 実施例５ 検索により容易に接近可能なのは構成員の約０．１〜１％のみであったため、先に結合させた系の全ての力を完全には利用できていなかった。 ファージミド／Ｍ１３の系では、類似する大きさのライブラリーが生成され、親和力選択を介して全ての構成員に接近する。 更に、一価Ｆａｂを生成したラムダベクターとは異なり、この系は多価粒子を生成し、よってより広い範囲の親和力の補足を可能とするものである。 重鎖の膜定置およびペリプラズムにおけるカッパ鎖の区画化が、この機能性二量体蛋白質を発現する鍵である。 この系の潜在力は抗体に何ら限定されず、全ゆる蛋白質認識系または多数の構成員を含む系の組合せに拡張することができる。 縮退オリゴヌクレオチドプライマーのプールは、第１のＰＣＲ反応生成物の生成物の３′末端に相補的で重複し得る５′末端を有する生成物の増幅を結果的に与えるように設計した。 よって、２つの別のＰＣＲ反応生成物をプールし、２つの生成物の間の重複領域を延在して無作為化したＣＤＲ３領域を有する重鎖を結果的に与える第３のＰＣＲ反応に供する。 ファージミドベクターｐＣｏｍｂ２−３′を実施例１ｂ（ｉｉ）に記載したように調製した。 ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化ｐＣｏｍｂ２−３′ベクターへの連結により、７Ｅラムダクローン由来の重鎖および軽鎖の元の対合を維持した。 ｃｐＩＩＩ膜アンカー配列を置換するため、ＬａｃＺプロモーター配列およびＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化により欠失させたｐｅｌＢリーダー、ｐＣｏｍｂ３由来のＳｐｅＩ−ＳａｃＩ断片（実施例１ｂ（ｉｉ）のように調製）を、クローン７Ｅ由来の重鎖および軽鎖配列を含むｐＣｏｍｂ２−３′ベクターに連結した。 以後ｐＣ３−ＴＴ７Ｅとして言及する得られたファージミドクローンを、実施例３でファージ表面上の抗ＮＰＮヘテロ二量体について記載したように最初に発現させ、その後実施例４ｃで抗ＮＰＮについて記載したようにＴＴ被覆プレート上で選別処理することにより検索した。 クローンｐＣ３−ＴＴ７Ｅは１０ -7 ＭのオーダーのＴＴに対するＫ dを示し、バーバスら、前記に記載されたように非特異的ファージに対して１０ 3倍集積された。 重鎖のＣＤＲ３領域の無作為変異誘発のための鋳型ＤＮＡとして重鎖および軽鎖配列の両者を有するクローンｐＣ３−ＴＴ７Ｅを使用し、ここに記載するように抗原結合特異性を変化させた。 実施例１ａ（ｉｉ）に記載したように重鎖の配列を決定した。 図１２に示すように２つの別のＰＣＲ反応を行った。 第２のＰＣＲ反応の結果、フレーム構造領域３の３′末端から長さ約３９０塩基対のＣＨ１領域の末端に延在する重鎖の増幅が得られた。 この領域を増幅するために次のプライマーを使用した。 ７ＥＣＤＲ３と命名した５′アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマープールは、式５′−ＧＴＧ−ＴＡＴ−ＴＡＴ−ＴＧＴ−ＧＣＧ−ＡＧＡ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＣＡＡ−ＧＧＧ−ＡＣＣ−ＡＣＧ−３′により表されるヌクレオチド配列を有していた（ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴとすることができ、ＳはＣまたはＧであり（配列番号：１２０）、またプライマープールの５′末端はオリゴヌクレオチドプライマーＢ７３ＦＲ３の相補的ヌクレオチド配列により表されるフレーム構造３の３′末端に相補的であり、プライマープールの３′末端はフレーム構造４の５′末端に相補的である）。 プライマープールの２つの特定の末端の間の領域は、長さ１６アミノ酸残基の変異誘発したＣＤＲ３領域の多様な集団を最終的にコードする４８マーＮＮＳ縮退によって表した。 パーソンら、前記により記載されたようにヌクレオチド配列５′−ＧＣＡＴＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ−３′（配列番号：１２１）を有する３′センスオリゴヌクレオチドプライマーＣＧ１Ｚは、ＣＨ１の３′末端に対応する重鎖のコード鎖にハイブリダイズした。 前記したように１μｇのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー７ＥＣＤＲ３およびＣＧ１Ｚを含む１００μｌ反応物中で第２のＰＣＲ反応をｐＣ３−ＴＴ７Ｅ上で行った。 得られたＰＣＲ増幅生成物をその後前記したようにゲル精製した。 この第２のＰＣＲ変異誘発増幅からのＤＮＡの全収量は約３μｇ／１００μｌであった。 その後第１および第２のＰＣＲ反応からの１００ナノグラムのゲル精製生成物を、最終ＰＣＲ反応におけるプライマー対としての１μｇのそれぞれのＦＴＸ３およびＣＧ１Ｚオリゴヌクレオチドと混合し、図１２に示すように重複延長により完全な重鎖断片を形成した。 ＰＣＲ反応混合物は、前記したように１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌＴａｑポリメラーゼおよび３μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰも含むものとした。 ＰＣＲ反応は前記したように行った。 十分な量の増幅生成物を得るため、１５の同一のＰＣＲ反応を行った。 フレーム構造１で開始しＣＨ１の末端に延長し無作為に変異誘発したＣＤＲ３領域を有する得られた重鎖断片は、長さ約７９０塩基対であった。 １５の反応からの重鎖断片増幅生成物を最初にプールし、その後ファージミドライブラリーへのその組込みの前に、前記したようにゲル精製した。 それぞれの増幅からの全収量は約３μｇ／１００μｌであり、よって全プールした収量は約４５μｇの増幅した変異誘発重鎖を含んでいた。 実施例６ｂ． ファージミドライブラリー構築 形質転換の後、ヘテロ二量体発現が誘導されたファージを単離するため、フルオレセインのような標的抗原上での続く選別処理につき、３ｍｌのＳＯＣ培地（ＳＯＣは、２０ｇバクトトリプトン、５ｇ酵母エキスおよび０．５ｇＮａＣｌを１リットルの水中で混合し、ｐＨを７．５に調整し、Ｆｄ−ｃｐＩＩＩおよび軽鎖ヘテロ二量体の発現を誘導するために使用する直前に２０ｍｌのグルコースを混合することにより調製した）を混合し、培養物を２２０ｒｐｍで１時間３７℃で振盪し、その時間の後２０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＳＢ（ＳＢは、リットル当り３０ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキスおよび１０ｇモップス緩衝液を混合しｐＨを７に調整して調製した）および混合物を３００ｒｐｍで更なる時間振盪した。 ５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１００ｍｌＳＢに得られた混合物を混合し、１時間振盪し、その時間の後にヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０ 12 ｐｆｕ）を混合し、混合物をさらに２時間振盪した。 この時間の後、７０μｇ／ｍｌカナマイシンを混合し、３０℃で一夜維持した。 低い温度ほど、結果的にファージの表面状でより良好なヘテロ二量体組込みが得られた。 滴定し得るコロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定するため、ファージ（パッケージしたファージミド）をＳ中で希釈し、１μｌを使用して１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＳＢ中で生育させた５０μｌの新鮮な（ＯＤ６００＝１）イー・コリＸＬＩブルー細胞に感染させた。 ファージおよび細胞を室温で１５分間維持し、その後ＬＢ／カルベニシリンプレートに直接プレート処理した。 使用した選別処理手順は、元はパルムレイとスミス（パルムレイら、Ｇｅｎｅ，７３：３０−５−３１８）により記載されたものの改変である。 ０．１Ｍビカーボネート、ｐＨ８．６中で前記調製した２５μｌの５０μｇ／ｍｌＴＴ抗原を用い、ミクロ滴定プレート（コスター３６９０）の２〜４の穴を４℃で一夜被覆した。 穴を水により２回洗浄し、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより穴を完全に満たしてプレートを３７℃で１時間維持することによりブロックした。 ブロック溶液を振盪して出した後、前記調製したファージライブラリー（典型的には１０ 11 ｃｆｕ）をそれぞれの穴に混合し、プレートを３７℃で２時間維持した。 溶出したファージを使用し、２ｍｌの新鮮な（ＯＤ 600 ＝１）イー・コリＸＬ１ブルー細胞に室温で１５分間感染させ、その時間の後に２０μｌ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＳＢを混合した。 プレート処理のために２０、１０および１／１０μｌの画分を培養物から除去し、プレートから溶出されたファージ（パッケージされたファージミド）の数を決定した。 培養物を３７℃で１時間振盪し、その後これを５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＳＢに添加し、１時間振盪した。 その後ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０ 12 ｐｆｕ）を添加し、培養物を更に２時間振盪した。 この時間の後に、７０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加し、培養物を３７℃で一夜インキュベートした。 ファージ調製および更なる選別処理を前記したように繰返した。 それぞれの回の選別処理の後、ファージの百分率収量を決定したが、この場合％収量−（溶出したファージの数／装填したファージの数）×１００とした。 実施例６ｂに記載したように選択プレート上で滴定することにより、初発ファージ投入比率をそれぞれの回の選別処理について約１０ 11 ｃｆｒと決定した。 前記したように２ｍｌの対数増殖期ＸＬ１ブルー細胞に感染させ、画分を選択プレート上でプレート処理することにより最終ファージ出力比率を決定した。 対照ファージによるこの表面への非特異的結合は、穴当り１０ 4 〜１０ 5ファージの間で変動した。 以下の２）に記載するように可溶性Ｆａｂの製造およびＥＬＩＳＡによるフルオレセインへの結合の確認により、それぞれ酸溶出およびフルオレセイン溶出ライブラリーについて、形質転換したコロニーから無作為に選択した６０の内の８つの反応性クローンおよび形質転換したコロニーから無作為に選択した４０の内の３８つの反応性クローンが明らかとなった。 可溶性ヘテロ二量体を調製するため、陽性クローンからファージミドＤＮＡを単離し、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化した。 これらの酵素による消化によって和合性の付着末端が生成した。 遺伝子ＩＩＩ部分を欠失する４．７ｋｂＤＮＡ断片をゲル精製（０．６％アガロース）して自己連結した。 イー・コリＸＬ１ブルーの形質転換により、ｃｐＩＩＩ断片を欠失する形質転換体を単離した。 １．６ｋｂ断片を生成する筈であるＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化によるｃｐＩＩＩ断片の除去についてクローンを検討した。 ０．２のＯＤ 600が達成されるまで、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２０ｍＭＭｇＣｌ 2を含む１００ｍｌＳＢ中で３７℃でクローンを生育させた。 ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、培養物を３０℃で一夜生育させた（３７℃での生育はヘテロ二量体収量の軽い減少を与えるのみである）。 ＪＡ１０ローター中４℃で１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離することにより細胞をペレット化した。 ３４μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む４ｍｌＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、氷上での超音波処理（５０％負荷で２〜４分）により溶解させた。 ＪＡ２０ローター中４℃で１５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより残渣をペレット化した。 後記するようにＥＬＩＳＡ分析のために上澄を直接使用し、−２０℃で保存した。 多数のクローンの検討のために、１０ｍｌの培養物で分析のための十分なヘテロ二量体が与えられた。 この場合、２ｍｌの緩衝液中で超音波処理を行った。 前記調製した可溶性ヘテロ二量体をＥＬＩＳＡにより検定した。 この検定のため、１μｇ／穴のフルオレセイン−ＢＳＡ溶液をミクロ滴定プレートの個々の穴に混合し、４℃で一夜維持し、蛋白質溶液を穴の壁に付着させた。 維持期間の後、ＰＢＳにより穴を１回洗浄し、その後３％ＢＳＡの溶液と共に維持し、穴上の非特異的部位をブロックした。 プレートを３７℃で１時間維持し、その時間の後にプレートを反転させ、振盪してＢＳＡ溶液を除去した。 前記調製した可溶性ヘテロ二量体をそれぞれの穴にその後混合し、３７℃で１時間維持して免疫反応生成物を形成した。 維持期間の後、ＰＢＳを用いて穴を１０回洗浄し、非結合可溶性抗体を除去し、その後１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で希釈したアルカリ性ホスファターゼと接合した二次ヤギ抗ヒトＦＡＢと共に維持した。 穴を３７℃で１時間維持し、その後ＰＢＳにより穴を１０回洗浄し、その後ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）による展開を行った。 前記ＥＬＩＳＡで決定した免疫反応性ヘテロ二量体をその後競合ＥＬＩＳＡにより分析し、変異誘発したヘテロ二量体の親和力を決定した。 可溶性ヘテロ二量体の存在下に混合した濃度で１０ -9 Ｍ〜１０ -5 Ｍの濃度範囲の増加する濃度の可溶性フルオレセイン−ＢＳＡを用いて前記したようにＥＬＩＳＡを行った。 実施例６ｄ． 選択した抗フルオレセインヘテロ二量体の配列分析 逆に、フルオレセインによって単離したクローンはコンセンサス配列の高い選択を示した。 配列決定した１０のクローンの内、異なる配列が認められたのは３のみであった。 全てのクローンが、アミノ酸残基位置９５のグリシンおよび位置１０１のアスパラギン酸を有していた。 アミノ酸残基位置は、カバトら、「免疫学的に興味ある蛋白質の配列」、ＵＳデパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービス（１９８７）に記載されたようにカバト番号系に基く。 全ての３２の可能なコドンを製造する合成手順により与えられたグリシン残基をコードする両者の可能なコドンを使用した。 天然の抗体では、位置１０１のアスパラギン酸残基は、フレーム構造領域３（ＦＲ３）の位置９４のアルギニン残基と塩橋を形成することにより構造的な役割を果たしている。 よって、人工的な選択過程が、動物に認められるものを反映する構造的意義の相互作用を反復した。 更に、１０のクローンから発現した９の半合成抗体は、直接隣接するループの中央付近にセリン−アルギニン−プロリンのトリプレット配列またはアルギニン残基のアミノ末端側で除去された１残基を含んでいたが、これらの残基の２つについてのコドン使用が異なっていた。 クローンＦ３１はこの中央構造を欠失していた。 全ての配列は、３２の可能なコドンの３つによりコードされるアルギニン残基に富んでいた。 １０の異なるＣＤＲ３配列内のアルギニンの存在と、同様に合成において３つの可能なコドンによりコードされるロイシンおよびセリンとの比較により、アルギニン−ロイシン−セリン比率は２９：１６：１５であることが明らかとなった。 アルギニンの選択に対するこの偏向は、フルオレセインのジシストロン性特徴の結果たり得る。 異なるコドンが使用されていることを突き止めたことは、クローン的選択は抗原−抗体合体のレベルで起こり、ＤＮＡへのヌクレオチド組込みの何らかの予期しない偏向によるものではないという提案を支持する。 第１のＰＣＲ反応の結果、ベクターの５′ＥｃｏＲＩ部位からＣＤＲ３領域の５′末端に延在するｐＣ３−ＴＴ７Ｅクローン中の軽鎖断片の領域の増幅を得た。 この領域を増幅するために次のプライマーを使用した：ヌクレオチド配列５′−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＧ−３′（配列番号：１２６）を有し、ベクターのＥｃｏＲＶ部位に対応する軽鎖の非コード鎖にハイブリダイズする５′アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーＫＥＦ、ヌクレオチド配列５′−ＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣ−３′（配列番号：１２７）を有し、ＣＤＲ３の５′末端に対応する重鎖のコード鎖にハイブリダイズする３′センスオリゴヌクレオチドプライマーＫＶ１２Ｂ。 ＰＣＲ増幅は実施例６ａに記載したように行った。 その後得られたＰＣＲ生成物を実施例１ｄに記載したようにゲル精製し、第２のＰＣＲ反応の生成物と共に重複延長ＰＣＲ反応で使用し（両者とも後記する）、図１２に示すように変異誘発したＣＤＲ３領域を含む再構成した重鎖に２つの生成物を組換えた。 第２のＰＣＲ反応の結果、ＣＤＲ３領域の５′末端からＣＨ１領域の末端に延在する軽鎖の増幅が得られた。 この領域を増幅するために次のプライマーを使用した。 ＫＶ５Ｒ３と命名した５′アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマープールは、式５′−ＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ−３′（配列番号：１２８）により表されるヌクレオチド配列を有していた（ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴとすることができ、ＫはＧまたはＴであり、またプライマープールの５′末端はＣＤＲ３の５′末端に相補的であり、プライマープールの３′末端はＣＤＲ３の３′末端およびフレーム構造４の５′末端に相補的である）。 プライマープールの２つの特定の末端の間の領域は、ＣＤＲ３領域の非変異誘発５′および３′末端を境界とする長さ５アミノ酸の内部変異誘発したＣＤＲ３領域の多様な集団を最終的にコードする１５マー縮退によって表した。 ヌクレオチド配列５′−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ−３′（配列番号：１２９）を有する３′センスオリゴヌクレオチドプライマーＴ７Ｂは、ベクターのＴ７領域に対応する軽鎖のコード鎖にハイブリダイズした。 第２のＰＣＲ反応は、ＫＶ５ＲおよびＴ７Ｂプライマーを用いて実施例６ａに記載したようにｐＣ３−ＴＴ７Ｅ上で行った。 得られたＰＣＲ増幅生成物をその後前記したようにゲル精製した。 第１および第２のＰＣＲ反応からの５００ナノグラムのゲル精製生成物を、その後最終ＰＣＲ反応においてプライマー対としての１μｇのＫＥＦおよびＴ７Ｂオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれと混合し、図１２に示すように重複延長により完全な軽鎖断片を形成した。 ＰＣＲ増幅は実施例６ａに記載したように行った。 十分な量の増幅生成物を得るため、５つの同一のＰＣＲ反応を行った。 実施例７ｂ． ファージミドライブラリー構築 実施例７ｃ． ファージ表面上での抗フルオレセインヘテロ二量体の選択および選択した抗体の配列分析 重鎖および軽鎖の両者のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の無作為変異誘発に帰着するようにプライマーを設計できるため、ＣＤＲ領域の変異誘発はＣＤＲ３領域に限定されるものではない。 ６つの全てのＣＤＲ領域の変異の結果、動物で得ることができるものを越える例外的に多様なライブラリーが得られる。 全てのＣＤＲにおける無作為化を得るため、重鎖ＣＤＲを出発クローンから最初に無作為化し、その後最良の抗体結合体の選択を行うことができる。 軽鎖のＣＤＲ上での第２の変異誘発工程を行うことができ、得られたライブラリーを選択した重鎖結合体と混合することができる。 また、全てのＣＤＲを同時に無作為化することができ、この結果重鎖および軽鎖ライブラリーを得て、これらをその後組合せて予備選択した抗原に対する選択に供するものとする。 実施例８ ここに記載する発明は３つの必須の特徴を有する：（ｉ）多価ファージ発現系の使用によって素朴なライブラリーから低親和力Ｆａｂに最初に接近する能力、（ｉｉ）エラープローンＰＣＲによるその後の親和力成熟および（ｉｉｉ）軽鎖の喪失による人工的結合の高いバックグラウンドを回避するため成熟過程の際の一本鎖構成体の使用。 具体的に使用した場合、これらの方法により素朴なライブラリーから抗体の選択および親和力成熟を行うことが可能となる。 簡略には、７μｇの全ＲＮＡを６０ｐｍｏｌのプライマーと混合し、７０℃で１０分間加熱し、氷上で直ちに冷却した。 ２μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、１０μｌの５×合成緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合物（２００μＭのそれぞれのＮＴＰの最終濃度を与えるものとする）、５μｌの０．１ＭＤＴＴ、および１μｌのＢＲＬスーパースクリプトＲＴ（２００Ｕ／μｌ）を混合し、ＤＥＰＣ処理水で反応物を５０μｌとした。 室温で１０分間反応を進行させ、その後４２℃で５０分間とした。 ９０℃で５分間維持することにより反応を停止し、その後氷上に１０分間載置し、その後１μｌのＲＮａｓｅＨを混合し、３７℃で２０分間維持した。 実施例８ｂ． 素朴な免疫グロブリンμ／ｋライブラリー構成 実施例８ｃ． プロゲステロンに特異的な低親和力抗体の選択 第１および第３の繰返しの後に溶出したファージを、実施例２ｆに記載したように細菌コロニー隆起により抗プロゲステロンＦａｂの発現について分析した。 ウエスタンブロットで最も強いシグナルを生成するこのようなコロニーを更に検討し、後続する分析のために３つのクローンＰｇＡ１１、ＰｇＢ６およびＰｇＦ１を単離した。 最初の２つは第１回の選別処理で出現したものであり、後者は第３回の選択の後に単離したものである。 実施例６ｃ２）に記載したようにその可溶性形態で生産されるこれらの全てのＦａｂは、プロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡおよびプロゲステロン−１１α−ヘミスクシニル−ＢＳＡに特異的に結合した。 更に、３つのＦａｂの全ては、チトクロームＣのエピトープに対して顕著な交差反応性を示した。 プロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡについてのその見かけの結合定数は、それぞれＰｇＡ１１について１０ 4 Ｍ -1 、ＰｇＦ１およびＰｇＢ６について３×１０ 4 Ｍ -1および１０ 5 Ｍ -1と決定された。 これらの結合定数は、２〜５×１０ 8 Ｍ -1の親和力を有する抗プロゲステロンモノクローナル抗体について報告されたものより遥かに低い。 クローンＰｇＢ６およびＰｇＦ１は、密接に関連するＶ HおよびＶ L遺伝子の同じ組合せを利用していた。 これらＶ H遺伝子の両者は２つの密接に関連するが別個の胚系統遺伝子と同一であったが、素朴なレパートリーから予期されるように、体性変異の証拠はなかった。 その密接に関連するＶ L遺伝子についての真の胚系統遺伝子は未だ知られていない。 両者のＶ H遺伝子は異なるＤおよびＪ断片に接続していたため、クローンＰｇＢ６およびＰｇＦ１は同じ起源ではあり得ず、２つの独立するクローン化の事態から選択された筈であり、プロゲステロン結合についてのこの特定の組合せの潜在的重要性を示している。 ＰｇＡ１１により使用されるＶ LおよびＶ H遺伝子は、他の２つのクローンとは密接に関連していない。 実施例８ｄ． ＰＣＲ指向性変異誘発による親和力成熟 膜アンカーｃｐＩＩＩとの一本鎖重鎖および軽鎖（縮退したＦＶ）融合体を調製するため、唯一のＳｐｅＩ制限部位を有する実施例１ｂ（ｉｉ）で調製したプラスミドｐＣｏｍｂ２−３を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＮｈｅＩで消化して再連結し、これにより軽鎖クローン化カセットを除去した。 ２つのオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列５′−ＴＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣ ＴＣＴＡＧＡ ＧＧＴＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＡＡＴＣＴＡＣＴ ＧＡＧＣＴＣ ＡＡＡＧＴＣＡ−３′（配列番号：１５３）を有する５′アンチセンスプライマーおよびヌクレオチド配列５′−ＣＴＡＧＴＧＡＣＴＴＴ ＧＡＧＣＴＣ ＡＧＴＡＧＡＴＴＴＡＣＡＴＴＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＡＣＣ ＴＣＴＡＧＡ ＧＡＣＴＴＴＣ−３（配列番号：１５４）を有する３′センスプライマーよりなる１５アミノ酸リンカー配列をコードする合成ＤＮＡリンカーを、ファージミドＳｃｐＣｏｍｂ２−３を形成するＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ消化裁頭ｐＣｏｍｂ２−３ベクターに挿入した。 制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）の内部認識配列に下線を付す。 プロゲステロン結合体のＶ HおよびＶ L断片を、その後２つの別の反応で実施例２ｇに記載したようにＰＣＲにより増幅した。 第１のＰＣＲ増幅では、前記列記した配列番号：１５３に対応するプライマーおよびヌクレオチド配列５′−ＡＴＴＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧ ＴＣＴＡＧＡ ＴＧＭＲＧＡＧＡＣ−３′（配列番号：１５５）（ここでＭはＡまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである）を有するオリゴヌクレオチドを使用して重鎖断片を増幅した。 軽鎖断片は、前記列記した配列番号：１５４に対応するプライマーおよびヌクレオチド配列５′−ＧＡＧＧ ＡＣＴＡＧＴ ＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧ−３′（配列番号：１５６）を有するオリゴヌクレオチドを用いて別に増幅した。 ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）の内部認識配列に下線を付す。 Ｖ HおよびＶ L ＰＣＲ断片をそれぞれＸｈｏＩ−ＸｂａＩおよびＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化し、その後ＳｃｐＣｏｍｂ２−３に挿入した。 実施例８ｅ． 可溶性Ｆａｂおよびプロゲステロンに特異的な一本鎖融合抗体の発現および検出 実施例８ｆ． エラープローンＰＣＲによる重鎖および軽鎖の標的変異誘発 全ての鋳型希釈物のＰＣＲ反応物をプールし、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩによる消化の前にフェノールで処理した。 ゲル精製し消化したＰＣＲ断片をＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ消化ＳｃｐＣｏｍｂ２−３プラスミドに連結して戻した。 連結生成物をイー・コリＸＬブルーにエレクトロポレーションし、１０ 6の形質転換体を生成した。 ファージをＢＳＡの非存在下に選別処理した以外は、ファージ製造および選別の後続する工程は実施例６に記載したように実施した。 実施例８ｇ． 変異誘発一本鎖融合抗プロゲステロン抗体の親和力の決定 競合ＥＬＩＳＡにより決定したプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキメチル）−オキシム−ＢＳＡに対する変異したＳｃ抗体の親和力は、ＳｃＰｇＢ６−１について親ＳｃＰｇＢ６の３０倍、またＳｃＰｇＢ６−３およびＳｃＰｇＢ６−４の両者について約１３倍増加した。 興味あることに、最も少ない変異を有するクローンが、最も高い親和力を示した。 変異体Ｓｃ抗体についての交差反応性パターンは、ＳｃＰｇＢ６−１がチトクロームＣに対するその反応性の大半を喪失した以外は、変化しなかった。 ハプテンに対する免疫応答の広範な研究で、１桁の大きさの親和力の増加は特定の単一のアミノ酸置換に帰することができたが、これはＳｃ抗プロゲステロン抗体の結合部位の唯１または２のアミノ酸交換のためにハプテン−接合体に対するその増加した親和力が与えられることを意味する。 実施例８ｈ． 核酸配列決定 要約すると、この発明は、素朴なライブラリーからのハプテンに対する特定の抗体の選択および親和力成熟の原理を企図するものである。 試験管内選択および変異誘発系は、免疫系の複雑性と比較して極めて単純であるが、幾つかの共通の特徴が存在する：（ｉ）素朴な結合ライブラリーから選択される抗体の親和力は、ハプテンに対する一次免疫応答からの抗体と同じオーダーの大きさに達することができる、（ｉｉ）生体内または試験管内で変異を生成する機構は異なるが、変異のホットスポットが認められた、（ｉｉｉ）試験管内での１回の変異および選択の後の親和力の増加は、ハプテンに対する一次から二次免疫応答への移行について観察されるのと同じオーダーの大きさである、（ｉｖ）場合により生体内で認められるように、変化した交差反応性を有する変異した抗体結合部位が回収された。 〔配列表〕 H ）を表し、その領域の生物学的に活性な（リガンド結合）部分を含むポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明の方法によって製造する。 H ）のＶ領域は、３つの超可変ＣＤＲ（図示せず）を有する点でＶ Lに類似する。 LおよびＣ Lドメインの同じ番号のアミノ酸残基に鎖間ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が渡っていることが銘記される。 パネル２は、Ｖ Lドメインにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置を示す。 ＣＤＲの外側の断片はフレーム構造断片（ＦＲ）である。 HコードＤＮＡ相同体を発現するのに必要な種々の特徴には、シャイン・ダルガーノリボソーム結合部位、モウバら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：２７，１９８０により記載されたようにペリプラズムに対して発現した蛋白質を向けるリーダー配列、およびＶ H相同体を発現ベクターに機能的に結合させるのに使用する種々の制限酵素部位が含まれる。 またＶ H発現ベクター配列は、可変領域重鎖（Ｖ H骨格）に典型的に認められるアミノ酸をコードする短い核酸配列も含む。 このＶ H骨格は直ぐ上流にあり、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩクローン化部位に機能的に結合したＶ H ＤＮＡ相同体として適切な読取り状態にある。 二本鎖合成ＤＮＡ挿入物の頂部および底部鎖の配列は、それぞれ配列番号：１および配列番号：２として列記する。 合成ＤＮＡ挿入物は、制限酵素Ｎｏｔ１およびＸｈｏＩにより消化したラムダＺａｐＩＩに方向性をもって連結してラムダＨｃ２発現ベクターを形成する。 H発現ベクター）の主要な特徴を示す。 図３からの合成ＤＮＡ配列は、ラムダＺａｐＩＩ由来のＴ 3ポリメラーゼプロモーターに沿って頂部に示す。 ラムダＺａｐＩＩにおける挿入物の方向性を示す。 Ｖ H ＤＮＡ相同体はＸｈｏＩおよびＳｐｅＩクローン化部位に挿入する。 リードスルー転写により、クローン化部位の丁度３′に位置するデカペプチドエピトープが生成する。 Lコード相同体をこのベクターが発現するのに必要な種々の特徴は図３に記載した。 Ｖ LコードＤＮＡ相同体は、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位でＬｃ２配列に機能的に結合させる。 二本鎖合成ＤＮＡ挿入物の頂部および底部鎖の配列は、それぞれ配列番号：３および配列番号：４として列記する。 合成ＤＮＡは、制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩにより消化したラムダＺａｐＩＩに方向性をもって連結してラムダＬｃ２発現ベクターを形成する。 L発現ベクター）の主要な特徴を示す。 図５からの合成ＤＮＡ配列は、ラムダＺａｐＩＩに由来のＴ 3ポリメラーゼプロモーターに沿って頂部に示す。 ラムダＺａｐＩＩにおける挿入物の方向性を示す。 Ｖ L ＤＮＡ相同体はＳａｃＩおよびＸｈｏＩクローン化部位に挿入する。 HコードまたはＶ LコードＤＮＡ相同体を含まないラムダＨｃ２およびラムダＬｃ２から調製する。 生体内切出し手順により、ラムダＨｃ２およびＬｃ２ベクターからファージミドベクターへとクローン化した挿入物が移動した。 得られたファージミドは、親ベクター同様抗体断片クローン化および発現について同一のヌクレオチド配列を含有していた。 Ｈｃ２およびＬｃ２ファージミド発現ベクターをＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩにより別々に制限消化した。 ＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端を介して線状化したファージミドを連結し、ジシストロン性（結合）ベクター、ｐＣｏｍｂを形成した。 H 、Ｃ H1 、ｃｐＶＩＩＩ）および軽鎖（Ｖ L 、Ｖ C ）をコードするジシストロン性メッセージのイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導発現により重鎖および軽鎖の形成を導く。 それぞれの鎖は ｐｅｌＢ標的配列によってペリプラズム空間に配送され、その後開裂される。 ｃｐＶＩＩＩ融合物によって重鎖が膜中に定置するが、軽鎖はペリプラズム中に分泌される。 軽鎖の存在下で重鎖が集成してＦａｂ分子を形成する。 ｃｐＶＩＩＩを介してＦａｂはファージ粒子に組込まれる（黒いドット）。 |
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