在过去，已经通过不同的方式创造出以新型生物多聚物(即DNA、RNA 或多肽)为基础的催化剂。下述段落对这些筛选方案中的一些进行了描述。
(1)结合过渡态类似物
通过该方法已经分离出催化性RNA、DNA和蛋白(特别是抗体)。其主 要用于通过用过渡态类似物(TSA)免疫小鼠进行对催化性抗体的分离，并用 TSA对展示于噬菌体以及RNA和DNA文库上的抗体进行筛查。其思路为 结合一给定TSA的分子(蛋白、RNA或DNA)可能结合底物并稳定过渡态 的几何结构和动力学。这可能产生催化作用。
该方法本身与其说是筛选催化活性，不如说是筛选对过渡态类似物 (TSA)的结合。然而，该方法也包括在本文中，因为它是目前分离新型催化 剂最常用的方法之一。该方法所面临的问题包括：ⅰ)需要对靶反应有详细的 力学知识(为了设计一种适宜的TSA)；ⅱ)在很多情况下，充分模拟过渡态的 TSA是无法获得或不稳定的；ⅲ)不可能模拟反应坐标的结构和电子动力学。
因此，通过该方法只成功地解决了相当有限系列的反应类型。在大多 数情况下，分离的催化剂具有较差的转化数。
(2)活性催化剂的功能标记
该筛选方案已经用于蛋白和核酸。对底物进行设计以便在反应过程中 形成一种反应性产物(将底物称为“自杀底物”或“抑制物类似物”)。反应 性产物可能与产生它的催化剂进行反应，形成共价键。结果，通过所附的 标记物可以将有活性的催化剂与无活性的催化剂分离。通过该方法已经分 离了在噬菌体上展示的催化性抗体，而且在一模型系统中显示，利用该方 法可以将有催化活性和无活性的蛋白分离。该方法使得可以进行罕见催化 剂的分离。
该方法的重要局限性包括：ⅰ)对很多反应设计一种适宜的自杀底物是不 可能的。ⅱ)成功的催化剂在筛选过程/周期中仅仅需要进行一次循环，其通 常大约为数分钟。因此，对于有效的催化剂没有筛选优势。
(3)连续进化(RNA)
设计在同一分子中含有底物和潜在催化性结构域的RNA文库。能够进 行预期反应(通常为连接反应)的RNA将“激活”它们本身进行扩增(反转录 随后进行RNA聚合酶转录)。经过充分的稀释和添加核苷酸前体，可以将 这种连续筛选维持数小时，然后进行分析。
该方法具有2个重要的局限性：ⅰ)底物和催化剂都必须为核酸；ⅱ)由于 所催化的反应和成功酶的扩增并未分离，所以筛选步骤的时间是靶反应的 循环时间和“激活”分子的扩增时间的总和。因此，由于扩增大约为数秒 钟，对于有效的催化剂无筛选优势。
(4)底物-酶-连接的筛选(SELS)
最近，已经对此类方法进行了描述，其涉及将靶反应的底物附于对所 附底物具有潜在催化活性的蛋白上(Pedersen等，美国国家科学院院刊， 1998,95卷，10523-10528页；Jestin等，1999,Angew.Chem.Int.Ed.,38 卷，1124-1127页；Demartis等，1999,JMB,286卷，617-633页；Neri等， 1997,WO 97/40141)。经过底物的分子内转换后，利用所附的产物可以对 有活性的催化剂进行分离。
该方案很常用。然而，由于成功的催化剂在筛选过程/周期中只需要进 行一次循环，该过程通常大约为数分钟，因此对于有效的催化剂没有筛选 优势。由于相同的原因，推测用该筛选方案不可能区分具有细微不同特异 性活性的酶。
发明简述
通过本发明所要解决的问题是提供一种方法，其用于从催化剂分子文 库中体外筛选与该文库内其余催化剂分子相比具有相对更有效的特异性目 的催化活性的目的催化剂分子，而且本文中所述的体外筛选方法以其令目 的催化剂分子在最终收集前可以进行多次催化活性转化(即底物到产物的催 化活性转化)为特征。
解决方案是基于在所述的体外筛选方法中利用包括许多独立单元的新 型样品。
紧接着下面给出了对所述新型样品特征的总结。
所述的新型样品包括以独立单元形式提供的催化剂分子的文库，其中 独立单元包括具有下述一般结构的第一种类型的独立单元：
C-XY-S，
其中C指催化剂分子，XY指XY交换对，而S指能够由在所述催化 剂分子的文库中所含的至少一种催化剂分子催化成产物的底物，由此提供 了获得第二种类型独立单元的可能性，所述的第二种类型的独立单元包括 如下一般结构：
C-XY-P，
其中C和XY具有上面所定义的意义，而P为由第一种类型独立单元 中底物S的催化性转换所产生的产物分子。对此种独立单元适当实例的图 解说明见图1。
然后，所述的新型样品以其包括下述功能上定义的特点为特征。
特点1：
将底物S附于催化剂上，在结构上使得在所述独立单元内催化剂和底 物间能够进行催化反应；而且所述的底物和催化剂结合的性质提供了借助 于产物的一个特征分离一种实体的可能性，所述的实体包括允许对催化剂 分子进行明确鉴定的信息，所述的催化剂分子能够催化底物分子到产物分 子的反应。
例证参见图1，其显示了包括上述特点1的这样一种独立单元的适当 实例。
特点2：
所述的包括许多独立单元而且包括上述特点1的样品进一步以所述的 XY交换对使得Y部分可以与另一个Y部分进行不对称交换(即Y与Y交 换，而不是与X交换)为特征；借此，然后所述的XY交换对使得在单元结 构：
催化剂-XY交换对-产物和“Y-底物”成分之间可以进行交换反应，而 且由此产生单元结构催化剂-XY交换对-底物。
例证参见图2，其显示了包括上述特点2的这样一种独立单元的适当 实例。
然后，在如本文所述的体外筛选方法(见下页)中，利用此类新型样品 为基本上只根据目的催化剂分子所产生的产物分子的特征来对目的催化剂 分子进行筛选提供了可能(特点1使之可以进行；例证见图1)；
而且，其进一步为筛选与该文库内其他催化剂分子相比具有相对更加 有效的特异性目的催化活性的目的催化剂分子提供了可能，其中所述的筛 选以对所述的目的催化剂分子在使其能够进行多次催化活性转化(即，底物 到产物的催化活性转化)后首先进行最终收集为特征(特点2使之可以进行； 例证见图2)。
相应地，本发明的第一个方面涉及包括许多适于在体外筛选系统中使 用的独立单元的样品，其中所述的体外筛选系统的目的是从催化剂分子的 文库中筛选与该文库内其他催化剂分子相比具有相对更有效的特异性目的 催化活性的目的催化剂分子，而且其中所述的体外筛选系统以其使得目的 催化剂分子在最终收集前可以进行多次催化活性转化(即，底物到产物的催 化活性转化)为特征，同时，其中所述的样品包括
(ⅰ)以独立单元形式提供的催化剂分子的文库，其中独立单元包括具有 下述一般结构的第一种类型的独立单元：
                        C-XY-S， 其中C指催化剂分子，XY指XY交换对，而S指能够由在所述催化剂分 子的文库中所含的至少一种催化剂分子催化成产物的底物，由此提供了获 得第二种类型独立单元的可能性，所述的第二种类型的独立单元包括如下 一般结构：
                        C-XY-P， 其中C和XY具有上面所定义的意义，而P为由第一种类型独立单元中底 物S的催化性转化所产生的产物分子；而且
(a)将底物S附于催化剂上，在结构上使得在所述独立单元内催化剂 和底物间能够进行催化反应；并且
(b)所述的底物和催化剂结合的性质提供了借助于产物的一个特征分 离一种实体的可能性，所述的实体包括允许对催化剂分子进行明确鉴定的 信息，所述的催化剂分子能够催化底物分子到产物分子的反应；而且
(c)所述的包括许多独立单元的样品进一步以所述的XY交换对允许Y 部分与另一个Y部分进行不对称交换(即Y与Y交换，而不是与X交换)为 特征；借此，然后所述的XY交换对使得在单元结构：
催化剂-XY交换对-产物和“Y-底物”成分之间可以进行交换反应，而 且由此产生单元结构
催化剂-XY交换对-底物。
在根据上述第一个方面的样品中所包括的术语“一个独立单元”指包 括本发明的第一个方面中(ⅰ)所规定的一般结构；本发明的第一个方面中(a) 和(b)所规定的附于催化剂分子的底物分子；以及本发明的第一个方面中(c) 所规定的XY交换对的一个独立单元。对于此类独立单元的适当实例见图1 和2。
术语“包括一般结构：催化剂-XY交换对-底物或催化剂-XY交换对- 产物的独立单元结构”指该独立单元包括所述的每个实体的至少一个分子， 即，至少一种催化剂分子、至少一种XY交换对分子以及至少一种底物分 子或至少一种产物分子。从而，所述的独立单元例如可能包括一个拷贝以 上的相同催化剂分子或可能包括数种不同的催化剂分子。
此外，在所述的独立单元内置于单个实体之间的术语“-”指在所述的 独立单元内所述的单个实体之间存在一种物理连接，即在催化剂-XY交换 对-底物或催化剂-XY交换对-产物之间存在物理连接。
另外，本文中所述的“一种独立单元”指一种独立单元，其中为了能 够分离独立的独立单元在所述的样品中能够将所述的独立单元与其他不同 的独立单元进行物理分离。
术语“不同的独立单元”指每个均独立包括不同的催化剂分子的不同 的独立单元，即，两个不同的独立单元的实例可以是
(1)催化剂分子1-XY交换对-底物；以及
(2)催化剂分子2-XY交换对-底物；
其中催化剂分子1和催化剂分子2指两种不同的催化剂分子。
术语“一种包括许多不同独立单元的样品”指包括至少两种不同独立 单元的一种样品，优选至少100种不同的独立单元，更优选至少10,000种 不同的独立单元，更优选至少106种不同的独立单元，更优选至少108种不 同的独立单元，更优选至少1010种不同的独立单元，甚至更优选至少1012 种不同的独立单元，而且最优选至少1014种不同的独立单元。不同独立单 元的实际数量基本上与催化剂分子文库的实际大小相对应。
术语“包括许多独立单元的样品”和术语“包括许多不同独立单元的 样品”在本文中可以交换使用。
术语“催化剂分子文库”指一种文库，其包括至少两种不同的催化剂 分子，优选至少100种不同的催化剂分子，更优选至少10,000种不同的催 化剂分子，更优选至少106种不同的催化剂分子，更优选至少108种不同的 催化剂分子，更优选至少1010种不同的催化剂分子，甚至更优选至少1012 种不同的催化剂分子，而且最优选至少1014种不同的催化剂分子。
术语“一种能够由所述的催化剂分子文库中所包括的至少一种催化剂 分子催化成产物分子的底物”基本上指任何适当的底物分子。基本上根据 预期要筛选的特异性催化活性对所述的底物分子进行选择。例如，如果预 期的催化活性为一种蛋白酶活性，那么适宜的底物应该为一种肽分子，产 物将为降解的肽。术语“底物”和“底物分子”可以交换使用。
术语“产物”指通过由如本文所确定的目的催化剂分子催化底物到产 物的反应而获得的产物。术语“产物”和“产物分子”可以交换使用。
术语“催化剂”指任何具有目的催化活性的催化剂分子，例如有机和 无机的分子、蛋白质、酶、肽、核酸、生物多聚物以及非生物学多聚物、 小的有机或无机分子。术语“催化剂”和“催化剂分子”可以交换使用。
术语“将底物附于催化剂上，在结构上使得在所述独立单元内催化剂 和底物间能够进行催化反应”指在每个独立单元内底物和催化剂之间的直 接或间接物理连接。这种连接应该优选使在独立单元内催化剂和底物之间 的生产性相互作用最大化，而使不同独立单元上的催化剂和底物间的相互 作用最小化。
根据本发明第一个方面的(b)，术语“所述的底物和催化剂结合的性质 提供了借助于产物的一个特征分离一种实体的可能性，所述的实体包括允 许对催化剂分子进行明确鉴定的信息，所述的催化剂能够多次催化底物分 子到产物分子的反应”指利用产物的一个或多个特征对所述的实体进行分 离。
产物适当特征的实例可以是所述的产物不与基质结合而底物结合于基 质。在这种情况下，适当的筛选方法可以是将独立单元以催化剂-XY交换 对-底物-基质的形式结合于固相支持物，当为催化剂-XY交换对-产物的形 式时将其释放。对这种系统的实例的具体描述，参考本文的工作实施例(见 下)。
产物适当特征的另一个实例可以是如在图1中所示，所述的产物结合 于一种受体。
根据本发明第一个方面的(b)，术语“所述的实体包括允许对催化剂分 子进行明确鉴定的信息，所述的催化剂能够多次催化底物分子到产物分子 的反应”指一种实体，或者其中催化剂分子本身中载有所述的信息，或者 其包括为明确鉴定催化剂提供可能的其他种类的信息。例如当目的催化剂 分子为一种肽或多肽时，这些其他种类的信息可以是包括一段编码所述的 肽或多肽的DNA序列的实体。举例如当分离的实体为包括编码一种目的多 肽的DNA序列的丝状噬菌体时。见图12及下述。
如上面所定义的，在一独立单元内所包括的术语“XY交换对”指将 催化剂通过XY交换部分结合于底物，即独立单元具有下面的一般结构： 催化剂-XY交换对-底物，而所述的XY交换对满足根据本发明第一个方面 的(c)的标准。
优选XY部分在缺少游离的Y时稳定，但允许游离Y与结合于X的Y 进行快速而特异的交换(而并非游离Y与X的交换)。如果独立单元：催化 剂-XY交换对-产物与Y-底物化合物相接触，这种交换反应能够以底物置换 产物。
例如，XY交换对可以具有下述特征：
ⅰ)X和Y可以共价或非共价结合；以及
ⅱ)XY交换对可以由任何种类的分子组成，包括小的有机(例如，EDTA) 和无机(例如，金属、磷酸盐)分子，以及大分子(例如，核酸、肽)。
进一步的具体描述见下面，图示说明见图2、3和4。
本发明的第二个方面涉及用于从催化剂文库中体外筛选与该文库内其 余催化剂分子相比具有相对更有效的特异性目的催化活性的目的催化剂分 子的方法，其中所述的体外筛选方法以其令目的催化剂分子在最终收集前 可以进行多次催化活性转化(即底物到产物的催化活性转化)为特征，而且其 中所述的方法包括下述步骤，
(ⅰ)将根据本发明包括许多独立单元的样品置于目的催化剂分子发挥其 目的催化活性的适当的条件下，继而将样品置于令所述的独立单元与一种 Y-底物化合物相接触的条件下。
(ⅱ)通过对一个或多个包括产物分子的独立单元进行筛选来对目的催 化剂进行筛选；并且
(ⅲ)借助于产物的一个特征，对一种实体进行分离，所述的实体包括 允许对催化剂分子进行明确鉴定的信息，所述的催化剂能够多次催化底物 分子到产物分子的反应；还可任选
(ⅳ)通过利用在步骤(ⅲ)所述实体中所包括的信息产生目的催化剂分子 并构建包括所产生的目的催化剂分子的一个独立单元，然后通过利用该独 立单元作为启始材料，将步骤(ⅰ)至(ⅲ)重复一次或多次。
根据本发明第二个方面的步骤(ⅰ)，术语“在目的催化剂分子发挥其目 的催化活性的适当条件下”指目的催化剂分子发挥其目的催化活性的任何 适当的条件。
如果筛选的目的是鉴定在碱性pH下有活性的目的催化剂分子，那么 这种适当的条件应该是碱性pH。
根据本发明第二个方面的步骤(ⅰ)，术语“将所述的独立单元与一种Y- 底物化合物相接触”指独立单元和Y-底物化合物适当地靠近，以便可能发 生在本发明第一个方面的(c)所定义的交换反应。所述的接触例如可以在缓 冲液中，其中独立单元和Y-底物化合物可以扩散到一起并由此而彼此相互 接触。图示见图2。
根据本发明第二个方面的步骤(ⅲ)，术语“能够催化多次底物到产物反 应的目的催化剂分子”指所述的目的催化剂分子进行底物到产物的催化反 应至少2次，更优选至少100次，更优选至少10,000次，甚至更优选至少 106次，而且最优选至少1010次。
术语“包括允许对目的催化剂分子进行明确鉴定的信息的实体”指一 种实体，或者其中催化剂分子本身中载有所述的信息，或者其包括为明确 鉴定催化剂提供可能的其他种类的信息。例如当目的催化剂分子为一种肽 或多肽时，这些其他种类的信息可以是包括一段DNA序列的实体。该定义 与上述对与本发明第一个方面的(b)相关的相同术语相同(见上)。
根据本发明第二个方面的(ⅳ)，术语“通过利用在步骤(ⅲ)所述实体中 所包括的信息来产生目的催化剂分子并构建包括所产生的目的催化剂分子 的一个独立单元，然后通过利用该独立单元作为启始材料，将步骤(ⅰ)至(ⅲ) 重复一次或多次”指所述的重复可以为一次，更优选2次，更优选5次以 上，甚至更优选10次以上，而且最优选25次以上。
上述用于体外筛选的方法的一个优点是其使得催化剂分子在一轮筛选 过程中可以进行多次底物到产物的循环(即在最终收集目的催化剂分子之 前)。
这从根本上与本领域中前面所描述的筛选方法不同，前述方法也包括 结合靶反应的过渡态类似物，其中不存在底物的循环(见上面“背景”中的 #1)，或者底物的单次转化(上面“背景”中的#2和3)。
这可以提供2个优点，这可以通过按照可能的筛选方案利用本发明的 方法来说明：
a)根据本发明第二个方面的方法中的(ⅰ)，将包括许多独立单元的样品 置于目的催化剂分子发挥其目的催化活性的适当的条件下，继而将样品置 于所述的独立单元与一种Y-底物分子在产物结合柱的一端(启始端)相接触 的条件下，在所述的产物结合柱中，特异性结合产物的受体偶联至产物结 合柱的基质上，而且在产物柱缓冲液中含有适量的Y-底物；
b)根据本发明第二个方面的方法中的(ⅱ)，通过收集最后到达产物柱另 一端(收集端)的独立单元对一个或多个包括产物分子的独立单元进行筛选来 对目的催化剂分子进行筛选。
在该筛选方案中，下述作用发生在产物柱内：
1)包括一个潜在目的催化剂分子的独立单元将所附的底物转化为产 物；
2)所述的独立单元现在包括产物，其扩散并与靠近产物柱启始端放置 的受体结合；
3)产物柱缓冲液内的Y-底物分子介导催化剂分子-XY交换对-产物和 Y-底物分子间的交换反应，而且由此产生单元结构催化剂分子-XY交换对- 底物，然后由此介导将上面步骤(2)中所述的被结合的独立单元释放；
4)上面步骤(3)中所述的释放的独立单元目前含有一种底物和一种潜在 的目的催化剂分子，其已经进行了一次底物到产物的催化转换，而且目前 被再生成(1)中独立单元的原始形式。于是，所述的单元因此可以再次进行 反应(1)；结合相对更靠近产物柱收集端的受体等。
具有最有效特异性目的催化活性的目的催化剂分子在一给定的时间间 隔内将进行最多的底物到产物的转换，由此将在固定于产物结合受体上花 更多的时间。因此，包括所述最有效的催化剂分子的独立单元将最后到达 所述产物柱的收集端。
利用本发明第二个方面方法中的这个实例，优于现有技术的两个优点 可以是：
ⅰ)可能的“可筛选”催化活性可以比现有技术的筛选方法高得多。筛 选步骤包括进行靶反应，扩散并将产物结合至产物结合柱上，最后通过XY- 交换反应将产物和底物交换。由于扩散通常是一个快速的过程，所以简单 地通过柱上的产物结合受体的数量或者在产物柱缓冲液总Y-S成分的数量 可以控制筛选的严谨度；此外，如果例如将电泳用作分离更有活性催化剂 的方式，那么向受体的扩散可能不是一个限制性因素，因此该系统的筛选 严谨度甚至可能更高。
ⅱ)可以区分活性上的微小差别；由于在催化剂流过柱子时筛选步骤被 重复很多次，所以即使在催化剂活性上的微小差别将导致在柱子上的不同 滞留时间，以及因此而不同的富集。
本发明的最后一个方面涉及一种用于生产目的催化剂分子的方法，其 包括进行根据本发明用于体外筛选的方法并进而进行下列步骤，
(a)通过适当的制备方法以适当的希望量制备所述分离的目的催化剂分 子。
附图简述
图1：对第一种类型独立单元适当实例的图示说明，所述的独立单元 具有下述一般结构：
                        C-XY-S， 其中C指催化剂分子，XY指XY交换对，而S指底物。将底物S附于催 化剂上，在结构上使得在所述独立单元内催化剂和底物间能够进行催化反 应。催化反应导致形成第二种类型的独立单元：
                        C-XY-P， 其中C指催化剂分子，XY指XY交换对，而P指产物分子。所述的底物 和催化剂结合的性质提供了借助于产物的一个特征(例如对一种基质的结合 亲和力)分离一种实体(例如催化剂本身或将其展示的一种噬菌体)的可能 性，所述的实体包括允许对催化剂分子进行明确鉴定的信息，所述的催化 剂能够催化底物分子到产物分子的反应。
图2：对第一种类型独立单元的图示说明，其中XY交换对允许Y部 分与另一个Y部分进行不对称交换(即Y与Y交换，而不是与X交换)。在 靶反应(图1)发生后，所述的XY交换对允许在第二种类型单元结构：C-XY-P 与未结合的Y-S成分间进行交换反应，由此产生新的第一种类型单元结构 C-XY-S和未结合的Y-P成分，此后，该单元的催化剂还可以在新结合的底 物上进行另一个催化反应。
结合产物P的基质可以有效地保持对Y-P成分以及C-XY-P类型独立 单元的结合，直至发生如就在上面所述的交换反应，所述的交换反应以一 种新产生的第一种类型单元C-XY-S的形式从基质中有效地释放催化剂而 留下Y-P成分与基质结合。
图3：对根据本发明的独立单元的适当XY交换对的图示说明。催化 反应促进X和Y的解离(例如，X为一条DNA链，Y为一种互补 DNA/RNA/DNA杂交体或者一种DNA/RNA/基质杂交体，C为一种RNA 酶)。
其他实例有：在X和Y之间的非共价键(His4-Fe-IDA和NTA-Fe-IDA)， 以及在X和Y之间的共价键(二硫键)。注意，对称交换单元(XX)与二硫键 相似，可以用作交换单元。
图4：对一种独立单元的图示说明，其中XY交换单元为另一种酶-底 物对。
图5：对在下面实施例2中所述的Y-底物分子的图示说明。
图6：对在下面实施例4中所述的筛选方案的图示说明。对催化羟醛 形成的酶的优化。
图7-8：对按照本发明第二个方面的体外筛选方法进行的适当筛选方案 的图示说明。
图9-11：图示证明在本文实施例1(见下页)中的描述。
图9．碱基-连接子-底物偶联物的结构和合成。
图10．底物与噬菌体上pⅢ蛋白的共价结合。(a)将编码酸性肽序列和 C-末端半胱氨酸的DNA融合于基因pⅢ的N-末端形成酸性辅助噬菌体。 噬菌粒编码与pⅢ蛋白融合的蛋白文库；(b)噬菌体的制备产生展示噬菌粒 编码蛋白的噬菌体颗粒；pⅢ蛋白具有酸性肽延伸部分；(c)酸性和碱性肽 之间螺旋-螺旋的形成将底物非共价结合至噬菌体pⅢ蛋白；(d)去除还原剂 导致酸性和碱性肽通过它们C末端的半胱氨酸交联；(e)在本研究中，将展 示葡萄球菌核酸酶的噬菌体通过5’-生物素化的单链寡聚脱氧核苷酸结合 于链亲和素磁珠上。通过在一种分子内反应中裂解寡聚脱氧核苷酸将展示 活性酶的噬菌体释放。
图11：噬菌体的固定以及从固相支持物上的裂解。将非碱基-连接子、 碱基-连接子-pTp或者碱基连接子-寡聚脱氧核苷酸偶联物交联于(a)噬菌体 展示的SNase或者(b)对照蛋白Fab 39-A11。1-4列显示在链亲和素磁珠上 的固定。通过直接对磁珠进行噬菌体滴度测定(1-3列)或在用DNA酶Ⅰ对磁 珠处理后进行滴度测定(4列)对固定进行检测；5-7列显示渗漏(在缺少Ca2+的情况下释放)；8-10列显示Ca2+诱导的释放(裂解)。回收率显示于各列上 面的括号中。
图12：图示证明在本文实施例5(见下)中的描述。
图13：图示证明在本文实施例6(见下)中的描述。
图14：图示证明在本文实施例7(见下)中的描述。对产生更有活性蛋 白酶的细胞的富集。
图15：图示证明在本文实施例8(见下)中的描述。对锤头型核酶的分 离。
图16：数据证明本文实施例10(见下)。在低活性变体的背景中对野生 型脂酶的富集。
图17：图示证明在本文实施例10(见下)中的描述。Y-底物-生物素偶联 物的合成。
图18：数据证明在本文实施例11(见下)中的描述。在低活性纤维素酶 变体的背景中对野生型纤维素酶C6B的富集。
图19：图示证明在本文实施例11(见下)中的描述。在噬菌体展示的纤 维素酶情况下再加载底物的原则。
图20：图示证明在本文实施例12(见下)中的描述。在低活性RNA酶 A变体的背景中对野生型RNA酶A的富集。
图21：数据证明在本文实施例14(见下)中的描述。通过荧光偏振光谱 法进行交换率的测定。
本发明实施方案如下述，仅为举例。
发明详述：
根据本发明的第一个方面包括许多不同独立单元的样品
XY交换对：
如上所述，在一个独立单元内，催化剂与底物通过一个XY交换对物 理相连。因此，独立单元具有催化剂-XY交换对-底物的-般结构。
此外，如上所述，在上面定义的独立单元内所包括的“XY交换对” 指将催化剂通过XY交换部分附于底物，即独立单元具有下述一般结构： 催化剂-XY交换对-底物而且所述的XY交换对满足根据本发明第一个方面 的(c)的标准。
另外，在缺乏另外的Y-底物成分时催化剂-XY交换对-底物单元仍保 持连接这个意义上，优选所述的交换对是稳定的，这意味着在测试条件下 X部分在任何给定的时间都应该载有底物。如果Y-底物成分显著高于在所 选条件下XY相互作用的解离常数Kd，这可能是事实。在大多数情况下， 最大的Y-底物浓度为大约1mM或更少。因此，解离常数Kd应该优选小于 10-4M。解离常数Kd=Koff/Kon。在结合的二级速率常数约106-109M-1sec-1时， 启始速率Kon通常受扩散制约。因此，为了获得良好的交换速率(每秒交换 一次以上)，结束速率Koff优选应该至少为1sec-1，由此在这种情况下Kd应 不低于10-9M。因此，在大多数需要交换率大于1sec-1的情况下，解离常数 应在10-4-10-9M范围内。
这个优选的实施方案提供了一个系统，在该系统中在C-XY-S或C-XY-P 单元如果不与Y-S化合物相接触便是稳定的这个意义上，XY交换反应可以 被称为是一种联合的置换反应。
一个XY交换对包括至少一个X-部分和至少一个Y-部分。然而其还可 以包括一个以上拷贝和/或类型的X-和Y-部分。
此外，X和Y部分可以是相同的分子。在本文中此类交换对可以被称 为一种“XX交换对”。
优选X和Y部分为不同的分子。
为了作为一个非限制性的实例进行说明，优选XY部分在缺乏游离的 Y时稳定，但可以使游离Y与结合于X的Y进行快速而特异的交换(而不 是游离Y与X的交换)。如果如上所述独立单元与Y-底物化合物相接触， 这种交换反应能够以底物置换产物。
XY交换对可以具有下述特征：
ⅰ)X和Y可以共价或非共价结合。
XY交换对可以由任何种类的分子组成，包括小的有机(例如，EDTA) 和无机(例如，金属、磷酸盐)分子，以及大分子(例如，核酸、肽)。
ⅱ)优选将XY交换反应描述为一种活跃的置换反应。
ⅲ)优选XY单元在缺乏另一个Y时稳定。
ⅳ)优选XY单元不对称，即Y只置换Y，而不是X。
ⅴ)优选Y对Y的交换非常快。
ⅵ)优选X和Y的结合为一个非常快的过程。
ⅶ)交换单元可以是对称的(即，一个XX交换单元。)
下面给出了XY交换对的适当实例。此外，在图3和4中给出了所述 实例图示说明。
ⅰ)金属配体。优选X部分由一个配体和一个金属离子以解离速率很慢 的强相互作用组成通常形成一种非常稳定的配体-金属单元。另一方面，Y 部分为一种与相同的金属离子相配具有高亲和力，但具有快速的解离和结 合速率的配体。此外，一个Y部分与另一个Y部分的交换优选为一种置换 反应，例如因为Y部分为多配位体。具体实例：
a)X:EDDA’-Ca++(EDDA，乙二胺二乙酸，相当于EDTA，其中去除 了偶联至其中一个氮上的两个乙酸。因此，EDDA与Ca++形成4倍的配位 体)。
Y:R-N(CH2COO-)2，一种双配位体配体，或者
Y:R-N(CH2COO-)(CH2)2N(CH2COO-)2，一种三配位体配体(Ca++可以与 某些配体形成9倍的配位体)。
b)X:His6-Ni++，可能为4倍的配位。将组氨酸标签用于重组蛋白的纯 化，而且可以将6个组氨酸插入到蛋白的N-或C-末端，或者在蛋白表面上 暴露的环中。Cu、Ni、Zn、Fe、Cd、Co、Mg和其他金属，优选具有快速 交换动力学的，它们可以与基于肽的螯合物一起使用。因此可以利用与金 属配位的其他肽，例如含有2个或多个组氨酸的肽(Schmidt等，1996，当 代生物学(Current Biology)，第3卷，645-653页；Kotrba等，1999，应用和 环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)，第65卷，1092-1098 页)，或者Cu结合肽二甘氨酰-L-组氨酸(Lau等，1974，生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)，第249卷，5878-5884页)。
Y:R-N(CH2COO-)2，一种双配位体配体。
c)X:His6-Ca++(Ca++具有与大部分配体快速交换的特征)
Y:R-N(CH2COO-)2，一种双配位体配体，或者
Y:R-N(CH2COO-)(CH2)2N(CH2COO-)2，一种三配位体配体。
ⅱ)大分子交换部分(核酸)。Y部分可以由结合X部分上重叠位点的两 种多核苷酸Y1和Y2组成，所述的X部分也是一种多核苷酸。优选对寡聚 体的长度和序列进行调节，以便X与Y1的相互作用在缺乏Y2的情况下稳 定，但Y2可以活跃地置换Y1，而且反之亦然。
相互作用的重叠区的原则通常应该适于交换其他化学物质的单元，例 如蛋白质、多聚体、有机或无机分子。对于多核苷酸的原则说明如下：
a)X:DNA多核苷酸5’-GGGGTTGTTCCCC-3’
Y:DNA多核苷酸Y1:3’-CCCCAACAA-5’和Y2:3’- AACAAGGGG-5’的等摩尔混合物。
b)X:DNA多核苷酸5’-GGAAGGGATGGTCAC-3’
Y：多核苷酸Y1:3’-CCTACTACCA-5’和Y2:3’-TCCCTAAGTG-5’ 的等摩尔混合物。
ⅲ)共价键。共价键的形成和断裂可以是一个相当快的过程。在某些情 况下这是所述键的内在特征。在其他情况下，催化剂可以加速该键形成和 断裂的速率(例如，下面的酶促酯基转移作用)。下面为具体的实例；“R” 代表独立单元(催化剂)或底物的结合位点：
a)X：硼酸，R-B(OH)2
Y：一种糖，或其他邻位二元醇
相互作用的“双配位体”特性(两个键的协调形成和断裂)应该引起一 个糖分子被另一个糖分子活跃地置换。
b)X:R1-COOR2(一种酯)
Y:HO-R2(相应的醇)
因此，在这种情况下XY等同于X。为了加快交换速率，可以向缓冲 液中加入酯酶。类似地，对于X和Y的交换可以利用氨基转移酶、淀粉转 移酶和其他转移酶反应。对于这些反应中的很多反应，利用相关的转移酶 来加速交换反应是可能的。
c)X:R1-SH
Y：包括两种类型的分子，Y1:R2-SH(一种游离的硫醇)和Y2: R2-SS-R2(一种二硫化物)。
在其底物附着形式中，通过一个二硫键将催化剂同底物偶联。可以将 蛋白质-二硫化物异构酶加入到缓冲液中来加快交换的速率。
d)X：邻二硫醇，或成对的硫醇(例如，在i和i+1位点上为半胱氨酸的 α-螺旋肽)
Y：含有三价砷的化合物
这种类型的邻二硫醇-三价砷相互作用已经用于含硫醇蛋白的层析纯化 (Gitler等，1997，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，第252卷，48-55 页)，或者用于联砷配体与在i、i+1、i+4和i+5位点上含有半胱氨酸的α- 螺旋肽的强亲和力相互作用(Griffin等，1998，科学(Science)，第281卷， 269-271页)。通过加入如DTT或2-巯基乙醇等还原剂可以加速交换反应。
ⅳ)催化剂-底物对。催化剂(例如一种酶)和底物间的相互作用通常由两 个常数描述，Kcat(转化数)和Km。Kcat可以用来概括地定义生产性催化剂/底 物复合物的寿命。因此，例如通过利用对一给定底物具有不同Kcat的酶的 不同变体可以获得具有不同交换速率(稳定性)的XY单元(其中酶代表X， 底物代表Y)，图3和4。同时与一种以上底物相互作用的催化剂作为XY 交换单元可能特别有用。
ⅴ)XY相互作用由底物到产物的反应进行调节。在某些情况下，可以对 XY-底物部分的结构进行设计，以便通过独立单元催化剂的活性加速再加载 过程。例如，如果X或Y均为一个裂解反应的交换单元和底物，那么裂解 可能导致XY的解离，由此再加载过程可能发生的更快。在下面的实施例8 中，X和Y均为核酸结构。Y为目的反应(核糖二核苷酸的裂解)的交换单 元和底物。Y裂解后XY单元解离，这将加速X与另一个Y-底物单元的结 合。
该原则可以被更广泛地应用。例如，实施例8中Y的中央部分(裂解靶 点)可以与另一个目的反应的底物进行交换(见图3A)。此外，可以对条件进 行选择以便X和Y左-底物-Y右的结合很牢固，但X和Y左-产物1、或X和 产物2-Y右的相互作用很弱。因此，底物裂解后X和Y立即分离，这加速 了底物的再加载过程。
为了发生该反应，底物不必是X或Y的部分。例如，如果底物到产物 的反应所诱导的构象改变由产物传递至Y，而且该构象改变导致XY的解 离，那么这也将加速再加载过程。在图3B中给出了一个实例。
ⅵ)在柱缓冲液中的酶和其他底物可以以其他方式加速交换反应。例如， 底物到产物的反应可以启动另一个使X和Y解离的反应(由在柱缓冲液中的 底物催化)。例如，如果独立单元的催化剂裂解一种核酸，那么其可能暴露 游离的3’-或5’-末端，其可以被核酸外切酶接近。如果核酸同时代表靶 底物和Y单元，那么Y单元可以被核酸酶降解，因此XY复合物解离。或 者，XY复合物(而不是未复合的X或Y)可以是柱缓冲液中一种物质的靶标； 如果该物质修饰XY复合物中的X或Y以便其解离得更快，那么该物质的 存在降加速交换速率。例如，如果X和Y为互补DNA和RNA寡聚体，那 么在缓冲液中可以包括RNA酶H。RNA酶H裂解在双螺旋复合物中的 RNA；因此RNA(Y)将不被裂解，直到其与DNA(X)结合形成双螺旋。RNA 酶H将裂解RNA而使DNA保持完整。因此，RNA酶H加速XY的解离 但使独立单元-连接子-X单元保持完整，便于与另一个Y相互作用。
在本文的实施例(见下)中进一步描述了适当XY交换对的具体实例。
包括许多不同独立单元的样品：
如上面所确定的，所述的样品可以包括至少两种不同的独立单元而且 高达多种不同的独立单元。
不同独立单元的实际数量通常与催化剂分子文库的实际大小相应。
除了所述确定的不同独立单元外，所述的样品原则上还可以包括任何 其他适当的材料。
此外，包括在所述样品中的所述不同独立单元可以溶于任何适当的缓 冲液中，例如水。
另外，所述的样品还可以包括Y-底物化合物，根据本发明第二个方面 的方法中步骤(ⅰ)其与不同的独立单元相接触。
不同的独立单元：
如上所述，一个独立单元包括一般结构：
催化剂-XY交换对-底物；或者如果底物已经被转化成产物，那么一般 结构为：
催化剂-XY交换对-产物。
另外，术语“不同的独立单元”指每个均独立包括不同催化剂分子的 不同独立单元，即两个不同独立单元的实例可以为
(1)催化剂分子1-XY交换对-底物；和
(2)催化剂分子2-Xy交换对-底物；
其中催化剂分子1和催化剂分子2指两种不同的催化剂分子。
此外，本文所述的“独立单元”指一种独立单元，其中为了能够分离 独立的独立单元，在所述的样品内将所述的独立单元与其他不同的独立单 元物理分离是可能的。
生物学上可扩增的独立单元：
本发明的一个实施方案涉及一种根据本发明包括许多独立单元的样 品，其中根据本发明第一个方面的(ⅰ)的独立单元为一种生物学上可扩增的 独立单元。
本发明的另一个实施方案涉及一种根据本发明包括许多独立单元的 样品，其中根据本发明第一个方面的(ⅰ)的独立单元为一种生物学上可扩增 的独立单元而且所述的底物和所述的催化剂分子都结合在所述生物学上可 扩增的独立单元的表面。
术语“生物学上可扩增的独立单元”指在所述的独立单元内；
(ⅰ)目的催化剂分子是一种生物学上可扩增的分子；或者
(ⅱ)目的催化剂分子由在允许对催化剂分子进行明确鉴定的实体内所包 括的信息进行生物学编码；
这提供了为获得多个拷贝的所述催化剂分子而扩增所述目的催化剂分 子的可能性。
在上面(ⅱ)中的术语“生物学编码”指信息以遗传密码的形式包括在DNA 或RNA分子内。
与上面(ⅰ)相关的生物学上可扩增的独立单元的一个实例为一种独立单 元，其中目的催化剂分子为DNA或RNA分子，因为在本领域中众所周知 DNA或RNA分子可以很容易地扩增。
与上面(ⅱ)相关的生物学上可扩增的独立单元的一个实例为一种独立单 元，其中目的催化剂分子为肽或多肽，而且其中所述的包括允许对催化剂 分子进行明确鉴定信息的实体为编码所述肽或多肽的DNA分子。
与上面的第二个实例相关，为了分离带有其编码的肽的DNA，在肽和 编码它的DNA之间必须存在一种物理连接。连接可以是直接连接，在这种 情况下肽直接附于编码它的核酸上，或者间接连接，此时肽可以附于例如 一种细胞的表面或者由一种细胞分泌，因此在紧邻分泌细胞处比其他任何 地方均丰富得多。此类细胞在本文中被称为“载体系统”，下面将对其进行 进一步讨论。
弹性连接子：
本发明的一个实施方案涉及根据本发明的第一个方面包括许多不同独 立单元的样品，其中(ⅰ)中所述的独立单元包括下述结构：催化剂分子-弹性 (XY交换对)连接子-底物。
优选弹性连接子包括XY交换对。
术语“弹性连接子”在本文中指作为一个整体连接催化剂和底物的分 子。例如，如果底物通过一种弹性分子结合于磁珠，而催化剂也通过一种 弹性分子结合于磁珠，那么“弹性连接子”指“弹性分子-磁珠-弹性分子”， 而且弹性连接子的特征将反映两个弹性分子和连接二者的磁珠部分的各自 特征。例如，弹性连接子可以由弹性多肽、聚乙二醇(PEG)以及其他具有适 当弹性的多聚体组成。
此外，弹性连接子还可以连接催化剂分子和载体系统(见下面)。
载体系统
本发明的一个实施方案涉及根据本发明包括许多不同独立单元的样 品，其中在本发明第一个方面的(ⅰ)中所述的独立单元包括下述结构：催化 剂分子-载体系统-XY交换对-底物，或者更优选包括下述结构：催化剂分子 -载体系统-弹性(XY交换对)连接子-底物。
术语“载体系统”指一种系统/实体，其物理连接催化剂分子和底物， 或者携带有允许对催化剂分子进行明确鉴定的信息，而且其中所述的载体 系统并不直接参与由催化剂分子催化的底物到产物的催化反应。
本文中将此类载体系统进一步分成生物学上可扩增的载体系统和生物 学上非可扩增载体系统。
生物学上可扩增载体系统的实例包括(载体系统-催化剂分子)：噬菌体- 多肽(Boublik等，1995，生物技术(Biotechnol)(NY)，第13卷，1079-1084 页)、丝状噬菌体-肽(Kay,Winter和McCafferty,1996，“肽和蛋白质的噬 菌体展示，实验室手册(Phage Display of Peptides and Proteins,A Laboratory Manual)”,Academic Press)、逆转录病毒-多肽(Buchholz等，1998，自然生 物技术(Nature Biotechnology)，第16卷，951-954页)、质粒-肽(Schatz等， 1996，酶学方法(Meth.Enzym.)，第267卷，171-191页)、多核糖体-肽 (Mattheakis等，1994，美国国家科学院院刊，第91卷，9022-9026页；He 和Taussig,1997，核酸研究(Nucleic Acids Research)，第25卷，5132-5134 页)、细菌-肽(Brown,1997，自然生物技术，第15卷，269-272页)以及mRNA- 肽(Roberts和Szostak,1997，美国国家科学院院刊，第94卷，12297-12302 页)、cDNA-肽(除了蛋白附于编码它的mRNA的cDNA而不是mRNA本身 外，类似于mRNA-蛋白质融合展示，)、肽-分泌性细胞-肽(Kinsella和 Cantwell,1991，酵母(Yeast)，第7卷，445-454页)、肽-分泌性人造微球- 肽(人造微球含有由微球内所含基因编码的蛋白质，见Tawfik和Griffiths, 1998，自然生物技术，第16卷，652-656页)。
生物学上非可扩增载体系统的实例包括(载体系统-催化剂分子)：磁珠- 有机分子或磁珠-肽(Brenner和Lerner,1992，美国国家科学院院刊，第89 卷，5381-5383页)、钉-无机分子和磁珠-DNA序列(Geysen等，1996，化学 和生物学(Chemistry and Biology)，第3卷，679-688页)。
应该注明的是，在本文中包括磁珠-DNA序列结构的独立单元是一种 生物学上可扩增的单元(见上面)，然而载体系统本身(磁珠)为一种生物学上 非可扩增的载体系统。
催化剂和催化剂分子库：
如上所述，术语“催化剂”指任何具有预期催化活性的催化剂分子， 例如有机和无机分子、蛋白质、酶、肽、核酸、生物多聚体和非生物学多 聚体、小的有机或无机分子。此外术语“催化剂”和“催化剂分子”可以 相互交换使用。
因而，本发明的另一个实施方案涉及
(ⅰ)根据本发明包括许多不同独立单元的样品，其中所述的催化剂分子 库为天然或非天然的肽或多肽的文库，优选为酶的文库；
(ⅱ)根据上面实施方案(ⅰ)包括许多不同独立单元的样品，其中所述的 文库为包括具有许多不同酶活性的多肽的文库；或者
(ⅲ)根据上面实施方案(ⅰ)包括许多不同独立单元的样品，其中所述的 文库为包括衍生自一个或多个前体多肽的多肽的文库，其中所述的前体多 肽表现出密切相关的酶活性。
优选术语“包括具有许多不同酶活性的多肽的文库”指一种文库，其 中所述的不同酶活性为实质上不同的活性，例如蛋白酶、淀粉酶、木聚糖 酶、纤维素酶活性。此类文库的一个优点可以是依所需特异性活性变换底 物，所述文库可用来鉴定多种目的肽。例如，如果例如一种肽作为底物用 本文所述体外筛选法首先分离了一种目的蛋白酶，那么随后通过将底物变 换为例如一种淀粉分子可以分离一种淀粉酶。
术语“天然或非天然的肽或多肽”指肽或多肽可以由二十种天然氨基 酸构建块(building blocks)中任何氨基酸，或者任何具有其他侧链的非天然 氨基酸，或者能够将两个肽连接起来的任何非氨基酸构建块组成。根据大 量已知用于制备此类文库的标准方法中的任意方法可以制备所述的文库。
因此，本发明的另一个实施方案涉及根据上面刚刚提到的本发明的实 施方案包括许多不同独立单元的样品，其中所述的文库为包括改组/重组/掺 杂的多肽的一种文库。
本发明的另一个实施方案涉及，
(ⅰ)根据本发明包括许多不同独立单元的样品，其中所述的催化剂分子 的文库为天然或非天然核酸的文库；
(ⅱ)根据上面实施方案(ⅰ)包括许多不同独立单元的样品，其中所述的 文库为包括具有许多不同催化活性的核酸的文库；或者
(ⅲ)根据上面实施方案(ⅰ)包括许多不同独立单元的样品，其中所述的 文库为包括衍生自一个或多个前体核酸的核酸的文库，其中所述的前体核 酸表现出密切相关的催化活性。
优选术语“包括具有许多不同催化活性的核酸的文库”指一种文库， 其中所述的不同催化活性为实质上不同的活性，例如核酸酶、连接酶、异 构酶、磷酸化酶。此类文库的一个优点可以根据目的特异性活性变换底物， 所述的文库可用来鉴定多种目的核酸。例如，如果利用例如两种DNA寡核 苷酸作为底物经本文所述体外筛选法首先分离了一种目的DNA连接酶，那 么随后通过将底物变换为例如一种RNA寡核苷酸可以分离一种核糖核酸 酶。
根据大量已知用于制备此类文库的标准方法中的任意方法可以制备所 述的文库。
因此，本发明的另一个实施方案涉及根据上面刚刚提到的本发明的实 施方案包括许多不同独立单元的样品，其中所述的核酸文库为包括改组/重 组/掺杂的核酸的一种文库。
术语“天然或非天然的核酸”指核酸可以包含五种天然碱基(A、T、G、 C、U)中的任何碱基、或任何非天然碱基或骨架结构。
本发明的另一实施方案涉及
(ⅰ)根据本发明包括许多不同独立单元的样品，其中所述的催化剂分子 的文库为包括天然多聚体分子、或非天然多聚体分子、或有机小分子、或 无机小分子或者所述分子的混合物的文库；或者
(ⅱ)根据上面刚刚提到的实施方案包括许多不同独立单元的样品，其 中通过组合化学制备所述的文库。
优选样品可以含有一个实质上的组合文库(美国国家科学院院刊， 1997，第94卷，2106-2110页)，每个潜在的催化剂由一个以上的亚单位组 成，在这个意义上，所述的亚单位通过可逆的共价键或非共价键相互作用 结合起来，在多次转化试验中亚单位结合并解离数次。
在实质上的组合文库情况下，可以用对回收的实体而不必是单个催化 剂组合的明确鉴定来理解本文通篇使用的术语“明确的鉴定”。此类由实质 上的组合文库分离的催化剂可以为由数条多肽链组成的催化剂，所述的多 肽链通过弱的相互作用(例如蛋白质亚单位的结合，以低的亚单位-亚单位亲 和力为特征)结合起来，或者通过可逆的共价二硫键结合起来，加入氧化还 原缓冲剂(例如氧化型和还原型谷胱甘肽)可加速其交换速率，因此连续地结 合和解离。
术语“天然多聚体分子或非天然多聚体分子”指多聚体可以是天然的， 或人工制备的。
或者，文库成员可以是通过二硫键结合起来的小的有机分子的集合； 此外，通过包含氧化还原缓冲剂可以加速实质上的组合文库的动力学。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明包括许多不同独立单元 的样品，其中催化剂分子和能够被催化成产物的底物(在第一个方面的(ⅰ)中) 为不同的化学物质。
术语“催化剂分子和能够被催化成产物的底物(在第一个方面的(ⅰ)中)为 不同的化学物质”指所述的催化剂分子和底物分子为实质上不同的化学物 质。
因此，在该优选的实施方案中，催化剂分子和底物分子为DNA或RNA 分子的情况在本文中被称为是催化剂分子和底物分子并非不同化学物质的 情况。
根据本发明的第二个方面，用于体外筛选中多次催化活性转化的方法：
根据本发明第二个方面中的步骤(ⅱ)，术语“筛选”指对包括在样品内 的1个以上，优选100个以上，或者优选10,000个以上，更优选1,000,000 个以上，甚至更优选108个以上，而且最优选1010个以上的独立单元进行筛 选，优选没有技术人员的干预。
术语“柱”在本文中指所有种类的固相支持物。实例为：柱、包括BiacoreTM 设备的表面。在某些情况下无需固相支持物，如果分离是基于在电场中的 迁移便是如此。
根据本发明第二个方面的方法的Y-底物化合物和目的催化剂的分离：
如上所述，根据部分们第二个方面中的(ⅰ)，术语“所述的独立单元与 Y-底物化合物相接触”指将独立单元和Y-底物化合物适当地靠近以便能够 进行交换反应。所述的接触例如可以在一种缓冲液中，其中独立单元和Y- 底物化合物可以扩散到一起，由此而彼此相互接触。
根据本发明，在按照用于多次催化活性转化的体外筛选方法进行的筛 选循环中，进行第一轮筛选的严谨度低于后几轮筛选是有利的。例如，通 过利用低浓度的Y-底物，和/或低浓度的产物结合受体可以很容易做到这一 点，在某些情况下在第一轮循环中可以不使用Y-底物。另外，可以使用低 效的Y-底物化合物。然后在后面的筛选循环中增加浓度。对于某些实验设 置，这可能是不可行的。例如，如果使用由非常活跃的酶组成的文库，而 且分离催化剂的方法是以在产物结合柱上的固定为基础，那么高启始浓度 的Y-底物可以产生高浓度的Y-产物。根据产物结合柱的容量，这可能以产 物饱和产物结合受体，因此导致筛选严谨度降低。然而，例如通过(在裂解 反应情况下)经含有底物的连接子将催化剂连接于柱(见图8)可以解决该问 题。为了进一步增加筛选的严谨度，可以向柱缓冲液中加入过量的底物S(未 连接于Y)(其将起“竞争性底物”的作用)。调节反应严谨度的其他方法包 括改变连接酶和底物的连接子的长度，向柱缓冲液中加入对底物或酶有亲 和力的因子，或者加入影响底物-酶相互作用的因子(例如，结合酶活性位点 的受体/抗体、酶抑制剂、对底物有亲和力的受体/抗体)。
为了限制催化剂转化底物的有效时间，例如在筛选过程中可以施加电 压或光线的脉冲。适当间隔的脉冲能够产生例如瞬时的pH或离子梯度，其 可以启动由催化剂进行的底物到产物的反应。脉冲在时间上应该有足够的 间隔，以便在脉冲开始下一个反应前，使溶液中的催化剂可以有充足的时 间固定于受体上。这样，在柱中进行的筛选的空载时间(即催化剂从一个受 体扩散到下一个上所花的时间)可以大大降低，并获得非常高的严谨度。
一般说来，优化具体实验设置是在技术人员一般知识范围内的。
在本发明第二个方面的步骤(ⅰ)之前进行富集的步骤
某些蛋白难以展示到丝状噬菌体上。特别是大的蛋白或对大肠杆菌具 有毒性或生长抑制作用的蛋白通常展示效率较低，即产生的噬菌体颗粒大 部分在表面上不携带展示的蛋白。已经报道过低至一千个有一个展示目的 蛋白的噬菌体的展示效率(Jestin等，1999,Angew.Chemi.Int.Ed.第38卷， 1124-1127页；Demartis等，1999，分子生物学杂志(JMB)，第286卷，617-633 页)。在这种情况下，由于携带编码目的蛋白DNA却未在表面上展示所述 蛋白的噬菌体颗粒大量过剩，所以估计会有高度非特异的背景。为了克服 这个潜在的问题，可以在目的蛋白的C-末端偶联一个亲和性标签，使得可 以通过柱层析对展示全长带标签的蛋白的噬菌体进行纯化。
在该方式中可以使用的非限制性的多种亲和性标签为：组氨酸标签(见 实施例9)、intein-几丁质结合结构域融合体(Chong等，1997，基因(Gene)， 第192卷，271-281页)、FLAG肽(Slootstra等，1997，分子多样性(Molecular Diversity)，第2卷，156-164页)以及麦芽糖结合蛋白(Pryor和Leiting,1997， 蛋白质表达和纯化(Protein Expression and Purification)，第10卷，309-319 页)。
因而，本发明的实施方案涉及
(ⅰ)根据本发明的第二个方面用于体外筛选的方法，其中目的催化剂分 子为偶联了一个亲和性标签的酶或蛋白质，而且其中在步骤(ⅰ)前进行一个 任选步骤，该任选步骤包括通过纯化对展示(全长)酶或蛋白的独立单元进行 富集，在所述的纯化步骤中利用亲和性标签对展示酶或蛋白的单元进行分 离。
(ⅱ)根据本发明的第二个方面用于体外筛选的方法，其中利用抗亲和 性标签抗体柱对展示(全长)酶或蛋白质的独立单元进行纯化，在所述的抗体 柱中利用标签对展示带标签的酶或蛋白质的单元进行分离。
(ⅲ)根据本发明的第二个方面用于体外筛选的方法，其中亲和性标签 包括偶联至目的酶或蛋白C-末端的六个组氨酸残基，而且在Ni-NTA柱上 或者在抗组氨酸抗体柱上对展示(全长)酶或蛋白的独立单元进行纯化，在所 述的柱中利用标签对展示带标签的酶或蛋白质的单元进行分离。
根据本发明的方法分离有活性目的催化剂的方法
对有活性或低活性催化剂的分离优选包括一个筛选步骤，在该步骤中 催化的反应引起催化剂通过其附着的连接子-底物而释放或附着。
当利用柱装置时，存在至少四种将有活性催化剂与无活性催化剂分开 的方法。ⅰ)通过将产物固定于产物结合柱上可以分离有活性催化剂(或者更 常用，通过附着的产物)。ⅱ)无活性催化剂可以通过固定于底物结合柱上而 被去除。ⅲ)在靶反应之前可以将催化剂附着于支持物上；在裂解反应发生 时，将催化剂从支持物上释放，并可以收集起来。ⅳ)经过底物1(附于催化 剂)和底物2(附于支持物)的反应后，有活性的催化剂本身可以附于固相支持 物上。图示说明见图7和8。
产物和底物特异性柱可以通过结合分别对产物和底物有特异性的受体 分子来固定产物和底物。或者，通过在柱子上功能基团和附于催化剂的产 物或底物之间的产物或底物特异性反应可以介导固定作用。
分离产物或底物(以及分别与它们在一起的有活性或无活性的催化剂) 的其他方法包括在不同相之间的分层、质谱、沉淀、电或电磁分离等。特 别是可以进行各种类型的电泳，尤其是在产物的形成导致独立单元的电荷 显著改变的情况下。电荷的显著改变可以导致例如，如果反应为连接两个 底物的连接反应，那么其中之一带电荷并且在反应之前在溶液中游离。
因而，本发明的实施方案涉及
(ⅰ)根据本发明的第二个方面用于体外筛选的方法，其中通过特异性固 定作用进行步骤(ⅱ)中对产生所述产物分子的目的催化剂分子的筛选；
(ⅱ)根据本发明的第二个方面用于体外筛选的方法，其中通过下述策 略进行步骤(ⅱ)中对目的催化剂分子的筛选，
(a)构建一个系统，其中将第二个方面的步骤(ⅰ)中包括底物分子和催化 性分子的独立单元每个都结合到基质上，而且其中在将底物转化成产物时 将单元从所述的基质上释放；并且
(b)对从所述的基质上释放的单元进行筛选；
(ⅲ)根据本发明的第二个方面用于体外筛选的方法，其中通过下述策 略之一对目的催化剂分子进行筛选(步骤(ⅱ))，
(a)构建一个产物柱，其中沿着产物柱的基质上放置特异性结合产物的 受体；并且
(b)在产物柱的一端加入独立单元的样品并通过分离最后到达柱子另 一端的独立单元对目的催化剂分子进行筛选；
(ⅳ)根据本发明的第二个方面用于体外筛选的方法，其中通过物理或 化学方法对一种实体进行分离(步骤(ⅲ))，所述的实体包括允许对目的催化 剂分子进行明确鉴定的信息；
(ⅴ)根据就在上面的方面用于体外筛选的方法，其中的物理方法为电 泳。
根据本发明第二个方面的(ⅳ)，重复步骤(ⅰ)至(ⅲ)一次或多次：
如上所述，根据本发明第二个方面的(ⅳ)，术语“通过利用在步骤(ⅲ) 所述的实体中所包括的信息来产生目的催化剂分子，并构建包括所产生的 该目的催化剂分子的一个独立单元，然后通过在所述的重复步骤中利用该 独立单元作为启始材料，将步骤(ⅰ)至(ⅲ)重复一次或多次”指所述的重复可 以为一次，更优选2次，更优选5次以上，甚至更优选10次以上，而且最 优选25次以上。
根据本发明的最后一个方面用于制备目的催化剂分子的方法：
如上所述，在最后一个方面中本发明涉及用于制备目的催化剂分子的 方法，所述的方法包括根据本发明进行用于体外筛选的方法而且进一步包 括下述步骤，
(a)通过适当的制备方法制备适当量的所述分离的目的催化剂分子。
如上所述，根据本发明的第二个方面在用于体外筛选的方法中，步骤(ⅲ) 写到：
(ⅲ)“借助于产物的一个特征，对一种实体进行分离，所述的实体包括 允许对催化剂分子进行明确鉴定的信息，所述的催化剂能够多次催化底物 分子到产物分子的反应”
因而，在所述的实体内所包括的信息为通过技术人员已知的任何标准 制备策略制备所述目的催化剂分子提供了可能性。
例如，若所述的催化剂分子为一种目的多肽，那么所述的标准制备策 略可以是用于重组制备所述目的多肽的标准方法，或者
例如，若所述的催化剂分子为一种目的有机分子，那么所述的标准制 备策略可以是用于制备此类有机分子的标准方法。
实施例：
实施例1：
包括本发明第一个方面中除XY交换对外的特征的独立单元的实例。
在该实施例1中，目的催化剂是葡萄球菌DNA酶(SNase)；底物是单 链寡核苷酸(ssDNA)；产物是被目的SNase裂解的ssDNA。
而且，用一种丝状噬菌体作为载体系统，用酸/碱连接子作为弹性连接 子。
因此，这个实施例中的独立单元有如下的一般结构：
SNase-丝状噬菌体-酸/碱连接子-ssDNA
催化剂-载体系统-弹性连接子-底物。
图示见图10。
在这个实施例中，产物(即，被裂解的ssDNA)的“筛选特性”为该产 物不与基质结合，而底物(ssDNA)与基质结合。
因此，在这个实施例中，通过筛选从所述的基质中释放的独立单元对 目的SNase分子进行分离。图示见图10。
材料和方法
化合物的合成Fmoc-S-(2-硝基-4,5-二甲氧苯甲基)-L-半胱氨酸1是 用Merrifield(6)方法的改良法合成的。简言之，将605mg L-半胱氨酸(5mmol) 悬浮于脱气的乙醇/水(2∶1)100ml中，加入1.39mL三乙胺(10mmol)和1.39g 1-(溴甲基)-2-硝基-4,5-二甲氧苯(5mmol)。在氮气中23℃避光搅拌该混合 物10小时并过滤。用乙醇清洗过滤块，并从乙醇/水中重结晶产生0.95g S-(2- 硝基-4,5-二甲氧苯甲基)-L-半胱氨酸(3mmol)。将重结晶产物(0.8g)悬浮于 20mL水中；加入0.53mL三乙胺(3.8mmol)，随后加入12mL溶解有0.9g 9- 芴基甲氧基羰基琥珀酸酯(2.7mmol)的乙腈溶液，在氮气中25℃条件下搅拌 该混合物。用1M HCL将产物酸化至pH2-3，使之沉淀，蒸发乙腈。收集 沉淀于一玻璃容器(frit)，用水和乙酸乙酯洗涤以去除过量的HCl和试剂。 将得到的粗产物1(1.13g)在真空中充分干燥，直接用于合成碱性连接子多 肽，C(GGS)4 AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKK-KLAQGGC(碱性 序列用下划线标出，光保护的半胱氨酸用黑体标出)。在ABI DNA合成仪 上，用3＇生物素基团(BiotinTEG CPG,Glen Research)和5＇硫醇(5＇-Thiol- Modifier C6,Glen Research)合成化合物2、3和4各1mmole，并用反向HPLC 纯化，从树脂中洗脱(Rainin Microsorb C18柱，流速1mL/min；溶剂A:50mM 醋酸三乙胺(TEAA),pH7；溶剂B：乙腈，溶剂B在40分钟内的5％到50 ％线性梯度；按照Glen Research的方法去除硫醇基上的三苯甲基保护基团。 冻干产物并溶解于水中(终浓度为1.0mM)。化合物2与碱性连接子肽的偶 联物的制备方法如下：在4℃氮气条件下，2mg(415nmole)碱性连接子肽与 20倍摩尔浓度过量的N,N＇-双(3-丙酰马来酰亚氨基)-2-羟基-1,3丙二胺(3.2mg) 在1mL 50mM pH5.5的磷酸钠缓冲液中反应10小时。化合物5是用反向 HPLC(Vydac RP-18柱，流速2mL/min；溶剂A:0.1％TFA水溶液；溶剂B: 0.1％TFA乙腈溶液；35分钟内10％到50％溶剂B的线性梯度)从反应混合 物中纯化，产物级分浓缩至大约0.3mL(OD280=6，化合物5不能被浓缩至 干燥)。向100mL(138nmole)这种溶液中加入75μL水，75mL pH7的1M 磷酸钠水溶液，30mL 5M NaCl水溶液和22mL(22nmoles)化合物2，并将反 应在23℃、氮气中温育10小时(为了避免沉淀，试剂应以这种顺序加入)。 用阴离子交换FPLC纯化产物(Mono Q HR 5/5柱(Pharmacia)，流速 0.75mL/min；溶剂A:20mM Tris-HCL,pH7；溶剂B:20mM Tris-HCL,pH7, 2M NaCl；B的20％到60％线性梯度，7.5分钟之内)；在10％变性聚丙烯 酰胺凝胶上，产物有一条单一条带。OD260=0.3-1的级分直接用在光-去保护 步骤中(见下面)。化合物3和4与碱-连接子-肽的偶联物以如下方法制备： 大约200nmoles化合物3或4和20倍过量的二马来酰亚胺在1mL pH5.5的 50mM磷酸缓冲液中，4℃温育15小时。在用反向HPLC纯化及冻干后， 用Maldi-ToF MS验证化合物6和7。化合物6和7(150nmoles)和碱-连接 子-肽在100mL 10mM TEAA,pH6.5,100mM NaCl中4℃温育15小时。产 物用反向HPLC纯化(Vydac RP-18柱，条件同前面叙述的条件相同)、冻干 并用Maldi-ToF MS分析(7)。三个偶联物的C末端半胱氨酸上的2-硝基-4,5- 二甲氧苯甲基保护基团通过光解作用去掉，获得化合物8、9和10，方法如 下：化合物8的方法，通氩气15分钟，除去含有被保护的偶联物的100mL FPLC纯化级分中的气体，然后置于隔膜封盖的玻璃小瓶中，汞灯(450W高 压汞灯，Ace-Hanovia；PyrexTM滤器，cutoff2300nm)照射30分钟(8)。化合 物9和10的方法，10nmoles偶联物溶解于100mL 10mM DTT中，按上述 方法除气和光分解。照射30分钟后，没有剩余的起始原料被MALDI-ToF MS 检测到。用HPLC分离反应混合物(Vydac RP-18柱，条件同前面叙述的条 件相同)，并将产物级分冻干。偶联物冰冻保存，并且为了保证有效地依附 于噬菌体，在光去保护之后1周内应用。
酸辅助噬菌体的构建用K07-NarⅠ-prim引物(5’-ACAACTTTCAACGG CGCCAGTTTCAGCGG-3’)通过Kunkel诱变(9)，在M13K07辅助噬菌体 (Promega)的成熟pⅢ蛋白的第三个和第四个密码子之间引入一个NarⅠ限制 性内切酶位点，得到NarⅠ-辅助噬菌体。两端均带有NarⅠ限制性位点的编码 氨基酸GAAQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQGGCPAGA(下划 线部分表示酸性肽序列，粗体表示GGC基序)的DNA，是通过聚合酶链式 反应(PCR)，用质粒pCRⅡ(Ellis L.Reinherz,Dana Farber癌症研究所，波士 顿)和引物NarⅠfwd(5’-ACTACAAATTGGCGCCGCTCAGCTCGAAAAAG AGC-3’)和引物NarⅠbck(5’-AATTATAGGCGCCAGCCGGGCAACCGCCC TGAGCCAGTTCCTTTTCC-3’)生成的。用NarⅠ消化PCR产物，并将其引 入到NarⅠ消化的NarⅠ-辅助噬菌体中，获得酸性辅助噬菌体。
编码葡萄球菌核酸酶-pⅢ融合蛋白和39-All Fab-pⅢ融合蛋白的噬菌 粒的构建为了制造SNase-pⅢ融合蛋白，用引物5’-CGCGAATTGGCCCA GCCGGCCATGGCCGCAACTTCAACTAAA-3’(划线部分为SfiⅠ限制性位 点)和引物5’-GCGAATTGGTGCGGCCGCTTGACCTGA-ATCAGCGTTG- 3’(划线部分为NotⅠ限制性位点)，在质粒pONF1上进行PCR(10),pONF1 上携带SNase编码基因。产物用SfiⅠ和NotⅠ消化，并引入到SfiⅠ-NotⅠ消化 的pFAB-5c的衍生物pFAB-5c.His上(11)，获得噬菌粒pⅡ78-6。用噬菌粒 pComb3H.DA作为阴性对照。这个噬菌粒(12)携带融合到pⅢ蛋白上的39- All Fab抗体(13)。SNase和对照蛋白的表达均受lac启动子的驱动。
噬菌体颗粒的产生噬菌体颗粒按照φrum等的方法(11)略有修改而制 备。简述之，用pⅡ78-6或pComb3H.DA转染大肠杆菌XL1-blue，在含 100mg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基中37℃振荡培养。在OD600为0.5时， 加入终浓度为1.5×108cfu/mL的酸性辅助噬菌体，在37℃温育20分钟。 将细胞成团，后在2×YT、100mM IPTG、100mg/mL氨苄青霉素、50mg/mL 卡那霉素中悬浮，在常温下振荡培养14小时。将细胞成团，上清中的噬菌 体颗粒用PEG沉淀，随后悬浮于TBS(25mM Tris-HCl,pH7.4、140mM NaCl、 2.5mM KCl)。用标准的方法以大肠杆菌XL1-blue滴定噬菌体(14)。
碱性连接子-底物偶联物和噬菌体的共价结合。大约108个噬菌体颗粒 在加有1mM巯基乙胺(MEA)和1nmole碱性-连接子-寡脱氧核苷酸(化合物 8)、碱-连接子-pTp(化合物9)或碱-连接子-pTpTp(化合物10)的40mL缓冲液 A(TBS,10mM EDTA,0.1％BSA)中37℃温育60分钟，然后PEG沉淀两 次，重悬于缓冲液A中。
噬菌体的固定和从固体支持相中释放大约108个与碱-连接子-底物偶 联物共价结合的噬菌体颗粒和50mL链亲和素磁珠(Boehnriger Mannheim， 生物素结合能力：1.5nmole/ml)在1mL缓冲液A中23℃温育15分钟；用含 0.1％吐温20的缓冲液A洗涤8次，每次1分钟，随后用缓冲液A洗涤2 次，每次1分钟。将磁珠悬浮于缓冲液A中，然后用悬浮珠直接感染大肠 杆菌XL1-blue并滴定，或者用Dnase 1(1单位/mL DNase 1,10mM MgCl2, 20mM Tris-HCl,pH8,23℃15分钟)处理后再感染，以确定磁珠上所固定 的噬菌体数。将磁珠悬浮于缓冲液B(TBS,10mM CaCl2,0.1％BSA),23℃ 温育5分钟并滴定上清，以检测其从固体支持相的钙依赖性释放(裂解)。将 磁珠悬浮于缓冲液A,23℃温育5分钟并滴定上清，以检测其从磁珠的钙 依赖性释放(裂解)。
从文库样集合体中富集活性酶将展示SNase或39-All Fab的噬菌体颗 粒以1∶100的比例混合，并共价结合碱性-连接子-寡脱氧核苷酸偶联物(化 合物8)。将噬菌体固定在链亲和素磁珠上，按上面叙述的方法在缓冲液A 中洗涤并在缓冲液B中温育，用上清感染大肠杆菌XL1-blue，将细胞铺于 含100mg/mL氨苄青霉素的LA平板上。用PCR或限制性内切酶消化的方 法，鉴定随机挑选的克隆为Snase克隆还是对照克隆。
结果和讨论
筛选方案为了检测上述噬菌体展示形式的定向酶进化策略，首先必需 发展一个常规方法以便选择性地将一个给定的底物附着在噬菌体展示的酶 上或其附近。重要的是底物必需被附着，以使其有效的结合在结合酶的活 性部位。而且，底物应该和噬菌体共价结合，以确保不存在文库成员间交 叉反应的产物。一种可能的策略包括用底物通过二硫化物交换反应对酶或 附近的噬菌体包膜蛋白(例如pⅢ蛋白)进行选择性的化学修饰。例如，经定 点诱变引入到葡萄球菌核酸酶活性部位附近的半胱氨酸残基已用来通过二 硫化物交换反应选择性的引入唯一的化学功能(15)。为了将这种方法应用在 表达于丝状噬菌体上的蛋白上，首先将包膜蛋白pⅥ、pⅦ、pⅨ上的三个 单独的半胱氨酸诱变成丙氨酸。pⅢ蛋白的埋在内部的8个半胱氨酸没有变 化，因为它们可能形成结构上重要的二硫键(16)。不幸的是，通过二硫化物 的交换、马来酰亚胺附加或烷化反应等方法对引入到几种展示于噬菌体上 的酶的活性部位附近的半胱氨酸选择性修饰的反复努力，均导致对噬菌体 包膜蛋白的显著的非特异性标记。选择性标记含唯一表面半胱氨酸残基的 pⅢ融合蛋白的条件和试剂，还没有发现。组成噬菌体包膜的几千种蛋白使 得对化学反应的特异性要求过高，还有由于在蛋白质生物合成时的内在错 误率，对这样一个大的蛋白集合体，半胱氨酸错误掺入的可能性变得显著。 另外，pⅢ蛋白的半胱氨酸残基可能对交联试剂敏感。
为了绕开这些问题，发展了两步法，即在化学交联之前，于修饰位点 上选择性形成非共价复合物(图9和10)。复合物是异二聚体化的卷曲螺旋 结构，包括一个合成的碱性肽B,C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKL QALKKKLAQGGC和酸性肽A,GAAQLEKELQALEKENAQLEWELQALE KELAQGGCPAGA，其中碱性肽A在形成异二聚体前与底物共价偶联，酸 性肽A作为与丝状噬菌体pⅢ包膜蛋白融合的N末端融合蛋白被表达。酸 性肽和碱性肽被选为二聚体化结构域是由于它们的序列短(30个氨基酸)且 具有较高的形成稳定、平行异二聚体化卷曲螺旋结构的倾向--酸-酸和碱- 碱同型二聚体的形成较异二聚体的形成效率低105倍左右(17)。合成肽(B)和 噬菌体编码肽(A)的异二聚体化将底物带到展示酶附近，并且引起两条肽链 的半胱氨酸自发形成二硫键(图10)。在酸性肽和碱性肽的C末端加上三肽 Gly-Gly-Cys，以促进两个螺旋间形成二硫键(17)。底物通过一个弹性连接 子共价结合于碱性肽B，以促进底物与酶的生产性结合(图9)。酸性肽A与 噬菌体的pⅢ蛋白融合，而不是与展示酶本身结合，原因如下：ⅰ)在酶中插 入该酸性肽序列可能干扰酶的功能；ⅱ)碱性-连接子-肽这种弹性连接子、pⅢ 蛋白的铰链区、以及位于pⅢ蛋白和展示酶之间的肽连接子，应使底物相 对于酶活性中心有多种可能的定向；和ⅲ)应能利用单个带有该酸性肽延伸 部分的辅助噬菌体展示多种酶-底物对，而不需要用基因工程为每种酶构建 一个功能性偶联位点。
酸性辅助噬菌体和碱性-连接子-底物偶联物的产生
为了将碱性-连接子-底物偶联物结合到噬菌体上，我们在M13K07辅 助噬菌体pⅢ蛋白的N末端引入了酸性肽A。酶文库与pⅢ包膜蛋白的N 末端融合，该构建体携带于噬菌粒中。辅助噬菌体超感染后，产生噬菌体 颗粒，它们包含噬菌粒DNA但其包膜组成蛋白是由辅助噬菌体编码的(有 一个例外)。这一个例外是pⅢ蛋白，它在噬菌体的一端有4-5个拷贝。在 噬菌体包装期间，酶-pⅢ融合蛋白和酸性肽A-pⅢ融合蛋白均可产生；从 典型制剂中得到的噬菌体颗粒携带一个或零个酶-pⅢ融合蛋白加上三到五 个拷贝的酸性肽A-pⅢ融合蛋白。
为了生成携带酸性肽-pⅢ融合蛋白的噬菌体，将编码C末端含半胱氨 酸残基的酸性肽A的DNA引入到M13K07辅助噬菌体基因Ⅲ的5’端。 得到的酸性辅助噬菌体颗粒在用碱性肽B包被的ELISA-平板上的固定效率 比M13K07高100多倍，提示突变的辅助噬菌体在其pⅢ蛋白上携带易接 近的酸性氨基酸延伸序列。同样，当含有编码pⅢ融合蛋白的噬菌粒的大 肠杆菌被酸性辅助噬菌体超感染时，得到的噬菌体颗粒，除了展示pⅢ融 合蛋白外，还展示被修饰的pⅢ延伸序列(图10)。酸性肽的插入并不显著 地改变该辅助噬菌体的滴度或挽救效率。
结合底物的合成性碱性-连接子-肽(B)包含12残基(GlyGlySer)4连接子， 其后为组成碱性序列的30个氨基酸(图9)。碱性-连接子-肽在N-末端和C 末端还有半胱氨酸，它们分别使肽与底物高效、选择性地结合及使肽与噬 菌体形成二硫键(图9和图10)。合成性肽C-末端的半胱氨酸最初是由2-硝 基-4,5二甲氧苯甲基保护基团保护，后者可经光化学反应去除。这使底物 通过硫醇特异性反应(如二硫化物交换、烷化反应或Micheal加成反应)选择 性地结合于N-末端半胱氨酸的游离硫醇基团上。底物结合之后，C-末端半 胱氨酸被光化学反应去保护，产生大量的游离硫醇基，它们可与噬菌体上 的酸性肽延伸序列交联。因为底物与碱性-连接子肽的化学偶联，及该偶联 物与噬菌体的交联是分别进行的，许多不同的化学物质和反应条件可以用 来使碱性连接子肽和底物结合。而且偶联物的成分在与噬菌体交联之前可 以纯化和定性(例如通过质谱分析)。
葡萄球菌核酸酶作为一个模型系统葡萄球菌核酸酶是一种已知酶，由 149个氨基酸的单链多肽组成(18)。它在A、U-或A、T-富集区域优先水解 单链RNA(ssRNA)、ssDNA和双链DNA的磷酸二酯键，产生3’磷酸和5’ 羟基末端(18)。Ca2+是酶活性所必须的，其提供了一个调节酶作用的机制。 此外SNase被成功地以pⅢ融合蛋白的形式展示于噬菌体上(19)。
因为没有试剂、抗体或受体可用来轻易的区分单链寡脱氧核苷酸底物 和它的裂解产物(互补寡核苷酸将降解)，发展了一个筛选方案，在这个方案 中ssDNA底物的裂解导致噬菌体从固体支持相中释放。在这个方案中一轮 的筛选包括如下的步骤：ⅰ)通过一个单链寡脱氧核苷酸将展示Snase的噬菌 体结合于固体支持相(为不激活SNase，没有Ca2+)；ⅱ)洗涤除去未结合的 噬菌体；ⅲ)通过加入Ca2+启动裂解反应；ⅳ)对洗脱噬菌体的分离。在筛选 的后几个循环中，洗脱可以在严谨度逐渐增加的条件下进行，例如缩短反 应时间、降低反应温度及改变pH。噬菌体与固体支持相的结合，是通过以 下几个步骤实验的，即5’-生物素标记的寡脱氧核苷酸-肽B偶联物和噬菌 体上酸性肽A延伸序列之间卷曲螺旋的形成，随后的两个肽的二硫键交联 及其在链亲和素珠上固定(图9)。这个方案中噬菌体通过底物与固体支持相 结合，需要酶或底物在与噬菌体结合期间保持无活性状态，然后通过改变 反应条件被激活。这些改变包括调节pH值，加入辅因子或共同底物，以及 底物的光化学或化学激活。生物分子缩合反应通过形成化学键导致噬菌体 固定在固体支持相上时，无需启动反应；如果活性酶是通过产物特异性试 剂、抗体或受体而捕获时，也是如此。
底物和噬菌体的共价结合通过酸性辅助噬菌体超感染制备展示SNase 或对照蛋白(抗体39-All Fab片段)的噬菌体。为了评估碱性-连接子-底物 偶联物与噬菌体的结合效率，用过量的对照偶联物“pTp”-肽B(化合物9) 与噬菌体共同温育。碱性-连接子-pTp偶联物由生物素部分及其后的脱氧胸 苷-3’,5-二磷酸(pTp)、弹性肽连接子和碱性肽序列、C末端半胱氨酸组成。 在溶液中碱性-连接子-pTp偶联物不是野生型SNase的底物(pTp是强效的 SNase抑制剂)(20)。噬菌体和底物-肽B偶联物首先用还原性试剂巯基乙胺 (MEA)温育，以还原噬菌体酸性肽或合成肽半胱氨酸之间的二硫键。然后 通过PEG沉淀除去MEA和游离碱性-连接子-pTp，并加入链亲和素磁珠。 洗涤十次后，通过用磁珠感染大肠杆菌XL1-blue并滴定噬菌体检测被固定 的噬菌体数量。这种方法检测时，展示SNase和抗体39-All Fab的噬菌体 的固定效率大约为10％(图11)。
接下来检测在无Ca2+时，与展示Snase的噬菌体结合的寡脱氧核苷酸 底物是否稳定。碱性-连接子-寡脱氧核苷酸偶联物与展示Snase的噬菌体结 合(在EDTA存在的条件下)，固定效率的检测同上。固定效率还是大约 10％(图11)，说明无Ca2+时，结合的寡脱氧核苷酸底物没有被SNase裂解。 如果一些噬菌体当与磁珠结合时丧失了感染性，那么真正的固定效率很可 能高于检测到的结果。通过加入DNaseⅠ可检测这个观点，DNaseⅠ可以裂 解结合的寡脱氧核苷酸底物，并释放被固定的噬菌体。如图11所示，大部 分被固定的噬菌体是非感染性的，但当加入DNaseⅠ后，变为感染性，说明 真正的固定效率大约为80％(图11)。如果没有包括寡脱氧核苷酸-肽B偶联 物，被固定的噬菌体少于0.01％；如果用野生型M13K07辅助噬菌体超感 染，被固定的噬菌体大约为0.3％。因此将底物结合于噬菌体pⅢ蛋白的两 步法是高效的、且高度位点特异性的方法。
噬菌体的酶依赖性与固体支持相分裂和富集为了检测噬菌体展示的 SNase是否能在分子内反应中特异性裂解结合的寡脱氧核苷酸底物，在被固 定的噬菌体中加入Ca2+以激活酶。大约有15％的噬菌体被释放(图11)，相 反仅有0.2％的展示Fab 39-All的对照噬菌体被释放(图11)。同预期结果一 样，这个实验证实SNase从固体支持相上裂解和释放噬菌体的效率比对照 蛋白高得多。然而在检测时，有小部分但是明显的噬菌体从支持相中漏出(在 碱性-连接子-寡脱氧核苷酸和碱性-连接子-pTp偶联物及两个展示蛋白中， 在没有Ca2+的条件下观察到这个背景渗漏，图11)。加入Ca2+导致噬菌体从 支持相开始爆发性释放；然而噬菌体的释放水平迅速降至相当于没有Ca2+时的渗漏水平。这个结果证实，通过分子间裂解反应将噬菌体释放到溶液 中时，并不释放其它噬菌体，如通过分子内裂解作用释放的那样。因此即 使用象Snase这样活性很高的酶，也不会有明显的交叉反应性。
上述分析说明，有可能从展示催化性失活蛋白库样集合体的噬菌体中 富集展示SNase的噬菌体。为检测这一点，以1∶100的比例混合展示SNase 和Fab 39-All对照蛋白的噬菌体，与寡脱氧核苷酸-肽B交联并固定。与Ca2+一起温育后，回收的噬菌体比例为22∶18，它相当于富集系数稍微高于100。 通过五轮的筛选和扩增，这个富集程度足以从含1010个成员的文库中分离 一个有活性的催化剂。
通过减少噬菌体从支持物中漏出，很可能提高富集系数。这种漏出可 能由链亲和素从支持物中的释放引起，或者由合成肽和噬菌体编码肽之间 的二硫键的还原或错误形成引起。我们目前探讨了这些可能性。或者，可 通过增加酶-催化的裂解反应的程度而提高富集系数。在噬菌体生成的条件 下，由辅助噬菌体表达的pⅢ与由噬菌粒表达的pⅢ融合蛋白的比例使大 部分的噬菌体仅携带野生型pⅢ蛋白，仅一小部分噬菌体携带pⅢ融合蛋 白。简单地通过增加展示所述酶的噬菌体的数量，就可以增加自我裂解的 噬菌体的数量。对在此描述的噬菌粒/辅助噬菌体组合，我们估计仅约15％ 的噬菌体为单价体。通过适当的载体设计和噬菌体制备，有可能将平均展 示增加到每个噬菌体约一个蛋白。这将使裂解和渗漏的比率增加7倍，因 此将活性酶对非活性酶的富集系数从目前的约100增加到约700。
为了检测在此描述的筛选方案是否适用于有小分子底物参与的反应， 一个pTpTp-肽B偶联物(化合物10)被结合到展示SNase或对照蛋白的噬菌 体上。通过上述的富集步骤携带噬菌体，并再一次富集展示SNase的噬菌 体。用MALDT-ToF质谱分析显示pTpTp底物在两个胸苷之间的磷酸二酯 键处被裂解；没有检测到副产物。因此表明这个方法对大分子和小分子底 物均适合。我们目前正在探讨从酶或抗体文库中分离新催化剂的可能性。
大部分在噬菌体上展示的酶文库需要用M13K07等辅助噬菌体超感 染。因此在此描述的筛选方案可以直接应用于这些文库--仅需要在用酸 性肽辅助噬菌体超感染噬菌粒编码的文库后制备噬菌体，并使所选底物与 碱性肽B偶联。同样，这种方法可以应用于结构上不同的蛋白群体。基因 组编码蛋白就是这样的群体。例如，用这种筛选方案应能从基因组蛋白文 库中分离具有指定底物特异性的天然激酶。这类功能性克隆(其中天然酶及 其编码基因根据其催化活性分离)应该能应用于天然酶催化的许多反应。
实施例1的参考文献和注解。
1．Schultz,P.G.和Lerner,R.A.(1995)科学269,1835-1842。
2．(a)Marks,J.D.,Hoogenboom,H.R.,Bonnert,T.P.,McCafferty,J., Griffiths,A.D.和Winter,G.(1991)分子生物学杂志222,581-597.(b).Barbas, C.F.,Ⅲ,Bain,J.D.,Hoekstra,D.M.和Lerner,R.A.(1992)美国国家科学院院 刊89,4457-4461.(c)Griffiths,A.D.,等，(1994)欧洲分子生物学组织杂志13, 3245-3260。
3．Janda K.D.Lo,C-H.L.,Li,T.,Barbas,C.F.,Ⅲ,Wirsching,P.和Lerner, R.A.(1994)美国国家科学院院刊91,2532-2536。
4．(a)Soumillion,P.,Jespers,L.,Bouchet,M.,Marchand-Brynaert,J., Winter,G.和Fastrez,J.(1994)分子生物学杂志237,415-422.(b)Janda,K.D., Lo,L-C.,Lo,C-H.L.,Sim,M.M.Wang,R.,Wong,C-H.和Lerner,R.A.(1997) 科学275,945。
5．Gao,C.,Lin,C.H.,Lo,C-H.L.,Mao,S.,Wirsching,P.,Lerner,R.A.和 Janda,K.D.(1997)美国国家科学院院刊94,11777-11782。
6．Erickson,B.W.和Merrifield,R.B.(1973)美国化学会杂志(J.Am. Chem.Soc.)95.3750-3756。
7．Piles,U.,Zrcher,W.,Schar,M.和Moser,H.E.(1993)核酸研究21, 3191-3196。
8．Marriott,G.和Heidecker,M.生物化学(1994)33,9092-9097。
9．Kunkel,T.A.,Roberts,J.D.和Zakour,R.A.(1987)酶学方法 (Methods in Enzymology)154,369。
10．Hibler,D.W.,Barr,P.J.,Gerlt.J.A.和Inouye,M.(1985).生物化学 杂志260,2670-2674。
11．φrum,H.,Andersen,P.S.,φster,A.,Johansen,L.K.,Riise E.,Bjφ rnvad,M.,Svendsen,I.和Engberg.J.(1993)核酸研究.21,449l-4498。
12．Schultz,P.G.和Romesberg,F.E.未发表的结果。
13．Romesberg,F.E.,Spiller,B.,Schultz,P.G.和Stevens,R.C.(1998)科 学279,1929-1933。
14．Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)“分子克隆：实验 指南”第二版.，冷泉港实验室，冷泉港，纽约
15．Pei,D.,Corey,D.R.和Schultz,P.G.(1990)美国国家科学院院刊。 87,9858-9862。
16．(a)Lubkowski,J.,Hennecke,F.,Plückthun,A.和Wlodawer,A. (1998)自然结构生物学5,140-147.(b)Kremser,A.和Rasched,I.(1994)生 物化学33,13954-13958。
17．(a)O＇Shea,E.K.,Rutkowski,R.,Kim,P.S.(1989)科学243,538-542。 (b)O＇Shea,E.K.,Rutkowski,R.,Stafford,W.F.Ⅲ和Kim,P.S.(1989)科学 245,646-648。(c)O＇Shea,E.K.,Klemm,J.D.,Kim,P.S.和Alber,T.(1991)科 学254,539-544。(d)xZhou,N.E.,Kay,C.M.和Hodges,R.S.(1993)生物 化学32,3178-3187。
18．(a)Cotton,F.A.,Hazen,E.E.,Jr.,和Legg,M.J.(1979).美国国家科学 院院刊76,2551-2555。(b)Tucker,P.W.,Hazen,E.E.,和Cotton,F.A.(1978) 分子细胞生物学.22,67-77。(c)Sondek,J.和Shortle,D.(1990)蛋白质7, 299-305。(d)Hale,S.P.,Poole,L.B.和Gerlt,J.A.(1993)生物化学，32, 7479-7487。(e)Hynes,T.R.和Fox,R.O.(1991)蛋白质10,92-105。(f)Loll, P.J.,Quirk,S.,Lattman,E.E.和Gravito,R.M.(1995)生物化学34,4316- 4324。(g)Judice,K.,Gamble,T.R.,Murphy,E.C.,de Vos,A.M.和Schultz,P.G. (1993)科学261,1578-1581。
19．Ku,J和Schultz,P.G.(1994)生物医学和化学快报(Biomed.Chem. Lett.)2,1413-1415。
20．Tucker,P.W.,Hazen,E.E.,Jr.和Cotton,F.A.(1979)分子和细胞生物 化学(Mol.& Cell.Biochem.).23,3-16。
实施例2：用噬菌体展示型脂酶作催化剂，以寡聚DNA(DNA oligo)为 XY交换对分离脂酶变体。这是图8所述筛选方案的实施例。
噬菌粒构建
用绒毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂酶基因(SP40)作为模板，以Fwd: GTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTCTC GCAGGATCTGTTTAACCAGTTC,Rev:CAGTCACAGATCCTCGCGAATT GGTGCGGCCGCAAGACATGTCCCAATTAACCCGAAGTACC为引物进行 PCR,PCR产物用SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶消化，并插入SfiⅠ和NotⅠ消化 的噬菌粒pFab5C(φrum等.,1993,NAR 21:4491-4498)中。得到的噬菌 粒pFab-SP400携带一个融合基因，该融合基因包含(从N末端读)pelB信号 序列(划线部分)、成熟脂酶编码基因和始于氨基酸残基198的pⅢ基因(划 线部分)。pFab-SP400脂酶文库包括大量的这类噬菌粒构建体，其脂酶的氨 基酸序列有差异。
噬菌体颗粒的产生
按φrum等的方法略作修改(见上面)制备噬菌体颗粒。简言之，用 pFab-SP400脂酶文库感染大肠杆菌Top10F’，在含100μg/mL氨苄青霉素 的LB培养基中37℃振荡培养。在OD600为0.5时，加入酸性辅助噬菌体(一 种M13K07衍生物，在pⅢ的N末端上携带一段30’聚体酸性肽序列，见 Pedersen等，美国国家科学院院刊(1998)，出版中)，终浓度为1.5× 108cfu/mL,37℃温育20分钟。细胞沉淀并重悬于含5μMIPTG,100μg/mL 氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素的LB中，37℃振荡培养6-8个小时。沉 淀细胞并用PEG沉淀上清中的噬菌体颗粒，随后重悬于TBS(25mM  Tris-HCl,pH7.4,140mM NaCl,2.5mM KCl)中。重复沉淀和重悬步骤，最后将噬 菌体菌过滤。
碱性-连接子-DNA偶联物(“碱性-连接子-X”)的合成
合成光保护和F-moc保护的化合物F-moc-S-(2-硝基-4,5-二甲氧苯甲 基)-L-半胱氨酸1。将得到的粗产物真空充分干燥，直接用于合成碱性-连接 子-肽C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKK-LAQGGC(划线 的为碱性序列，黑体为光保护的半胱氨酸)。用5＇-硫醇(5＇-Thiol-Modifier C6, Glen Research)合成具有近似长度和序列5＇-SH-GGGAAGAACCC-3＇的寡聚 DNA，用反向HPLC纯化，从树脂中洗脱。按照Glen Research的实验方案 去除硫醇上三苯甲基保护的基团。冻干产物，溶于水并结合于碱性-连接子- 肽，方法如下：碱性连接子多肽和20倍摩尔过量的N,N＇-双(3-丙酰马来酰 亚氨基)-2-羟基-1,3-丙二胺在pH5.5的磷酸钠缓冲液中4℃氮气下反应约10 小时。用反向HPLC从反应混合物中纯化产物。将缓冲液调整为磷酸钠， pH7，加入NaCl以避免沉淀，然后加入上述的寡聚DNA，在室温下，溶液 于氮气中温育约10小时。产物用阴离子FPLC纯化，产物级分直接用于光 去保护步骤。在去保护步骤中，在C-末端半胱氨酸残基上2-硝基-4,5二甲 氧苯甲基保护的基团通过如下的光解方法去除：通过通入氩气使被保护的 偶联物(见上)脱气，然后在被隔膜盖上的小瓶中暴露于汞灯30分钟，产生 去保护的碱性-连接子-DNA偶联物。
DNA-pnp丁酸酯-柱基质偶联物的合成
通过例如使硫醇化的DNA与丁酸酯或软脂酸酯上的马来酰亚胺反应， 将具有近似长度和序列5＇-SH-CCCTTCTT-3＇和5＇SH-TTCTTGGG的5＇-硫醇 修饰的寡聚DNA与对硝基-苯基-丁酸酯或对硝基-苯基-软脂酸酯结合，而 制备该筛选方案中应用的Y-底物柱部分。然后通过与基质上功能性基团的 特异性反应，将产物结合到柱基质的正位或间位上。
碱性-连接子-DNA偶联物与噬菌体的共价结合
大约1010个噬菌体颗粒在含10mM EDTA、0.1％BSA、1mM巯基 乙胺(MEA)和100nmole碱性-连接子-DNA的4mL TBS中37℃温育60分 钟，然后PEG沉淀两次，重悬于脂酶缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.5,0.3mM CaCl,0.1mM MgCl2,0.1％Triton X-100)。
被碱性-连接子-DNA偶联物结合的噬菌体预分类
为去掉未被碱性连接子-DNA偶联物结合的噬菌体，将已如上述实施 了共价结合步骤的噬菌体加载在带寡聚DNA的亲和柱上，该DNA是碱性- 连接子-DNA-偶联物中DNA的互补序列(如GGGAAGAACCC序列)。收集 滞留于柱上的DNA。
分离文库中活性最强的脂酶。
其中“DNA-pnp丁酸酯”已与基质结合的柱在脂酶缓冲液中平衡。然 后，结合了碱性-连接子-DNA偶联物(见上面)的噬菌体颗粒被加载在柱上。 对每个收集组分进行滴定检测；含大量噬菌体的迁移最快的组分中应该含 有携带活性更强的脂酶的噬菌体。
实施例3：用可PCR扩增的DNA文库，以寡聚DNA作为XY交换对 (Y交换单元由两个寡聚DNA,Y1和Y2组成，它们在X寡聚体的结合部 位有重叠)分离RNA裂解性脱氧核酶变体。
DNA文库构建
用正义引物：5＇-GGAAGGGATGGTCACATGCA-3＇和反义引物：5＇-生 物素-GTCAGTTGCCAAGCTTACCG-3＇，和模板5＇-ggaagggatggtcacatgca CTAGTTAGGCTAGCTACAACGATTTTTCCcggtaagcttggcaactgac-3＇(小写部分 为引物位点，斜体部分为脱氧核酶为催化基序，划线部分为底物结合序列， 黑体为X交换部分)进行PCR。通过重复过链亲和素亲和柱(Genosys,The Woodlands Texas)，将PCR产物固定，用几个柱体积的洗涤缓冲液(1M NaCl,0.1mM EDTA,50mM Tris-HCl pH7.5)洗涤，用100mM NaOH洗脱 非生物素标记链。用乙醇沉淀单链DNA分子，用于下述基于柱的筛选方法。 上述(“野生型”)序列的ssDNA分子在依赖Mg2+的反应中裂解序列为 5＇r(GGAAAAAGUAACUAG)-3＇的RNA分子。脱氧-核酶文库(见下)包括大 量的这类ssDNA分子，它们在引发位点的序列中有差异。
Y-RNA靶-基质柱的制备
通过重复过链亲和素亲和柱，将序列为5’-生物素化-d(TACACG)- r(GGAAAAAGUAACUAG)-d(TTAGTGTCTCACCATCATCC)-3’和5’-生 物素化-d(TACACG)-r(GGAAAAAGUAACUAG)-d(TTAGTGTCTCGTGAAT CCCT)-3’(Oligos Etc.,USA)的两种DNA/RNA寡聚物混合的等克分子溶液 固定，用几个柱体积的洗涤缓冲液(1M NaCl,0.1mM EDTA,50mM Tris-HClpH7.5)洗涤。黑体部分为Y交换部分Y1和Y2。
分离ssDNA文库中活性最强的RNA-裂解性脱氧-核酶
将ssDNA文库(见上面)加载在链亲和素柱上，在该柱中已将Y1-RNA- 生物素和Y2-RNA-生物素靶底物(见上)固定在洗涤缓冲液中。用几倍柱体 积的洗涤液平衡后，用反应缓冲液过柱，持续一段时间。收集级分，并测 定DNA含量(例如用紫外检测)。包含显著量DNA的最快迁移级分应含有 携带最强活性、镁依赖的RNA-裂解性分子的DNA。
实施例4：催化羟醛形成的酶的最优化。在这个实施例中，X单位包 含一个多组氨酸环和相关金属离子：Y单位由双配位配体(乙二胺)组成。
一种酮底物与乙二胺(EDA)部分结合，该酶携带一个多组氨酸环。当 酮和酶在有适当金属离子(如Fe)存在的条件下混合时，多组氨酸与金属离 子将形成动力学和热力学稳定的相互作用。EDA-酮将竞争多组氨酸-结合金 属的剩余两个配位位点。有醛缩酶活性的酶可促进酮与带乙醛的酶在柱缓 冲液中的结合，以形成羟醛产物。通常，该羟醛有一定频率的脱水现象， 从而形成一个α,β-不饱和酮。这一偶联的烯烃能与柱上的游离硫醇基发生 Micheal加成反应，从而将酶固定。然而，缓冲液中的EDA-酮偶联物将与 固定的酶交换，将酶以其原始底物结合形式释放。在这个过程中，His*金 属-EDA代表X-Y，产物结合部分是亲核体，它在水分消失后捕捉产物。因 而所述筛选方案将筛选能有效催化羟醛和脱水反应的酶。
实施例5：
适合于引入实施例1所述噬菌体展示系统的XY交换对的实施例。
如实施例1中所述的噬菌体展示系统中XY的“实施方案”：
方案1：按照实施例1的指示合成碱性-连接子-X，不同的是此处X是 与碱性连接子肽结合，不是与底物结合(见上面实施例2)。如实施例1中描 述的方法，将碱性-连接子-X偶联物与pⅢ(辅助噬菌体上)上酸性伸展区交 联(见图12)。将Y和底物偶联，并进行筛选(见上面实施例2)。
方案2：将4、5或6个组氨酸引入辅助噬菌体pⅢ的N末端，或者引 入到pⅢ的一个暴露的环上(His4和金属离子组成X部分)。通过一个弹性 连接子(如聚乙二醇)使底物与金属配体结合(如双配位体或三配位体)。在指 定金属离子存在的条件下，混合噬菌体和金属配位的底物，然后进行筛选(见 图12B)。
方案3：将酸性肽序列或His4肽序列插入到噬菌体的酶-pⅢ融合蛋白 上，优选在连接pⅢ和酶的连接子上插入。如上继续。
常规蛋白中的XY“实施方案”
方案1：将酸性肽或His4序列引入到酶的一个暴露的环上，或其C-或 N-末端上。如上继续。
方案2：在酶上引入一个唯一的半胱氨酸残基(在DNA水平上)，通过 硫醇特异性反应(如，二硫键的形成、马来酰亚胺加成反应)与X部分结合， 如上继续。
实施例6
特别适合于引入噬菌粒-肽、多聚核糖体-肽或mRNA-肽系统中的一个 交换对的实施例。在下面叙述了交换对-底物如何与噬菌粒系统(Schatz 等，.1996，酶学方法，第267卷，171-191页)、多聚核糖体-肽系统(Mattheakis 等，1994，美国国家科学院院刊，第91卷，9022-9026页；He和Taussig, 1997，核酸研究，第25卷，5132-5134页)或mRNA-肽系统(Roberts和Szostak, 1997，美国国家科学院院刊，第94卷，12297-12302页)中的酶结合。在这 里以mRNA-肽融合系统为例。
设计DNA模板，使mRNA-蛋白融合体中mRNA的一部分成为X单 位(如，在模板DNA中包括DNA序列5＇-GCCGAAGCGCAATGAAGGGCAA CCCG-3＇)，见图13A。使指定底物与DNA Y单位结合(例如将底物与Y1 3’ -TTACTTCCCGTTGGGC-5’和Y2 3＇-CGGCTTCGCGTTACTT-5＇两种寡聚 体的混合物结合)。使mRNA-肽融合体沉淀后，将mRNA-肽融合体(携带X 单位)和底物偶联物(携带Y单位)混合，例如通过与产物结合柱混合进行底 物再加载筛选(见图2)。
或者，X单位可以是连结mRNA和编码肽的连接子的一部分(如在连 结mRNA和肽的连接子中包括序列5＇-GCCGAAGCGCAATGAAGGGCAA CCCG-3＇)，见图13B。然后与底物偶联物混合，如上进行底物再加载筛选。
实施例7：
在产生较低活性蛋白酶变体的细胞背景中富集产生较高活性蛋白酶的 细胞
在这个实施例中，独立单元包括一个细胞、通过XY交换单位结合到 细胞表面的底物和由细胞产生并分泌的酶(图14)。在周围介质中游离的Y- 底物持续取代结合于细胞表面的底物。从而因所分泌的酶的局部浓度在结 合酶分泌细胞的底物附近高于结合任何其它细胞的底物附近，故结合活性 酶分泌细胞的产物比结合低活性酶分泌细胞的产物更多。
底物可以通过多种途径结合于细胞表面。例如，磷脂、脂肪酸、固醇、 胆固醇酯等可与靶反应的底物一起衍化。当与细胞温育时，这些分子轻易 地定位于膜内部，并且在细胞表面暴露底物。或者底物可以和与细胞表面 物质相互作用的交联试剂一起衍化。最后，底物可与结合于膜组分(如多糖 或膜蛋白)的结构(如蛋白、抗体等)一起衍化。
以下述例子举例说明本原理，其中独立单元由细胞(如芽孢杆菌)、结 合的底物(肽)和分泌的酶(蛋白酶)组成。His6-金属-IDA或His6-金属-NTA 复合物作为XY交换单位。筛选是在柱中进行。用含蛋白酶靶序列的肽包 被柱基质，肽的一端与柱基质结合，另一端携带一个多组氨酸(His6)。
实验按如下步骤进行。分泌目的蛋白酶(如地衣芽孢杆菌C组分或市售 Savinase蛋白酶)的芽孢杆菌细胞在指数生长期收集，重悬于适当的缓冲液 中，用可以与细胞表面组分交联的双功能分子共同温育。双功能分子可以 是与亚胺基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)部分结合的羟基琥珀酰亚胺 (NHS)。NHS与细胞表面共价锚定IDA或NTA部分的伯胺反应。
用靶向目的蛋白酶的肽(例如靶向C组分时，肽序列为 IELSEPIGNTVCHHHHHH)包被或衍生用于分离细胞的适当柱基质(如 Sepharose或Sephadex)。该肽的一端携带多组氨酸延伸区，另一端结合于 柱基质(例如通过N末端氨与NHS活化的Sepharose(Pharmacia Biotech)的相 互作用)。
将适当的缓冲液中(例如，加入了Ni++、Zn++、Cu++或Co++的2×TY或 LB培养基；温度为35-50℃)的IDA-或NTA修饰细胞加载在肽修饰柱上， 流速保持在0.5mL/min以下。
形成His6-金属-IDA(或His6-金属-NTA)复合物，并因此使蛋白酶底物 结合于细胞。如果细胞分泌活性蛋白酶，这些酶裂解靶位点并从柱基质中 释放细胞；还有，His6-金属-IDA(或His6-金属-NTA)复合物迅速被平衡，导 致用新的底物持续取代底物或产物。因此分泌更有效的酶的细胞或分泌活 性酶更多的细胞，首先在柱的底部洗脱。
按如下步骤检测了其原理。用上述方法检测，分泌大量蛋白酶变体的 细胞或分泌不同量的相同蛋白酶的细胞，并且按上述方法进行底物再加载。 分泌更有效酶的细胞或分泌更多活性酶的细胞首先洗脱。
该原理如下检验。分泌多种蛋白酶变体的细胞，或分泌不同量的同种 蛋白酶的细胞如上述处理，并如上述实施底物再加载方案。分泌更有效酶 的细胞或分泌最多蛋白酶的细胞被首先洗脱。
用固定在柱基质上和细胞表面IDA-(或NTA-)偶联物上的底物浓度控制 筛选的严谨性。在不同条件如盐浓度、pH值或温度下表达或活性改善了的 变体可以用这种方法分离。
实施例8
用DNA/RNA杂合二聚体作为XY交换对，以Y-单位的一部分作为靶 底物，分离锤头型核酶。
锤头型核酶是天然核酶，其裂解特定磷酸二酯，产生3＇-环磷酸和5＇羟 基末端，速率(Kcat)接近1min-1(Stage-Zimmermann等，1998,RNA第4卷， 875-89页)。其特异性由核酶和靶序列之间简单的Wason-Crick碱基配对介 导，因为裂解对靶序列的唯一要求是U后的碱基为A、U或C，所以事实 上，锤头型核酶可以被设计来裂解任何RNA分子。然而，锤头型核酶用于 治疗有一个主要缺点，当为了增加特异性而延长两个二聚体时，结束速率 显著下降，并且核酶不能转化。为了寻找显示增加的裂解率的锤头型核酶 变体，其他人在含随机序列的RNA库中进行了体外筛选(Vaish等，1997， 生物化学，第36卷，6495-501页)。然而在所有已报道的研究方案中的筛 选方案都是以单轮裂解为基础。利用底物再加载策略，核酶必须从待由柱 中洗脱的固定基质中将其本身释放多次。为了使核酶裂解后迅速释放底物， 在下述的实验中优化了盐浓度、温度和二聚体长度。释放的核酶迅速结合 于被两个由5bp螺旋堆积成的共轴所稳定的新靶标上。Y被核酶裂解成两 半，因此使XY相互作用不稳定，由此完成了快速X-Y交换(见图3A)。当 缓冲液持续流过柱时，更快裂解的核酶首先洗脱。
为了消除潜在的对RNA分子的筛选，即由于竞争性的内部结构或错误 折叠，这些RNA与底物结合慢(因此被迅速洗脱)，可以选择进行预筛选(图 15,B)，筛选出与非裂解性DNA-底物寡聚物有效相互作用的分子。
为了证实其原理，我们在核酶的保守核心区选择了7个位点进行随机 化(见图15)。这相当于16384个不同的分子，其中一个相应于野生型锤头 型核酶，其裂解速率约为1min-1(Stage-Zimmermann等，1998,RNA，第4 卷，875-89页)。因为在下述的实验中我们的文库包含1013个以上的RNA 分子，我们预期能分离到野生型核酶或至少具有野生型核酶速率的核酶。
实验概述
材料：
1．用传统技术(用随机合成的DNA寡聚物作为模板，用T7 RNA聚 合酶在体外转录)制备RNA文库(约100微克)。文库用PAGE纯化，重新溶 解于柱缓冲液中，分成每份10微克，-80℃保存。
2．用于结合底物寡聚体(通过2-氨基-1-(2-pyrridyldithio)-乙烷)的 NHS活化的Sepharose和硅化玻璃柱(0.2cm×10cm)。
3．通过传统的化学方法合成底物寡聚RNA(图15)，并用HPLC纯 化。在5＇末端连结一个5＇-硫代磷酸-HEG-间隔臂(5＇硫代磷酸-HEG间隔臂- AGCUGUCACUCC-3＇)。
4．基于脱氧核苷酸的反向筛选DNA寡聚体(图15B)是通过传统的 化学方法合成的(5＇硫代磷酸-HEG-间隔臂-AGCTGTCACTCC-3＇)。
5．柱缓冲液(10mM MgCl2,50mM Tris/HCl pH7.5)
实验步骤；
(可任选进行DNA反向筛选-步骤2-4)
1．100nmol RNA底物寡聚体或100nmol反向筛选DNA寡聚体被加 载在1毫升床体积的NHS活化的sepharose上，所述Sepharose用活化的二 硫化物衍生化，其在一个直径0.2厘米长10厘米的硅化玻璃柱中，并在使 用前用5倍柱体积的柱缓冲液新鲜平衡。
2．RNA文库加载在所述DNA寡聚体柱上，用10倍体积的柱缓冲 液洗涤，20℃，流速为1毫升/分钟。
3．柱温度调节为60℃，用2倍柱体积的水洗脱RNA。
4．缓冲液调整为0.25M NaOH pH6.0，RNA用2.5倍体积EtOH 沉淀并重新溶于20mL柱缓冲液。
5．将该样品在37℃温育5分钟，使RNA复性，小心地加载在所述 RNA柱上。为了随后筛选的优化，应该将温度调节在25-50℃范围之内。 流速应保持在0.5mL/min以下，以便允许所述核酶的底物再加载。
6．从柱底部收集样品，用标准方法分别检测核酶活性(Vaish等， 1997，生物化学，第36卷，6495-501页)。
7．利用3＇端互补引物将在最早收集到的表现出核酶活性的组分池中 的核酶进行逆转录，并用上游和下游配对引物进行PCR扩增。在上游引物 中包括T7启动子，它可造成随后转录。将DNA池克隆在质粒中，每个克 隆均测序分析。每个克隆子的核酶通过T7转录而制备并检测。
实施例9：展示His标记蛋白的噬菌体的预富集。
某些蛋白在丝状噬菌体上展示是困难的。尤其是大分子蛋白或对大肠 杆菌有毒性或生长抑制作用的蛋白通常具有较低的展示效率，即制备的大 多数噬菌体颗粒在表面不携带pⅢ融合蛋白。仅在千分之一的噬菌体上展 示融合蛋白的低展示效率已见报道(Jestin等，1999,Angew.Chemi.Int.Ed. 第38卷，1124-1127页；Demartis等，1999，分子生物学杂志，第286卷， 617-633页)。在这些情况中，非特异性背景将会较高，因为携带pⅢ融合 蛋白之编码DNA但不在表面展示该融合蛋白的噬菌体严重过量。为了克服 这个潜在的问题，我们在pⅢ包膜蛋白和所述酶之间引入了一个组氨酸标 签，使得可用Ni-NTA柱层析纯化展示His-标记蛋白的噬菌体。
在下面阐述的与组氨酸标签用法相似的其它标签包括，intein-几丁质结 合结构域域融合蛋白(Chong等，1997，基因，第192卷，271-281页)，FLAG 肽(Slootstra等，1997，分子多样性，第2卷，156-164页)和麦芽糖结合蛋 白(Pryor和Leiting,1997，蛋白表达和纯化，第10卷，309-319页)。
展示脂酶-His-pⅢ或纤维素酶-His-pⅢ融合蛋白的噬菌体的Ni-NTA 柱纯化
用600μl“50mM pH8.0磷酸钠缓冲液，300mM NaCl,1mM咪唑， 0.05％BSA”平衡Ni-NTA离心柱(Qiagen Spin Kit)(700G离心2分钟)。400 μl噬菌体制剂(见实施例10和11)(约1012个噬菌体颗粒)中加入100μl“250 mM pH8.0磷酸钠缓冲液，1.5M NaCl,,0.25％BSA”，和4μl100mM咪唑， 将溶液加载在预平衡过的柱上，200G离心4分钟。用600μl“50mM pH8.0 磷酸钠缓冲液，300mM NaCl,20mM咪唑，0.05％BSA”洗涤两次(分别为 200G离心4分钟和700G离心2分钟)。然后噬菌体用3×333μl“50mM pH 8.0磷酸钠缓冲液，300mM NaCl,250mM咪唑，0.05％BSA”(700G离心2 分钟)洗脱。然后用PEG沉淀999μl洗脱物，重悬于400μl“50mM pH8.0 磷酸钠缓冲液，300mM NaCl,1mM咪唑，0.05％BSA”。将溶液加载在新 的离心柱上，重复上述过程，只是将最后的PEG沉淀物溶于50μl pH8.0 TE 缓冲液中。这个步骤使展示His-标记蛋白的噬菌体富集约500倍。
实施例10：在过量的低活性脂酶变体环境中，用噬菌体展示的脂酶和 DNA寡聚体作为XY交换对，富集野生型脂肪酶。
这个筛选方案的实施例在图10B中描述。
噬菌粒构建
使噬菌粒ph8(野生型脂酶)和ph18(脂酶S146A突变体)：DNA寡聚体 “Not-His6-正义链”(5’-GGCCGCACCAGGAGGAGGATCACATCACCATC ACCATCACTC-3’)和“Not-His6-反义链”(5’-GGCCGAGTGATGGTGAT GGTGATGTGATCCTCCTGGTGC-3’)退火，将该双链产物连接至NotⅠ消 化的pFab-SP400(见上述)和pFab-SP400-S146A(除了在146位点携带一个丝 氨酸到丙氨酸的突变使其活性降低至少100倍外，与pFab-SP400相同)。得 到的噬菌粒ph8(野生型脂酶)和ph18(脂酶S146A突变体)携带的氨基酸序列 见SEQ ID NO 2(野生型)。得到的融合基因包括(从N末端读)pelB信号序列 (划线部分)、成熟脂酶编码基因(wt或S146A突变体)、插入序列(斜体)和6 个组氨酸(黑体)以及始于氨基酸残基196的pⅢ融合蛋白(划线)。
噬菌体颗粒的产生
根据φrnm等的方法(稍作修改)制备噬菌体颗粒(见实施例2)。简言之， 用噬菌粒ph8(野生型脂酶)、噬菌粒ph18(脂酶S146A突变体)或噬菌粒 ph13(阴性对照，携带组氨酸标记的纤维素酶，而不是脂酶，但是其它方面 与ph8和ph18结构相同)转化大肠杆菌XL1blue，转化的细胞在含100微克 /毫升氨苄青霉素、5微克/毫升四环素和2％葡萄糖的2×YT培养基中37℃ 振荡培养。在OD600值为0.5时，加入酸性噬菌体(一种M13K07衍生物， 在pⅢ蛋白的N末端携带30＇聚体酸性肽延伸区，见Pedersen等，美国国 家科学院院刊(1998)，第95卷，10523-10528页)至终浓度为1.5×108cfu/mL, 在37℃温育20分钟。离心细胞并重悬于含5μM IPTG(对ph13为100mM IPTG),100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素的2×YT培养基中，30 ℃振荡培养3小时。离心细胞，上清中的噬菌体颗粒经PEG沉淀3次，重 悬于400微升TE缓冲液中(10mM Tris-HCl pH8；1mM EDTA)。
在碱性-连接子-X和噬菌体共价结合之前(见下面)，按照实施例9的方 法，富集展示脂酶变体的噬菌体。这种方法一般可获得最初噬菌体之0.04- 0.2％的回收率；我们估计超过90％的回收噬菌体展示脂酶。
在噬菌体上展示组氨酸标记的活性脂酶
为了证实制备的噬菌体展示脂酶-pⅢ融合蛋白，用抗组氨酸标记的抗 体(五-His抗体，Qiagen)、抗脂酶蛋白抗体或作为阴性对照的抗无关淀粉酶 抗体包被微滴板的各个孔。每孔加入大约109个展示非组氨酸标记的野生型 脂酶(ph13)、组氨酸标记的野生型脂酶(ph8)或组氨酸标记的脂酶S146A突 变体(ph18)的噬菌体。结果表明同预期的一样，ph8和ph18均展示组氨酸 标签，非组氨酸标记的野生型脂酶没有明显地结合于抗His抗体(见图16)。 同预期地一样，突变和野生型脂酶均被固定在抗脂肪酶抗体上。最后，没 有脂肪酶变体被固定在无关抗体上。因此可以得出结论，ph8和ph18编码 可在噬菌体表面正确折叠的脂酶-组氨酸标签-pⅢ融合蛋白。组氨酸标记的 噬菌体(ph8和ph18)按实施例9中叙述的方法通过Ni-NTA柱纯化。富集步 骤预期产生几乎完全由展示His-标签蛋白的噬菌体组成的噬菌体群体。这 个过程包括两个连续的Ni-NTA柱纯化步骤，第一轮可重复性地回收输入 量的0.2-0.3％，第二轮回收输入量的10-20％。这些数目说明得到的主要是 展示蛋白的噬菌体，并且最终的噬菌体群体几乎由均展示蛋白的噬菌体组 成。最后，在亮绿平板检测中，含野生型脂酶-His-pⅢ融合蛋白的细胞显示 脂酶活性，而含脂酶S146A-pⅢ融合蛋白的细胞则无活性。因此可以暂时 认为ph8展示有活性的正确折叠的野生型脂酶；ph18-噬菌体展示正确折叠 的活性降低的脂酶S146A突变体。
碱性-连接子-DNA(“碱性-连接子-X”)偶联物的合成。
碱性连接子肽C(GGS)4AQLKKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLA QGGC与DNA寡聚体“X-26聚体”(HS-5＇-ATTAAATTAGCGCAATGAA GGGCAAC-3＇)的5＇硫醇结合，并被光去保护，按Pedersen等(美国国家科学 院院刊(1998),95,10523-10528)描述的方法进行。划线的序列组成X部分。 得到的偶联物称为“碱性-X-26聚合体”。
Y-底物-生物素偶联物的合成
制备异功能性分子(39)(见图17)，其在一端含马来酰亚胺部分，在另一 端含生物素，在中间有作为脂酶底物的一种酯。ω-氨基十二烷酸首先以其 与生物素-NHS偶联的甲基酯形式(40)被保护，随后水解，释放生物素-酸 (41)。通过马来酰亚胺与6-羟基己胺的反应，制备马来酰亚胺醇。在(41)和(42) 之间酯化，产生靶底物(39)。最后，化合物(39)与Y1 DNA寡聚体(5＇-SH- AATAAATAAACGGGTTGCCCTTCATT-3＇)或Y2 DNA寡聚体(5＇- TTCATTGCGCTTCGGCAAATAAATAA-SH-3＇)结合。划线序列组成Y1和Y2 交换部分。
碱性-连接子-DNA偶联物与噬菌体的共价结合
X-26聚体偶联物(见上面)与Ni-NTA纯化的噬菌体(见上面)共价结合， 例如可通过上面实施例1的方法。为了确保偶联度较高，从偶联反应中得 到的噬菌体可选择再次纯化。这包括噬菌体与链亲和素包被的磁珠退火， 所述磁珠上固定了与X-26聚体互补的生物素化寡聚体。洗涤几次除去没有 与X-26聚体结合的噬菌体，增加温度，使DNA二聚体解链并释放结合的 噬菌体。
分离活性更高的脂酶
Y1-底物-生物素和Y2-底物-生物素偶联物与用链亲和素衍生的基质(例 如固定在4％琼脂糖上的链亲和素，Sigma)混合，浓度为1-10μM，在室温 下温育1-2小时。洗涤柱子，在缓冲液中加入与26聚体偶联物结合的噬菌 体，在20-35℃温度下，这种缓冲液允许脂酶有活性以及有效的退火(其含 有MgCl2和CaCl2)。或者直接在柱上进行结合步骤。与噬菌体结合的X-26 聚体DNA与Y1-或Y2-底物一生物素分子退火，通过底物固定在基质上。 展示有催化活性的脂酶的噬菌体将裂解底物，并在柱子中持续迁移，依靠 与另一个Y1-或Y2-底物的相互作用，交换反应可以发生，并将再一次固定 噬菌体。催化活性低的脂酶与给定底物的结合时间长，因此催化活性高的 噬菌体比活性低的噬菌体迁移速度更快，因此可以先在柱底部收集。
实施例11：用纤维素酶的纤维素结合结构域(CBD)作为X单位，用 Avicel(纤维素)基质作为底物和Y-单位，在低活性突变纤维素酶的环境中富 集在丝状噬菌体上展示的野生型纤维素酶C6B。
噬菌粒的构建
噬菌粒ph7(克隆载体)：
DNA寡聚物“Not-His-正义链”(见上面)与“Not-His6-反义链”(见上 面)退火，将双链产物连接至用NotⅠ消化的pFab5c.His(φrum等，1993，核 酸研究，第21卷，4491-4498页)，生成噬菌粒ph7。基本上，这可导致在 pⅢ包膜蛋白的N末端上加入氨基酸序列APGGSHHHHHHS(划线部分为组 氨酸标签)。
噬菌体ph13(野生型纤维素酶)
在编码Humicola insolens的野生型纤维素酶C6B的合成DNA构建体 上进行PCR，引物为：
NcoⅠ-纤维素酶-fwd:5’-CGACATGCCATGGCGCAGTCCGGCAAT CCGTTCTC
NotⅠ-纤维素酶-bck:5’-CCTTTAGAGCCTGCGGCCGCGCCTCCTGGG AGGCACTGGCTGTACCAC
产物用NcoⅠ和NotⅠ消化，并引入NcoⅠ和NotⅠ消化的ph7(见上面)， 得到ph13。
噬菌粒ph14(纤维素酶D316A)：
构建方法与ph13一样，只是用带有D316A突变的DNA分子作为模板。
噬菌粒ph16(纤维素酶D139A,D136A)：
首先进行两个PCR反应，其中一个PCR的模板含D316A突变(见上面)， 引物为：
D139A-fwd:5’-GCTGTGATTCTGGAACCCGCGGCCATC-GGCAAC ATGGTGAC
NotⅠ-纤维素酶-bck:5’-CCTTTAGAGCCTGCGGCCGCGCCTCCT GGGAGGCACTGGCTGTACCAC。
另一个PCR用相同的模板，但引物为：
NcoⅠ-纤维素酶-fwd：(见上)
D139A-bck:5’-GTCACCATGTTGCCGAT-GGCCGCGGGTTCCAGAA TCACAGC
这两个PCR产物用琼脂糖凝胶纯化，并作为模板，以“NcoⅠ-纤维素- fwd”和“NcoⅠ-纤维素-bck”(见上面)为引物进行PCR反应。得到的PCR 产物用NcoⅠ和NotⅠ消化，并引入NcoⅠ和NotⅠ消化的ph7(见上面)。得到 的融合基因序列见SEQ ID NO 3(给出野生型序列；以pelB的第一个密码子 开始，以pⅢ蛋白的终止密码子结束)这对应于下面的融合蛋白(从N端开 始读)：pelB肽，纤维素C6B，组氨酸连接子，pⅢ包膜蛋白。
噬菌体ph17(纤维素结合结构域，CBD)：
用编码Humicola insolens的野生型纤维素酶C6B的合成DNA(见上面) 和引物“NcoⅠ-CBD-fwd”(5＇-CGACATGCCATGGCGGCGAGAGGCGCTGCC GGTTC-3＇)和“NotⅠ-纤维素酶-bck”(见上面)进行PCR。得到的PCR产物 用NcoⅠ和NotⅠ消化，并引入NcoⅠ和NotⅠ消化的ph7(见上面)，得到ph17。 得到的融合基因序列见SEQ ID NO 4。这对应于下面的融合蛋白(从N末端 开始读)：pelB引导肽，CBD结构域，组氨酸标签，pⅢ包膜蛋白。
噬菌体颗粒的制备
按实施例10中描述的方法制备噬菌体，不同的是在用辅助噬菌体超感 染之后加入100μM IPTG。
组氨酸标记的活性纤维素酶在噬菌体上被展示
为了证实制备的噬菌体展示纤维素-pⅢ或CBD-pⅢ融合蛋白，用抗组 氨酸标记的抗体、抗纤维素酶C6B蛋白抗体或作为阴性对照的抗无关脂酶 (SP400，见实施例2)的抗体包被微量滴定板的各个孔。将大约108个展示野 生型纤维素酶(ph13)、纤维素酶D316A(ph14)、纤维素酶D316A, D319A(ph16)、CBD(ph17)或无关脂肪酶(ph3)的噬菌体，加入到各个孔中。 结果表明ph13、ph14、ph16和ph17均展示His标签，见图18。全长纤维 素酶(ph13、ph14、ph16)与抗纤维素酶抗体结合，而CBD结构域不与这个 抗体结合。与预期的一样，阴性对照(ph13)不与抗-His或抗纤维素酶抗体结 合。同样，纤维素酶和CBD展示噬菌体不与抗脂酶抗体结合，而展示脂酶 的噬菌体(ph13)则可结合。因此，可得出结论，ph13、ph14和ph16噬菌粒 编码纤维素酶-组氨酸标签-pⅢ融合蛋白，并很可能在噬菌体表面正确折叠。 His-标记的噬菌体(ph13、ph14、ph16和ph17)用实施例9中的方法经过 Ni-NTA柱纯化。富集步骤预期可以产生一个噬菌体群体，该群体几乎完全由 展示His标记的蛋白的噬菌体组成。过程包括两步连续的Ni-NTA柱纯化， 第一轮可重复地回收输入量的不到0.1％，第二轮回收输入量的近20％。这 些数目说明得到的主要是展示蛋白的噬菌体，并且最终的噬菌体群体几乎 均由展示蛋白的噬菌体组成。最后，在液体CMC-刚果红纤维素酶活性检 测中，进一步证实携带表达野生型纤维素酶的噬菌粒的XL1 blue细胞提取 物，显示纤维素酶活性(数据未显示)，而表达突变的D316A纤维素酶的细 胞提取物不显示该活性。因此认为ph13展示有活性的正确折叠的野生型纤 维素酶；ph14和ph16-噬菌体展示正确折叠的纤维素酶活性降低的纤维素 酶突变体。
在噬菌体展示的纤维素酶环境中底物再加载的原则
Humicola insolens中的纤维素酶C6B由两个结构域组成，具有催化活 性的核心结构域和通过一个约25个氨基酸残基的连接子与该核心连接的纤 维素结合结构域，CBD。因此我们推测当CBD对纤维素的亲和力适当减弱 时，有可能造成CBD对纤维素上不同位点的合理交换，并且有可能建立一 个基于这种交换的以柱为基础的筛选方法。在这样的条件下，CBD将结合 纤维素上的一个位点，并因此将核心酶固定于这个结合位点附近(图19)。 活性酶可以裂解与其CBD结构域结合的纤维素束，因而使其本身释放。而 活性较低的酶才被固定在纤维素上直到相应CBD脱离其结合位点。在一个 极端情况中，如果CBD与纤维素的结合非常牢固，纤维素酶将通过裂解使 其本身从柱中释放，并以CBD-纤维素束复合物的形式从柱中洗脱。在这种 情况下，只需要一次底物的转化，因此对更好的纤维素酶的选择压力小。 在另一个极端情况中，CBD-纤维素相互作用非常弱，以至于在柱上的固定 时间是由CBD-纤维素复合物的半衰期决定的，而不是酶的转化率决定的。 在这种情况下，对活性更高的酶几乎不存在选择压力。
在中性pH值条件下，纤维素酶C6B的CBD与酸处理的AvicelTM(微 结晶纤维素，Merck)有高度的亲和力，在高pH值时，亲和力低。在pH值 11.6以上时，纤维素酶能够从AvicelTM中洗脱。因此我们开始定义条件， 在这个条件中，纤维素酶是有活性的，并且为了获得多次转化系统，CBD 的结合性适当降低，这将区别不同比活性的纤维素酶。
展示的纤维素酶的CBD结构域与AvicelTM柱材料结合
我们希望用CBD-纤维素相互作用作为一个XY交换单位的简单模型。 因此，检测了CBD结构域与磷酸膨胀的AvicelTM可逆结合的能力。约1mg 酸膨胀的AvicelTM和Sephacryl混合，得到约2mL的柱床体积。Ni-NTA纯 化的ph17噬菌体(见上)在pH7.5磷酸钠(Naphosphate)缓冲液中再加载于凝 胶上，并在pH值逐渐增高的条件下(同下面的条件一样)，用几倍柱体积的 缓冲液洗涤。展示无关脂酶的对照噬菌体在第一个洗脱级分中收集，直到 几倍柱体积的pH值11.6的磷酸钠洗脱之后，ph17噬菌体才被洗脱(数据未 显示)。因此在中性pH下，在噬菌体上展示的CBD结构域与酸膨胀的Avicel 结合，在pH值11.6的条件下，亲和力将下降，CBD被洗脱下来。
活性纤维素酶的富集超过低活性纤维素酶
接下来，我们在AvicelTM/SephacrylTM柱上加载了约1∶1混合的Ni-NTA纯化的展示野生型纤维素酶(ph13)或D139A,D316A突变的纤维素酶的噬 菌体(ph16)，制备方法同前。在这个实验中温度为50℃。上样缓冲液为pH7.5 20mM磷酸钠缓冲液，0.05％BSA,0.05％吐温。用1倍柱体积的pH7.5 20mM磷酸钠缓冲液，0.05％BSA,0.05％吐温，500mM NaCl和1倍柱 体积的pH8.5 20mM Tris-HCl,0.05％BSA,0.05％吐温，200mM NaCl洗 涤之后，在接下来的6个柱体积中将pH值增加到10.6。最后pH值增加到 11.6。收集级分，检测每个级分中噬菌体的效价。通过PCR反应，然后用 PstⅠ消化并在琼脂糖凝胶上分析，检测ph13∶ph16的比率。D136A突变引 入了一个PstⅠ位点，因而用PstⅠ消化将产生两个较小的片段。在琼脂糖凝 胶上，上面和中间条带的强度比因此相当于指定级分中野生型纤维素酶 (ph13)对突变型纤维素酶(pH16)的噬菌体相对数量。在输入物中ph13∶ph16 的比率约为0.7。在凝胶上估计，级分1-2(相当于pH值7.5)和级分4-11(相 当于pH值10.6/11.6)中的ph16噬菌体过量1-10倍，级分3中ph13∶ph16 的比率约为1.5。因而在一个低活性纤维素酶(双突变，ph16)的环境中，获 得了高活性酶(野生型，ph13)的近两倍富集。应该指出的是，所得噬菌体的 52％在级分2-4中回收，在级分1和7-11中为17％，在pH值11.6的条件 下，30倍柱体积洗涤后，仍然有31％的噬菌体固定在柱上。
在相似的实验中，我们没有从ph14单突变体环境中富集到野生型纤维 素酶。我们重复观察到筛选的两个阶段(即，在第一个级分中ph16过量回 收，然后在一个或两个级分中ph13组分过量回收，在剩下的级分中ph16 过量回收)。这两个阶段的存在，证实了这样的推论，即当展示纤维素酶的 噬菌体通过柱时，至少发生两个反应：CBD结构域与纤维素结合，裂解纤 维素。
在这个实验中，CBD-Avicel相互作用代表一个XY交换单位。这个简 单的XY单位可能没有达到最佳：首先，大部分大分子的相互作用是用慢 动力学描述的，在这个实施例中这导致慢速底物再加载。第二，就启始速 率和结束速率而言，CBD和纤维素的结合是通过适当的pH值选择进行最 优化的，因为pH值也影响纤维素酶的催化活性，所以这种方法不理想。这 种结合可能可以用不显著影响纤维素酶活性的其它方式调节，例如盐浓度 或高浓度去污剂的存在。如果CBD-纤维素相互作用的亲和力和/或动力学 可通过这种方式进一步优化，这应该可以增加筛选的严谨度，并可以分离 活性水平仅有轻微差异的酶(在上述实验中用野生型和单突变纤维素酶代 表)。
或者可以将实施例10的方法应用于噬菌体展示的纤维素酶：ⅰ)用酸性 辅助噬菌体挽救噬菌体(ph13、ph14、ph16、ph17等)，ⅱ)Ni-NTA纯化展示 纤维素酶变体的噬菌体，ⅲ)将碱性-X-26聚体与噬菌体结合，ⅳ)在柱上固 定Y-底物偶联物(在这里底物指纤维素，例如通过β1-4键连接的2或6个 葡萄糖单位，ⅴ)进行底物再加载方案。这可能增加底物再加载的效率，并 可分离活性有稍许差异的纤维素酶。
我们断定即使用这种简单CBD-纤维素交换单位，也有可能从低活性纤 维素酶(ph13)背景中富集高活性纤维素酶(ph16)。
实施例12
用多组氨酸标签作为X单位，用亚氨基二乙酸作为Y单位，在过量、 低活性的RNase A肽变体背景中在珠上富集野生型RNase A肽。
为了在合成性组合文库领域中检测底物再加载原理，我们设计了一个 涉及RNase A肽的简单实验。合成了两个C末端生物素化的肽，肽1和肽 2，如在(Gutte等，1971，生物化学杂志，第246卷，1922-1941页)中概述。 除了N末端加入了六个组氨酸，肽1携带野生型RNase A序列。除了引入 突变使肽的RNA酶活性完全或部分消除(如用丙氨酸替换活性位点组氨酸， H12和H119中的一个或两个)以外，肽2的序列与肽1相同。所述肽去保 护之后，从支持相中裂解，如(Gutte等，1971，生物化学杂志，第246卷， 1922-1941页)所述再折叠，通过C末端的生物素部分固定于直径约10-100nm 的链亲和素包被珠上。通过将链亲和素固定于N-羟基-琥珀酰亚胺活化的胶 乳珠(Polysciences Inc.)上，制备这种包被珠。制备一个柱子(如Sepharose或 Sephadex)，其柱基质一端携带被固定的RNA分子，另一端与亚氨基二乙 酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)结合。这可通过下面的方法制备，即合成RNA 寡聚体(如20个核苷酸长)，在一个末端加上硫醇基，另一个末端加上生物 素(Oligos Etc.,Inc)，使其具有功能。然后通过标准的方法，用硫醇基将RNA 和亚氨基二乙酸(或次氮基三乙酸)特异性偶联。
按如下的方法进行底物再加载实验(图20)。在缓冲液中混合携带肽1 或肽2的珠，这种含有金属离子(Zn++或Ni++)的缓冲液可使RNase A具有活 性(例如Tris-HCl pH7或8)，然后按上述方法加载在柱上。柱用相同的缓冲 液洗涤，收集级分。在柱中迁移期间，肽珠通过六个N末端组氨酸、Zn++或Ni++与结合了RNA分子的IDA之间的相互作用，被固定在基质上。因 而，形成His6-金属-IDA复合物，它有效的将携带肽的肽珠与RNase A的 底物RNA结合。活性Rnase A(肽1)将裂解结合的RNA，并使其本身释放， 从而继续其在柱中的迁移。然而肽2的催化活性低于肽1，被固定的时间较 长，因此多次转化之后，肽1珠与肽2珠将因它们对RNA底物的不同催化 活性而被分离。因此在柱底部，带活性较高的RNase A变体的肽珠首先被 收集。
利用非天然氨基酸，可以检测RNase A的催化机制，并且应用上述的 底物再加载筛选，很可能开发出新的改良型RNase A变体(Jackson等，1994， 科学，第266卷，243-247页)。或者，可在随机肽总库中寻找新的催化剂。 在所回收的磁珠上的肽序列可以用Edamn降解或质谱分析测定。
实施例13：在低活性葡萄球菌核酸酶(SNase)变体环境中，富集较高活 性的Snase变体。这个筛选中应用电泳分离高活性酶。
将His6-标签引入到噬菌粒pⅡ78-6中连接SNase和pⅢ包膜蛋白的连 接子中(Pedersen等，1998，美国国家科学院院刊，第95卷，10523-10528 页)，或者将His6-标签克隆在M13K07辅助噬菌体的gpⅢ基因的N末端(按 照将酸性延伸区克隆到M13K07的克隆方法，Pedersen等，1998，美国国 家科学院院刊，第95卷，10523-10528页)。用正常M13K07辅助噬菌体和 His6标记的SNase噬菌粒，或者用pⅡ78-6噬菌粒和His标记的辅助噬菌体， 制备噬菌体颗粒。这两种方法均产生在其表面展示SNase和His标签的噬 菌体。
用标准的方法，用亚氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)在5’末 端衍生含约20个核苷酸的DNA寡聚体。例如，合成的寡聚体带有5’硫 醇基，它可以与双功能IDA-马来酰亚胺部分形成衍生物。衍生的寡聚体与 另一个引物及可以产生100-1000碱基对产物的模板一起进行PCR。
在其末端与IDA或NTA形成衍生物的DNA片段，与上面制备的噬菌 体共同温育，并上样在电泳凝胶上，例如在适合的缓冲液中的0.5％-0.7％的 琼脂糖凝胶上。缓冲液(Tris-HCl pH5-8)中包含Ca++(SNase活性所需)和Zn++、 Ni++、Co++或Cu++(为协调His6和IDA或NTA部分)，和高浓度的上述IDA- 或NTA-衍生的DNA片段。
在噬菌体上展示的His6标签，通过形成复合物His6-金属-DNA(His6- 金属-NTA)与DNA结合。如果在同一个噬菌体上展示的SNase是有活性的， 它将裂解相连的DNA。同时，不同DNA片段之间的迅速交换导致噬菌体 上全长片段的持续加载。因此，展示较高活性SNase的噬菌体通常与较短 DNA片段相连，并因此与展示无活性SNase的噬菌体的迁移不同。这个实 验是通过混合展示大量不同的SNase变体的噬菌体，并如上所述通过电泳 分离较高活性变体而进行的。
实施例14：
DNA寡聚体作为XY交换体：用荧光极化光谱检测交换速率
间接底物再加载方案的基本特征是连接底物和酶的XY交换单位。理 想的XY单位应该提供一个底物在酶上动态地、快速地和有效地再加载的 方法。我们希望设计一些核酸，可以满足(至少部分满足)理想的XY单位的 需要：快速交换且XY复合物内部仍然稳定。因此，设计了两套寡聚体，#1 和#2。这两套XY复合物的预期解链温度分别约为60℃和40℃。为了提供 活跃的交换，设计了两个DNA寡聚体，Y1和Y2，使它们与X上不相同 的但有重叠的靶区域结合(见材料和方法)。预计重叠区可以提供X-Y1和X- Y2复合物间的快速交换。
在各种温度下，用荧光极性光谱法分析两套寡聚体的交换速率。动力 学范围(寡聚体交换相对较快而X仍然是保持复合物状态的温度范围)比XY 二聚体的预期解链温度稍微低一些。得到游离Y与复合物结合Y的90％交 换所需要的时间(t交换)在30到500秒之间变动。用其它的寡聚体设计或优 化条件(尤其Mg++浓度和温度)，有可能获得高于每秒1次的核酸交换率， 很可能每秒10-100次。
材料和方法
DNA寡聚体序列。 Set#Ⅰ: X#1:     3＇-TGCTAGCATGGCCCAACGGGAAGTAACGCGAAGCCGATGCTAGCATGC-5＇ Y1-F1#1: 5＇-Fam-CGGGTTGCCCTTCATT-3＇ Y1#1:    5＇-CGGGTTGCCCTTCATT-3＇ Y2#1:    5＇-TTCATTGCGCTTCGGC-3＇ Set#Ⅱ: X#2:     3＇-ACGGGAAGTAACGCGA-5＇   Y1-F1#2: 5＇-Fam-TGCCCTTCATT-3＇ Y1#2:    5＇-TGCCCTTCATT-3＇ Y2#2:    5＇-TTCATTGCGCT-3＇
黑体部分为在X和Y中互补的序列；划线部分为Y1和Y2的重叠区； FAM指荧光部分。
荧光极化光谱
在Perkin Elmer LS50分光光度计上检测。激发光为485nm，放射光在 525nm处记录。所有的检测在缓冲液A(除非指明，否则为10mM Tris-HCl pH 9,100mM NaCl,1mM MgCl2)中进行。一个薄管与样品试管相连，因此在加 额外材料时不需要开盖。用这套装置不可能测量到在30秒内完成的反应的 速率。
结果
根据核酸设计XY交换单位
为了最终的应用，在酶-连接子XY连接子-底物结构中的XY交换单位， 应该在缓冲液中迅速用过量的Y-底物分子平衡，这样通过在缓冲液中Y产 物(或Y底物)与Y底物的交换，促进与酶“结合”产物(或底物)的迅速交换。
为了完成这个快速平衡，我们设计了两个寡聚体，Y1和Y2，它们在 X寡聚体上有重叠的结合位点(见材料和方法)。因此通过不与Y1退火的X 部分，Y2将能短暂地与X∶Y1复合物上的X相互作用，反之亦然。当与 X上完全互补序列退火时，Y1和Y2形成相同数量的AT和GC碱基配对， 因此预计对X具有非常相近的亲和力，及大概相似的启始或结束速率。因 此Y1从X∶Y2复合物中替换Y2的速度与Y2替换Y1的速度一样快。
我们设计了两套寡聚物，它们的退火位点长度不同，退火区和重叠区 域的相对长度也不同。选择重叠区序列(5’-TTCATT-3’)以避免三聚体的 形成，而且在实验中(和实施例10中)应用的X和Y的浓度非常低。因此， 几乎不可能形成三聚体。
Y2与X-Y1复合物的Y1的交换
用荧光极化法分别分析了两套寡聚体的交换率。溶液中荧光标记分子 的荧光极化与分子的旋转放松(relaxation)时间成比例。如果粘性和温度保持 恒定，荧光极化值直接与分子的体积成比例。两个分子的结合或分离可以 导致改变分子的体积，如同本实验中的应用。
首先分析了#1套寡聚体，在5nM浓度和46℃条件下，荧光素标记的 Y1寡聚体(Y1-F1#1，见材料和方法)的荧光极化值为0.028(见图21，上图)。 在t=660秒时加入200倍过量的寡聚体#1(1μM)，极化迅速增加到约0.037 的高水平，提示X∶Y1-F1#1复合物的形成。在t=2400条件下，当加入20 倍过量的Y2#1(20μM)至X时，极化迅速下降，提示Y1-F1#1从X∶Y1-F1#1 复合物中释放。最可能的情况是，形成X∶Y2-#1复合物，从X#1中替换 Y1-F1#1。
从X#1中用Y2#1替换Y1-F1#1是相对较快的过程；在30秒内，观察 到90％的平衡。X#1∶Y1-F1#1复合物的形成是一个较慢的过程(得到90％ 的平衡大约需要600秒)。然而，这可以被过量寡聚体的浓度低20倍的事 实解释。
接着在50℃分析了同样的结合反应。形成X∶Y1复合物所需要的时 间缩短(300秒)；另一方面，交换完成90％的时间稍慢(40秒，见表1)。
我们想验证重叠靶区域可以提高交换速率的观点。因此在相同的条件 下(46℃)，形成X#1∶Y-F1#1复合物，但在此向X#1中加入20倍过量的Y1#1(而 不是Y2#1)。从图21的下图和表1中可以看到，非标记Y1#1取代Y1-F1#1 是缓慢进行的。得到90％平衡需要约500秒。我们推断在这种情况下，X 上Y1和Y2的重叠靶机制将交换加速大约17倍。
用同样的方法分析了#2套寡聚体(见表1)。在24℃和1mM MgCl2参考 条件下，在200秒内，交换反应完成90％。温度增加到30℃，交换速度增 加4倍；同样，增加Mg++浓度到10mM，可增加交换4倍。目前的装置有 -个大约30秒的应答时间，因此我们没有检测10mM Mg++和30℃时的交 换速率。
最后，重叠靶区域机制再一次被验证。在亚优化条件下(24℃,1mM MgCl2),Y1对与X形成复合物的Y1-F1的交换在500秒内完成90％，这 比Y2对Y1的交换慢2.5倍。因此即使在这些条件下交换速度仅增加2.5 倍，包含两个而不是一个Y单位也是有利的。
在图21的下图中，荧光极化信号没有下降到基线(游离Y1-F1的信号 水平)。在针对#1套和#2套寡聚体、Y1交换Y1和Y2交换Y1以及用不同 的MgCl2浓度的多次实验中，几次观察到这个结果。我们对此现象无法解 释，然而，这似乎并不影响测定的交换速率。在无X的条件下，向游离Y1-F1 中加入大量过量的Y2对荧光极化信号没有影响。
讨论
两套寡聚体的交换速率表明强烈依赖于温度；为了交换的高效进行， 筛选实验的执行温度应该保持在一个相对窄的范围内，大约为最佳温度的+/- 5℃范围内。
MgCl2浓度强烈的影响交换速率。在一个所谓的“以DNA为臂的锤头 型核酶”中，(Shimayama等，(1995),FEBS Letters 368,304-306)也观察 到了相似的影响。他们发现锤头型核酶的催化活性，其中杂交臂已用脱氧 核糖核苷酸取代，强烈的依赖于Mg++浓度，即使是在确信活性部位已经用 Mg++饱和的高镁离子浓度条件下也是如此。因此他们的结果可解释为，高 Mg++浓度可增加RNA靶上核酸臂的交换。
基于核酸的XY交换单位的设计应该是一种非常普通的产生快速有效 的交换单位的方法。适当选择退火位点的长度和组成以及进行筛选的条件， 可使DNA寡聚体在不同的pH值、盐浓度、温度和压力等条件中作为XY 交换单位。本研究中表明Mg++浓度和温度的最优化可使交换率下降到仪器 的检测极限(每秒10次)。这些条件的结合，可能还包括其它条件的优化， 可使交换率下降到大约每秒1次。最后，调节退火位点的相对长度与组成 和Y1与Y2寡聚体的重叠区域，可以进一步改善交换率。
在X寡聚体上具有重叠结合位点的Y1和Y2寡聚体的设计可以提高 交换率。推测重叠靶区域介导一个寡聚体被另一个寡聚体活跃替换。根据 这种观点以及反义RNA的结构和机制特点，XY交换单位的更复杂设计， 应该能更进一步改善这个系统的动力学。                                   #1套     交换 Mg++ (mM)     温度     (℃) t(复合体形成)     (秒)     T(交换)     (秒)     Y1/Y2  1     46     600     30     Y1/Y2  1     50     300     40     Y1/Y1  1     46     800     500                                  #2套     交换     Mg++     (mM)   温度   (℃) t(复合体形成)     (秒)     t(交换)     (秒)     Y1/Y2     1     24     80     200     Y1/Y2     1     27     300     100     Y1/Y2     1     30     100     50     Y1/Y2     1     33     80     200     Y1/Y2     5     24     70     70     +Y1/Y2     10     24     90     50     Y1/Y2     500     24     400     70     Y1/Y1     1     24     200     500
表1．在各种温度和MgCl2条件下90％复合物的形成和90％交换的时 间。
将第一个寡聚体(Y1-F1)加至5nM；第二个寡聚体(X)加至1μM；第 三个寡聚体(Y2或Y1)加至20μM。
                 序列表 <110>Novo Nordisk A/S <120>利用底物置换进行酶活性筛选 <130>用底物筛选酶活性 <140> <141> <160>4 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>379 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：噬菌粒，pFab-SP400 <400>1 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala   1               5                  10                  15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Ser Gln Asp leu Phe Asn Gln Phe
         20                  25                  30 Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
     35                  40                  45 Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
 50                  55                  60 Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser  65                  70                  75                  80 Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
             85                  90                  95 Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
        100                 105                 110 Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
    115                 120                 125 Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
130                 135                 140 Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr 145                 150                 155                 160 Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
            165                 170                 175 Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
        180                 185                 190 Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
    195                 200                 205 Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
210                 215                 220 Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro 225                 230                 235                 240 Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
            245                 250                 255 Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
        260                 265                 270 Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
    275                 280                 285 Thr Cys Leu Ala Ala Ala Gly Ser Lys Asp Ile Arg Pro phe Val Cys
290                 295                 300 Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala 305                 310                 315                 320 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
            325                 330                 335 Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
        340                 345                 350 Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn
    355                 360                 365 Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala
370                 375 <210>2 <211>391 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：噬菌粒，ph8 <400>2 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala   1               5                  10                  15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe
         20                  25                  30 Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn
     35                  40                  45 Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro
 50                  55                  60 Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser  65                  70                  75                  80 Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys
             85                  90                  95 Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile
        100                 105                 110 Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly
    115                 120                 125 Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp
130                 135                 140 Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr 145                 150                 155                 160 Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val
            165                 170                 175 Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser
        180                 185                 190 Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr
    195                 200                 205 Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile
210                 215                 220 Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro 225                 230                 235                 240 Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp
            245                 250                 255 Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro
        260                 265                 270 Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly
    275                 280                 285 Thr Cys Leu Ala Ala Ala Pro Gly Gly Ser His His His His His His
290                 295                 300 Ser Ala Ala Gly Ser Lys Asp Ile Arg Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln 305                 310                 315                 320 Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly
            325                 330                 335 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
        340                 345                 350 Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
    355                 360                 365 Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys
370                 375                 380 Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala 385                 390 <210>3 <211>2031 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：噬菌粒，ph7 <400>3 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggcgcagt ccggcaatcc gttctctgga cgtaccttgc tcgttaacag cgactacagt 120 tccaagttgg accagactcg acaggctttc ctgagccgag gtgatcagac caacgctgcc 180 aaggtgaagt acgttcagga gaaggtcggt accttctact ggattagcaa catcttcctc 240 ttgcgtgata tcgacgttgc tatccagaac gcacgtgctg ccaaggcccg tggagagaat 300 cccattgttg gtttggtcct gtacaacttg cctgatcgag attgcagcgc tggtgagagc 360 agtggcgagc tgaagctgag ccagaacggt ctcaaccggt acaagaacga gtacgtgaat 420 cccttcgctc agaagcttaa ggctgcatcc gacgtgcagt tcgctgtgat tctggaaccc 480 gatgccatcg gcaacatggt gaccggcacc agtgctttct gccgaaatgc acggggccct 540 cagcaagagg ctatcggcta cgcgatcagc cagttgcagg cctcccacat tcacctgtac 600 ctggacgtgg ccaacggcgg ttggctcggt tgggctgaca agctcgagcc cactgctcag 660 gaggtggcta ctatcctgca gaaggctggt aacaatgcga agatccgcgg cttcagttcg 720 aacgtgagca actacaatcc ctacagcacc tccaaccctc cgccctacac tagcggttct 780 ccgtctcctg acgagtcccg ctacgctacc aatatcgcta acgccatgcg ccagcgaggc 840 ttgcccactc agttcattat cgatcagagc cgcgtcgctc tgtccggagc ccgtagcgaa 900 tggggacagt ggtgcaacgt gaacccggct ggtttcggtc agccgttcac taccaacacg 960 aacaatccta acgtggacgc gatcgtctgg gtcaagcctg gaggcgaatc tgacggtcaa 1020 tgcggtatgg gcggtgctcc cgctgccggc atgtggttcg acgcgtatgc ccaaatgctc 1080 actcagaatg ctcacgacga gatcgcgaga ggcgctgccg gttccggtgg aggcaacaat 1140 ggcggaggta acaatccgaa tcctactccc accaatccca cgaatcccgg tcctacttct 1200 aaccctggag gcggtaactg cgcatccaag tggggtcagt gcggaggcca aggatgggca 1260 ggacccacct gttgcgaagc tggaagcact tgcacccgtc agaacgagtg gtacagccag 1320 tgcctcccag gaggcgcggc cgcaccagga ggatcacatc accatcacca tcactcggcc 1380 gcaggctcta aagatatcag accattcgtt tgtgaatatc aaggccaatc gtctgacctg 1440 cctcaacctc ctgttaatgc tggcggcggc tctggtggtg gttctggtgg cggctctgag 1500 ggtggtggct ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggct ctgagggtgg cggttccggt 1560 ggtggctctg gttccggtga ttttgattat gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct 1620 atgaccgaaa atgccgatga aaacgcgcta cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct 1680 gtcgctactg attacggtgc tgctatcgac ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct 1740 aatggtaatg gtgctactgg tgattttgct ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt 1800 gacggtgata attcaccttt aatgaataat ttccgtcaat atttaccttc cctccctcaa 1860 tcggttgaat gtcgcccttt tgtctttggc gctggtaaac catatgaatt ttctattgat 1920 tgtgacaaaa taaacttatt ccgtggtgtc tttgcgtttc ttttatatgt tgccaccttt 1980 atgtatgtat tttcgacgtt tgctaacata ctgcgtaata aggagtctta a          2031 <210>4 <211>993 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：噬菌粒，ph17 <400>4 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggcggcga gaggcgctgc cggttccggt ggaggcaaca atggcggagg taacaatccg 120 aatcctactc ccaccaatcc cacgaatccc ggtcctactt ctaaccctgg aggcggtaac 180 tgcgcatcca agtggggtca gtgcggaggc caaggatggg caggacccac ctgttgcgaa 240 gctggaagca cttgcacccg tcagaacgag tggtacagcc agtgcctccc aggaggcgcg 300 gccgcaccag gaggatcaca tcaccatcac catcactcgg ccgcaggctc taaagatatc 360 agaccattcg tttgtgaata tcaaggccaa tcgtctgacc tgcctcaacc tcctgttaat 420 gctggcggcg gctctggtgg tggttctggt ggcggctctg agggtggtgg ctctgagggc 480 ggcggttctg agggtggcgg ctctgagggt ggcggttccg gtggtggctc tggttccggt 540 gattttgatt atgaaaagat ggcaaacgct aataaggggg ctatgaccga aaatgccgat 600 gaaaacgcgc tacagtctga cgctaaaggc aaacttgatt ctgtcgctac tgattacggt 660 gctgctatcg acggtttcat tggtgacgtt tccggccttg ctaatggtaa tggtgctact 720 ggtgattttg ctggctctaa ttcccaaatg gctcaagtcg gtgacggtga taattcacct 780 ttaatgaata atttccgtca atatttacct tccctccctc aatcggttga atgtcgccct 840 tttgtctttg gcgctggtaa accatatgaa ttttctattg attgtgacaa aataaactta 900 ttccgtggtg tctttgcgtt tcttttatat gttgccacct ttatgtatgt attttcgacg 960 tttgctaaca tactgcgtaa taaggagtct taa                              993